Metschnikowia pulcherrima Türü Mayaların İzolasyonu ve Pulcherrimin’in Antimikrobiyal Aktivitelerinin Araştırılması

Prof. Dr. Sezai Türkel

Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü,

Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı. 16059-Bursa.

Mayalar ile Biyokontrol

Yer ve besin için yarışma/rekabet

“Killer Toksin” üretimi

Hücre dışı litik enzim üretimi

Diğer mekanizmalar

Metschnikowia pulcherrima

• Bazı suşları Biyokontrol maya olarak Penicillium ve Botrytis’e etkili

• Etki mekanizması tam olarak bilinmiyor (Fe++ immobilizasyonu ??)

• Doğal habitatı Çiçek ve bazı meyvelerdir.

• Bitkiler/meyveler Arasında Çoğunlukla Apis ve Drosophiloid’lerce taşınmaktadır.

• Bazı suşları Pulcherrimin pigmenti üretir.

Araştırmalarımızın amacı:

1-) Metschnikowia pulcherrima türü mayaları izole edip türlerini tanımlamak

2-) M. pulcherrima türü mayaların antagonistik özelliklerini araştırmak

2-) Endüstriyel önemi olan yeni maya türleri izole etmek, türlerini tanımlamak

3-) Saflaştırılıp türleri belirlenen mayaların endüstriyel amaçlar için kullanılabilirliklerini test etmek

Kullanılan Yöntemler

• Meyve homojenatlarının hazırlanması

• YGC Agar (Maya özütü-Glukoz-Kloramfenikol-Agar) petrilerine ekim

• Pozitif maya kolonilerin Seçimi

• Pulcherrimin Üreten kolonilerin saf kültür olarak eldesi

• Fermentasyon/Assimilasyon testleri

• API ID 32c ile türlerin yaklaşık olarak belirlenmesi

• Genomik DNA izolasyonu ve ITS1-5.8s rDNA-ITS2 Dizilerinin belirlenmesi

• Antifungal ve Antibakteriyel aktiviteler için testler

• Antimikrobiyal aktivitesi olan M. pulcherrima türlerinin detaylıanalizi.

SONUÇLARMaya türleri dağılımı (Tür tayini API ID 32c ile yapılmıştır)

Maya türleri Örneklerdeki frekansları

Pichia norvegensis %56

M. pulcherrima %18

Kloeckere japonica %13

Kloeckere apis %13

Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi(pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu-YGC Agar Petrileri)

Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi(pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu – YPD Petrileri)

Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi(pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu- YPD Petrileri-)

Metchnikowia pulcherrima suşlarının seçilmesi(pulcherrimin üreten kolonilerin izolasyonu- YPD Petrileri-)

M. pulcherrima suşlarının ITS1-5.8s rDNA-ITS2 Bölgelerinin Genomik DNA’dan PCR ile çoğaltılmaları

M: Marker, 1-3: Sırasıyla UMY12, UMY14 ve UMY15 kodları ile verilen M. pulcherrima suşları genomik DNA örneklerinden ITS1 ve ITS4 primerleri ile elde edilen PCR sonuçları.

Metschnikowia pulcherrima suşlarının rDNA dizileri ve BLAST analizi

• UMY12 sekans analizi ve blast sonuçları. ITS4 primeri ile sekanslanmıştır. >99862-M4-98989 sequence exported from 8-ITS4-21Nov2007[1].ab1

• NNAAATCGGAGCTCGAGGTGAGGAGAAGATGGGGCTAAACTTATTCTAGCGCCGTTGATATTAGGCCGAAGCAGGACCAAACCGGAGGTTTGAGAGTAAATATCGCTCACCCACGCATGCCCTGGGGAATACCCCGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCAATGATTCACGTCTGCAAGTCATATTACGTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTTAATTGAGTTATTGAAGAATAAGATGTAGAGTGTGTGCCCAAAAGGGTGTAAAAATGTTTTTAAAGAGCCCTCCCCACGTGCACCCTACAGAAAAGNNNNNNNNNNN

• BLAST Analizi Sonucu:

• Metschnikowia pulcherrima isolate MB510, ITS1- 5.8S rRNA -ITS2, Length=327 Score = 478 bits (241), Expect = 7e-132 Identities = 262/269 (97%), Gaps = 0/269 (0%) Strand=Plus/Minus

Metschnikowia pulcherrima suşlarının rDNA dizileri analizi

• UMY14 sekans analizi ve blast sonuçları. ITS4 primeri ile sekanslanmıştır.>99864-M4-98989 sequence exported from 9-ITS4-21Nov2007[1].ab1

• NNCCTAGACCGTACTCGAGGTGAGGAGAGATGGGGCTAAACTTATTCTAGCGCCGTTGATATTAGGCCGAAGCAGGACCAAACCGGAGGTTTGAGAGTAAATATCGCTCACCCACGCATGCCCTGGGGAATACCCCGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCAATGATTCACGTCTGCAAGTCATATTACGTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTTAATAGAGTATTTGACGGATAAGATGTAAAGTGTGTGCCTAAAAGGGTGTAAAAATGATTTTAATGATCCTTCCCCACGTGCACCTACAGAAGAGNNNNNNNNNNN

• BLAST Analizi Sonucu:

• Metschnikowia pulcherrima isolate MB510,

• ITS1- 5.8S rRNA -ITS2, , Score = 478 bits (241), Expect = 7e-132 Length=327

• Score = 486 bits (245), Expect = 3e-134

• Identities = 263/269 (97%), Gaps = 0/269 (0%) Strand=Plus/Minus

•

Metschnikowia pulcherrima suşlarının rDNA dizileri analizi

• UMY15 sekans analizi ve blast sonuçları. ITS1 primeri ile sekanslanmıştır.

• >99866-M4-98988 sequence exported from 10-ITS1-15Nov2007[1].ab1

• NNNGGATATGTTTCCCCTTTAGGCCAACTCTAAATCTAACCGTCAATATCTTTATCAAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAATATGACTTGCAGACGTGAATCATTGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCGGGGTATTCCCCAGGGCATGCGTGGGTGAGCGATATTTACTCTCAAACCTCCGGTTTGGTCCTGCTTCGGCCTAATATCAACGGCGCTAGAATAAGTTTTAGCCCCATTCTTTTTCCTCACCCTCGTAAGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGCGAGGAAAANNNNNN

• BLAST Analizi Sonucu:

• Metschnikowia pulcherrima strain BIO126, ITS1- 5.8S rRNA -ITS2,

• Length=377 Score = 567 bits (286), Expect = 9e-159

• Identities = 292/294 (99%), Gaps = 0/294 (0%) Strand=Plus/Plus

Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleriA- Bakteri ve Mayalar Üzerine etkileri (İnhibisyon Zonları mm olarak verildi)

Mikroorganizma

M. pulcherrima Suşları veinhibisyon zonları (mm)

UMY12 UMY14 UMY15

E. coli 4 NZ NZ

Proteus vulgaris 5 4 4

S. cerevisiae 2 3 3

D. occidentalis 3 4 4

K. marxianus NZ 2 5

C. albicans 2346 NZ 2 4

C. parapsilosis 2 4 5

C. krusei 1 3 4

C. dupliensis 1 2 2

C. tropicalis NZ 2 2

Tricosporon mucoides 1 4 4

Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri(Proteus vulgaris üzerine etkileri –Nutrient Agar petrileri)

Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleriBazı Küfler Üzerine etkileri (İnhibisyon Zonları mm olarak verildi)

Mikroorganizmalar

M. pulcherrima suşları ve/İnhibisyon Zonları (mm)

UMY12 UMY14 UMY15

A. niger 16604 2 2 2

A. flavus 22293 1 2 3

A. terreus 1 2 2

A. fumigatus 1 3 3

Paecilomyces spp 2 3 3

Mucor spp 1 3 3

Bipolaris spp 1 4 3

K. lactis türlerinde Laktaz (ββββ-galaktozidaz) sentezinin glukoz baskılamasıLaktaz (aβ-galaktozidaz) aktiviteleri Miller Ünitesi olarak verilmiştir. (SD: +/- %10)Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri

(M. pulcherrima UMY12, UMY14, UMY15 suşlarının Paecilomyces spp’ye etkileri)

Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri(M. pulcherrima UMY12, UMY14, UMY15 suşlarının Mucor spp’ye etkileri)

Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri(M. pulcherrima UMY12, UMY14, UMY15 suşlarının Trichoderma spp’ye etkileri)

Metschnikowia pulcherrima suşlarının Antimikrobiyal aktiviteleri(M. pulcherrima UMY14 suşunun Aspergillus terreus’a etkileri)

Pulcherrimin Pigmenti Fe++ Bağlamaktadır(PNAS, 39, 583-593, 1953)

Metschnikowia pulcherrima suşlarına Fe++ iyonlarının etkileri(YNB Glukoz + Fe++ Petrileri)

Metschnikowia pulcherrima suşlarına Fe++ iyonlarının etkileri(Fe++ iyonları Antagonistik etkiyi bloke etmektedir)

Genel Sonuçlar

• Saflaştırılan Metschnikowia pulcherrima türleri ayrı ırklara ait olabilir

• Metschnikowia pulcherrima türlerinin sentezlediği Pulcherrimin pigmentinin demir bağlama özellikleri türe göre değişmektedir.

• Metschnikowia pulcherrima türleri hasat sonrası ürün korumada (post harvest protection) biyoajan olarak kullanılabilir.

• Pulcherrimin antibakteriyel/antifungal etken madde olarak topikal uygulamalar için geliştirilebilir.

• Pulcherrimin ortamdaki Fe++ iyonlarının mikroorganizmalar tarafından kullanımınıbloke ederek etkisini göstermektedir.

•• TETEŞŞEKKEKKÜÜRLERRLER,,

• Proje desteği için

• Uludağ Üniversitesi BAP’a

• TÜBİTAK’a

• Teknik yardımlarından dolayı• Yrd. Doç. Dr. Tülay Turgut Genç’e (ÇOMU)

• Teşekkürler ederim.