Klinik Toksikolojide Laboratuar

Prof. Dr. Ali ÜNLÜ

İçerik

• Klinik toksikoloji laboratuarı• Acil toksikoloji için laboratuar• Toksikolojik analizlerde metodoloji• Toksikolojik analizlerde standardizasyon

• Analit;– Adli ilaç, uyuşturucular– TDM– Bilinmeyen ilaçlar

• Metodoloji– Hızlı tarama testleri (pozitif, negatif)– Semikantitatif analizler– Kantitatif analizler– Doğrulama analizleri

Toksikoloji-Hastane• Klinik laboratuarlarda toksikoloji hizmeti;

– Acil intoksikasyon– Terapötik ilaç izlemi (TDM)

• Klinik laboratuarlarda acil toksikoloji hizmeti 2 basamak olarak değerlendirilmelidir:– 1. Basamak;

• Belirli ilaçlar için kantitatif serum yada plazma testler ve kalitatif idrar analizleri yapılmalıdır.

• Acil test parametreler,• Olası ileri testler için örnek saklama.

– 2. Basamak; daha komplike ve zaman alıcı bir seri analizi içeren pahalı ve kapsamlı bir basamaktır. Eğer ilk basamak analizi ile toksik etkiyi yaratan etken bulunamadıysa ve hastanın medikal problemleri hala devam ediyorsa önerilir.

1. Basamak Analizler; Acil Testler• Serum/Plazma Kantitatif

– Asetaminofen– Teofilin– Valproik asit– Karbamezapin– Digoksin– Fenobarbital – Lityum– Salisilat– Ko-oksimetre– Demir– Transferrin yada DBK– Etil alkol– Metil Alkol?, Etilen glikol?

• İdrar Kalitatif– Kokain– Amfetamin,– Opiat– Barbutirat

National Academy of Clinical Biochemistry (NACB, USA), Association of Clinical Biochemistry (ACB, UK) Rehber.

1. Basamak Analizler; Parametreler

• Acil toksikolojide;– anyon açık, – osmolar açık, – kolinesteraz– karaciğer enzimleri, – kardiyak enzimler, – kalsiyum, – sodyum, potasyum, – glukoz, – CRP– Protrombin zamanı yaygın olarak kullanılan parametrelerdir.

1. Basamak Analizler• Hem spesifik ilaç analizleri hemde rutin acil

parametreler için önerilen TAT 1 saat (örnek kabulünden sonra).

• Ağır metaller ve diğer olası toksinler için uygun örnek alım ve saklama konusunda laboratuar desteği.

National Academy of Clinical Biochemistry (NACB, USA), Association of Clinical Biochemistry (ACB, UK) Rehber.

2. Basamak Analizler• Hastaneye gelen intoksike, komada yada bitkin ve 1.

basamak analizleri ile tespit edilemeyen laboratuar testleridir.

• Komplike ve zaman alıcı analizlerdir.• Laboratuar ve acil klinik çalışanları bu test menüsünü

ve TAT beraber belirlemelidir. • Bu testlerin analizi klinik toksikolog ile birlikte

değerlendirilmelidir.

2. Basamak Analizler• Fenotiazinler, • Kalsiyum kanal blokerleri, • Beta blokerler, • Hipnotik ve trankilizanlar (chloral hydrate,

ethchlorvynol, glutethimide), • Antikolinerjik ilaçlar drugs (atropin), • Kas gevşeticileri (carisoprodol, cyclobenzaprine), • Antidepressantlar (fluoxetine), • Davranışı etkileyen ilaçlar (clonidine,

methylphenidate), • Anestezik ilaçlar (ketamine), • Analjezikler (fentanil).

2. Basamak Analizler-Metodoloji• Metodoloji; idrar

– İnce tabaka kromatografisi (TLC), – Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), – Gaz kromatografisi (GC), – Gaz kromatografi kütle spektrometri (GC-MS veya

GC-MS/MS)– Sıvı kromatografi kütle spektrometri (LC-MS veya

LC-MS/MS). • Klinik laboratuarlar ciddi anlamda hizmeti ve

test masraflarını kısma baskısı altında

Pratikte!• Klinik laboratuardan tüm bu ilaçların analizini beklemek doğru değildir.

Tüm bu analizler için basit ve ucuz immünoassayler (IA) bulunmamaktadır.

• Halihazırdaki IA ciddi çapraz reaksiyon karşılaşılmaktadır;• Klinik laboratuarlar

– Sempatetik (kokaine, amfetamin)– Sedatif (benzodiazepin, trankilizanlar ve barbutiratlar)– Halüsinasyon yapanlar (Tetrahidrocannabinoidler (THC), LSD, PCP)Şeklindeki sınıflamalar ile ilaç analiz kombinasyonlarını oluşturabilirler

(Toksidrom). Klinikten net klinik bilgi önemli. Kliniğe göre yapılan doğru analiz isteği doğru sonuca daha çabuk ulaşmak demektir.

• Klinik pratikte gastrik sıvı analizi işlevsel değil. Adli vakalarda önemli olabilir.

• Hastane laboratuarlarının primer amacı teşhis ve tedavi amaçlı ilaç analizlerinin yapılmasıdır. Klinik toksikoloji laboratuarında saklama-transfer zincir dökümantasyonuna gerek yoktur. Adli vakalar için gereklidir.

Klinik/Adli Amaçlı Test• Klinik test tıbbi nedenler için yapılmaktadır. Örnekler hasta tanı

ve tedavisi için toplanmaktadır. • Örnekler bir seri resmi yazı ile gelmez. • Pozitif tarama testi tıbbi amaçlıda doğrulama analizlerine

genelde kullanılmaz. • Uyuşturucu analizlerinde doğrulama kullanılmaktadır. Doğrulama

kararı laboratuarcı veya klinisyen tarafından verilmelidir. • Klinik testler metil alkol, asetaminofen, salisilatlar, trsiklik

antidepresanlar, teofilin, valproik asit, fenitoin, karbamezapin, digoksin ve fenobarbital yaygın yapılan ilaç analizleridir.

• Sadece acile, polikliniğe yada klinikte yatan hastalara uygulanır. Hastalar komada olabileceği gibi şüpheli yüksek doz ilaç alımı, veya ilaç aşırı alımı ile ilgili davranışsal bozukluk içerenler olabilir.

• Laboratuar ilaç analizine başlamadan önce kesin amacını belirlemelidir ve bu analiz için detaylı rehberini hazırlamalıdır.

• Klinik amaçlıda olsa potansiyel mediko-legal durumlar için analiz prosedürlerinin hastanece onaylanması ve legal değerlendirilmsei gereklidir.

Preanalitik Faz• Uygun klinik-laboratuar kontağı; laboratuar uzmanı

test seçme ve sonuçları değerlendirmede gerekli konsültasyonu klinisyene verebilmeli.

• Örnek; – Ne kadar idrar örneği? Konsensus yok ama 30-40 ml idar

örneği testin tekrarı, dilüsyon, refleks testler ve doğrulama testleri için gerekli.

– Kan; standart 1 tüp genelde yeterli– Yüksek doz ilaç maruziyeti düşünülüyorsa tekrar analzi için

örneklemeler yapılıp laboratuara gönderilmeli. Bu klinisyenezehirlenmenin durumunu ve tedavisini düzenlemesine yardımcıolur. Örnek barkotlanması gerçek zamanı belirlemesiaçısından son derece önemlidir.

Analitik Faz• Başlangıç Tarama Testleri• Immunoassay• TLC• HPLC• GC• UPLC• GC-MS• LC-MS/MS• ….

Başlangıç Tarama Testleri (POCT)

• Kullanımı artan testlerdir. Genelde idrar numuneleri için kullanılsada serum ve tam kan gibi kompleks matriksi olan örnekler içinde üretilen kitleri vardır.

• Dipstik, kaset test, multitest kart şeklindedir. Hızlıca negatif/pozitif sonuç alınabilir ve genellikle laboratuar dışında kullanılır. Örneğin hemen alımından sonra kullanıldığı için analiz amaçlı örnek saklama gerektirmez. Sıklıkla immünassay tipinde olup ciddi spesifite problemleri vardır.

• Genellikle QC materyali içermez. QC içeren kitlerde ise kontrol hazırlanırken kullanılan antikorla ile daha sonrası için hazırlanan antikor lot farklılığı hatalı sonuçlara neden olabilmektedir.

• İdrar analizlerinde, idrardaki kan, menstruasyon, kullanılan diğer ilaç yada metabolitleri yanı sıra proteinüri varlığında ciddi interferans görülmektedir.

• Ticari kitler valide edilmelidir (CLSI EP 10, 12, 15 ve 21).• LOD ve LOQ, Kalitatif testlerdir ve cut-off değerleri firmalarca

belirlenmiştir. Kesinlikle değiştirilmemelidir.• Kullanımı kolaydır. Genelde TDM analizinden ziyade uyuşturucu analizleri

için dizayn edilmişlerdir.

• Kalite kontrol ilaç analizi için son derece önemlidir.• Klinik testler için rutin kalite kontrol yöntemleri yeterli iken adli

testler için daha titiz kalite kontrol prosedürleri uygulanmalıdır.– Rutin analiz için tek seviye kontrol yeterli iken– Adli test için en az 2 seviyeli QC gereklidir. Kontrolün birisinin

seviyesi cut-off konsantrasyonunu içermeli, ve donör örenği ile birlikte çalışılmalıdır.

• Adli test analiz raporları daha detaylı ve spesifik dökümanlar içermesi beklenmektedir.

• QC basamakların tüm preanalitik, analitik ve postanalitik basamakları kapsaması gerekmektedir.

•

İmmunassay• Sensitivite ve spesifite kısıtlılıklarına rağmen hala acil

toksikolojik analizlerde hala dayanak noktamız.• Laboratuar uzmanları spesifite-sensitivite

kısıtlılıklarından haberdar ama klinisyenler?• Ticari IA kitleri sınırlı yeni üretimler ?? • Laboratuar klinisyeni menü hakkında detaylı

bilgilendirmeli (TAT, çapraz reaksiyon…).• Nihai raporda

– Pozitif sonuç rapor edilirken kesinlikle çapraz reaksiyon veren moleküllerde rapora eklenmeli,

– Negatif idrar sonucunun uyuşturucu kullanımının yokluğunu gösteremeyeceği belirtilmelidir.

İmmunassay-Çapraz Reaksiyon• Komplike;

– Firmaların çeşit çeşit olması ve farklı ab kullanıyor olması (İhale sistemi?)

– Aynı firma bile olsa “lot to lot” kullanılan ab’ların çapraz reaktivitesinin değişebileceği (Firmalar internet sitelerinde çapraz reaktanları vermeli)

– Laboratuar metod modifikasyonuna gidiyorsa (örn dilüe edip maliyeti azaltma…) validasyon çalışmalarını kesinlikle yapmalı.

– İn Vitro IA intereferans çalışmalarında kesinlikle metabolitleride eklenmeli.

• IA kiti ana moleküle olup metabolitini yakalayamıyor ise “yalancı negatif”. Benzodiazepinler için IA kitleri yetersiz. İdrar örneklerine β-Glukronidaz uygulaması ile metabolit ayrıştırılabilir, zaman alıcıdır ve acil analizlerde uygulanamaz.

İmmunassay• Hook Effect; Yüksek analit

konsantrasyonu ab ile reaksiyona girip yalancı negatif sonuç verebilir.

• Heterofilik Ab

1. ab blokaj

Deteksiyon ab blokaj

Her 2 ab blokajı

İmmunassay

• İlacın serbest / bağlı formu– Digoksin %25 proteine bağlanır, serbest

kısmı aktif özelliğe sahip. Digoksin intoksikasyonunda digibin yada digifab tarzı bağlayıcı protein kullanılır. Her 2 proteinde digoksin ab ile ciddi interferans gösterir.

– Spirinolakton-digoksin interferansı– Digoksin benzeri endojen immünreaktanlar– Heterofilik ab (genelde yalancı pozitif)– Bitkisel ilaçlar/katkılar; digoksin ve diğer

ilaçlar ile ciddi interferans gözlenir.

İmmünassay/Bitkisel İlaçlar

İmmünassay/Bitkisel İlaçlar

• Vlachojannis et al. Pharmacol Res; 2011:63;254-256

• Sarı kantaron

Immunsuppressant

http://drugstestingbook.com/immunoassays-and-their-screening/cutoff-ranges-and-result-interpretation/

İmmünassay Çapraz Reaksiyon

Diazepam

• Diazepam• Nordiazepam• Temazepam• Oxazepam

Hem ilaç hem metabolit

http://drugstestingbook.com/immunoassays-and-their-screening/cutoff-ranges-and-result-interpretation/

İmmünassay Çapraz Reaksiyon

Opiat Tarama Analizi• Morfin IA analizidir.• Kodeine, hidrokodon, hidromorfon,

oksikodon, oksimorfon interferansı ab bağımlıdır.

IMMUNOASSAY

Güçlü Yönleri Yüksek verimlilikle

otomatize edilebilmeleri Numune ön hazırlığının

olmaması LIS sistemine kolay

bağlanma Lab ekipmanı ile uyumlu Diğer üretici firmalarla

performans karşılaştırılabilmesi

Düşük numune hacmi ile çalışabilmeleri

Zayıf Yönleri Reaktiflerin yüksek

maliyeti Üretici firma bağımlılığı Analitik ölçüm aralığının

dar olması Sensitivitelerinin

yetersiz olması Spesifite problemleri

(Hangi metabolit??) Diğer interferanslara

açık olma Panel halinde ilaç analizi

yapılamaması

GC-MS/LC-MS/MS

Güçlü Yönleri Az oranda reaktif kullanması Çok sayıda numune çalışma

kapasitesi İç standart kullanıldığı zaman

stabil olması Spesifite problemlerini en

aza indirmesi Analitik ölçüm aralığının geniş

olması Sensitivitesinin yüksek olması Ucuz işletme maliyetinin

olması Multipleks analiz

Zayıf Yönleri Başlangış cihaz maliyeti yüksek Klinik laboratuvarlarda genellikle

bulunmayan ölçüde yüksek deneyim gerektirmesi

Çoğunlukla metot geliştirme ve validasyonu gerektirmesi

Otomasyona uygun olmadığı için hasta sonuç verme süresinin uzun olması

Reaktiflerin standardize olmaması Metodoloji veya kalibrasyondaki

farklılıklar (Kıyaslama eksik) Yüksek örnek hacmi gerekebilir??

Postanalitik Faz Sonuç-IA• IA sonucu verilirken, kullanılan testin bir

"tarama testi" olarak kabul edilmesi gerektiği ve herhangi bir olumlu sonucun "varsayımsal" olduğu düşünülmeli (NACB Guideline 16).

• Her pozitif sonuç doğrulama analizine gitmemeli (NACB Guideline 17).

• Doğrulama gerekiyor ise laboratuar olay (adli) çözülene kadar örneği saklamalı, ve hastane risk yönetimi departmanına danışmalı (NACB Guideline 18).

Klinik Toksikoloji

İlaçlar (ağrı, antikonvülzan)

Klinik & Adli Toksikoloji

Etanol, Metanol

• Alkolometre, pratik, kesinliği ve doğruluğu iyi kabul edilen cihazlardır. POCT olarak acil intoksikasyonlarda kullanılabilir.

• Hastanede alkolometre kullanılacaksa seçiminde ve validasyonunda kesinlikle laboratuar uzmanı olmalı ve kalite kontrol basamakları uygulanmalı.

• Biyolojik sıvılardaki alkol analizinde çoğunlukla alkol dehidrogenazın kullanıldığı enzimatik ölçümler kullanılır.

• Alkol sonucu verilirken ünite kullanılmalı ve kesinlikle raporda kullanılan matriks (serum, plazma, tam kan) ve metodoloji verilmeli. Tam kan seruma oranla ~%12 daha düşük sonuç verir.

• Tükrük ve terde alkol analizi konusunda yeterince tecrübe bulunmadığından pratikte kullanılmaması önerilir.

• Serum yada plazmada metilen yada etilen glikol analizinin direk ölçümü önerilmektedir. GC kullanılacak ise ana toksik madde yanında toksik metabolit olan “glikolik asit” te ölçülmeli.

35

Teşekkürler