KLONING GEN

OLEH : TIA OKSELNI (S2 KIMIA PMDSU)

DOSEN : PROF. DR. SUMARYATI SYUKUR

PENGERTIAN KLONING

Upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel

yang bukan sel alaminya

SYARAT KLONING :

ADANYA GEN DNA YANG AKAN DI KLONING

TEKNIK AMPLIFIKASI (PERBANYAKAN)

1. In Vivo : Kloning atau perbanyakan DNA dengan

bantuan makhluk hidup melalui perkembang biakannya

(ex: Bakteri)

2. In Vitro : Kloning tanpa menggunakan makhluk hidup

untuk amplifikasi nya (PCR; Polimerisasi Chain

Reaction)

TEKNIK IN VIVO

• Teknik untuk mengisolasi DNA

• Teknik untuk memotong DNA

• Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA

• Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan.

PERANGKAT UTAMA DALAM KLONING IN VIVO:

1. DNA yang akan di kloning

2. Plasmid

3. Enzim restriksi

4. DNA Ligase

5. Bakteri

TEKNIK PENGGABUNAN

TAHAPAN KLONING IN VIVO

TEKNIK IN VITRO (PCR)

PERANGKAT UTAMA DALAM

KLONING IN VITRO:

1. Template DNA

2. Primer

3. Enzim taq polimerase

4. Prekusor nDTP (AGTC)

5. Buffer (250 mM KCl, 50 mM

Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM

MgCl2)

TAHAPAN REAKSI PCR

Target DNA = 2n-2n

PEMURNIAN DNA (ELEKTROFORESIS)

Gel Agarosa = > 200bp

Gel Poliakrilamida = <200bp

JURNAL

PENDAHULUAN

Gula yang rendah Kalori

Ex : d-psicosa

Banyak manfaat

Enzim D-tagatose 3-epimerase

Diproduksi dari gula biasa (ex :

D-fruktose)

Jarang ditemukan

dialam

d-psicosa

Diisolasi dari Escherichia coli

JM109

Di ekspresikan oleh E. Coli (Top 10 dan

BL21)

METODE PENELITIAN

Bahan : Plasmid pET-15B, E. coli JM109, E.coli TOP 10 dan

BL21(DE3) Xho I and BamH I restriction enzymes and DNA

polymerase,ampisilin reagen PCR, dan Elektroforesis, reagen

induksi IPGT

Primer untuk amplifikasi PCR

Xho I

BamH I

PROSEDUR

Template DNA: E. Coli JM109

DNA DTE (Belum Murni)

PRODUK PCR : DNA DTE (Murni)

1. PCR AMPLIFICATION : GENE AMP PCR SYSTEM 9700

Diamplifikasi dengan alat PCR

- Dikonfirmasi dengan elektroforesis

(gel agarosa 1%)

- Bercak DNA DTE pada gel di ekstraksi

PROSEDUR

2. KLONING GEN DTE

- Di potong dengan enzim

XhoI dan BamH I

- Di masukkan ke

PRODUK PCR : DNA DTE (Murni) PLASMID pET-15b

pET-15b-DTE

E. Coli TOP 10

- Di screening dengan Ampisilin

E. Coli Resisten ampicilin E. Coli tak resisten ampicilin

(+) pET-15b-DTE

XhoI 5’-C’TCGAG-3’

Bam I 5′-G’GATCC-3′

PROSEDUR

2. EKSPRESI GEN DTE

- Di masukkan ke

pET-15b-DTE

E. Coli BL21 (DE3)

- Di induksi dengan penambahan isopropil-

beta-D-thiogalactopiranosida (IPTG)

- di sentrifuge(40C)

Pelet (Hasil Kultur/ E. Coli BL21 (DE3)

Larutan Hasil Suspensi

Ditambah buffer(50 mM Tris–HCl, 0.15 MNaCl, 20%

glycerol, pH 7.5) untuk resuspensi, Diaduk hingga

benar-benar larut

Disonikasi (pemecahan dinding sel)

Supernatan

dianalisa dengan SDS-PAGE

PROSEDUR

3. PEMURNIAN DTE PROTEIN (IMMOBILIZED METAL

AFFINITY CHROMATOGRAPHY)

Pelet (dari hasil sentrifuge 2000mL Kultur)

Supernatan

- Ditambahkan buffer (50 mM Tris–HCl,

0.15 M NaCl, 20% glycerol, pH 7.5)

Protein Campuran

- Diultrasentrifuge

Larutan hasil suspensi

- Disonikasi di es dan di sentrifuge

- Di masukkan ke

Protein Campuran

Kolom Ni Separase - yang telah disetimbangkan dengan Buffer 1

Protein Hasil rekombinan

dianalisa dengan SDS-PAGE

Dicuci dengan 5mL Buffer P1 4x dan Buffer P2

-dielusi @1ml berturut turut dengan :

a. 5ml Buffer 3(150 mM imidazole)

b. 5 mL Buffer 4(500 mM imidazole)

A5 A6 A7 A8 B9 B10 B11 B13 A4 B12

3. PEMURNIAN DTE PROTEIN (IMMOBILIZED METAL

AFFINITY CHROMATOGRAPHY)

PROSEDUR

3. PEMURNIAN DTE PROTEIN DENGAN FPLC

- Dimurnikan kembali dengan teknik FPLC

(Sephacryl S-200 150 ml, GE Healthcare,USA) in

PD10 column buffer (50 mM Tris–HCl, 0.15 M

NaCl, 5% glycerol, pH 7.5)

Protein dengan Ukuran > 10kDa

Fraksi 22-30

Dianalisa dengan SDS-PAGE

A5 A6 A7 A8 B9 B10 B11 B13 A4 B12

Digabung dan dipekatkan hingga 3mL dengan amicon

Filter 10 kDa

Diperoleh gen DTE = 789 bp (262 asam amino, 29.8 kDa)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sumber : Web NCBI (KJ958537)

27 bp= 1 kDa

SEQUENCE NUKLEOTIDA PLASMID PET-15B (5708BP)

Sumber : Web BVtech Search

LANJUTAN SEQUENCE NUKLEOTIDA PLASMID PET-15B (5708BP)

HASIL ELEKTROGRAM PROTEIN DARI PET-15B-DTE INDUKSI IPTG

EKSPRESI REKOMBINAN PET-15B-DTE

Terlihat intensitas warna

noda pada elektrogram

semakin bertambah

dengan pemberian IPTG

29,8 Kda

PEMURNIAN PROTEIN

Pemurnian dengan teknik IMAC kolom Ni Sepharase yang di elusi dengan

buffer P3 (150 mM imidazole) dan buffer P4(500mM imidazole) terlihat

protein mulai murni

Kolom dilengkapi dengan adsorben yang mengandung Ni2+, sehingga akan

berinteraksi dengan protein yang mengikat histidin. Protein rekombinan yang

telah dimodifikasi dengan adanyan His pada ujung rantai akan tertahan di

kolom.

Reaksi pengikatan tersebut reaksi reversibel, sehingga dapat dielusi dengan

peningkatan imidazole atau penurunan pH.

Pemurnian dengan FPLC = protein (terlihat satu peak dan satu noda pada

SDS-PAGE)

ELEKTROFORESIS SDS-PAGE (SODIUM DODECIL

SULFAT- POLIAKRILAMIDA GEL ELEKTROFORESIS)

Pembentukan muatan negatif pada protein

dengan penambahan SDS, sehingga dapat

bergerak pada proses elektroforesis