Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
KLONLAMA VEKTÖRLERİ
DR. ONUR YILMAZ
ADÜ ZİRAAT FAKÜLTESİZOOTEKNİ BÖLÜMÜ
BİYOMETRİ & GENETİK ABD
Vektörler, kendilerine eklenen yabancı DNA parçasınıkonakçı hücreye taşıyan ve burada çoğalmasınısağlayan küçük DNA parçalarıdır.
Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir.
Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir.
ori
Vektörde seçicilik sağlayan “marker genler” bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir.
• Bunlar; antibiyotik direnç genleri ya da
koloni rengini değiştirecek genler
olabilir.
• Vektör ve vektörün taşıdığı DNA parçası
konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir.
Plasmidler Bakteriyofajlar Cosmidler Bakteri Yapay Kromozomları (BAC) Maya Yapay Kromozomları (YAC) Memeli Yapay Kromozomları (MAC) İnsan Yapay Kromozomları (HAC) İfade Vektörleri
Günümüzde en sık kullanılan vektörler Plasmid Bakteriyofaj Cosmid Yapay Kromozomal vektörlerdir
1947-59 --Professor of genetics at the University of Wisconsin. Conducts research in the genetics of E. coli and Salmonella as well as on antibody formation. Discovers and names plasmids, particles of DNA
in bacterial cells that replicate separately from chromosomal DNA
Joshua Lederberg (1925-2008)
Plasmid, çoğu bakteri türünde doğal olarak bulunan,
Bağımsız olarak replike olabilen, Bakterinin kendi kromozomu
dışındaki çift zincirli halkasal veya süper sarmallı DNA molekülleridir.
• Plazmid varlığı genellikle bulunduğu bakteriye
avantaj sağlar.
• Bunlar; antibiyotiklere, ağır metallere ve olumsuz
çevre şartlarına direnç sağlayan genleri taşıyabilir.
• Klonlama vektörleri olarak kullanılan ilk plazmidler
1970’li yıllarda kullanılan ve E. coli’de doğal olarak
bulunan bakteriyel plazmidlerdi.
• Klonlanmak istenen DNA fragmanını, plazmid vektöre
aktarmak için restriksiyon enzimleri kullanılır.
Plazmid vektör
rekombinant plazmid
aynı restriksiyon enzimi ile kesim hedef DNA’nın
plazmid vektöre aktarılması
yabancı DNA segmenti
hedef DNA fragmanı
• Restriksiyon enzimleri ile kesilerek doğrusal hale
getirilen plazmid ile aynı yapışkan uçlara sahip
yabancı DNA fragmanı birbirlerine kolayca tutunur
ve birlikte tekrar halkasal forma dönerler.
Yapışkan uçlar
EcoRI
• Her restriksiyon enzimi yapışkan yapışkan uçlar
üretir mi?
• DNA ligaz enzimi, plazmid DNA'sı ile hedef DNA
fragmanının birbirlerine kovalent olarak sıkı bir şekilde
bağlanmasını sağlar.
rekombinant plazmid
DNA ligaz
hedef DNA fragmanı
Oluşturulan rekombinant DNA kendisini alabilecek
ve replikasyonuna olanak sağlayacak uygun bir alıcı
hücreye aktarılır.
• pBR322 plazmidinin alıcı
hücresi bu plazmidlerin ait
olduğu E. coli
• pUB110 plazmidi için
uygun alıcı hücre
Bacillus subtilis 'tir.
Plazmid vektör
+
Klonlanacak DNA fragmanı
DNA fragmanınınPlasmid vektöre
eklenmesiRekombinant
plazmid
E.coli ile plazmidCaCl2 ve ampisilinli nütrient
agarda inkübasyon
Plazmidi alamayanE. coli ölür
Plazmidi alan E. coli yaşar
Plazmidin replikasyonu
üreme
AmpR
Amp R.
ori
ori
• Yabancı DNA fragmanı, direnç genlerinden birini kodlayan bölge
içerisine yerleştirilirse, bu direnç geni insersiyonel olarak inaktive
olur.
DNA fragmanlarının plazmide bağlanması
pUC18 plazmid vektörü ampisilin direnç genine ve β-galaktozidaz enzimini kodlayan lacZ gen bölgesine sahiptir .
Bu plasmidi barındıran E.coli’ler ampisilin ve X gal içeren besi yerinde üreyerek mavi renk verirler.
Hedef DNA’nın bu bölgeye eklenmesi bu genin transkripsiyonunu durdurur.
Bu durumda E.coli kolonileri beyaz renkte olacaktır
DNA fragmanlarının plazmide bağlanmasıRE ile kesim
Ap dirençli, lac negatifbeyaz koloni
Ap dirençli, lac pozitifmavi koloni
Mavi-beyaz tarama yönteminde kullanılan pUC serisi plazmidler aynı zamanda çoklu klonlama bölgesine sahiptirler.
Bu tür vektörler, alıcı hücre tarafından aktive edilebilecek promotor bölgelerini de taşırlar. Böylece plazmidin ekspresyon şansı arttırılmış olur.
Bakterileri enfekte eden virüslerdir. Tüm virüsler gibi basit bir yapıya
sahiptirler. Genellikle baş, boyun, kuyruk ve
kuyruk fibrillerinden oluşmakla birlikte filamentöz yapıda olanları da vardır
Bakteriyofajlar, enfekte ettikleri bakteride litik ve lizojenikolmak üzere iki farklı hayat döngüsüne sahiptirler
λ-DNA profaj
LizojenikLitik
En çok çalışılmış bakteriyofajlardanbirisi E. coli’ye ait lambda (λ) bakteriyofajıdır.
Bakteriyofaj DNA’sının her iki ucunda (5’ uçlarında) 12 bazlık ve birbirinin tamamlayıcısı olan nükleotid dizileri mevcuttur.
Bu uçlar tıpkı restriksiyon enzimi kesimi sonucu oluşan yapışkan uçlara benzer (cos-cohesive end)
cos
λ Faj Genomu
cos
Bu yapışkan uçlar sayesinde doğrusal yapıda olan fajgenomu, bakteri hücresine girdiğinde halkasal hale gelir. Bağlanma bölgesi, plazmidlerde olduğu gibi ligaz enzimleri sayesinde onarılır.
Halkasal faj genomu
Konak genomu
Bakteriyofaj genomuna eklenecek hedef DNA’nın büyüklüğü en fazla 20 kb kadar olabilir.
Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle, buna birleştirilmiş lambda fajıyapışkan ucundan (cos, cohesive ends) oluşturulmuşlardır
35-40 kb uzunluğunda yabancı bir DNA fragmanını kabul edebilir ve alıcı hücreye aktarabilir.
Restriksiyon enzimiyle kesim ve hedef DNA fragmanı ile ligasyondan sonra oluşan DNA, λ faj partiküllerine paketlenir.
Orikozmid
Ampr
cos
MCS
Ampr MCS cos ori
Ampr cos ori
Yabancı DNA fragmanı
Daha büyük DNA parçalarının (1 Mb’dan daha fazla) klonlanmasına olan ihtiyaç duyulması yapay kromozom vektörlerinin geliştirilmesine neden olmuştur.
İlk olarak Saccharomyces cerevisiae’da geliştirilmiştir. Bu mayanın genomu temel alınarak inşa edilen rekombinant
kromozomlar (yeast artifical chromosomes,YAC’s). Önceleri genetik inceleme için Daha sonra çok büyük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılmıştır:
Yapay kromozomlarda maya genomuna ait telomer,
sentromer, otonom olarak çoğalan diziler (ARS) izole edilmiş
ve plazmid üzerinde birleştirilmiştir.
• Bakteriyel yapay kromozomlar YAC’lardan daha küçük DNA
fragmanları (300-350 kb) taşıyabilen klonlama vektörlerdir. Buna
rağmen çok önemli bazı avantajlara sahiptirler.
• YAC’lar, kararsız bir yapıya sahip olduklarından çoğalma sırasında
taşıdıkları DNA fragmanlarını kaybedebilmektedirler.
• Bakteriyel yapay kromozomlar ise hem oldukça kararlı bir yapıya
sahiptirler hem de E. coli gibi çok hızlı ve kolaylıkla üreyen bir
bakterinin tranformasyon kolaylığına sahiptirler.