TAQ DNA POLYMERASEDISUSUN OLEH:

Diana Christina, 1306370902

Dyah Paramawidya Kirana, 1306447846

Faustina Prima Martha, 1306404802

Kamila Luthfia Putri, 1306412193

Nadira Putri Pinasthika, 1306370814

Syafira Andyah Putri, 1306371022

TEKNOLOGI BIOPROSES 2013

BIOKATALIS

OUTLINE

Deskripsi enzim

Polymerase

Produksi TAQ DNA Polymerase

Aplikasi TAQ DNA Polymerase

Pembahasan Jurnal

Referensi

JENIS-JENIS ENZIM POLYMERASE

DESKRIPSI ENZIM

DESKRIPSI ENZIM

• Merupakan enzim sentral yang berperan dalam proses replikasi DNA dan reparasi DNA, serta mengkatalisasi reaksi pembentukan DNA dalam sintesis protein.

• Pada proses replikasi, DNA polymerase hanya bisa menempel pada gugus OH (hidroksil) dimana gugus OH hanya ada pada ujung 3’ sedangkan ujung 5’ adalah ujung fosfat

• Hanya bisa mensintesis DNA dari arah 5’-3’ sehingga pertumbuhannya dari 5’-3’ karena penambahan pada ujung 3’, dimana pada ujung 3’ terdapat ujung hidroksil.

DNA POLYMERASERNA POLYMERASE• Enzim ini berperan dalam proses

pembentukan RNA berupa mRNA, rRNA dan tRNA dari DNA sebagai cetakannya. RNA polymerase bekerja melalui 3 tahap pada proses yang disebut sebagai transkripsi (pembentukan RNA).

• Fungsi RNA polymerase digunakan di tahap inisiasi, elongasi, dan terminasi

DESKRIPSI ENZIMRIBOSOMES

Ribosom adalah salah satu organel yang berukuran

kecil dan padat dalam sel yang berfungsi sebagai tempat sintesis

protein. Ribosom berdiameter sekitar

20 nm serta terdiri atas 65% RNA  ribosom (rRNA) dan 35% protein ribosom

(disebut Ribonukleoprotein atau

RNP). 

DNA NUCLEOTIDYLEXOTRANSFERASE • DNA Nucleotidylexotransferase/Terminal

trasnferase adalah DNA Polimerase khusus yang diekspresikan pada sel limpatik pre-T & pre-B

• Digunakan pada proses amplifikasi cepat cDNA untuk menambahkan nukleotida supaya dapat digunakan sebgai template primer pda PCR Subsekuen

• Antibodi TdT digunakan untuk menunjukkan keberadaan sel B & T muda serta untuk multipotensi stem sel hematopatik

REVERSE TRANSCRIPTASE• Reverse transcriptase

adalah enzim yang digunakan untuk membentuk cDNA dari RNA template

• Aplikasinya sering ditemukan pada pembuatan Obat Anti Virus, Mempermudah proses PCR, dan Produksi Insulin

SUMBER ENZIM TAQ DNA POLYMERASE

DESKRIPSI ENZIM

Thermus aquaticus

Klasifikasi: Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Themales;

Thermophilus; Aquaticus

Pertama kali ditemukan pada Yellowstone National Park, USA pada suhu 55-100°C dan pH 5-9

Berupa bakteri gram-negative atau bakteri yang hanya memiliki sedikit peptidoglikan pada dinding selnya

Terdapat dalam bentuk filamen-filamen pendek

Ketika dikenakan cahaya, Thermus terlihat warna kuning, merah, atau merah muda (karena pigmen dalam bakteri tsb.)

Dapat memiliki flagella atau dapat berupa immotile (tidak bergerak)

Ketahanannya terhadap suhu tinggi, TAQ DNA Polymerase dari Thermus aquaticus sering digunakan untuk PCR

KARAKTERISTIK DNA POLYMERASE DARI Themus aquaticus

Kegunaan• Mengoptimalk

an PCR• DNA labeling

yang melibatkan primer

• DNA Sequencing

Properti fisis/kimiawi• MR = 94 kDa• pH optimal =

7.5 - 9• Suhu optimal

= 80°C (namun juga tergantung senyawa buffer)

< ContinueTitik Isoelektrik : 6.03 (Theoretical)Extinction Coefficient : 110,380 cm-1 M-1 (Theoretical)

E1%, 280 = 11.75 (Theoretical)Waktu Paruh : >40 menit, 95°C

InhibitorBromophenol blue (Wittwer and Garling 1991)Pyranicin (Takahashi et al. 2008)KCl (greater than [75 mM])Urea, DMSO, DMF, formamide, and SDS (Wittwer and Garling 1991)

HARGA TAQ DNA POLYMERASESKU-Pack Size Availability   Price (SGD) Quantity

D1806-5KUEstimated to ship on 17.01.16

  3,780.00

D1806-250UNEstimated to ship on 04.12.15

  260.50

D1806-1.5KUEstimated to ship on 17.01.16

  1,370.00

D1806-20X250UNEstimated to ship on 04.12.15

  3,910.00

D1806-10X1.5KUEstimated to ship on 17.01.16

  10,500.00

STRUKTUR TAQ DNA POLYMERASE

MEKANISME KERJA TAQ DNA POLYMERASE

DESKRIPSI ENZIM

Sumber: http://www.worthington-biochem.com/DNAPTAQ/default.html

KLONING GEN TAQ DNA POLYMERASE

PRODUKSI ENZIM

Isolasi genom DNA Thermus aquaticus dan

plasmid DNA nya

Amplifikasi gen Thermus aquaticus DNA polymerase dengan PCR

Ligasi fragmen amplikon ke dalam vektor

ekspresi pET yang sudah didigest dengan

EcoRI dan SalI

Hasil ligasi ditransformasikan ke sel kompeten E.coli TOP10 dengan CaCl2 & heat shock pada 42oC (45

menit)

E.coli rekombinan dikultur dalam 10 ml LB

broth 1 malam pada 37OC, mengandung 100ug/ml ampicilin

sebagai seed culture

Medium LB mengandung100ug/ml

ampicilin diinokulasi dengan 1% seed culture

ditumbuhkan pada 37OC

Ekspresi protein rekombinan diinduce

oleh 0,52 mM IPTG pada kultur dengan OD600 0,6-

0,8 (fase mid-log) yield enzim maksimal

Pemanenan sel

Ekstraksi dan purifikasi

Primer :F 5’ - CGG AAT TCT GAG GAG GTA ACA TGA GGG -3’ RE: EcoRIR 5’-CGT CGA CTA GAT CAC TCC TTG GCG GAG AG -3’ RE: SalI

mid-log phase yield enzim maksimal

EKSTRAKSI DAN PURIFIKASI TAQ DNA POLIMERASE

PRODUKSI ENZIM

3. Penambahan lisozim

Sebelumnya didinginkan dua kali dengan nitrogen cair, lalu dicairkan

pada suhu ruang

Ditambahkan 1 ml lisozim dan 1 ml lysis buffer

Diinkubasi pada 75°C selama 30 menit

2. Pelarutan sel kembaliSentrifugasi kembali Dilarutkan kembali dengan 50 ml buffer

A

1. Pemanenan SelSentrifugasi Dicuci dengan 50 ml buffer A per liter volume

kultur

6. Mendenaturasikan Dnase I

Direndam dalam water bath pada suhu 75°C selama 30 menit

Sentrifugasi pada 16.000 x g selama 10 menit pada suhu 4°C

5. Penambahan digestive solution1% digestive solution dengan PMSF ditambahkan ke larutan untuk menghilangkan DNA

dan RNA setelah suhunya turun menjadi suhu ruangan

4. Pemisahan padatan selSentrifugasi pada 16.000 x g selama 10 menit pada suhu 4°C

8. Pengambilan Taq PolimeraseSentrifugasi 16.000 x g selama 15

menit pada suhu 4°C untuk memperoleh Taq Polimerase

Endapan dilarutkan pada 25 ml buffer penyimpanan lalu disimpan pada suhu -

20°C

7. Penambahan etanolSupernatan dipindahkan ke botol plastik Ditambahkan etanol sampai

konsentrasinya 55%

APLIKASI ENZIM

ALIKASI

Taq Polymera

se Mutagenesis

Sequencing

PCR

Kloning

DNA polimerase membantu proses sintesis. Dimana enzim ini akan "memeriksa" apakah nukleotida yang benar telah

dimasukkan ke dalam template. Jika ketidakcocokan terdeteksi

DNA ditransfer dari domain polimerisasi ke 3'→

5'exonuclease domain N-terminal dari polimerase.

Nukleotida salah dimasukkan dipotong dan DNA pindah

kembali ke domain polimerisasi, proses penyalinan dilanjutkan.

Skema Reaksi Taq Polimerase

POLYMERASE CHAIN REACTION

PEMBAHASAN JURNAL

DNA polymerase berfungsi untuk manipulasi DNA secara in vitro seperti cloning, sekuensing, DNA labeling, mutagensesis, dll

DNA polymerase dari Thermus aquaticus (Taq Polimerase) merupakan enzim yang paling sering digunakan diseluruh dunia

untuk proses PCR

Untuk meningkatkan performance PCR yang menggunaka taq polymerase sebagai enzimnya, perlu dilakukan mutagenesis

Sebelum dilakukannya mutagenesis, DNA polymerase diamplifikasikan dengan PCR dari DNA microorganism yang

didapat dari tanah

Kemudian corresponding region gen pol untuk taq polymerase di ganti dengan fragment gen yang telah diamplifikasi dan

membandingkannya dengan beberapa chimeric DNA polymerase untuk mencari titik kritis untuk kemampuan elongasinya

• Host yang membawa plasmid rekombinan ditumbuhkan pada LB Medium 100µg/ml ampicillin

• Sel dikultur hingga nilai absorbansinya mencapai 0,2-0,3

• Pol gen kemudian di kultur selama 3 jam lagi dengan kehadiran IPTG

• Sel dipanen dan dihancurkan dengan proses sonifikasi pada larutan lysis (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)

• Untuk persiapan WT dan polimerase Taq mutan, ekstrak sel larut, diperoleh dengan sentrifugasi pada 12.000 x g selama 20 menit, dipanaskan pada suhu 75 ° C selama 30 menit.

• Hasil akhir dari purifikasi ini berupa protein yang terelusi pada 0,8 M NaCl di kromatografi kolom hidrofobik

Ekstraksi DNA

•Ekstraksi DNA mikroorganisme yang berada di tanah menggunakan UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO, San Diego, CA, USA)

•Ekstrak DNA diseleksi dengan elektroforesis

Persiapan Enzyme dan Substrat

• Enzim untuk manipulasi DNA in vitro dibeli dari New England Biolabs (Ipswich, MA,USA). [metil-3H] TTP dibeli dari Amersham (Buckinghamshire, Inggris) dan [γ32-P] ATP dibeli dari Nen Life Science Produk (Boston, MA, USA).

Konstruksi plasmid untuk chimeric Taq Polimerase

• Vector: pTV-Taq (asal: pTV118N)

• RE: B1pI dan Bg1II

Amplifikasi fragment gen pol dari metagenomic DNA

• PCR dilakukan dalam reaksi 50μl, mengandung 10ng DNA, 25p mol masing-masing primer, 0.2mm dNTP, dan 1 unit PFU polimerase DNA Ultra (Stratagen). Setelah inkubasi dari campuran tanpa enzim untuk 3 menit di 95◦C, tiga puluh siklus PCR, dengan profil suhu 30-an di 95◦C, 30sat 55◦C, dan 1 menit pada 72◦C, dilakukan.

Konstruksi mutan Taq Polimerase

• pTV-Taw plasmid kemudian dimutagenesis pada bagian E742 dan A73

• Pada reaksi PCR campuran mengandung 20ng DNA template, 1 × PCR buffer KOD-Plus-Neo, 1.5mm Mg2SO4, 0.2mm setiap dNTP, 0.3μM primer masing-masing, dan 0,5 Unit KOD-Plus-Neo DNA polimerase (TOYOBO, Osaka , Jepang) dalam volume akhir 20μl. Campuran dipanaskan pada 95◦C untuk 30-an detik dan kemudian mengalami siklus termal (14 siklus 95◦C untuk 30-an, 55◦C selama 1 menit, dan 68 ◦ C untuk 8 menit). Produk PCR dirawat dengan DpnI pada 37 ◦C untuk 1h

Purifikasi Wild-type dan mutan DNA PolimeraseAnalisis hasil amplifikasi

• Meligasi fragment gen dari metagenomic DNA ke plasmid dan host

• Host: E.coli JM109

MATERIAL DAN METODE

Pemanjangan Primer lebih Cepat dan Kenaikan

Kinerja PCR dengan

Mutan Taq Polimerase

HASIL

• Chen, Sique, dkk. 2015. A Simple and Efficient Method for Extraction of Taq DNA Polymerase. Tiongkok: Electronic Journal of Biotechnology.

• http://www.worthington-biochem.com/DNAPTAQ/default.html• https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Thermus_aquaticus*• http://eol.org/pages/974560/overview• http://bioinfo.bact.wisc.edu/themicrobialworld/LAHT/b27.html

REFERENSI

THANK YOU!