KLJUČNE REČI:

kvalitet semene tečnosti, spermatozoidi, morfologija, MSOME, IMSI, oksidativni stres, antioksidtivna suplementacija, muška neplodnost, asistirana reproduktivna tehnologija, IVF, ART.Sledi isti tekst kao gore, samo na španskom jeziku( prim. prev.)

UVOD

Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO) ukupna proporcija neplodnosti vezane za faktor muškarac, dostiže 46%. Nije iznenađujuće da su brojne publikacije sugerisale pad broja spermatozoida i drugih parametara semene tečnosti širom sveta ( Nelson&Bunge, 1974; Carlsen et. Al, 1992).

Nasuprot tim nalazima, druge studije nisu uočile ovaj pad, ili su uočile pad samo nekoliko parametara (Rasmussen et al., 1997; Acacio et al., 2000). Međutim, postoje veoma jaki dokazi da nekoliko podpopulacija, odnosno da određene države u svetu pate od smanjenog humanog fertiliteta. Iako su razlozi za ovo brojni i promenljivi, jasno je da je jedan od faktora koji tome doprinosi zagađenje životne sredine (Oliva et al., 2001; Multiger& Olivan, 2002).Ovo je posebno tačno kada su u pitanju države sa brzim ekonomskim industrijskim razvojem, kao što su tzv. BRICS države ( Brazil, Rusija, Kina, Južna Afrika). Tu su zaštita životne sredine i politika bezbednosti na radu još uvek popustljive, gradovi se neobuzdano razvijaju, odnosno poljoprivredni sektor je glavna grana privrede.

Prema godišnjem spisku najzagađenijih mesta u svetu koju je prezentirao institut Blacksmith, čak sedam od deset najzagađenijih regiona u 2007-moj godini može se naći u Kini, Indiji, Rusiji i Južnoj Americi (Blacksmith institut, 2007). Postoje razlozi da sepretpostavi da ovo povećanje zagađenosti životne sredine i široka upotreba biocida , ne samo da, generalno, utiče na zdravlje ljudi, nego posebno utiče baš na fertilitet, delimično usled endokrinih poremećaja, ali i usled povećanog oksidativnog stresa. Nekoliko ocena i studija iz sistema animalnog modela, a i populacione studije u područjima jake zagađenosti životne sredine u Južnoj Americi i Kini, podržavaju pretpostavke da fertilitet ljudi opada u tim regionima (Mohallem et al.,2005; Lichtenfels et al., 2007; Koifman et al.,2002; Huang et al., 2010).

U pogledu muškog fertiliteta, reprodukcija ne zahteva samo normalne parametre sperme u smislu koncentracije sperme i pokretljivosti, već je takođe neophodan i integritet genetske konstitucije spermatozoida. Iako je asistirana reproduktivna tehnologija (ART) pomogla da se prevaziđu određeni tipovi neplodnosti kod ljudi, reproduktivni kapacitetpolne ćelijeostaje u mnogome nepogođen ART procedurom. Imajući u vidu činjenicu da su mehanizmi ćelijske reparacije ograničeni kod hromatinski kondenzovane zrele sperme, intenzivna

SAŽETAK

Svrha:

Da se ispita uticaj suplementacije antioksidansima i mikronutrijentima na kvalitet semene tečnosti, procenjen putem MSOME kriterijuma (ispitivanje morfologije pokretnih organela sperme) u kolektivnoj ili in vitro fertilizaciji (IVF)

METODE:

Analiza sperme 160 IVF pacijenata je evaluirana 2-12 meseci pre podvrgavanja IVF/IMSI ( intracitoplazmatska injekcija morfološki selektiranog spermatozoida) ciklusu.Analizirani su sledeći parametri: volumen semene tečnosti, koncentracija sperme, pokretljivost i morfologija u skladu sa MSOME kriterijumom. Pacijenti su grupisani prema kriterijumu svetske zdravstvene organizacije (WHO) u normozoospermične, oligoastenoteratozoospermične (OAT), oligo i astenozoospermične muškarce, pojedinačno. Između prve i druge analize semene tečnosti, pacijenti su oralno tretirani dijetetskim antioksidativnim suplementom. Student-ov t-test je korišćen za ocenjivanje signifikantnosti podatka.Rezultati:Kod ukupnog broja pacijenata pronašli smo značajno smanjenje procenta nepokretnih spermatozoida i visoko signifikantanporast ukupne pokretljivosti spermatozoida nakon antioksidativne terapije. Takođe smo uočili značajno poboljšanje pokretljivosti, koncentracije sperme, kao i morfologije spermatozoida ( prema MSOME kriterijumu) u semenoj tečnosti oligozoospermičnih, astenozoospermičnih i OAT pacijenata. Kod normozoospermičnih pacijenata nismo našli skoro nikakav signifikantan porast parametara sperme.

ZAKLJUČCI:

Rezultati prikazuju značajno poboljšanje u pogledu kvaliteta semene tečnosti, kao što su pokretljivost, koncentracija sperme i morfologija, nakon dijetetske suplementacije, što je primećeno kod IVF pacijenata sa lošim kvalitetom semene tečnosti. Poboljšanje kvaliteta sperme IVF pacijenata može imati ključni uticaj u asistiranoj reproduktivnoj tehnologiji (ART). Naši nalazi sugerišu da suplementacija mikronutrijentima može generalno biti korisna za kvalitet semene tečnosti kod muškaraca koji se podvrgavaju ART, ali uglavnom kod onih sa većim stepenom izmena u pogledu parametara njihove sperme. Sugerisani modul dejstva je verovatno takav zahvaljujući padu oksidativnog stresa.

još uvek malog broja kliničkih podataka, efikasnosti različitih antioksidanasa, primenjenih doza, analize parametra semene tečnosti , tipova neplodnosti, i, verovatno, usled heterogenosti ispitivanih podpopulacija.Studija koja je ovde predstavljena imala je za cilj da ispita dali se kvalitet semene tečnosti (posebno morfologija sperme prema MSOME kriterijumu , kao i u pogledu razlika muškog fertiliteta) IFV pacijenata može poboljšati dijetetskom suplementacijom koja sadrži definisane antioksidanse.

MATERIJAL I METODE

U periodu od januara 2008 do jula 2011, u ovu studiju je uključeno ukupno 160 pacijenata iz naše IVF klinike u Bregencu , Austrija. Uzorci semene tečnosti pacijenata koji su prolazili IMSI (intracitoplazmatska injekcija morfološki selektiranim spermatozoidom) cikluse su analizirani u pogledu nekoliko parametra sperme, kao što su volumen ejakulacije, koncentracija sperme i pokretljivost u skladu sa kriterijumima WHO ( WHO,2010).Pored toga , kvalitet semene tečnosti je ocenjivan i prema MSOME kriterijumu ( izmenjeno od Vanderzwalmen et al.,2008). Selektiranje spermatozoida je urađeno pri uvećanju od 6000x pod invertovanim mikroskopom tipa Normanski interferential Leica AM 6000 ( Leica, Nemačka). Sperma stepena I je definisana prema normalnom obliku i veličini spermatozoida, bez vakuola ili samo sa malim vakuolama <4% spermine glave, stepen II : normalan oblik i veličina ali velike vakuole <4% spermine glave, stepen III: velike vakuole <4% spermine glave i , osim toga, abnormalan oblik i veličina spermatozoida.

Za potrebe naše studije pacijenti su regrutovani u skladu sa sledećim kriterijumima: pristali su na dijetetsku suplementaciju, nisu imali nikakvih indikacija na azoospermiju i nisu imali nikakve , poznate genetske razloge za pojavu umanjene spermatogeneze ( kao što su hromozomske aberacije ili drugi genetski defekti). Osim toga, ovi pacijenti nisu bili izloženi zračenju ili hemoterapiji.

Nakon prve analize semene tečnosti pacijenti su oralno tretirani dijetetskim suplementima ( Fertilovit®

M plus ) i to u periodu od najmanje 2 meseca, a davana im je jedna kapsula dva puta dnevno ( supstance iz sadržaja ovog preparata su navedene u Tabeli br. 1). Različite komponente ovog preparata su opisane kao korisne u zaštiti sperme od oksidativnog oštećenja ili su opisani njihovi drugi, korisni efekti, pojedinačno. Uzorci semene tečnosti su ponovo ispitivani putem MSOME kriterijuma nakon uzimanja antioksidativne terapije u perioda od 2 do 12 meseci ( prosečna vrednosti 3,5 meseci). Do sada nisu primećena nikakva neželjena dejstva unosa suplementa.

izloženost ROS ili drugim štetnim supstancama ne samo što oštećuje integritet membrane sperme, pa time i pokretljivost i fertilizaciju, ona takođe utiče i na genetsku konstituciju sperme.

Iako još uvek nije nedvosmisleno jasno do koje mere ovociti mogu prevazići oštećenje DNK sperme nakon fertilizacije, u nekoliko studija se ističe da pro-oksidativno stanje ili umanjeni DNK integritet u semenoj tečnosti utiču na razvojnu sposobnost embriona (Silva et al., 2007; Agarwal & Allamaneni, 2011).

Dobro je poznato da izlaganje toksičnim supstancama značajno utiče na integritet DNK sperme. Pored toga, čak je i pokazano da je DNK sperme bila hipermetilirana kod miševa, kada su izloženi zagađenju vazduha (Yauk at. Al., 2008) Mada su epigenetska istraživanja još uvek mlada tema u nauci i dostupno je svega nekoliko podataka koji se odnose na epigenetske modifikacije sperme, brojne izmene DNK metilacije su povezane sa neplodnošću i posledicama po potomstvo (Jenkins & Carrel, 2012).

Propusti u genomu, odnosno propusti tj. greške utiskivanja u epigenom, reflektuju se lošim kvalitetom semene tečnosti. Sa druge strane , mnoge studije su jasno pokazale da poboljšani kvalitet sperme, posebno fine morfologije sperme i DNK integriteta, doprinosi boljem ishodu kod IVF pacijenata u smislu bolje fertilizacije i implementacije, kao i niže stope pobačaja, odnosno zdravlju potomstva (Vanderzwalmen et al., 2008; Lewis i Simon, 2010; Bartoov et al., 2003).

Obrnuto,ovi rezultati pokazuju da smanjen kvalitet sperme utiče na fertilizaciju, trudnoću i stopu odnošenja bebe kući, i to na negativan način. Dalje, i pored svog napretka ART, još uvek je, naravno, veoma prikladno omogućiti da se humana reprodukcija uradi na prirodan način. Iz tog razloga, bilo bi bolje imati adekvatne instrumente da se,na prvom mestu, zaobiđu problemi neplodnosti.

Iako se o tome još uvek raspravlja , sve više i više studija iz sistema animalnog modela, pa čak i klinički podaci, impliciraju da faktori stila života , kao što je ishrana, imaju veliki uticaj na kvalitet sperme, a posebno u pogledu ukupnog antioksidativnog kapacitet semene tečnosti ( Omu et al, 2008; Balercia et al.,2009).

U skladu sa tim , studije su pokazale korist antioksidativne , odnosno mikro- nutritivne suplementacije. Pored toga, prikazano je da unos vitamina, odnosno mikronutrijenata ublažava štetne uticaje na kvalitet semene tečnosti u sistemima animalnih modela, ko što je izlaganje toksičnim supstancama ( Cifti et.al,2011). U skladu sa ovim nalazima, pokazalo se neplodni muškarci imaju povećane nivoe reaktivnih vrstakiseonika (ROS) u semenoj plazmi i spermatozoidima, smanjen antioksidativni kapacitet(Zini et al.,1993) i povećan broj mitohondrijskih DNK mutacija ili nuklearne DNK fragmentacije ( Mahfouz et al.,2010, Kumar et al., 2009). Stoga se , na antioksidativnu ishranu uglavnom gleda kao na alatku za pomoć pri izbacivanju ROS i time poboljšanjukvaliteta sperme kod ljudi ili laboratorijskih životinja, ali ne bez kontroverzi. To može biti usled ,

SADRŽAJ DNEVNA DOZA / 2 KAPSULE

Vitamin C 100 mgVitamin E 100 mgFolna kiselina 500 μgCink 25 mgSelen 100 μgN-acetil-L-cistein 50 mgL-karantin 300 mgCitrulin 300 mgGlutatoin 50 mgLikopen 4 mgKoenzim Q10 15 mg

Tabela I: Supstance koje sadrži Fertilovit® Mplus

Preporučen dnevni unos za sve pacijente iznosi 2 kapsule.

Ukupni starosni rang ispitivanih pacijenata se kretao od 28 do 61 godina starosti ( prosečna vrednost 39,2). Koncentracija sperme i procenat pokretljivosti su ocenjivani na osnovu WHO kriterijuma (WHO,2010).Na osnovu ovih kriterijuma, pacijenti su podeljeni na klase i to : pacijenti sa normoozospermijom ( koncentracija sperme 15 Mio/ml i progresivna pokretljivost32%), OAT pacijenti ( koncentracija sperme < 15 Mio/ml i progresivna pokretljivost <32%) ili grupa pacijenata kod kojih je otkrivena ili oligozoospermija (koncentracija sperme <15 Mio/ml) ili astenoozoospermija ( progresivna pokretljivost <32%). Podaci su izraženi kao srednja ±standardna devijacija za parametarske promenljive i analizirani su putem Studentovog t-testa.

REZULTATI

Prema ovim kriterijumima, 65 pacijenata je bilo sa normozoospermijom (NO), 42 muškarca su bila u OAT grupi, 20 pacijenata je imalo ograničenja u pogledu broja spermatozoida (oligozoospermija), a 33 pacijenta su svrstana u grupu astenozoospermičnih ( videti Tabelu br.2). Prosečni broj godina starosti normozoospermičnih pacijenata je bila 39,2 godine, za OAT pacijente je to iznosilo 39,2, dok je za oligozoospermične i astenozoospermične muškarce taj broj bio 38,7, odnosno 39,2 godine starosti. Upoređivanjem parametara semene tečnosti sa rezultatima prve analize semene tečnosti, kod OAT pacijenata je otkrivena značajno manja ukupna pokretljivost spermatozoida, za razliku od ostalih grupa ( ukupna pokretljivost za OAT pacijente 21,8 ± 21,1 naspram 63,4 ± 12.0 kod normozoospermičnih pacijenata i 52,9 ±15,6 kod oligo i 36,1 ± 16,9 kod astenozoospermičnih pacijenata (Tabela 2a).

Druga analiza semene tečnosti je obavljena u toku perioda od 2 do 12 meseci trajanja antioksidativne suplementacije u IVF/IMSI ciklusima (prosečno trajanje: 3,2 meseca za OAT, 3,5 za normozoospermične pacijente i 3,4 meseca za oligo-

i astenozoospermične pacijente). Nakon dijetetske suplementacije, otkrili smo izvanredno manju kolicnu nepokretne sperme (stepen d) i značajan porast ukupne pokretljivosti kod ukupnog broja pacijenata (videti tabelu 2a).

Osim toga, moglo se uočiti visoko značajan porast progresivne i ukupne pokretljivosti kod OAT grupe u drugoj analizi semene tečnosti. Koncentracija sperme kod OAT pacijenata je takođe značajno porasla ( 2,6 Mio ±4.9 naspram 6,7 Mio ±9,6).

Štaviše, uočen je značajan porast kod sperme stepena a i stepena b, dok je procenat sperme stepena d (nepokretna sperma) značajno smanjen. Ostale izmene parametra sperme koje su analizirane prema kriterijumima WHO u ovoj podgrupi, sa izuzetkom volumena semene tečnosti, nisu bili signifikantni. Kod oligo- kao i astenozoospermičnih pacijenata , u drugoj analizi otkriven je značajno veći procenat sperme klase a. Obe podgrupe takođe pokazuju poboljšanje progresivne i ukupne pokretljivosti, mada ono nije značajno kod oligozoospermičnih pacijenata.Bez obzira na to, koncentracija spreme u grupi oligozoospermičnih pacijenata je značajno porasla. Na suprot tome, izmene parametara sperme normozoospermičnih pacijenata pokazale su trend rasta, ali bez značaja. U pogledu morfologije sperme prema MSOME kriterijumu, uočili smo značajan porast sperme sa niskom stopom vakuolizacije ( stepen I ) i pad sperme sa visokom stopom vakuolizacije, odnosno deformacija ( stepen III) sperme i to kod ukupnog broja pacijenata ( Tabela 2 b). Značajan porast sperme stepena I je takođe pronađen i u semenoj tečnosti oligo- i astenozoospermičnih pacijenata. Što se tiče OAT pacijenata, uočili smo značajan pad procena sperme stepen III. Nasuprottome, procenat sperme stepena I i stepena II je povećan, iako za stepen I to povećanje nije signifikantno. Ovi rezultati pokazuju da dijetetska suplementacija može biti veoma korisna i to ne samo u pogledupokretljivosti spermatozoida, već i u pogledu morfologije i integriteta sperme ( MSOME kriterijum)kod posebnih IVF grupa pacijenata.

DISKUSIJA

Predstavljena studija pokazuje poboljšanje morfologije sperme prema MSOME kriterijumu, kao i poboljšanu pokretljivost i koncentraciju sperme IVF pacijenata nakon oralne suplementacije antioksidansima i drugim mikronutrijentima. Najznačajnija korist je uočena kod IVF pacijenata sa umanjenim parametrima spreme. Brojne publikacije su već sugerisale da su ograničeni parametri sperme kao što su mali broj spermatozoida, loša morfologija ili nepokretljivost spermatozoida uzrokovani porastom reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) ili neefikasnim izbacivanjem ROS, kao i lošom ishranom, inflamacijom, godinama starosti ili izloženosti toksičnim supstancama i endokrinim

5.1 ±5.4

6.6 ±6.7

* 7.2 ±6.1

8.3 ±6.3

n.s. 3.4 ±3.2

10.8 ±7.5

* 5.1 ±5.2

8.4 ±7.0

* 2.6 ±4.0

5.0± 7.2

n.s.

39.7±15.5

42.9 ±14.6

n.s. 44.4±13.0

47.1 ±12.5

n.s. 47.1±12.2

43.9 ±9.0

n.s. 42.5±11.7

41.8 ±11.6

n.s. 26.9±15.7

37.4± 15.8

**

55.2±18.1

50.5 ±18.2

* 48.4±15.6

44.6 ±14.5

n.s. 49.5.0±14.4

45.3 ±10.2

* 52.4±13.1

49.8 ±14.8

* 70.5±17.7

57.6± 20.1

**

SVI PACIJENTI OLIGOZOOSPERMIČNI PACIJENTI

ASTENOZOOSPERMIČNI PACIJENTI

OATPACIJENTI

NORMOZOOSPERMIČNI PACIJENTI

Pre

tret

man

a

Step

en I

Step

en II

Step

en II

I

Pre

tret

man

a

Pre

tret

man

a

Pre

tret

man

a

Pre

tret

man

a

Posl

e an

ti-ok

sida

tivno

g un

osa

Posl

e an

ti-ok

sida

tivno

g un

osa

Posl

e an

ti-ok

sida

tivno

g un

osa

Posl

e an

ti-ok

sida

tivno

g un

osa

Posl

e an

ti-ok

sida

tivno

g un

osa

P- vrd P- vrd

P- vrd P- vrd

P- vrd

Tabela 2b. Rutinska ocena semene tečnosti pre i posle antioksidativne suplementacije

Oligoastenoteratozoospermija je definisana u skladu sa kriterijumima WHO.OAT= oligoastenoteratozoospermija; n.s. = nije signifikantno; * = p < 0.05; **= p < 0.01; *** = p < 0.001.

poremećajima ( Eskenazi et al., 2005). Antioksidansi , kao što su askorbinska kiselina, tokoferoli, karotenoidi i mikronutrijenti kao što je, npr. cink, koji je poznat kao kofaktor glutation peroksidaze i superoksid dismutaze (SOD1 o SOD3), su se pokazali kao ključno važni elementi za normalan kvalitet semene tečnosti i reproduktivnu funkciju u velikom broju studija, koje su obavljene ispitivanjem i životinja i ljudi ( Eskenazi et al. 2005.). Smatra se da oni deluju nasuprot štetnim efektima oksidativnog stresa na spermatozoide ( Ross et al. , 2010). Veliki broj studija je opisao korisne efekte antioksidativne terapije na kvalitet sperme ( pregledao Ross et. Al., 2010). Smatra se da su ti efekti zazvani zaštitom sperme u razvoju od štetnog dejstva oksidativnog tresa. Uprkos malom boju IVF pacijenata unutar podgrupa, ova studija je jasno prikazala efekte dijetetske suplementacije ne samo na konvencionalne kriterijume parametara sperme ( prema WHO), već i na MSOME kriterijume, a ona takođe opisuje i korelaciju

populacionih podgrupa i ishod u smislu poboljšanih parametara semene tečnosti. Dok su oligo-, asteno ili OAT pacijenti iskusili najveću korist od dijetetskog unosa, normozoospermični pacijenti su pokazali samo mala poboljšanja morfoloških parametara sperme, koja nisu signifikantna.

Ovi nalazi pokazuju da se ozbiljna restrikcija parametara semene tečnosti može odraziti većom neravnotežom nivoa ROS/antioksidans, verovatno izazvano razlozima životne sredine, stila života ili genetskim razlozima. Na primer, poznato je da se nenormalna ekspresija antioksidativno delujućeg enzima GPX4 u spermatozoidima smatra jednim od uzroka za nastanak oligozoospermije kod neplodnih muškaraca (Schneider et al., 2009; Chaborz et. Al,2010). Još jedan ključnih faktora je zagađenje životne sredine, koje se neprekidno povećavalo tokom poslednjih decenija, manje

u industrijalizovanim, ali posebno u razvojnim privredama. Pokazano je da većina toksičnih supstanci iz životne sredine umanjuju spermatogenezu u testisima indukujući reaktivne vrste kiseonika, odnosno slobodne radikale kiseonika ( Mathur & D’cruz, 2011). Ovo je važno , obzirom da se smanjenje parametara sperme i povećanje DNK oštećenja u spermi , nastalo kao rezultat oksidativnog stresa povezuje sa lošim reproduktivnim ishodima.

ZAKLJUČAK

Smatra se da konzumacija antioksidativne hrane kao što je voće, minerali ili esencijalne masne kiseline ima pozitivnu korelaciju sa kvalitetom semene tečnosti ( Braga et al., 2012). Tokom poslednje decenije, postajalo je sve jasnije i jasnije da, pored ličnih faktora,kao što su stil života, ishrana i genetske predispozicije, na kvalitet sperme takođe utiče i sve veće zagađenje i da faktori životne sredine i te kako utiču na humani fertilitet i potomstvo. Stoga, parovima koji žele da imaju decu, a posebno IVF pacijentima, treba savetovati da budu sasvim svesni štetnih uticaja faktora životne sredine i stila života, kao i uticaja njihovog ponašanja i navika u vezi ishrane, odnosno činjenice da dijetetska suplementacija može imati efekat podrške, naročito kada su u pitanju muškarci sa lošim kvalitetom sperme.

Korespodencija

Nicolas Herbert ZechTel.: +43-664-2843996. E-mail: n.zech@ivf.atRoemerstrasse 2, A 6900 Bregenz. Austrija

REFERENCES

Acacio BD, Gottfried T, Israel R, Sokol RZ. Evaluation of a large cohort of men presenting for a screening semen analysis. Fertil Steril. 2000;73:595-97. Agarwal A, Allamaneni SS. Free radicals and male reproduction. J Indian Med Assoc. 2011;109:184-87. Review.

Balercia G, Buldreghini E, Vignini A, Tiano L, Paggi F, AmorosoS, Ricciardo-Lamonica G, Boscaro M, Lenzi A, Littarru G. Coenzyme Q10 treatment in infertile men with idiopathic asthenozoospermia: a placebo-controlled, double-blind randomized trial. Fertil Steril. 2009;91:1785-92.

Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosovsky A, Yagoda A, Lederman H, Artzi S, Gross M, Barak Y. Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic morphologically selected sperm injection than with conventional intracytoplasmic injection. Fertil Steril. 2003;80:1413-19.

Blacksmith Institute, The World’s Worst Polluted Places: The Top Ten of the Dirty Thirty; 2007. Available at: http://www. blacksmithinstitute.org/.

Braga DP, Halpern G, Figueira Rde C, Setti AS, Iaconelli A Jr, Borges E Jr. Food intake and social habits in male patients and its relationship to intracytoplasmic sperm injection outcomes.Fertil Steril. 2012; 97:53-9.

Carlsen E, Giwercman A, Keiding n, Skakkebaek nE. Evidence for decreasng quality of semen during past 50 years. BMJ. 1992;305:609-13. Review.

Chabory E, Damon C, Lenoir A, Henry-Berger J, Vernet P, Cadet R, Saez F, Drevet JR.Mammalian glutathione peroxidases control acquisition and maintenance of spermatozoa integrity. J Anim Sci. 2010;88:1321-31. Review.

Ciftci O, Aydin M, Ozdemir I, Vardi n. Quercetin prevents 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxininduced testicular damage in rats. Andrologia 2011. doi: 10.1111/j.1439 0272i.2010.01126.x.

Ciftci H, Verit A, Savas M, Yeni E, Erel O. Effects of n-acetylcysteine on semen parameters and oxidative/antioxidant status. Urology. 2009;74:73-76.

Eskenazi B, Kidd SA, Marks AR, Sloter E, Block G, Wyrobek AJ. Antioxidant intake is associated with semen quality in healthy men. Hum Reprod. 2005;20:1006-12.

Huang CY, Yao CJ, Wan.g C, Jiang JK, Chen G,. Zhonghua nan Ke Xue. Changes of semen quality in Chinese fertile men from 1985 to 2008. 2010;16:684-88.

Jenkins TG, Carrell DT. The sperm epigenome and potential implications for the developing embryo. Reproduction. 2012;143:727-34.

Koifman S, Koifman RJ, Meyer A. Human reproductive system disturbances and pesticide exposure in Brazil. Cad Saude Publica. 2002;18:435-45.

Kumar R, Venkatesh S, Kumar M, Tanwar M, Shasmsi MB, Kumar R, Gupta nP, Sharma RK, Talwar P, Dada R. Oxidative stress and sperm mitochondrial DnA mutation in idiopathic oligoasthenozoospermic men. Indian J Biochem Biophys. 2009;46:172-77.

Lewis SE, Simon L. Clinical implications of Sperm DnA damage. Hum Fertil (Camb). 2010;13:201-7. Review.

Lichtenfels AJ, Gomes JB, Pieri PC, El Khouri Miraglia SG, Hallak J, Saldiva PH. Increased levels of air pollution and a decrease in the human and mouse male-to-female ratio in São Paulo, Brazil.Fertil Steril. 2007;87:230-32.

Mahfouz R, Sharma R, Thiyagarajan A, Kale V, Gupta S, Sabanegh E, Agarwal A. Semen characteristics and sperm DnA fragmentation in infertile men with low and high levels of seminal reactive oxygen species. Fertil Steril. 2010;94:2141-46.

Mathur PP, D’Cruz SC. The effect of environmental contaminants on testicular function. Asian J Androl. 2011;13:585-91. doi: 10.1038/aja.2011.40. Review.43, 121 – 8. doi: 10.1111/j.1439 – 0272.2009 .01032.x.

Mohallem SV, de Araújo Lobo DJ, Pesquero CR, Assunção JV, de Andre PA, Saldiva PH,Dolhnikoff M. Decreased fertility in mice exposed to environmental air pollution in the city of Sao Paulo. Environ Res. 2005;98:196-202.

Multigner L, Oliva A. Secular variations in sperm quality: fact or science fiction? Cad Saude Publica. 2002;18:403-12. Review.

Nelson CM, Bunge RG. Semen analysis: evidence for changing parameters of male fertility potential. Fertil Steril. 1974;25:503-7. Oliva A, Spira A, Multigner L. Contribution of environmental factors to the risk of male infertility. Hum Reprod. 2001;16:1768-76.

Omu AE, Al-Azemi MK, Kehinde EO, Anim JT, Oriowo MA, Mathew TC. Indications of the mechanisms involved in improved sperm parameters by zinc therapy. Med Princ Pract. 2008;17:108-16.

Rasmussen PE, Erb K, Westergaard LG, Laursen SB. no evidence for decreasing semen quality in four birth cohorts of 1,055 Danish men born between 1950 and 1970. Fertil Steril.1997;68:1059-64.

Ross C, Morriss A, Khairy M, Khalaf Y, Braude P, Coomarasamy A, El-Toukhy T. A systematic review of the effect of oral antioxidants on male infertility. Reprod BioMed Online. 2010;20:711- 23.

Schneider M, Förster H, Boersma A, Seiler A, Wehnes H, Sinowatz F, neumüller C, Deutsch MJ, Walch A, Hrabé de Angelis M, Wurst W, Ursini F, Roveri A, Maleszewski M, Maiorino

M,Conrad M. Mitochondrial glutathione peroxidase 4 disruption causes male infertility. FASEB J.2009;23:3233-42.

Silva PF, Gadella BM, Colenbrander B, Roelen BA. Exposure of bovine sperm to pro-oxidants impairs the developmental competence of the embryo after the first cleavage. Theriogenology. 2007;67:609-19.

WHO Laboratory manual for the examination and processing of Mhuman semen, Fifth Edition.2010.

Vanderzwalmen P, Hiemer A, Rubner P, Bach M, neyer A, Stecher A, Uher P, Zintz M, Lejeune B, Vanderzwalmen S, Cassuto G, Zech nH. Blastocyst development after sperm selection at high magnification is associated with size and number of nuclear vacuoles. Reprod BioMed Online. 2008;17:617-27.

Yauk C, Polyzos A, Rowan-Carroll A, Somers CM, Godschalk RW, Van Schooten FJ, Berndt ML, Pogribny IP, Koturbash I, Williams A, Douglas GR, Kovalchuk O. Germ-line mutations, DnA damage, and global hypermethylation in mice exposed to particulate air pollution in an urban/industrial location. Proc natl Acad Sci U S A. 2008;105:605-10.

Zini A, de Lamirande E, Gagnon C. Reactive oxygen species in semen of infertile patients: levels of superoxide dismutase- and catalase-like activities in seminal plasma and spermatozoa. Int J Androl. 1993;16:183-88.