Embed Size (px)
Citation preview
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN VĂN THẮNG
MÃ SINH VIÊN: 1101486
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN
MỘT SỐ DẪN CHẤT MỚI CỦA
2,3-DIHYDROBENZO
[4,5]IMIDAZO[2,1-b]THIAZOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN VĂN THẮNG
MÃ SINH VIÊN: 1101486
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN
MỘT SỐ DẪN CHẤT MỚI CỦA
2,3-DIHYDROBENZO
[4,5]IMIDAZO[2,1-b]THIAZOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Công nghiệp Dược
2. Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI - 2016
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Nguyễn Đình Luyện - người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn, cho tôi những lơi khuyên
quý báu va tao moi điêu kiên giup đơ tôi trong quá trình nghiên cưu và hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đăc
biêt la TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Nguyễn Văn Giang va CN. Phan Tiên Thanh
thuộc phòng thí nghiệm Tông hơp Hoa Dươc, bộ môn Công Nghiệp Dược, Trường
Đại Học Dược Hà Nội đa tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các
cá nhân đơn vị trong và ngoài trường. Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến bộ môn Vi
sinh – Sinh học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến, ThS.
Phạm Thị Hiền, ThS. Ngô Quang Trung – Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia,
TS. Mạc Đình Hùng – Phòng thí nghiệm Hóa Dược, khoa Hóa Học, Đại học Khoa
Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Đồng thời tôi xin cảm ơn toàn thể các thầy
cô trong trường Đai hoc Dươc Ha Nôi.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cam ơn chân thành đên gia đình và bạn bè - những
người luôn giúp đỡ, động viên, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
quãng thời gian học tập cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày 14 tháng 04 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Văn Thắng
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ 2-MERCAPTOBENZIMIDAZOL .................... 2
1.1.1. Cấu tạo của khung 2-mercaptobenzimidazol ............................................ 2
1.1.2. Tính chất hóa lý của 2MBI ........................................................................ 2
1.2. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2MBI ....................... 3
1.2.1. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ........................................................... 3
1.2.2. Các tác dụng khác của các dẫn chất 2MBI ................................................ 7
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT KHUNG 2MBI ............. 11
1.3.1. Tổng hợp 2MBI và các dẫn chất N,S-alkyl hóa ...................................... 11
1.3.2. Tổng hợp các dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol ...... 14
1.3.2.1. Phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol... 14
1.3.2.2. Phản ứng tạo dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
......................................................................................................................... 16
1.4. LỰA CHỌN HƯỚNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
CHO ĐỀ TÀI ......................................................................................................... 16
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 18
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ .................................................................... 18
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 19
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 20
2.3.1. Tổng hợp hóa học .................................................................................... 20
2.3.2. Xác định độ tinh khiết ............................................................................. 20
2.3.3. Xác định cấu trúc ..................................................................................... 20
2.3.4. Thử tác dụng kháng khuẩn ...................................................................... 21
2.3.4.1. Giống vi sinh vật kiểm định ............................................................... 21
2.3.4.2. Môi trường thử nghiệm ...................................................................... 21
2.3.4.3. Mẫu kháng sinh chuẩn ....................................................................... 22
2.3.4.4. Phương pháp tiến hành ...................................................................... 22
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................ 24
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC ................................................................................. 24
3.1.1. Tổng hợp các chất trung gian ................................................................... 24
3.1.1.1. Tổng hợp 2MBI (II) ........................................................................... 24
3.1.1.2. Tổng hợp 2, 3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (III) ........... 25
3.1.2. Tổng hợp các sản phẩm IV, V, VI ........................................................... 26
3.1.2.1. Tổng hợp 7-nitro-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (IV) 26
3.1.2.2. Tổng hợp 6,7-dinitro-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
(V) ................................................................................................................... 27
3.1.2.3. Tổng hợp 7-amino-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (VI)
......................................................................................................................... 28
3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT ....................................................................... 30
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC ............... 31
3.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) .................................................... 31
3.3.2. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) ................................................... 32
3.3.3. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ........................... 33
3.4. THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN ........................................................... 34
3.5. BÀN LUẬN .................................................................................................... 36
3.5.1. Về tổng hợp hóa học ................................................................................. 36
3.5.1.1. Phản ứng tổng hợp 2MBI ................................................................... 36
3.5.1.2. Tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol .................... 36
3.5.1.3. Tổng hợp chất IV ............................................................................... 38
3.5.1.4. Tổng hợp chất V ................................................................................ 38
3.5.1.5. Tổng hợp chất VI ............................................................................... 39
3.5.2. Về cấu trúc sản phẩm ............................................................................... 39
3.5.3. Về thử tác dụng kháng khuẩn ................................................................... 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 44
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µM Micromol
1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân proton)
CH2Cl2 Dicloromethan
CHCl3 Cloroform
CTCT Công thức cấu tạo
CTPT Công thức phân tử
DMF N,N- dimethylformamid
DMSO Dimethyl sulfoxid
EtOH Ethanol
GI50 Growth inhibition of 50% (Nồng độ ức chế 50% sự phát triển)
HT-29 Dòng tế bào ung thư đại tràng người
IC50 Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%)
IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
m Khối lượng
MeOH Methanol
MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)
MS Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phân tử)
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (Phổ tương tác của các
proton gần nhau trong không gian)
Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ)
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TEA Triethanolamin
to Nhiệt độ
tonc Nhiệt độ nóng chảy
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Đường kính vòng vô khuẩn của các chất 1a– 1f ......................................... 3
Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của các hợp chất 1a-1j ........................................ 5
Bảng 1.3 Đường kính vòng vô khuẩn của các hợp chất 2a-2h ................................... 6
Bảng 1.4 Kết quả thử hoạt tính chống kí sinh trùng của các dẫn chất 5a-f ................ 9
Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất.............................................................................. 18
Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ, thiết bị ................................................................. 19
Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm kháng khuẩn ........................................................ 22
Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học ......................................................................... 30
Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các chất .................................. 30
Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) ..................................................... 31
Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các sản phẩm ................................ 32
Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất ........................................... 33
Bảng 3.6 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn ............................................................ 34
Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn chất III theo Nai SeangThaing ......... 42
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1 CTCT của phân tử 2-mercaptobenzimidazol (2MBI) ................................. 2
Hình 1.2 Sự đồng phân hóa của 2MBI ....................................................................... 2
Hình 1.3 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của Krunal G. Desai và cộng sự ....... 3
Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất theo nghiên cứu của Sidram A. Nevade và
các cộng sự .................................................................................................................. 6
Hình 1.5 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của M. S. Vedula và cộng sự ............ 7
Hình 1.6 CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Pu Xiang và các cộng sự . 8
Hình 1.7. CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của TS. Nguyễn Văn Hải và
cộng sự ........................................................................................................................ 8
Hình 1.8 CTCT các dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Ulf K. Junggren và
cộng sự ...................................................................................................................... 10
Hình 1.9 CTCT của các dẫn chất 2MBI theo nghiên cứu của Y. C. Sung và cộng sự
................................................................................................................................... 11
Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp khung 2MBI theo Allan và Deacon từ o-phenylendiamin
và kali ethylxantat ..................................................................................................... 12
Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp khung 2MBI của Allan và Deacon từ o-phenylendiamin,
kali hydroxyd và carbon disulfid............................................................................... 12
Hình 1.12 Sơ đồ tổng hợp 2MBI theo H. Thakuria và cộng sự ............................... 12
Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ o-phenylendiamin và thiophosgen hoặc thioure
................................................................................................................................... 13
Hình 1.14 Cơ chế phản ứng tổng hợp 2MBI theo D. Harrison và cộng sự .............. 13
Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp 2MBI và dẫn chất theo S. S. Rao và cộng sự ................ 13
Hình 1.16 Phản ứng tạo khung 2MBI từ arylcarbamothioyl cyanid và o-cloroanilin
................................................................................................................................... 14
Hình 1.17 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ benzimidazol và lưu huỳnh ............................. 14
Hình 1.18 Sơ đồ phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
................................................................................................................................... 14
Hình 1.19 Cơ chế phản ứng tạo ra dẫn chất chứa khung 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Ki-Whan Chi và cộng sự ................. 15
Hình 1.20 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất chứa khung 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Anelia Ts. Mavrova và cộng sự ....... 15
Hình 1.21 Sơ đồ tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Nai
SeangThaing .............................................................................................................. 16
Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp của các chất IV, V, VI ..................................................... 24
Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp 2MBI ................................................................................ 25
Hình 3.3 Tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol ............................ 25
Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất IV ............................................................................. 26
Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất V ............................................................................... 27
Hình 3.6 Sơ đồ tổng hợp chất VI ............................................................................. 28
Hình 3.7 Kết quả đo phổ NOESY hợp chất IV ........................................................ 34
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Benzimidazol là một trong những khung hóa học với nhiều dẫn chất có nhiều
hoạt tính sinh học đáng chú ý. Một trong những nhóm dẫn chất quan trọng của khung
benzimidazol đó là 2-mercaptobenzimidazol. Nhiều công trình nghiên cứu đã cho
thấy tác dụng sinh học đa dạng và rất triển vọng như kháng khuẩn, kháng nấm [11],
[28], gây độc tế bào ung thư [2], [34], [35], chống viêm [15], [23], giảm đau [15], ức
chế bơm H+/K+-ATPase [18], [19],… Trên lâm sàng, rất nhiều hợp chất đã được ứng
dụng vào điều trị và đã cho thấy tác dụng tốt như: triclabendazol (trị sán), omeprazol
(giảm acid dạ dày), lansoprazol (giảm acid dạ dày),…
Chính vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu, tổng hợp các hợp chất mới của 2-
mercaptobenzimidazol là một hướng nghiên cứu có tiềm năng lớn trong việc tìm ra
các phân tử có hoạt tính sinh học cao phát triển làm thuốc. Mặt khác việc nghiên cứu
các hợp chất N,S dialkyl hóa mà tiêu biểu là 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-
b]thiazol đã cho thấy nhiều kết quả triển vọng [3]. Mặt khác chúng tôi nhận thấy các
dẫn chất nitro thường có hoạt tinh sinh học tốt như metronidazol,
nitrofurantoin,…Trên cơ sở đó, để góp phần làm phong phú thêm các nghiên cứu về
tổng hợp và thử tác dụng sinh học của nhóm dẫn chất quan trọng này, chúng tôi đã
thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn một số dẫn
chất mới của 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol” với các mục tiêu sau:
1. Tổng hợp được một số dẫn chất mới của 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol;
2. Thử tác dụng kháng khuẩn của một số dẫn chất 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol tổng hợp được.
2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ 2-MERCAPTOBENZIMIDAZOL
1.1.1. Cấu tạo của khung 2-mercaptobenzimidazol
2-Mercaptobenzimidazol (tên khoa học 1H-benzo[d]imidazol-2-thiol hoặc 2-
sulfanylbenzimidazol) là dẫn chất của benzimidazol, cấu tạo bởi khung benzimidazol
liên kết với nhóm thiol (SH) ở vị trí số 2 (xem hình 1.1)
Hình 1.1 CTCT của phân tử 2-mercaptobenzimidazol (2MBI)
Công thức phân tử: C7H6N2S.
Khối lượng phân tử: 150,2 đvC [25].
1.1.2. Tính chất hóa lý của 2MBI
Trong phân tử có nhóm thioamid (-N-C=S), nên nó được xem như là một hợp
chất thioamid, có khả năng phản ứng thế ở nguyên tử nitơ hoặc lưu huỳnh. Nó được
tồn tại ở 2 dạng đồng phân hỗ biến là thiol và thion, được biểu diễn dưới đây [7]:
Hình 1.2 Sự đồng phân hóa của 2MBI
Một số tính chất lý học của 2MBI:
- Độ tan [21]:
Kém tan trong nước: S < 0,1 g/100 mL ở 23,5oC.
Tan tốt trong DMSO: S ≥ 10 g/100 mL ở 23,5oC
Tan trong aceton: S=1-5 g/100 mL ở 23,5oC,
Tan trong ethanol: S=0,1-1 g/100 mL ethanol 95% ở 23,5oC
- Nhiệt độ nóng chảy: 300-305oC [25].
- Cảm quan: Tinh thể hình phiến mỏng, có màu vàng nhạt hoặc màu trắng [25].
3
1.2. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2MBI
1.2.1. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Năm 2006, Krunal G. Desai và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp và
thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm một số dẫn chất của 2MBI với β-lactam thông
qua cầu nối CO-NH có công thức cấu tạo như sau:
Hình 1.3 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của Krunal G. Desai và cộng sự
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn được trình bày trong bảng 1.1. Kết quả cho
thấy rằng tất cả các hợp chất tổng hợp được thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh.
Các hợp chất 1a, 1i và 1j cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn rõ rệt so với các hợp
chất 1b-h. Trong đó, các hợp chất 1i và 1j thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng chú
ý trên Escherichia coli (ATCC 6538) khi so sánh với kháng sinh streptomycin.
Bảng 1.1 Đường kính vòng vô khuẩn của các chất 1a– 1f
Hợp chất
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-)
Bacills substilis
(ATCC 6633)
Staphylococcus aureus
(ATCC 6538)
Escherchia coli
(ATCC 6538)
1a + + + + + + +
1b + + + + + +
1c - - -
1d + + + + + +
1e + + + + + +
4
1f - - -
1g + + + + + +
1h + + + + + +
1i + + + + + + + +
1j + + + + +
Streptomycin + + + + + + + + + + + +
Đường kính vòng vô khuẩn (-) 6mm; (+) 6-15 mm; (+ +) 15-20 mm; (+ + +) 20-25
mm; (+ + + +) 25-30 mm
Mặt khác, các hợp chất 1a và 1i cho thấy hoạt tính mạnh trên Bacillus subtilis
(ATCC 6633) và Staphylococcus aureus (ATCC 6538) khi so sánh với streptomycin.
Hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram dương của 1c, 1e và 1j yếu hơn
70% so với chất đối chiếu; tương tự với hoạt tính trên chủng vi khuẩn Gram âm của
1c và 1f. Nhìn chung, các hợp chất 1b, 1d, 1e, 1g và 1h cho thấy hoạt tính kháng
khuẩn trung bình trên các vi sinh vật được thử nghiệm.
Hoạt tính kháng nấm của các hợp chất đã tổng hợp được 1a-j được thử ở 4
nồng độ khác nhau (50, 100, 150, 200 µg/mL). Nồng độ ức chế tối thiểu của
fluconazole là (+ + + +) ở ≤ 50 µg / mL đối với tất cả các vi nấm.
Kết quả thử hoạt tính kháng nấm được trình bày ở bảng 1.2. Các hợp chất 1c
và 1f cho thấy hoạt tính tốt hơn các hợp chất còn lại khi thử trên Candida krusei (100
µg/mL) và Aspergillus niger (100 µg/mL). Các hợp chất 1e và 1j thể hiện hoạt tính
kháng nấm yếu khi thử trên Candida albicans và Aspergillus niger với MIC là 200
µg/mL. Nhìn chung, các hợp chất 1b, 1d, 1g và 1h cho thấy hoạt tính kháng nấm
trung bình trước tất cả các chủng vi nấm (150 µg/ml). Các hợp chất 1c, 1f và 1j cho
thấy hoạt tính trung bình trên Candida albicans (150 µg/mL), 1e, 1f và 1j cho thấy
hoạt tính trung bình với Candida krusei (150 µg/mL). Hợp chất 1c và 1e có hoạt tính
kháng nấm trung bình trên Aspergillus niger (150 µg/mL). Từ dữ liệu thu được có
thể thấy rằng một số hợp chất có hoạt tính kháng nấm đáng chú ý, tuy nhiên không
có hợp chất nào vượt trội so với các chất chuẩn dùng để so sánh trong thử nghiệm
này [11].
5
Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của các hợp chất 1a-1j
Hợp chất
Nồng độ ức chế tối thiểu (µg/mL)
Candida albicans
(ATCC 64550)
Candida krusei
(ATCC 14243) Aspergillus niger
1a - - -
1b + + + + + +
1c + + + + + + +
1d + + + + + +
1e + + + + +
1f + + + + + + +
1g + + + + + +
1h + + + + + +
1i - - -
1j + + + + +
Flucanozole + + + + + + + + + + + +
Nồng độ ức chế tối thiểu: 50 µg/mL = + + + +, 100 µg/mL = + + +, 150 µg/mL =
+ +, 200 µg/mL = +
Năm 2013, Sidram A. Nevade và cộng sự đã tổng hợp và thử hoạt tính kháng
khuẩn một số dẫn chất của 2MBI theo sơ đồ sau:
6
Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Sidram A.
Nevade và cộng sự
Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch
tán trên thạch. Kết quả (bảng 1.3) cho thấy các hợp chất 2a, 2c, 2e thể hiện hoạt tính
khá tốt trên S. aureus và E. coli, trong khi các hợp chất 2b, 2f, 2g chỉ có hoạt tính
trung bình trên các chủng sinh vật tương tự. Các hợp chất đã tổng hợp cũng được thử
hoạt tính kháng nấm với Candida albicans, trong đó 2c, 2b, 2d cho thấy khả năng ức
chế khá tốt, trong đó 2a thể hiện hoạt tính kháng nấm với C. albicans tốt nhất khi so
sánh với ketoconazole [28].
Bảng 1.3 Đường kính vòng vô khuẩn của các hợp chất 2a-2h
Hợp chất Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
E. Coli S. Aureus C. Albicans
2a 15 13 18
2b 13 11 12
2c 17 16 14
2d 12 13 16
2e 13 17 09
7
2f 10 08 11
2g 08 11 12
2h 12 07 10
S 24 25 -
K - - 20
B - - -
S – Ampicillin chuẩn; B – mẫu trắng (DMSO); K – Ketoconazole
Hoạt tính yếu: 6-8 mm; Hoạt tính trung bình: 9-11 mm; Hoạt tính tốt: 12-15 mm
1.2.2. Các tác dụng khác của các dẫn chất 2MBI
1.2.2.1. Tác dụng gây độc tế bào ung thư
Năm 2003, M. S. Vedula và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất
styrylsulfon của 2MBI. Các dẫn chất tổng hợp được đem thử in-vitro trên các dòng
tế bào ung thư khác nhau.
Hình 1.5 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của M. S. Vedula và cộng sự
Kết quả cho thấy hoạt tính khá mạnh của các dẫn chất khi thế halogen ở vị trí
para trên nhân thơm. Đặc biệt là dẫn chất 3d (R=R1= R3= H, R2= Br) với nhóm bromo
ở vị trí para trên nhân phenyl cho gía trị GI50 trung bình trên các dòng tế bào ung thư
được thử nghiệm là 8,5 µM và có hoạt tính tốt trên các dòng tế bào ung thư vú (MCF-
7), ung thư thần kinh (U-251), ung thư buồng trứng (PA1) và ung thư thận (A-498),
với giá trị GI50 lần lượt là 2,0; 0,35; 5,0; 3,0 µM. Hợp chất 3h cho giá trị GI50 < 5 µM
đối với nhiều dòng tế bào ung thư và có cả tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư vú
kháng doxorubicin (MCF7/ADR) [34].
8
Năm 2012, Pu Xiang và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu một số dẫn chất
có chứa khung benzothiazole, benzimidazole và benzoxazole trong đó có dẫn chất
của 2MBI như hình 1.6. Chất này có khả năng ức chế tốt sự phát triển của tế bào ung
thư đại tràng HCT-116 với giá trị IC50 là 3,69 µM [35].
Hình 1.6 CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Pu Xiang và các cộng sự
Năm 2014, TS. Nguyễn Văn Hải và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác
dụng gây độc tế bào ung thư của 2 dẫn chất 2MBI (xem hình 1.7).
Hình 1.7. CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của TS. Nguyễn Văn Hải và
cộng sự
Các chất thử (20 µL) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay
96 giếng để có nồng độ: 100; 20; 4 và 0,8 µg/mL. Chất đối chứng là ellipticin, sử
dụng ở các nồng độ: 10; 2; 0,4 và 0,08 µg/mL. Kết quả cho thấy 2 mẫu nghiên cứu
4a, 4b có hoạt tính khá mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi (LU-1) với giá trị IC50
lần lượt là 10,80 và 10,65 µg/mL và dòng tế bào ung thư vú (MCF7) với giá trị IC50
lần lượt là 9,11 và 7,59 µg/mL [2].
1.2.2.2. Tác dụng chống ký sinh trùng
Trong lâm sàng, triclabendazol là dẫn chất của 2MBI đã được sử dụng rộng
9
rãi để làm thuốc điều trị sán lá gan, sán lá phổi [31].
Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu khác vẫn tiếp tục tìm kiếm các dẫn chất
2MBI có tác dụng chống ký sinh trùng. Năm 2002, J. Valder, R. Cedillo và cộng sự
đã tổng hợp và nghiên cứu tác dụng chống lại các sinh vật đơn bào Giardia lamblia,
Entamoeba histolytica và sán Trichinella spiralis của 18 dẫn chất benzimidazol, trong
đó có 6 dẫn chất của 2MBI:
Hình 1.7 CTCT các dẫn chất 2MBI theo nghiên cứu của J. Valder và cộng sự
Bảng 1.4 Kết quả thử hoạt tính chống kí sinh trùng của các dẫn chất 5a-f
Chất IC50(µM) % giảm khả năng sống sót của
T. spiralis* G. lamblia E. histolytica
5a 0,040 0,133 11
5b 0,045 0,393 -
5c 0,081 0,005 13
5d 0,005 0,192 15
5e 0.078 0,055 23
5f 0,227 0,356 17
Albendazol 0,037 56,33 34
Metronidazol 1,22 0,350 --
Chú thích:
* : % giảm khả năng sống sót của ấu trùng T. spiralis sau 3 ngày của thời kì ủ
bệnh với nồng độ 3nM.
- : không quan sát thấy sự giảm.
-- : không xác định được.
Kết quả đã cho thấy rằng tất cả 6 chất này đều có hoạt tính tốt hơn metronidazol
khi thử trên sinh vật đơn bào trong thử nghiệm. Khi thử trên G. lamblia, chất 5d có
10
tác dụng tốt hơn metronidazol 244 lần và albendazol 7,4 lần. Kết quả thử các chất 5a,
5b cho thấy tác dụng tương đương với albendazol. Điều này đã lưu ý về ảnh hưởng
của nhóm 2-mercapto trong các chất 5a, 5c và 5e, cho thấy rằng mức độ tác dụng như
nhau khi thế ở vị trí 5 và 6. Đối với E. histolytica, chất 5e có tác dụng hơn
metronidazol 70 lần. Ngược lại với tác dụng chống đơn bào, tác dụng chống giun sán
của các chất này chỉ ở mức trung bình, không có chất nào có tác dụng chống lại T.
spiralis tương đương albendazol. Tuy nhiên không có chất nào có tác dụng ức chế sự
tổng hợp tubulin [22].
1.2.2.3. Tác dụng ức chế bơm proton H+/K+-ATPase, chống bài tiết dịch vị và
chống viêm loét dạ dày
Các dẫn chất của 2MBI vẫn được biết tới với nhiều thuốc sử dụng trong điều
trị với tác dụng ức chế bài tiết dịch vị, ức chế bơm proton H+/K+-ATPase và chống
loét dạ dày như: omerprazol, lansoprazol, pantoprazol, rabeprazol,…
Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu khác vẫn tiếp tục tìm kiếm các dẫn
chất của 2MBI có tác dụng ức chế bơm proton H+/K+-ATPase, chống bài tiết dịch vị
và chống viêm loét dạ dày. Năm 1981, Ulf K. Junggren và các cộng sự đã tổng hợp
một số dẫn chất 2MBI có công thức cấu tạo như sau:
Hình 1.8 CTCT các dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Ulf K. Junggren và
cộng sự
11
Tất cả các dẫn chất này đều có tác dụng chống bài tiết dịch vị, trong đó có một
số dẫn chất nêu trên là có tác dụng khá mạnh (hiệu lực ức chế 95-100%) [19].
Năm 2001, Y. C. Sung và cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng ức chế bơm
proton H+/K+-ATPase của các hợp chất có chứa khung benzimidazol trong đó có một
số dẫn chất của 2MBI có công thức cấu tạo như sau:
Hình 1.9 CTCT của các dẫn chất 2MBI theo nghiên cứu của Y. C. Sung và cộng sự
Các hợp chất tổng hợp được thử nghiệm lâm sàng trên chuột để xác định tác
dụng của chúng đối với sự tiết acid dạ dày. Kết quả của thử nghiệm này cho thấy các
hợp chất này có tác dụng gần như tương đương với omeprazole [18].
Ngoài ra, trong nhiều năm gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu đã cho thấy
tác dụng sinh học đa dạng của các dẫn chất 2MBI như điều trị rối loạn hệ thần kinh
trung ương (trầm cảm) [4], kháng histamin [26], chống dị ứng [17], [27], chống oxy
hóa [6], [9], chống viêm [15], [23], giảm đau [15]. Điều này cho thấy, dẫn chất của
2MBI là một nhóm chất có tác dụng sinh học đa dạng, cần được tiếp tục đi sâu nghiên
cứu để tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng làm thuốc.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT KHUNG 2MBI
1.3.1. Tổng hợp 2MBI và các dẫn chất N,S-alkyl hóa
1.3.1.1. Tổng hợp khung 2MBI
1.3.1.1.1. Tổng hợp từ o-phenylendiamin
Năm 1950, J. A. VanAllan và B. D. Deacon đã nghiên cứu tổng hợp 2MBI từ
o-phenylendiamin và kali ethylxantat trong hỗn hợp dung môi ethanol – nước:
12
Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp khung 2MBI theo Allan và Deacon từ o-phenylendiamin
và kali ethylxantat
Hiệu suất phản ứng khoảng 84-86,5%, kali ethylxantat có thể được thay bằng
hỗn hợp kali hydroxyd và carbon disulfid với hiệu suất đạt được tương đương. Sản
phẩm được kết tinh lại trong ethanol 95% thu được khoảng 90% sản phẩm với nhiệt
độ nóng chảy không đổi [33].
Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp khung 2MBI của Allan và Deacon từ o-phenylendiamin,
kali hydroxyd và carbon disulfid
Năm 2008, H. Thakuria và cộng sự nghiên cứu tổng hợp 2MBI và dẫn chất
thông qua phản ứng giữa o-phenylendiamin hoặc dẫn chất với amoni thiocyanat, xúc
tác là amoni clorid. Các chất phản ứng và xúc tác được nghiền ở nhiệt độ phòng cho
đến khi đồng nhất, sau đó hỗn hợp được nung nóng ở 140oC trong 1-3 giờ. Sau khi
phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được rửa với nước lạnh và sản phẩm được kết
tinh lại trong ethanol [32].
Hình 1.12 Sơ đồ tổng hợp 2MBI theo H. Thakuria và cộng sự
Khung 2MBI còn có thể được tổng hợp từ o-phenylendiamin bằng phản ứng
với thiophosgen trong dung môi cloroform [30] hoặc bằng phản ứng đun chảy với
thioure [13].
13
Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ o-phenylendiamin và thiophosgen hoặc thioure
1.3.1.1.2. Tổng hợp từ các dẫn chất khác của benzimidazol
Năm 1965, D. Harrison và J. T. Ralph đưa ra quy trình tổng hợp 2MBI bằng
phản ứng giữa 2-clorobenzimidazol và thioure, tiến hành hồi lưu trong dung môi
ethanol [16].
Hình 1.14 Cơ chế phản ứng tổng hợp 2MBI theo D. Harrison và cộng sự
Năm 2013, S.S. Rao và cộng sự nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất của 2MBI,
theo đó, khung 2MBI có thể được tạo thành theo sơ đồ sau [29]:
Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp 2MBI và dẫn chất theo S. S. Rao và cộng sự
Khung 2MBI cũng có thể tạo ra từ phản ứng giữa o-phenylendiamin và dẫn
chất arylcarbamothiol cyanid trong dung môi DMF/TEA hoặc EtOH/TEA hoặc thu
được từ phản ứng đi từ nguyên liệu ban đầu là dẫn chất arylcarbamothioyl cyanid và
o-cloroanilin trong dioxan/TEA [12].
14
Hình 1.16 Sơ đồ phản ứng tạo khung 2MBI từ arylcarbamothioyl cyanid và o-
cloroanilin
1.3.1.1.3. Tổng hợp từ benzimidazol và lưu huỳnh
Khung 2MBI có thể được tổng hợp bằng cách đun chảy benzimidazol với lưu
huỳnh [14].
Hình 1.17 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ benzimidazol và lưu huỳnh
1.3.2. Tổng hợp các dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
1.3.2.1. Phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
Phản ứng được tiến hành dựa trên phản ứng N,S-dialkyl hóa giữa 2-
mercaptobenzimidazol và dẫn xuất 1,2-dihaloethyl. Phản ứng xảy ra theo cơ chế ái
nhân lưỡng phân tử SN2 trong đó có khả năng ái nhân của –SH lớn hơn –NH [5].
Hình 1.18 Sơ đồ phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
Năm 2002, Ki-Whan Chi và cộng sự đã nghiên cứu một số phản ứng giữa
perfluoro-2-methyl-2-pentene với tác nhân 1,3-binucleophilic. Trong đó đã tạo ra một
số dẫn chất chứa khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol [10].
15
Hình 1.19 Cơ chế phản ứng tạo ra dẫn chất chứa khung 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Ki-Whan Chi và cộng sự
Ngoài ra, năm 2005, Anelia Ts. Mavrova và cộng sự đã nghiên cứu phản ứng
giữa dẫn chất của o-phenylendiamin với acid cloroacetic. Phản ứng xảy ra theo cơ
chế giai đoạn N-alkyl hóa trước rồi giai đoạn S-acyl hóa sau tạo ra sản phẩm [24].
Hình 1.20 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất chứa khung 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Anelia Ts. Mavrova và cộng sự
Năm 2015, tác giả Nai SeangThaing đã nghiên cứu phản ứng giữa 2MBI với
1,2-dicloroethan trong dung môi isopropanol. Sản phẩm thu được có cảm quan là
tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng với hiệu suất 30,51% [3].
16
Hình 1.21 Sơ đồ tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Nai
SeangThaing
1.3.2.2. Phản ứng tạo dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
Phản ứng nitro hóa
Nitro hóa là quá trình thế H của hợp chất hữu cơ bằng nhóm nitro (-NO2). Phản
ứng có thể chạy theo các cơ chế như thế ái điện tử (SE) hay thế gốc tác nhân (SR), phụ
thuộc vào bản chất các chất được nitro hóa và điều kiện phản ứng. Có nhiều tác nhân
có thể được sử dụng như dung dịch acid nitric, hỗn hợp sulfonitric, acylnitrat,…[1].
Phản ứng khử hóa
Tùy vào khả năng phản ứng của hợp chất đem khử, có thể sử dụng nhiều tác
nhân khử hóa khác nhau có thể được sử dụng như kim loại trong môi trường acid,
kiềm, hỗn hống kim loại, kim loại kiềm trong alcol,…[1].
Phản ứng khử hóa được sử dụng trong thực nghiệm
Tác nhân được sử dụng là Na2S2, với sơ đồ phản ứng như sau [8]:
1.4. LỰA CHỌN HƯỚNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
CHO ĐỀ TÀI
Theo tài liệu tham khảo [3], chúng tôi nhận thấy một số dẫn chất 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol có tác dụng sinh học khá triển vọng như
kháng khuẩn, kháng nấm. Mặc dù vậy, các dẫn chất khung 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol chưa được nghiên cứu sâu. Bên cạnh đó,
chúng tôi thấy rằng các dẫn chất có chứa nhóm nitro trong phân tử thường có tác dụng
sinh học tốt. Hơn thế chúng tôi chưa tìm thấy bấy kỳ nghiên cứu nào thực hiện nitro
hóa 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol, đây là một hướng biến đổi mới trên
17
khung dẫn chất này. Để tiếp nối các nghiên cứu đó, chúng tôi dự kiến tổng hợp một
số dẫn chất nitro hóa mới của 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol và thử
hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất này.
18
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ
Để thực hiện khóa luận này chúng tôi đã sử dụng một số hóa chất, thiết bị và
dụng cụ của Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược,
Trường Đại học Dược Hà Nội (xem bảng 2.1, bảng 2.2).
Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất
STT Tên hóa chất Xuất xứ
1 Acid hydrocloric đặc (37%) Trung Quốc
2 Acid sulfuric đặc (98%) Trung Quốc
3 Acid nitric đặc (68-70%) Trung Quốc
4 Natri sulfid Trung Quốc
5 Cloroform Trung Quốc
6 Carbon disulfid Trung Quốc
7 Dicloroethan Trung Quốc
9 Ethanol Trung Quốc
10 Isopropanol Trung Quốc
11 Kali carbonat Trung Quốc
12 Kali hydroxyd Trung Quốc
13 Methanol Trung Quốc
14 Natri hydrocarbonat Trung Quốc
15 Natri sulfat Trung Quốc
16 Nước cất ĐH Dược HN
17 o-Phenylendiamin Đức
18 Than hoạt Nhật
19
Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ, thiết bị
TT Tên máy móc, dụng cụ Xuất xứ
1 Bản mỏng silicagel 60 F254 Merck Đức
2 Bình cầu 1 cổ 50 mL, 100 mL, 250 mL Đức
3 Bình cầu 2 cổ 50 mL, 100 mL, 250 mL Đức
4 Bình chiết 50 mL, 100 mL, 250 mL Trung Quốc
5 Bình sắc ký Trung Quốc
6 Hệ thống lọc hút chân không Trung Quốc
7 Đèn tử ngoại (soi ban mỏng sắc ký) bước sóng 254 nm &
366 nm Đức
8 Hệ thống sinh hàn hồi lưu Đức
9 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sỹ
10 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ
11 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-
500MHz Mỹ
12 Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-6700 Nhật
13 Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS - Agilent 1290/6460 Mỹ
14 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Mỹ
15 Tủ sấy Memmert Đức
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất mới của 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo sơ đồ 3.1.
- Kiểm tra độ tinh khiết.
- Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được.
- Thử hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất IV, V, VI.
20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tổng hợp hóa học
Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp
các chất dự kiến: phản ứng ngưng tụ, S-alkyl hóa, N-alkyl hóa, phản ứng nitro
hóa, phản ứng khử hóa. (xem hình 3.1)
Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel 60 F254
Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước
sóng 254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng.
Sử dụng phương pháp chiết, kết tinh, kết tủa để xử lý phản ứng, tinh chế sản phẩm.
2.3.2. Xác định độ tinh khiết
Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy
EZ-Melt.
Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel 60 F254
Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước
sóng 254 nm.
2.3.3. Xác định cấu trúc
Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp
phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR).
Phổ hồng ngoại (IR)
Được ghi tại phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Đánh giá tương đương sinh học –
Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia, trên máy Jasco FT/IR-6700 với kỹ thuật viên
nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với
tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để
loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối lượng phân tử (MS)
Được ghi theo phương pháp ESI trên máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent 1290/6460
tại Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Đánh giá tương đương sinh học – Viện Công
Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia.
21
- Chế độ đo: ESI-MS dương và ESI-MS âm.
- Dung môi: methanol.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz tại Phòng thí nghiệm Hóa Dược – Khoa
Hóa học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG Hà Nội.
- Dung môi đo: MeOD, CDCl3
- Chất chuẩn: Tetramethylsilan (TMS)
2.3.4. Thử tác dụng kháng khuẩn
Thử hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện tại bộ môn Vi sinh – Sinh học,
Trường Đại học Dược Hà Nội, theo phương pháp khuếch tán trên thạch.
2.3.4.1. Giống vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện với 5 vi khuẩn Gram (+) và 4 vi khuẩn
Gram (-) sau:
+ Vi khuẩn Gram (+):
- Staphylococcus aureus ATCC 1128 (S. aureu)
- Bacillus pumilus ATCC 10241 (B. pumilus)
- Bacillus subtilis ATCC 6633 (B. subtilis)
- Bacillus cereus ATCC 9946 (B. cereus)
- Sarcina lutea ATCC 9341 (S. lutea)
+ Vi khuẩn Gram (-):
- Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli)
- Proteus mirabilis BV 108 (P. mirabilis)
- Shigella flexneri DT 112 (S. flexneri)
- Salmonella typhi DT 220 (S. typhi)
2.3.4.2. Môi trường thử nghiệm
22
Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm kháng khuẩn
Canh thang Thach thương
- NaCl 0,5%
- Cao thịt 0,3%
- Pepton 0,5%
- Nước cất vừa đủ 100 mL.
- NaCl 0,5%
- Cao thịt 0,3%
- Thạch 1,6%
- Pepton 0,5%
- Nước cất vừa đủ 100 mL.
2.3.4.3. Mẫu kháng sinh chuẩn
- Benzathin penicillin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (+).
- Streptomycin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (-).
2.3.4.4. Phương pháp tiến hành
Nguyên tắc:
Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy
VSV kiểm định (vi khuẩn), hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ
ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành:
- Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (methanol, H2O) với nồng độ cho
các mẫu như sau: IV: 100 g/mL, V: 100 g/mL, VI: 100 g/mL. Các khoanh
giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm với 3 lần với dung dịch mẫu
thử, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy <
60oC đến khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường cà cấy VSV kiểm định
Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho
phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế
bào/mL (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dung dịch chuẩn). Môi trường thạch
thường vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-50oC và được
23
cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5mL/100mL. Lắc tròn để VSV kiểm
định phân tán đều trong môi trường thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng
với thể tích 20mL/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Đặt mẫu thử và chứng: Khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như
trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường chứa VSV kiểm định theo
sơ đồ định sẵn.
- Ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở 37oC trong 18-24h,
rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có (thước kẹp
Panmer độ chính xác 0,02mm).
- Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh vòng vô
khuẩn được đánh giá theo công thức:
2
1 1
( )
1
n n
i i
i i
D D D
D sn n
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
Di : Đường kính vòng vô khuẩn thứ i
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n: Số thí nghiệm làm song song (n= 3)
24
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC
Thông qua các tài liệu tham khảo và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm,
các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol đi từ nguyên liệu ban đầu là o-
phenylendiamin theo sơ đồ như sau:
Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp của các chất IV, V, VI
3.1.1. Tổng hợp các chất trung gian
3.1.1.1. Tổng hợp 2MBI (II)
Sơ đồ phản ứng
25
Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp 2MBI
Tiến hành phản ứng [33]
Cho vào bình cầu hỗn hợp gồm có: 9,72g (0,09 mol) o-phenylendiamin và
5,04g (0,09 mol) KOH, 98 mL ethanol, 17 mL nước cất. Sau đó nhỏ từ từ 5,55 mL
(0,09 mol) carbon disulfid vào bình cầu. Tiến hành đun hồi lưu trong khoảng thời
gian 3 giờ.
Phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 1,2g than hoạt, tiếp tục đun
trong 10 phút, lọc nóng và nhanh hỗn hợp bằng phễu lọc Buchner, rửa lại 2 lần bằng
ethanol nóng. Thêm 65 mL nước nóng (60- 70oC), acid hóa bằng HCl 5M đến pH 6-
7 để xuất hiện tủa, tiếp tục khuấy 1 giờ. Lọc lấy tủa, rửa lại 3 lần bằng nước cất, kết
tinh lại trong ethanol 50%. Lọc tủa, sấy sản phẩm khô ở 70- 80 oC.
Kết quả
- Cảm quan: Tinh thể hình phiến mỏng, màu trắng ánh bạc.
- Khối lượng: 11,2 g
- Hiệu suất: 90,20 %
- Rf = 0,30 (hệ dung môi cloroform: methanol = 9:1).
- To nc = 300oC – 304oC [25].
3.1.1.2. Tổng hợp 2, 3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (III)
Sơ đồ phản ứng
Hình 3.3 Tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
26
Tiến hành phản ứng [3]:
Cho 6,8g (0,08 mol) NaHCO3 và 50 mL isopropanol vào bình cầu 100 mL,
thêm 9,4g (0,1 mol) của 1,2-dicloroethan, đun sôi hồi lưu khoảng 1 giờ. Hòa tan trong
cốc có mỏ hỗn hợp gồm: 2,5g (0,016mol) II trong 45 mL isopropanol và 8 mL KOH
20%. Chuyển hỗn hợp vào bình nhỏ giọt và nhỏ rất từ từ vào hỗn hợp phản ứng ở
trên. Thời gian đun sôi thêm khoảng 5 giờ.
Khi phản ứng kết thúc, đổ hỗn hợp phản ứng vào bình một cổ và cất gần kiệt
dung môi isopropanol. Hòa tan hỗn hợp còn lại trong 200 mL cloroform. Rửa lại 3
lần bằng KOH 15% và kiểm tra pH dịch rửa để đạt khoảng 10-11, sau đó rửa thêm
3 lần bằng nước cất 50 mL/lần, kiểm tra pH nước rửa đạt khoảng 6-7. Làm khan dịch
chiết bằng Na2SO4 khan, rồi lọc lấy dịch và cất quay chân không đến khô, thu hồi
dung môi.
Kết tinh lại sản phẩm trong hỗn hợp methanol : nước (tỷ lệ thể tích 1:1). Lọc
lấy tinh thể và sấy khô trong tủ sấy nhiệt độ 70- 80 oC.
Kết quả
- Cảm quan: Bột màu trắng hoặc trắng hơi vàng
- Khối lượng : 0,91g
- Hiệu suất : 30,51%
- Rf = 0,76 (Khai triển trong hệ dung môi cloroform : methanol = 9 :1)
- T0 nc = 108- 111oC.
3.1.2. Tổng hợp các sản phẩm IV, V, VI
3.1.2.1. Tổng hợp 7-nitro-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (IV)
Sơ đồ phản ứng
Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất IV
27
Tiến hành phản ứng
Hòa tan 1,00g (5,7 mmol) III với 5 mL H2SO4 đặc trong bình cầu dung tích 50
mL. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá. Sau khi hòa tan và làm lạnh 5-10
phút, tiến hành nhỏ giọt rất từ từ 1,5 mL dung dịch HNO3 40% (11,9 mmol) và kiểm
soát nhiệt độ khối phản ứng 0-3oC.
Kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ chứa 10mL nước cất
lạnh, tiếp làm lạnh bên ngoài cốc có mỏ bằng nước đá, khuấy đều và thêm từ từ dung
dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 8-9, xuất hiện kết tủa vàng nhạt. Để yên khoảng 30 phút.
Lọc lấy tủa, kết tinh lại trong methanol 50%. Lọc thu lấy sản phẩm, sấy khô sản phẩm
ở nhiệt độ 60-70 oC
Kết quả
- Cảm quan: Bột màu vàng nhạt
- Khối lượng : 0,67g
- Hiệu suất : 51,03%
- Rf = 0,65 (hệ dung môi cloroform : methanol = 9 :1)
- T0 nc = 220oC (phân hủy)
3.1.2.2. Tổng hợp 6,7-dinitro-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (V)
Sơ đồ tổng hợp
Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất V
Tiến hành phản ứng
Hòa tan 1,00g (5,7 mmol) III với 5 mL H2SO4 đặc trong bình cầu dung tích 50
mL. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá. Sau khi hòa tan và làm lạnh 5-10
28
phút, tiến hành nhỏ giọt rất từ từ 2 mL hỗn hợp sulfonitric (tỷ lệ mol H2SO4: HNO3
= 1,5: 2,2) và kiểm soát nhiệt độ khối phản ứng 0-3oC.
Kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ chứa 10mL nước cất
lạnh. Tiếp tục làm lạnh bên ngoài cốc có mỏ bằng nước đá, khuấy đều và thêm từ từ
dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 8-9, xuất hiện kết tủa vàng sẫm. Để yên khoảng 30
phút. Lọc lấy tủa, kết tinh lại trong methanol 50%. Lọc thu lấy sản phẩm, sấy khô sản
phẩm ở nhiệt độ 60-70 oC
Kết quả
- Cảm quan: Bột màu vàng sẫm
- Khối lượng : 0,14g
- Hiệu suất : 9,27%
- Rf = 0,57 (hệ dung môi cloroform : methanol = 9 :1)
- T0 nc = 250oC (phân hủy)
3.1.2.3. Tổng hợp 7-amino-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (VI)
Sơ đồ phản ứng
Hình 3.6 Sơ đồ tổng hợp chất VI
Tiến hành phản ứng
Hòa tan 1g (4,5 mmol) IV với 20 mL ethanol trong bình cầu 2 cổ dung tích 250ml.
Đun hồi lưu hỗn hợp trong bình cầu lên 60-70oC. Dung dịch nóng chứa 40g (0,17
mol) Na2S.9H2O, 3,5g lưu huỳnh và 23mL nước cất được nhỏ từ từ vào hỗn hợp trong
bình cầu. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng hệ dung môi cloroform : methanol
= 9 :1.
Sau khi kết thúc phản ứng, để nguội thêm dung dịch HCl đến pH= 1, khuấy đều.
Lọc hút chân không lấy dịch. Trung hòa dung dịch thu được bằng NaOH 10% đến
29
pH= 7. Chiết dung dịch với CHCl3 3 lần, mỗi lần 50ml. Gộp dịch chiết, làm khan với
Na2SO4 khan, cất quay kiệt đến cắn. Cắn thu được rửa với diethyl ether 3 lần, mỗi lần
10mL, thu sản phẩm
Kết quả
- Cảm quan: Bột màu nâu
- Khối lượng : 0,32g
- Hiệu suất 37,02%
- Rf = 0,38 (hệ dung môi cloroform : methanol = 9 :1)
- T0 nc = 222oC (phân hủy)
30
Như vậy, 3 dẫn chất của 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol đã được
tổng hợp. Dưới đây là bảng tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học:
Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học
Chất CTPT Cảm quan Hiệu Suất
IV
Bột màu vàng nhạt 51,03%
V
Bột màu vàng sẫm 9,27%
VI
Bột màu nâu 37,02%
3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT
Các chất sau khi được tổng hợp, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký
lớp mỏng (SKLM) và đo nhiệt độ nóng chảy.
SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh,
sử dụng dung môi hòa tan là ethanol hay aceton, hệ dung môi khai triển: cloroform:
methanol (9: 1), soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng λ= 254nm để quan sát vết sắc ký.
Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt: 3 chất sau
khi tinh chế đều có dạng chất rắn, được sấy khô và đo nhiệt độ nóng chảy để xác định
khoảng nhiệt độ nóng chảy của từng chất.
Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các chất
Chất t 0nc Rf Hệ dung môi khai triển
IV 220oC (phân hủy) 0,65 Cloroform : methanol= 9 : 1
V 250oC (phân hủy) 0,57 Cloroform : methanol= 9 : 1
VI 222oC (phân hủy) 0,38 Cloroform : methanol= 9 : 1
Nhận xét: Với hệ dung môi triển khai, các chất tổng hợp được cho một vết gọn, rõ,
31
không có vết phụ, giá trị Rf của sản phẩm và nguyên liệu khác biệt trên bản sắc ký.
Như vậy, có thể kết luận sơ bộ là các chất tổng hợp được khá tinh khiết.
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC
Để xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được, tiến hành phân tích phổ hồng
ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS) và phổ cộng hưởng từ (NMR).
3.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
Thông qua việc phân tích phổ IR của các chất tổng hợp, nhận biết được các
dải hấp phụ đặc trưng của dao động hóa trị (ν), dao động biến dạng (δ) của các nhóm
chức và các liên kết điển hình có trong cấu trúc phân tử của chúng như =C-H thơm,
C-N no, C=N, C=C thơm. Ngoài ra với các nhóm thế khác nhau, mỗi chất lại có
những pic đặc trưng riêng. Từ đó xác định được bộ khung của phân tử. Phổ đồ của
các chất được trình bày ở các phụ lục 1, 7, 11. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
của 3 chất IV, V, VI được ghi trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
CTCT Nhóm chức
Đỉnh hấp thụ đặc
trưng
ν (cm-1)
Phụ
lục
=C-H thơm 3097,36
1
C-H no 2853,41; 2925,36
C=N 1615,57
C=C thơm 1589,30
N=O 1459,73; 1331,12
=C-H thơm 3097,36; 3019,74
7
C-H no 2853,41; 2926,57
C=N 1616,90
C=C thơm 1540,36
N=O 1446,71; 1346,07
C-H no 2926,57 11
32
C=C thơm 1492,63; 1593,28
C=N 1627,02
N-H 3300,69; 3382,05
Nhận xét: Qua bảng nhận thấy kết quả phân tích phổ IR phù hợp với cấu trúc dự kiến
của các chất dự kiến.
3.3.2. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng được trình bày ở phụ lục 2, 8, 12. Kết quả phân tích phổ khối
lượng được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các sản phẩm
CTCT CTPT
KLPT
dự
kiến
m/z Tỷ lệ
(%)
Chú
thích
Phụ
lục
C9H7N3O2S 221,23
221,85 33,67 [M+H]+
2
243,83 100,00 [M+Na]+
C9H6N4O4S 266,23 266,87 100,00 [M+H]+ 8
C9H9N3S 191,25
191,90 100,00 [M+H]+
12
213,87 12,26 [M+Na]+
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ khối lượng cho thấy các chất tổng hợp được đều có
các pic phân tử và có giá trị phổ khối lượng phù hợp với khối lượng phân tử của các
chất dự kiến.
33
3.3.3. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
3.3.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Phổ 1H-NMR của các chất được trình bày từ phụ lục 11 đến 27. Kết quả biện
giải phổ được trình bày trong bảng 9.
Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất
CTCT Kết quả phân tích Phụ
lục
IV
1H-NMR (500MHz, CDCl3+MeOD),
(ppm):
3,92 (2H, t, J= 7,0 Hz, H-2’);
4,30 (2H, t, J= 7,0 Hz, H-3’);
7,19 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-7);
8,01 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-6);
8,29 (1H, s, H-4)
3, 4, 5
V
1H-NMR (500MHz, CDCl3), (ppm):
4,09 (2H, t, J= 7,0 Hz, H-2’);
4,47 (2H, t, J=7,0 Hz, H-3’);
7,81 (1H, s, H-4);
8,07 (1H, s, H-7).
9, 10
VI
1H-NMR (500MHz, D2O), (ppm):
3,88 (2H, t, J= 7,0 Hz, H-2’)
4,21 (2H, t, J= 7,0 Hz, H-3’)
6,58 (1H, dd, J1= 2,0 Hz, J2= 8,5 Hz, H-6)
6,94 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-4)
6,97 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-7)
13, 14,
15
Ghi chú: δ: Độ chuyển dịch hóa học được lấy theo giá trị trung bình (ppm),
s: singlet, d: doublet, dd: doublet doublet, t: triplet, m: multiplet.
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên, nhận thấy sự có mặt
của các tín hiệu proton phù hợp với công thức cấu tạo của các chất dự kiến.
3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ NOESY
34
Phổ NOESY được trình bày ở phụ lục 6. Kết quả được trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7 Kết quả đo phổ NOESY hợp chất IV
3.4. THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN
Dựa vào một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của các dẫn chất 2MBI, chúng
tôi tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn của 3 chất: IV, V, VI thực hiện tại bộ môn
Vi sinh - Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của các chất IV, V, VI được ghi lại trong
bảng 3.6 dưới đây:
Bảng 3.6 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn
Bắt
màu Vi khuẩn Kết quả IV V VI MC
Gr(+) S. aureus D ± s 13,00 ±
0,00
15,70 ±
0,10
12,80 ±
0,21
15,83 ±
0,15
35
B. cereus D ± s - - - 15,00 ±
0,00
B. pumilus D ± s 12,70 ±
1,84
11,23 ±
0,79
12,35
±2,33
15,84 ±
1,64
B. subtilis D ± s 16,10 ±
0,00
12,40 ±
0,42
11,68 ±
0,00
8,46 ±
0,00
S. lutea D ± s 11,61 ±
0,52
13,52 ±
0,40
17,30 ±
0,38
11,00 ±
0,40
Gr(-)
E. coli D ± s 9,63 ±
0,75
13,91 ±
0,45
14,07 ±
0,81
15,61 ±
0,77
P.mirabilis D ± s 9,78
±1,38
9,13 ±
1,03
8,60 ±
0,00
9,35 ±
0,49
S. typhi D ± s 10,74 ±
3,12
11,73 ±
1,51
9,41 ±
2,38
17,31 ±
0,27
S. flexneri D ± s 9,02 ±
1,13
12,63 ±
1,75
10,80 ±
1,56
17,80 ±
0,85
MC: mẫu chứng
Kết luận:
Sau khi đã thử tác dụng kháng khuẩn của 3 hợp chất IV, V, VI với nồng độ
100 µg/ mL , cho thấy kết quả như sau:
- Tất cả đều không có hoạt tính kháng khuẩn với B. cereus.
- Các mẫu đều có tác dụng trên 8 mẫu còn lại, cụ thể:
o Cả 3 dẫn chất đều thể hiện hoạt tính mạnh trên các chủng vi khuẩn S.
aureus, B. subtilis, S. lutea, P.mirabilis.
o Cả 3 dẫn chất đều thể hiện hoạt tính trung bình trên các chủng vi khuẩn
B. pumilus, S. typhi, S. flexneri.
o Trên chủng vi khuẩn E. coli: dẫn chất IV thể hiện hoạt tính trung bình,
các dẫn chất V, VI thể hiện hoạt tính mạnh.
36
3.5. BÀN LUẬN
3.5.1. Về tổng hợp hóa học
3.5.1.1. Phản ứng tổng hợp 2MBI
Phản ứng tạo 2MBI bằng cách ngưng tụ o-phenylendiamin và carbondisulfid
đã được nhiều tác giả trước đây thực hiện tương đối dễ dàng với hiệu suất khá cao.
Trong khóa luận này chúng tôi đã thực hiện phản ứng này và cho hiệu suất khá cao
(90,20%). Sản phẩm thu được ít tạp, dễ tinh chế.
Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng đóng vòng:
Tỷ lệ mol của CS2 và KOH sử dụng:
Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy phản ứng xảy ra tốt nhất khi
sử dụng tỷ lệ mol giữa 3 chất là o-phenylendiamin: CS2: KOH (1: 1: 1). Khi thay đổi
đều làm giảm hiệu suất phản ứng.
Nhiệt độ phản ứng:
Nhiệt độ phản ứng có ảnh hưởng đến hiệu suất và thời gian phản ứng, trong
đó chúng tôi đã tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho phản ứng ở khoảng 90°C. Nếu nhiệt độ
thấp, phản ứng diễn ra chậm và không hoàn toàn. Nếu nhiệt độ quá cao sẽ tạo ra nhiều
tạp do phản ứng oxy hóa amin, do đó làm giảm hiệu suất phản ứng.
Lượng than hoạt sử dụng, nhiệt độ và thời gian tẩy màu:
Thường trong quá trình tẩy màu lượng than hoạt sử dụng tốt nhất là 5- 10% so
với lượng sản phẩm, phải lọc lấy sản phẩm khoảng nhiệt độ tốt nhất là 60 oC và thời
gian là 10 phút. Việc giảm hoặc tăng lượng than hoạt, nhiệt độ và thời gian sẽ làm
giảm hiệu suất phản ứng.
3.5.1.2. Tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol
Đây là phản ứng akyl hóa, phản ứng xảy ra theo cơ chế ái nhân lưỡng phân tử
SN2 trong đó có khả năng ái nhân của –SH lớn hơn –NH (xem hình 3.7).
37
Hình 3.7 Cơ chế tạo dẫn chất III từ II
Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo ra chất III:
Tỷ lệ mol II : dicloroethan
Tỷ lệ mol này có vai trò quan trọng để nâng cao tính chọn lọc của phản ứng
và độ tinh khiết của sản phẩm III. Trong đó, chúng tôi đã dùng tỷ lệ II : dicloroethan
= 1:6. Trên thực nghiệm cho thấy nếu dùng lượng dư hoặc vừa đủ II trên SKLM quan
sát thấy xuất hiện nhiều vết của sản phẩm phụ (xem hình 3.8).
Hình 3.8 Các sản phẩm phụ có thể có trong phản ứng tổng hợp III
Thứ tự nạp liệu
38
Cách thực hiện phản ứng cũng rất quan trọng. Cần nhỏ giọt dung dịch II (trong
isopropanol/ aceton) vào tác nhân dicloroethan. Nếu nhỏ giọt dung dịch II quá nhanh
thì các sản phẩm phụ cũng dễ tạo ra do lượng cục bộ của II trong khối phản ứng.
3.5.1.3. Tổng hợp chất IV
Phản ứng nitro hóa tạo dẫn xuất mononitro chỉ thu được một đồng phân duy
nhất như dự kiến mặc dù cấu trúc là bất đối xứng. Điều này có thể giải thích là do
trong quá trình phản ứng, trước khi nhỏ tác nhân phản ứng là dung dịch HNO3 40%
vào thì nguyên liệu III đã được hòa tan bằng H2SO4 đặc. Do vậy, nguyên tử N đã
được proton hóa giúp định hướng sự tấn công của ion NO2+ vào vị trí như dự kiến.
Hình 3.9 Cơ chế phản ứng tạo dẫn chất IV
3.5.1.4. Tổng hợp chất V
Phản ứng nitro hóa tạo dẫn xuất dinitro chỉ thu được một đồng phân duy nhất
như dự kiến mặc dù cấu trúc là bất đối xứng. Điều này giải thích tương tự như phản
ứng tạo ra chất IV. Cơ chế phản ứng diễn ra theo 2 giai đoạn như sau:
Hình 3.10 Cơ chế phản ứng tạo dẫn chất V
Trước khi cho tác nhân phản ứng vào hỗn hợp phản ứng, III được hòa tan với
H2SO4 đặc, cả 2 nguyên tử N đều bị proton hóa và giúp định hướng cho NO2+ tấn
công vào phân tử.
Theo nghiên cứu của Zygmunt Kazimierczuk và David Shugar [20] về phản
ứng nitro hóa tương tự được thực hiện trên phân tử benzimidazol. Phản ứng xảy ra
theo sơ đồ sau:
39
Hình 3.11 Phản ứng nitro hóa benzimidazol theo nghiên cứu của Zygmunt
Kazimierczuk và David Shugar
Theo đó nếu giai đoạn mononitro hóa đầu tạo ra hỗn hợp 2 đồng phân thì giai
đoạn nitro hóa tiếp theo sẽ tạo ra sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp dinitro. Nếu quá
trình mononitro chỉ tạo ra 1 dẫn xuất mononitro hóa duy nhất thì sau khi được nitro
hóa lần 2 thì sẽ chỉ tạo ra một dẫn xuất dinitro duy nhất (xem hình 3.11) [20].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, ở giai đoạn tạo dẫn chất mononitro cũng thu
được sản phẩm duy nhất, hoàn toàn phù hợp với các kết quả phân tích phổ của chúng
tôi. Nên cũng có thể kết luận rằng phản ứng dinitro hóa chỉ tạo ra một dẫn chất duy
nhất.
3.5.1.5. Tổng hợp chất VI
Phản ứng tổng hợp chất VI xảy ra theo sơ đồ sau [1], [8]:
Phản ứng xảy ra tương đối dễ dàng với hiệu suất 37,02%.
Quá trình xử lý khối phản ứng có sinh ra khí hydro sulfid, có mùi khó chịu và
độc hại, cần được xử lý bằng các biện pháp thích hợp. Trong nghiên cứu, chúng tôi
đã sử dụng dung dịch NaOH loãng để thu hồi xử lý khí này.
3.5.2. Về cấu trúc sản phẩm
Các hợp chất II, III
40
Đây là các hợp chất đã được tổng hợp trước đây, cấu trúc của chúng đã được
xác định. Trong khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành chạy SKLM, xác định Rf và
đo nhiệt độ nóng chảy để khẳng định lại các chất.
Các hợp chất IV, V, VI là các chất mới chưa từng được tổng hợp trước đây, vì
vậy chúng tôi tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), và phổ cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc của chúng.
Hợp chất IV
Trên phổ IR quan sát thấy các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhân benzimidazol
(C=Cthơm tại 1589,30 cm-1; C-Hthơm tại 3097,36 cm-1 ). Đồng thời nhận thấy từ phổ
các nhóm đặc trưng khác của chất IV: N=O (1459,73 cm-1; 1331,12 cm-1) C-H no
(2853,41 cm-1; 2925,36 cm-1), C=N (1615,57 cm-1).
Phổ khối lượng của chất này cho pic phân tử m/z là 221,85 ([M+H]+), 243,73
([M+Na]+) phù hợp với KLPT (221,23) và CTPT của IV (C9H7N3O2S).
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của cho thấy IV có cấu
trúc đúng như dự kiến. Trong đó hydro nhóm S–CH2-C có độ chuyển dịch hóa học δ
là 3,92 ppm ở dạng triplet (t) với hằng số J= 7,0 Hz, hydro nhóm N-CH2-C cho δ phù
hợp tại 4,30 ppm dạng triplet với hằng số J= 7,0 Hz. Các hydro thơm nhân
benzimidazol xuất hiện tại trường đặc trưng 7,19 ppm (H-7) ở dạng doublet với hằng
số J= 7,0 Hz, 8,01 ppm (H-6) ở dạng doublet với hằng số = 7,0 Hz và 8,29 (H-4) ở
dạng singlet.
Kết quả phân tích phổ NOESY của chất IV chỉ ra nguyên tử H-7 có tương tác
không gian với nguyên tử H-3’. Chứng tỏ nhóm NO2 phải ở vị trí 5, đúng như công
thức cấu tạo dự kiến.
Từ kết quả phân tích các phổ trên chúng tôi xác định được cấu trúc IV đúng
như dự kiến.
Hợp chất V
41
Trên phổ IR quan sát thấy các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhân benzimidazol
(C=Cthơm tại 1540,36 cm-1; C-Hthơm tại 3097,36 cm-1 và 3019,74 cm-1). Đồng thời nhận
thấy từ phổ các nhóm đặc trưng khác của chất V là: N=O (1446,71 cm-1; 1324,98 cm-
1) C-H no (2853,41 cm-1, 2926,57 cm-1), C=N (1616,90 cm-1)
Phổ khối lượng của chất này cho pic phân tử m/z là 266,87 ([M+H]+) phù hợp
với KLPT (266,23) và CTPT của V (C9H6N4O4S).
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton cho thấy V có cấu trúc
đúng như dự kiến. Trong đó hydro nhóm S–CH2-C có độ chuyển dịch hóa học δ là
4,09 ppm ở dạng triplet (t) với hằng số J= 7,0 Hz, hydro nhóm N-CH2-C cho δ phù
hợp tại 4,47 ppm dạng triplet với hằng số J= 7,0 Hz, các hydro thơm nhân
benzimidazol xuất hiện tại trường đặc trưng 8,07 ppm (H-7) ở dạng singlet và 7,81
ppm (H-4) ở dạng singlet.
Từ kết quả phân tích các phổ trên chúng tôi xác định được cấu trúc V đúng
như dự kiến.
Hợp chất VI
Trên phổ IR quan sát thấy các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhân benzimidazol
(C=Cthơm tại 1492,63 cm-1 và 1593,28 cm-1). Đồng thời nhận thấy từ phổ các nhóm
đặc trưng khác của chất VI là: N-H (3382,05 cm-1, 3300,69 cm-1), C-H no (2926,57
cm-1), C=N (1627,02 cm-1)
Phổ khối lượng của chất này cho pic phân tử m/z là 191,90 ([M+H]+), 213,87
([M+Na]+ phù hợp với KLPT (191,25) và CTPT của VI (C9H9N3S).
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của chất VI chỉ ra VI có
cấu trúc đúng như dự kiến. Trong đó hydro nhóm S–CH2-C có độ chuyển dịch hóa
học δ là 3,88 ppm ở dạng triplet (t), hydro nhóm N-CH2-C cho δ phù hợp tại 4,21
ppm dạng triplet. Hydro thơm của nhân benzimidazol H-6 xuất hiện tại trường đặc
trưng 6,58 ppm ở dạng double doublet với 2 hằng số tương tác spin-spin là 2,0 Hz và
42
8,5 Hz. H-4 tương tác meta với H-6 nên cho tín hiệu doublet tại 6,94 ppm với hằng
số J= 2,0 Hz. H-7 tương tác ortho với H-6 nên cho tín hiệu doublet tại 6,97 ppm với
hằng số J= 8,5 Hz.
Từ kết quả phân tích các phổ trên chúng tôi xác định được cấu trúc VI đúng
như dự kiến.
3.5.3. Về thử tác dụng kháng khuẩn
Năm 2015, tác giả Nai SeangThaing nghiên cứu và thử hoạt tính kháng khuẩn
của một số dẫn chất 2MBI [3]. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng đường
kính vòng vô khuẩn ở nồng độ thích hợp. Trong khóa luận này, tác giả đã thử hoạt
tính kháng khuẩn của 2 hợp chất II, III. Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn chất III theo Nai SeangThaing
Bắt màu Vi khuẩn Kết quả III MC
Gr(+)
B. cereus D ± s - 14,51 ± 1,36
B. subtilis D ± s - 13,06 ± 1,24
B. pumilus D ± s - 16,2 ± 0,75
S. aureus D ± s - 16,47 ± 0,99
S. lutea D ± s - 13,43 ± 0,92
Gr(-) E. coli D ± s - 15,52 ± 0,67
P.mirabilis D ± s - 13,62 ± 4,33
S. flexneri D ± s - 16,22 ± 0,50
S. typhi D ± s 7,48 ± 0,19 17,44 ± 0,57
MC: Mẫu chứng
Kết quả thử nghiệm cho thấy hợp chất III không có tác dụng trên 8/9 chủng vi
khuẩn kiểm định, và thể hiện hoạt tính trung bình với chủng vi khuẩn còn lại (S.
typhi). Từ các giá trị đường kính vòng vô khuẩn của 3 hợp chất IV, V, VI (xem bảng
3.7), chúng tôi có một số nhận định sau:
43
- Vai trò của nhóm nitro: các dẫn chất chứa nhóm thế nitro (IV, V) thể hiện hoạt
tính trên hầu hết các chủng vi khuẩn kiểm định (trừ B. cereus) với hoạt lực
tương đối tốt. So sánh với hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất III trong thử
nghiệm của tác giả Nai SaengThaing, chúng tôi sơ bộ kết luận rằng nhóm nitro
có vai trò quan trọng, giúp tạo ra và tăng cường hoạt tính kháng khuẩn.
- Vai trò của nhóm amino: tương tự như với dẫn chất chứa nhóm nitro, hợp chất
VI với nhóm thế amino ở vị trí số 7 cũng thể hiện hoạt tính tương đối tốt trên
hầu hết chủng vi khuẩn kiểm đinh (trừ B. cereus). Cũng so sánh với thử nghiệm
của tác giả Nai SaengThaing, chúng tôi sơ bộ kết luận rằng nhóm amino có
vai trò quan trọng, giúp tạo ra và tăng cường hoạt tính kháng khuẩn.
- Việc gắn nhóm thế hút điện tử mạnh hay đẩy điện tử trên nhân thơm không
tạo ra tác dụng kháng khuẩn cho khung dẫn chất trên chủng B. cereus.
- Nhóm thế hút điện tử mạnh (-NO2) hay đẩy điện tử (-NH2) đều tạo ra dẫn chất
có tác dụng kháng khuẩn tốt đối với 8/9 chủng vi sinh vật kiểm định, nên chúng
tôi đề xuất tổng hợp và thử tác dụng sinh học trên các dẫn chất của khung 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol với các nhóm thể hút và đẩy điện tử
khác.
44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây, chúng tôi rút ra một số kết
luận sau:
1. Đã tổng hợp được 3 dẫn chất nitro hóa của 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-
b]thiazol là 7-nitro-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (IV); 6,7-dinitro-
2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (V); 7-amino-2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (VI). Cấu trúc của các sản phẩm được xác
định bằng phương pháp phân tích các phổ IR, MS, NMR.
2. Đã thử tác dụng kháng khuẩn của 3 dẫn chất tổng hợp được ở nồng độ 100
µg/mL cho kết quả:
- Cả 3 dẫn chất đều thể hiện hoạt tính mạnh trên các chủng vi khuẩn S.
aureus, B. subtilis, S. lutea, P.mirabilis.
- Cả 3 dẫn chất đều thể hiện hoạt tính trung bình trên các chủng vi khuẩn
B. pumilus, S. typhi, S. flexneri.
- Trên chủng vi khuẩn E. coli: dẫn chất IV thể hiện hoạt tính trung bình,
các dẫn chất V, VI thể hiện hoạt tính mạnh.
- Tất cả đêu không có hoạt tính kháng khuẩn với B. cereus.
ĐỀ XUẤT
Dựa trên kết quả đã đạt được đồng thời tiếp tục phát triển kết quả nghiên cứu
trong khóa luận, góp phần vào quá trình nghiên cứu về tổng hợp và thử tác dụng sinh
học của các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol, chúng tôi xin được đưa ra một số đề
xuất sau:
1. Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol với các nhóm thế đẩy điện tử khác,
nhóm thế hút điện tử ở vị trí số 5 và các vị trí khác.
2. Tiếp tục nghiên cứu các hoạt tính sinh học khác của các 3 dẫn chất 2,3-
dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol như kháng nấm, gây độc tế bào ung
thư, kháng virus, diệt kí sinh trùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Hải, Bùi Thị Thu Hiền, Nguyễn Văn Hân, Nguyễn Văn Giang,
Nguyễn Đình Luyện (2014), "Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn
chất mới của 2-mercaptobenzimidazol", tạp chí Dược học.
2. Nguyễn Đình Luyện (2009), Kỹ thuật hóa dược I, Trường Đại học Dược Hà
Nội.
3. Nai SeangThaing (2015), Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của
một số dẫn chất N,S-dialkyl hóa của 2- mercaptobenzimidazol, Khóa luận tốt
nghiệp dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Tiếng Anh
4. Akula, G., et al (2011), "Synthesis of 3-(1H-benzimidazol-2-yl amino) 2-
phenyl-1, 3-thiazolidin-4-one as potential CNS depressant", Int. J. Pharm.
Tech. Res. 3, pp. 360-364.
5. Al-Rashood, K. A., and Abdel-Aziz, H. A. (2010), "Thiazolo [3, 2-a]
benzimidazoles: synthetic strategies, chemical transformations and biological
activities", Molecules. 15(6), pp. 3775-3815.
6. Ateş-Alagöz, Z., Kuş, C., and Çoban, T. (2005), "Synthesis and antioxidant
properties of novel benzimidazoles containing substituted indole or 1, 1, 4, 4-
tetramethyl-1, 2, 3, 4-tetrahydro-naphthalene fragments", Journal of enzyme
inhibition and medicinal chemistry. 20(4), pp. 325-331.
7. Balestrero, R. S., Forkey, D. M., and Russell, J. G. (1986), "15N NMR:
Iminothiol‐thioamide tautomerism of 2‐mercaptobenzazoles and 1‐methyl‐2‐
mercaptoimidazole", Magnetic resonance in chemistry. 24(8), pp. 651-655.
8. Bhave, R. R., and Sharma, M. M. (1981), "Kinetics of two‐phase reduction of
aromatic nitro compounds by aqueous solutions of sodium sulphides", Journal
of Chemical Technology and Biotechnology. 31(1), pp. 93-102.
9. Can-Eke, B., et al (1998), "A study on the antioxidant capacities of some
benzimidazoles in rat tissues", Chemico-biological interactions. 113(1), pp.
65-77.
10. Chi, K. W., et al (2002), "Synthesis of novel heterocycles containing
perfluoroalkyl groups: Reaction of perfluoro-2-methyl-2-pentene with 1, 3-
binucleophilic reagents", BULLETIN-KOREAN CHEMICAL SOCIETY.
23(7), pp. 1017-1020.
11. Desai, K. G., and Desai, K. R. (2006), "Green route for the heterocyclization
of 2-mercaptobenzimidazole into β-lactum segment derivatives containing–
CONH–bridge with benzimidazole: Screening in vitro antimicrobial activity
with various microorganisms", Bioorganic & medicinal chemistry. 14(24), pp.
8271-8279.
12. El‐Gaby, M. S., et al (2002), "Reactivity of cyanothioformamides and 3‐(4‐
bromophenyl)‐5‐imino‐4‐oxazolidinethione toward ortho‐substituted
nucleophiles", Heteroatom Chemistry. 13(7), pp. 611-616.
13. Elderfield, P. (1961), Heterocyclic Compounds, vol 5, J. Wiley & Sons, New
York, pp.225.
14. Giner-Sorolla, A., Thom, E., and Bendich, A. (1964), "Studies on the Thiation
of Purines1", The Journal of Organic Chemistry. 29(11), pp. 3209-3212.
15. Goud, V. M., and et al (2011), "Synthesis, antimicrobial and pharmacological
evaluation of substituted novel benzimidazoles", Der Pharma Chemica. 3(1),
pp. 446-452.
16. Harrison, D., and Ralph, J. T. (1965), "574. Nucleophilic substitution
reactions of-2-chlorobenzimidazoles. Part II. Formation of benzimidazoline-
2-thiones and related compounds", Journal of the Chemical Society
(Resumed), pp. 3132-3135.
17. Iemura, R., et al (1986), "Synthesis of 2-(4-substituted-1-piperazinyl)
benzimidazoles as H1-antihistaminic agents", Journal of medicinal chemistry.
29(7), pp. 1178-1183.
18. Jo, S. U., et al (2001), "Synthesis and SAR of Benzimidazole Derivatives
Containing Oxycyclic Pyridine as a Gastric H+/K+-ATPase Inhibitors",
Bulletin of the Korean Chemical Society. 22(11), pp. 1217-1223.
19. Junggren, U. K., and Sjostrand, S. E. (1981), “Gastric acid secretion inhibiting
substituted 2-(2-benzimidazolyl)-pyridines, pharmaceutical preparations
containing same, and method for inhibiting gastric acid secretion”, editor,
Google Patents.
20. Kazimierczuk, Z., and Shugar, D. (1989), "Preparation and properties of the
5, 6-and 4, 6 (5, 7)-dinitro derivatives of benzimidazole and their 1-β-D-
ribofuranosides", Nucleosides & nucleotides. 8(8), pp. 1379-1385.
21. Keith L. H., and Walters D. B. (1992), National Toxicology Program's
Chemical Solubility Compendium, Lewis Publishers, Chelsea, pp.260.
22. Kumar, P. S., and Sahoo, J. (2014), "Anthelmintic Evaluation of Some Novel
Synthesized 1, 2, 4-Triazole Moiety Clubbed with Benzimidazole Ring",
Oriental Journal of Chemistry. 30(1), pp. 211-217.
23. Lazer, E. S., Matteo, M. R., and Possanza, G. J. (1987), "Benzimidazole
derivatives with atypical antiinflammatory activity", Journal of medicinal
chemistry. 30(4), pp. 726-729.
24. Mavrova, A. T., et al (2005), "Synthesis and antitrichinellosis activity of some
2-substituted-[1, 3] thiazolo [3, 2-a] benzimidazol-3 (2H)-ones", Bioorganic
& medicinal chemistry. 13(19), pp. 5550-5559.
25. Michael Ash and Irene Ash (2004), Handbook of Preservatives, Synapse Info
Resources, pp.446.
26. Mor, M., et al (2004), "Synthesis, biological activity, QSAR and QSPR study
of 2-aminobenzimidazole derivatives as potent H 3-antagonists", Bioorganic
& medicinal chemistry. 12(4), pp. 663-674.
27. Nakano, H., et al (1999), "Synthesis of benzimidazole derivatives as
antiallergic agents with 5-lipoxygenase inhibiting action", Chemical &
pharmaceutical bulletin. 47(11), pp. 1573-1578.
28. Nevade, S. A., Lokapure, S. G., and Kalyane, N. V. (2013), "Synthesis and
Pharmacological Evaluation of Some Novel 2-Mercapto Benzimidazole
Derivatives", Journal of the Korean Chemical Society. 57(6), pp. 755-760.
29. Rao, S. S., Dubey, P. K., and Kumari, Y. B. (2013), "A Green and Simple
synthesis of N-substituted-2-mercapto benzimidazoles", Indian Journal of
Chemistry. 52, pp. 1210-1213.
30. Sharma, S. (1986), "The Chemistry of Thiophosgene", Sulfur reports. 5(1),
pp. 1-87.
31. Sean C Sweetman (2009), Martindale The Complete Drug Reference, 36,
Pharmaceutical Press, London, pp.959.
32. Thakuria, H., and Das, G. (2008), "An expeditious one-pot solvent-free
synthesis of benzimidazole derivatives", Arkivoc. 15, pp. 321-328.
33. VanAllan J. A., and Deacon B. D. (1950), "2-mercaptobenzimidazol",
Organic Syntheses(30), pp. 56.
34. Vedula, M. S., et al (2003), "New styryl sulfones as anticancer agents",
European journal of medicinal chemistry. 38(9), pp. 811-824.
35. Xiang, P., et al (2012), "Novel benzothiazole, benzimidazole and benzoxazole
derivatives as potential antitumor agents: synthesis and preliminary in vitro
biological evaluation", Molecules. 17(1), pp. 873-883.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Phổ hồng ngoại IR của chất IV
Phụ lục 2 Phổ MS-positive chất IV
Phụ lục 3 Phổ 1H-NMR chất IV
Phụ lục 4 Phổ 1H-NMR giãn rộng chất IV
Phụ lục 5 Phổ 1H-NMR giãn rộng chất IV
Phụ lục 6 Phổ NOESY-NMR chất IV
Phụ lục 7 Phổ hồng ngoại IR chất V
Phụ lục 8 Phổ MS-positive chất V
Phụ lục 9 Phổ 1H-NMR của chất V
Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR của chất V
Phụ lục 11 Phổ hồng ngoại IR chất VI
Phụ lục 12 Phổ MS-positive chất VI
Phụ lục 13 Phổ 1H-NMR của chất VI
Phụ lục 14 Phổ 1H-NMR giãn rộng chất VI
Phụ lục 15 Phổ 1H-NMR giãn rộng chất VI
Phụ lục 1: Phổ hồng ngoại IR của chất IV
Phụ lục 2: Phổ MS-positive chất IV
Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR chất IV
Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR giãn rộng chất IV
Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR giãn rộng chất IV
Phụ lục 6: Phổ NOESY-NMR chất IV
Phụ lục 7: Phổ hồng ngoại IR của chất V
Phụ lục 8: Phổ MS-positive chất V
Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR chất V
Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR giãn rộng chất V
Phụ lục 11: Phổ hồng ngoại IR của chất VI
Phụ lục 12: Phổ MS-positive chất V
Phụ lục 13: Phổ 1H-NMR chất VI
Phụ lục 14: Phổ 1H-NMR giãn rộng chất VI
Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR giãn rộng chất VI
![KLTN - Hieu Qua Su Dung Von (18!6!09)3[1]](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/577d20de1a28ab4e1e93f33d/kltn-hieu-qua-su-dung-von-1860931.jpg)
