KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK ÁLTAL INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT

VIZSGÁLATA TROPHOBLAST SEJTVONALBAN

Kovács Árpád Ferenc1, Pap Erna1, Fekete Nóra1, Rigó János2, Buzás Edit1, Pállinger Éva1

1Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Semmelweis Egyetem,2I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, Semmelweis Egyetem

2016. 10. 14.

KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK

SPIRÁLIS ARTÉRIA REMODELLING

PREECLAMPSIA FELTÉTELEZETT PATOMECHANIZMUSA

Decidua

Magzati rész Anyai rész

Myometrium

ANYAI VÉR

Endotél sejt

Monocita/ Makrofág

Simaizomsejt

Extravillosus trophoblast

Syncytiotrophoblast sejtréteg

Endovaszkuláris trophoblast

Syncytiotrophoblast eredetűextracelluláris vezikulák

Cytotrophoblast

AZ ANYAI-MAGZATI HATÁRFELÜLET

B

C

EGÉSZSÉGES VÁRANDÓS PREECLAMPSIÁS VÁRANDÓS

CÉLSEJT

MIKROVEZIKULÁK100-1000 nm

EXOSZÓMÁK35 - 150 nm

EXTRACELLULÁRIS VEZIKULA (EV) MEDIÁLT SEJTKOMMUNIKÁCIÓ (1)

APOTOTIKUS TESTEK300 - 3000 nm

EV BIOGENÉZIS

EXTRACELLULÁRIS VEZIKULA MEDIÁLT SEJTKOMMUNIKÁCIÓ (2)

EV SZERKEZETHidrofób molekulák

Hidrofil molekulák

miR, mRNS, DNS, mtDNS

Fehérje cargo

Foszfatidiliszerin(Annexin A5)

Tetraspanin

(CD63, CD81, CD9)

Anyasejtre jellemző molekula

(pl. HLA-G)

Lipid cargo

CÉLKITŰZÉS

A preeclampsia asszociált keringő extracelluláris vezikulák trophoblast sejtek adhéziós génexpressziósmintázatra kifejtett hatásainak felderítése.

Idővonal Lépések

1 mL PFP/ minta

12.5K pelletMikrovezikula

100K pelletExoszóma

Inkubáció

BeWo sejtek 12.5K vagy 100K pellettel

BeWo sejtekből RNS izolálás

0. n

ap2

. nap

1. n

ap

12.500 g

12.500 g

70’

15’

20’

100.000 g

70’100.000 g

24h

Átírás cDNS-sé RT-PCR Analízis

5*105 BeWo sejthez

Vezikulaszámlálás: 1*106 vezikula

MÓDSZER (1)

MÓDSZER (2)

1.) 5*105 BeWo

2.) 1*106 EV

3.) 24h inkubációBeWo sejtekből RNS izolálás

cDNS-sé írás

qRT-PCR (ABI 7900RT FAST)

Antigén Expresszió

CD18 -

CD44 -

Bcl2 -/+

Pgp +/-

CD11c -

CD162 -

CD95 -

CD54 +

HLA-G ++

PSR ++

HLA-DR -

CD62L -

CD49d -

CD11b -

FasL +/-

CD34 -

CD10 -

BeWo sejtek

12.5K pellet MIKROVEZIKULA

100K pellet EXOSZÓMA

ELMI ELMI

200nm500 nm

DLS DLS APOGEEAPOGEE

HL

A-G

CD

62

CD

41

An

nexin

V

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

MV

/ 1

mic

ro

lite

r p

las

ma H ea lthy

P re e c la m p tic

***

***

***

Mik

rove

ziku

la/ μ

L p

lazm

a

HL

A-G

CD

62

CD

41

An

nexin

V

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

MV

/ 1

mic

ro

lite

r p

las

ma H ea lthy

P re e c la m p tic

***

***

***

HP HP

PE PE

233

PE MV

297 proteinHP MV

282 protein

6449

MS MS

HP exo

163 proteinPE exo

159 protein

137

26 22

PEPE

HPHP

KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULA MINTÁZAT JELLEMZÉSE

EGÉSZSÉGES PREECLAMPSIÁSPREECLAMPSIÁSEGÉSZSÉGES

50 100 150 200 250 300

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

Avg

. M

otilit

y (

µm

)

Time (unit = 20 sec)

0 20 40 60 80

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

C

I

Time / h

BeWo

BeWo + H-EV

BeWo + P-EV

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00

Normalized slope

VEZIKULA HATÁS A KORAI ADHÉZIÓRAH-EV VS P-EV ADHÉZIÓS HATÁSA EV KONCENTRÁCIÓ FÜGGŐ HATÁSA

BeWo + H-EV

BeWo + P-EV

BeWo BeWo

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

1

2

3

4

5

6

7

8

9

C

I

Time / h

BeWo H-EV

BeWo + H-EV

BeWo + 10x hígított H-EV

50 100 150 200 250 300

0

20

40

60

80

100

120

140

Avg. M

igra

tion (

µm

)

Time (unit = 20 sec)

KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK FUNKCIONÁLIS HATÁSAI

BeWo + P-EV

BeWo + H-EV

H-EV VS P-EV SEJTMIGRÁCIÓS HATÁSA H-EV VS P-EV SEJTMOTILITÁS BEFOLYÁSOLÁSA

BeWo + H-EV

BeWo

BeWo + P-EV

GÉN

HP

MV

kez

elt

Be

Wo

PE

MV

kez

elt

Be

Wo

CD44

CD82

CLDN1

CXCR4

ICAM1

MMP2

MMP7

MMP9

MMP11

TGFB1

VCAM1

VDR

VEGFA

VEGFB

VEGFC

Expression levels compared to non-treated BeWo cells

Növekedett (>1.5x)

Csökkent (<0.5x)

BeW

o +

H-E

V

BeW

o +

P-E

V

BeW

o

0

5

1 0

1 5

2 0

re

latí

v m

RN

S e

xp

re

ss

zió

**

**

Változtatlan

Nem detektált

MMP2VEGFB

EV INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT (2)

BeW

o +

H-E

V

BeW

o +

P-E

V

BeW

o

0

5

1 0

1 5

2 0

re

latí

v m

RN

S e

xp

re

ss

zió

**

**

ANOVA, p<0.05, Dunnett’s test

MEGBESZÉLÉS

KÖVETKEZTETÉS

Az eltérő keringő extracelluláris vezikula mintázat kiváltotta funkcionálishatásaira (trophoblast inváziós képességét) részben magyarázatot ad a megfigyelt adhéziós génexpressziós változás (növekedett VEGFB, TGFB1, csökkent MMP2).

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Extracelluláris vezikula csoport

Prof. Dr. Buzás EditDr. Pállinger ÉvaDr. Wiener ZoltánDr. Tamási ViolaDr. Pap ErnaFekete Nóra

Kemotaxis csoport

Dr. Kőhidai LászlóDr. Láng OrsolyaDr. Lajkó EszterKrausz Máté

Dr. Turiák Lilla

Prof. Kittel Ágnes

MTA Természettudományi Központ

SE I. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika

Prof. Dr. Rigó JánosDr. Alasztics Bálint

Kísérletes Orvostudományi Központ

SE Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet

Köszönöm a megtisztelő figyelmet!