KLNK BYOKMYALABORATUVARLARINDA ANALZ (HORMON TAYNYNTEMLER)

Dr. Beyhan MERTF Klinik Biyokimya MerkezLaboratuvar

*Tbbi Laboratuvar Tanm*Hata kaynaklar*Hormon tayin yntemleri

Tbbi Laboratuvar

*Hasta rneklerini kullanarak; tansal testlerinseilmesi, gerekletirilmesi ve yorumlanmas ileilgilenen alan

*Bu alann kapsamna kliniklere verilen hizmetinyan sra aratrma, idari iler ve eitimaktiviteleri girer

*

*Klinik Biyokimya*Klinik Kimya*Klinik Patoloji*Laboratuvar Tbb*Tbbi Biyokimya

*Hastane bnyesindeki ilk laboratuvar 1886daMnihte kurulmutur

*A.B.Ddeki ilk tbbi laboratuvar 1895tePensilvanya niversitesinde almtr

* Tbbi Laboratuvar klinisyenlere ukonularda bilgi salar:

1. Klinik bir phenin dorulanmas (tan koymak)

2. Dnlen tandan uzaklalmas

3. Tedavinin seimi ve izlenmesi

4. Prognozun belirlenmesi

5. Klinik bulgularn yokluu durumunda hastalk iin taramasalanmas

* Laboratuvar, salk hizmetlerinde merkezibir konuma sahiptir

*Tbbi kararlarn %70i laboratuvar sonularnagre verilmektedir (Silverstein, 2003)

*Buna karlk, total salk harcamalarnn sadece%3.5unu laboratuvar masraflar oluturmaktadr(IOM, 2000)

* Test srecinin aamas vardr:

*Preanalitik faz

*Analitik faz

*Postanalitik faz

*Pre-analitik: Testlerin istenmesi ve rneklerintoplanmas

*Analitik: rneklerin otoanalizrlerde allmasile test sonularnn elde edilmesi

*Post-analitik: Sonularn deerlendirilipraporlanmas

Karlalan Hatalarn Dalm,

*Preanalitik 62-87*Analitik 4,35- 15*Post analitik 11,3-23

En sk karlalan preanalitik hatalar;

I. Uygun olmayan numune(hemoliz,pht, lipemivs)

II. Hasta Kimlii veya Barkod hatasIII.Transport HatasIV.Test istei hatas.

Preanalitik hatalarn %80 gibibir ksm laboratuvar d hatalardankaynaklanmaktadr.

*

Analitik performans ve verimlilieodaklanmak;Bu sreteki her aamann kolaylklaizlenebilir olmas;Teknolojinin gelimesianalitik hatalar olduka azaltmtr.

14

*Analitik Sre kontroln;

Laboratuvar ii kontrolLaboratuvarlar aras kontrollke dzeyinde kalite

kontrolUluslararas denetim

nternal kalitekontrol

Eksternalkalite kontrol

*POSTANALTK SRE:

*Bilgi ilem Sistemleri*Otomatik Aktarm ve*Manuel Sonu Girileri

* Preanalitik Faz: rnek analizinden nceyaplmas gereken tm ilemler

*Hasta ile ilgili deikenler*rnek toplama teknikleri*Antikoaglanlar ve koruyucu maddeler*rnein tanmas* " ilem grmesi* " saklanmas

*Preanalitik deikenler

*Kontrol edilebilenler (etki sresiksadr)

*Kontrol edilemeyenler

*Kontrol edilebilen deikenler

*rnek toplanmas ile ilgili deikenler

*Fizyolojik deikenler: postr, uzun sreli yatakistirahati, egzersiz, sirkadiyen varyasyon, seyahat

*Diyet: yemek, vejeteryenlik, malntrisyon, alk

*Yaam biimi: sigara, alkol, ila, bitkisel preparatlar

* Fizyolojik Deikenler

*Postr: Yatar durumdan dik duruma geite kanhacmi (plazma) %10 azalr

*Uzun sreli yatak istirahati: Sv retansiyonusonucu plazma protein ve albumin konsantrasyonuazalr

*Egzersiz: Kan glukoz, laktat dzeyleri ile CK,AST, LDH aktiviteleri artar

*Sirkadiyen varyasyon: Kortizol, TSH

*Seyahat: 10 zaman dilimi aldnda diurnalritmin geri dnmesi iin 5 gn gerekir

*Diyet

*Yiyecekler:- Yksek proteinli diyet serum ve idrardaki re

ve rik asid dzeylerini artrr- Kolesterol almnda %50 art serum dzeyini

sadece 5-10 mg/dL ykseltir

- Yemek sonras en ok glukoz,demir ve total lipidartar

- Kafein adrenal medullay uyarr

*Kontrol edilemeyendeikenler

*Biyolojik etkiler: ya, cinsiyet, rk

*evre faktrleri: ykseklik, vcut scakl,yaanlan yer

*Uzun sreli siklik deiiklikler: mevsimler,menstrel siklus

*Altta yatan medikal durumlar: obezite,gebelik, stres, ate, ok ve travma, transfzyonve infzyonlar

*

*Kan

*Tam kan*Serum*Plazma

*Arterial (Kan gaz, pH )*Venz (Biyokimya, hormon)*Kapiller*Tup / hct*Filter paper / yeni doan tarama

* Antikoaglan ieren tbe kan alnr

*Plazmann serumdan fark fibrinojeniermesidir.

*Kullanlan Antikoaglanlar

*EDTA: hematolojide hcre saym ve morfolojisi(K2EDTA ve K3EDTA,etilen diamin tetra asetat)Mor kapakl

*Sodyum sitrat: koaglasyon (0.105 M veya 0.129M, kan/antikoaglan: 9/1)

Mavi kapakl

*Kullanlan Antikoaglanlar

*Sodyum sitrat: sedimentasyon (4/1)Siyah kapakl

*Heparin ( Sodyum veya Lityum heparin )Yeil kapakl

*Sodyum florr: glukoz lm Gri kapakl(glikolizi 3 gn sresince engeller)

*Kan Alma Sras

Kapak Rengi erik

Kltr SterilAk mavi Sodyum sitratSar Jel ayrcl, pht aktivatrlKrmz Pht aktivatrlYeil HeparinMor K2 veya K3EDTAGri Glikolitik inhibitr (Na Florr)

*

*rnein reddedilmesini gerektirensebepler:

*Etiketlenmemi/yanl etiketlenmi rnek*Uygun olmayan tp*Eksik/fazla kan alnmas*Uygun olmayan transport ve saklama koullar*Alk durumunun gereklememesi*Hemoliz (LDH, AST, K+) veya lipemi*Antikoaglanl rnekte pht bulunmas

*

* Post-analitik Faz

*Laboratuvarn bir sonu retmesinden sonratbbi bir karar verilebilmesi iin sonucunyorumlanmas gerekir

*Sonular normal veya patolojik olarakyorumlanr

* Referans Aral

*Hasta olmayan veya normal kiilerdenolumu bir poplasyona ait lmlerinmerkezdeki %95ini temsil eden deer aral

*Doruluk ve Kesinlik

*lm doruluu: Bir sonucun gerek deere nekadar yaklatnn ltdr

*Kesinlik: Sonularn tekrarlanabilirliinin birlsdr

*Kalite Kontrol

*Performans parametrelerini kontrol altndatutmak iin kullanlan teknikler ve ilemler grupta incelenir:

- Preanalitik deikenlerin kontrol- Analitik deikenlerin kontrol

(metodoloji, kalibrasyon)- Analitik kalitenin istatistik metotlar ve

kontrol grafikleri ile izlenmesi

* Analitik Kalitenin KontrolMateryalive Kontrol Grafikleri ileTakibi

*Kalite kontrol amac ile kullanlan rneklerekontrol materyali denir

*Stabil, sv veya liyofilize, insan veya srdan eldeedilmi, nceden allarak ortalama ve SDdeerleri saptanmtr

*Kontrol materyalinin bulunan deerleri, bilinendeerleri ile kontrol grafikleri aracl ilekarlatrlr

*Kontrol grafikleri klinik biyokimyalaboratuvarna 1950de Levey ve Jenningstarafndan tantlmtr

Levey-Jennings grafii

* Eksternal Kalite Kontrol

*nternal kalite kontrol tek bir laboratuvarnanalitik metotlarnn doruluk ve kesinliinignlk olarak deerlendirirken eksternal kalitekontrol eitli laboratuvarlarn uzun vadedekiperformansn gsterir

*Sensitivite: Hastaln bulunduu kiide pozitifsonu kma olasl

*Spesifisite: Hastaln bulunmad kiide negatifsonu kma olasl

*Tarama testlerinin sensitivitesi, konfirmasyontestlerinin ise spesifisitesi yksek olmaldr

*POSTANALTK SRE:

*Bilgi ilem Sistemleri*Otomatik Aktarm ve*Manuel Sonu Girileri

Analitik hizmetlere talep arttka,

analiz sreci nce makinelemi,en sonunda da otomasyona geilmitir

Tekrarlayc ve monoton ilemler teknisyeninsklmasna ve dikkatinin dalmasna yol aar

Bu da analiz hatalarna ve sonularda varyasyonasebep olur

Son yllarda birok kk laboratuvar, igcnden kaynaklanan masraflar azaltmakamac ile konsolidasyona gitmitir

*Klinik Biyokimyada Otomasyon

Testlerin, teknisyenin minimum katksngerektirecek ekilde,

laboratuvardaki otoanalizrler vernei analize hazrlayan cihazlar kullanlarakyaplmas demektir

*Laboratuvarda OtomasyonunGetirileri

Test bana den maliyet azalr

rnek kapasitesi, igc ile orantsz olarak artar

dn sresi azalr ve stabil olur

Biyolojik tehlikeye daha az maruz kalnrHastanede yatma sresi ksalr

Laboratuvar otomasyon cihazlarnn retimi1950lerde, testlere olan taleplerin dramatikbiimde artt dnemde balamtr

Laboratuvar otomasyonu, retim endstrisindekigelimeler ile paralel olarak evrim geirmitir

Sabit otomasyonProgramlanabilir otomasyonZeki otomasyon

lk continuous flow analizrSkeggs LT Jr. An automaticmethod for colorimetricanalysis. Am J Clin Pathol 1957;28:311.

Model IISkeggs LT Jr. Persistence . . . and Prayer: Fromthe Artificial Kidney to the AutoAnalyzer. ClinChem 2000; 46:1425-36.

*Robot Teknolojisi1980lerde, Klinik laboratuvarlarda endstrideki robotik otomasyondan eyrek yzylsonra, kullanlmaya balanm

Mikroilemci kontrolndeki robotik kollarngelitirilmesi ile rnein birok aamada ilemgrmesini salamak zere programlama mmknolmu

*Otomasyon TipleriTotal Otomasyon (TLA)

lk model 1980lerde Japonyada kurulduPreanalitik otomasyon, rneklerin cihaz zerindetanmas, otomatik pipetleme, allan rneklerindepolanmas gibi ilevlere sahiptir

Yksek maliyetlidirModler Otomasyon

1990larn ortalarnda analizr, ISE, tama bant gibiotomasyon paralar ayr ayr pazarlanmaya baland

*Birletirilmi veya ModlerOtomasyon Sistemleri

rnek yerletirme blm, barkod okuma istasyonlar,rnek kontrol, santrifj,kapak ama ,alikotlama, tekrar kapama, tama, snflandrma, cihaz ile fiziksel balant, ii biten rnei saklama, uzun sreli depolama

*LIS (Laboratuvarnformasyon Sistemi)1960 sonlar 1970 balarnda sadece sonu

raporlarnn birletirilmesi iin planlanm

Bugn eitli ilevleri var:rnek bilgilerini analizrlere yollar ak bilgilerini operatre iletirAnalizrlerden gelen test sonularn alr ve denetler

Analizrler ile LIS arasnda direkt elektronikarayzler bulunur

Laboratuvar lm metodlar

1- k iddetinden faydalanlarakyaplan lmler2- iyon selektif elektrotlar (ISE)3- trbidimetri4- nefelometri5- florometri6- dk konsantrasyonlumaddelerin lm7- elektroforez8- kromotografi

Dk konsantrasyonlumaddelerin lm

Ortamdaki madde konsantrasyonu ok dkolduunda, birok yntem kantitatif lm iinyetersiz kalr.Bu durumda,

1. enzim immunoassay2. radyoimmunoassay (RIA)3. kemilminessans

yntemleri kullanlr.

*mmun yntemler:Numunedeki analit dzeyini, spesifik balayc bir molekllekompleks oluturarak ler.

Balayc molekl analite spesifik bir antikordur (veya ift antikor)Meydana gelen kompleks bir sinyal oluturur.

Bu kalibrasyon erisi kullanlarak miktar tayinine geilir.

Oluan immn reaksiyon farkl iaretleyiciler seilerek farklteknolojilerde kullanlr

nemli: Her yntem farkl interferanslardan etkilenebilir.

*MMUNOASSAY TESTLER*aretli antikorlarn kullanlmasyla 1942de;

FA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar) 1954de;

IFA (ndirekt Fluoresan Antikor) 1960da;

RIA (Radyoizotopla- iyotla) 1970de;

EIA (enzimle) kullanma girmitir Antikor yada antijen saptamak iin

kullanlrlar

*

I- mmun Fluoresan (IF) testler

*FLUORESANS Fluorokrom veya florofor boyalarn Ultraviyole k altnda Ik enerjisini emerek Bu enerjiyi farkl dalga boyunaevirmesine denir

* II-Radioimmuno Assay (RIA)

*Yntem ayn IF ve EIA gibidir*Antikorda iaretliyici madde olarak Radyoaktif madde I. 125 ve I. 132 kullanlr

Gamma sayalarnda deerlendirilir Radyoaktif madde kullanmndan dolaysnrldr zellikle hormon testlerinde (TSH, T3, T4) kullanlr

III. Enzim immunoassay:

ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)EIA (enzyme immunoassay)gibi isimleri vardr.

Prensip: antijen-antikor arasndaki reaksiyona dayanr.aretli antijen ile iaretsiz antijen, antikorla reaksiyonagirmek iin yarrlar. Tayin etmek istediimiz iaretsizantijendir. aretleyici madde olarak enzim kullanlr.Alkalen fosfataz en ok kullanlan enzimdir. Reaksiyontamamlandktan sonra ortama bir substrat eklenerekspektrofotometrik olarak enzim aktivitesi llr.

kemilminessans

Prensibi RIAya benzer. Ancak burada iaretleyicimadde olarak radyoizotop yerine reaksiyonagirdiinde k yayan madde yani kemilminesanmadde kullanlr.

*ELISA sisteminin alma prensibi nedir ?

*Spesifik bir antijen/antikorun spesifik bir antijen/antikorabalanmasnn, enzim bal bir baka antikor/antijentarafndan tespit edilmesine dayanmaktadr

*Test sisteminin dizaynna bal olarak hem antijen hemantikor varln tespit etmek mmkndr.

*Eer aradmz analit test edilen serumda mevcut ise,yaplan inkbasyon esnasnda plaa kaplanm antijen veyaantikor ile balanr .

* Yaplan ykama ilemiyle plaktan ayrlmaz.

* Kuyucuklara konjugat eklenip belli bir sre inkbeedildiinde, plakta balanm antijen veya antikor ileenzim balanm antikor veya antijen balanr.

*Yaplan ikinci bir ykama ilemi ile balanmamkonjugat kuyucuklardan uzaklatrlr.

* Eer ortamda enzim mevcutsa, eklenen substrat ileenzim reaksiyona girer ve oluan renk younluuspektrofotometrik olarak llr.

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbend Assay)

*Antikoru ENZMLE ARETLEME yntemidirPeroksidaz, alkali fosfataz ve beta galaktozidaz gibi

enzimlerSpesifik substratlar renkli rnlere evirirlerRenkli rnler spektrofotometrede belirli dalga boylarnda

olurlar*Yntemin;Kullanlan reaktifler uzun mrl olmasArtk maddelerle ilgili radyasyon sorunu olmamasUygulamasnn basit ve otomatize edilebilmesi ynleriyleAyn prensipli (iaretleme) RIA ve IFye gre avantajldr

*Antijen veya antikorun eitli vcut svlarnda

Baz ELIZA uygulama ekilleri:

1)NDREK ELIZA ile Ab Tayini

*Ag kapl kuyucuk*Hasta serumu (Aranan Ab)*Ykama*Enzim iaretli ikincil Ab*Ykama*Substrat*H2SO4 (Reaksiyonu durdurur)*Spektrofotometre

*UYGULAMA CHAZ SSTEMLER*MKROELSA TEMELL AIK SSTEMLERKlasik Cihazlarlk yllarda kullanlan bamsz ykayc ve okumacihazlarndan ibaret sistem

Yar Otomatik veya Tam Otomatik Cihazlarrnek ykleme, Ykama ve okuma cihazlar entegresistemler

*MAKROELSA TEMELL KAPALI SSTEMLER

*alma sistemleri ve Prensipleri;Kapal bir cihaz ve bu cihazda almaya uygun kitler ile cihaza bal

bilgisayar ve yazc.

*Piyasada en sk bulunan sistemlerde kullanlan kitler;

Enzyme-linked flureskent assay (ELFA)Mikro partikl enzim immuno assay (MPEIA)Fluoresan polorizasyon immuno assay (FPIA)Chemiluminescent Assay (CA) yntemleri ile almaktadr.

*Bu sistemlerin;*BALICA AVANTAJLARIDuyarllk ve zgllkleri yksektir.Tam otomatik (inkbasyon, ykama, reaktif pipetleme ilemleri) 24

saat kesintisiz almaktadrlar. Ak sistemlere gre kontaminasyon,teknisyen hatalar son derece azalmaktadr.

Random acces(Rastgele eriimli) ok sayda farkl testi ayn anda ve aralkl yapan sistem stenilen bir test istenilen bir rnekten istenilen bir

durumda(acil)yapabilmeye uygun

STAT girili (tek rnek ve bir rneklik reaktif kullanm) olmalardr.Reaktif kompartmanlarnn 2-8 0C sahip olmalardr ve cihazlarda atk

torbalarnn olmas.

Bunlarn yannda gerek cihaz donanm gerek kitlerin hazrlanmatekniklerine ilikin olarak avantajlar vardr.

*DEZAVANTAJLARI

Kurumu tek cihaza ve buna bal olarak tek kitezorunlu klmalar

Ak sistemlere gre pahal olmalar

Antijen-antikor ilikisi

rnek ile kapl yzey(antijenler)

Nonspesifik proteinledoldurulmamblgelerin bloklanmasSpesifik antijene kar1.cil antikorlainkbasyon

Enzim bal antijen ileantikor kompleksi

substratSpesifik antijenin varlnGsteren renkli rnnoluumu