Texty k úlohám na laboratórne cvičenia pre cyklus separačných metód - chromatografia a elektroforéza laboratórium č. 472 Tieto študijné texty (interná pomôcka) sú vybrané a spracované s cieľom zjednodušenia individuálnej prípravy na laboratórne cvičenie. Obsahujú základné informácie potrebné na zvládnutie praktických úloh a vyhodnotenie meraní, na podklade vybraných textov z Praktika (1). Na ucelenejšie pochopenie súvislostí a doplnenie poznatkov odporúčame aj podrobnejšie štúdium z pôvodnej literatúry: 1. kniha: M. Čakrt a kolektív: Praktikum z analytickej chémie, 1989 2. skriptá: D. Bustin a kolektív: Analytická chémia II, tlačená verzia (1996) alebo elektronická učebnica Analytická chémia 3. kniha: J. Garaj, D. Bustin, Z. Hladký: Analytická chémia Všetky chromatografické metódy: 2. Skriptá: Analytická chémia II, 5-44 téma plynovej chromatografie 1.Praktikum..., str. 278-293 text k podobným úlohám 12.5.2.(str.301-306) a 12.5.3.(str. 306-312) 2. Skriptá: Analytická chémia II, teória str. 5-28, 41-43 téma kvapalinovej chromatografie 1. Praktikum..., hodnotenie výsledkov HPLC 232-239, mobilné fázy 229-232 2. Skriptá: Analytická chémia II, str. 5-19, 21-22, 28-40 téma tenkovrstvovej chromatografie 1. Praktikum ..., str. 313-323, 225-231 2. Skriptá: Analytická chémia II, str. 20-21, 32-33, 43-44 téma elektroforézy: 1. Praktikum ..., str. 331-336 2. Skriptá: Analytická chémia II, str. 44-49 Pre všetky úlohy je potrebné ovládať základné výpočty, ktoré sú všeobecne platné - Praktikum..., kapitola 5 (časť 5.1 nutný základ) časť 5.2: Výpočty výsledkov chemických analýz, str 119-127, potrebná na spracovanie výsledkov meraní pre kvantitatívnu analýzu

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIA Plynová chromatografia patrí medzi separačné metódy, ktoré využívajú dvojfázovú sústavu. Táto dvojfázová sústava sa vytvorí v chromatografickej kolóne - úzkej dlhej rúrke z inertného materiálu tým, že plynná fáza prúdi cez kolónu (tzv. mobilná fáza) a druhá fáza je umiestnená v chromatografickej kolóne tak, aby sa nepremiestňovala (stacionárna fáza). Stacionárnou fázou môže byť viskózna kvapalina, zosietený polymér alebo tuhá fáza so špeciálne upraveným povrchom. V kolóne je fixovaná ako film alebo tenká vrstva na vnútornom povrchu dlhej kolóny s veľmi malým priemerom (v prípade kapilárnych kolón), alebo vo forme husto natlačených zrniek (v prípade náplňových kolón), ktoré buď priamo sú stacionárnou fázou (povrchovo aktívny adsorbent, alebo molekulové sitá), alebo sú z inertného materiálu a majú tenkú vrstvu stacionárnej fázy na svojom povrchu. Nosný plyn prúdi cez voľný priestor medzi časticami náplne kolóny, resp. okolo vrstvy stacionárnej fázy v kolóne. Používajú sa chromatografické kolóny kovové, sklené a kremenné. Vzorka sa dávkuje do prúdu plynu, ktorým sa prenesie do chromatografickej kolóny a nepretržitým prúdením plynu sa súčasti vzorky premiestňujú postupne cez kolónu. Preto sa mobilná fáza nazýva aj nosný plyn. Pohyb molekúl analyzovaných zlúčenín je brzdený ich interakciou so stacionárnou fázou v kolóne. Na základe rôznej schopnosti pútať sa na stacionárnu fázu sa chemicky a priestorovo odlišné molekuly rôznych zlúčenín spomaľujú odlišne a tým dochádza k ich priestorovej separácii do zón podľa charakteru zlúčeniny, ktoré postupujú kolónou. Na výstupe kolóny je umiestnený detektor, ktorý indikuje prítomnosť látky inej ako nosný plyn. Signál z detektora sa vyhodnocuje a z časového priebehu intenzity signálu sa určia píkové maximá a plochy píkov. Zhodnotením chromatogramu sa zistí druh a kvantitatívne zastúpenie zložiek. Keďže pri tejto metóde sa analyty musia previesť do plynnej fázy, dajú sa analyzovať také látky, ktoré majú dostatočný tlak nasýtených pár (t.j. sú dostatočne prchavé) pri pracovných teplotách, sú tepelne stále, majú relatívnu molekulovú hmotnosť menšiu než 1000. Všeobecne sa môže plynová chromatografia použiť na separáciu plynov, väčšiny nedisociovateľných kvapalných a tuhých organických zlúčenín po rozpustení v rozpúšťadlách. Dajú sa analyzovať aj dostatočne prchavé organokovové zlúčeniny. Plynová chromatografia sa nedá použiť priamo na separáciu makromolekúl, organických a anorganických solí, preto sa používa chemická premena pôvodného analytu na deriváty, ktoré sa plynovou chromatografiou už dajú analyzovať. Možno analyzovať aj rozkladné produkty z pôvodných materiálov po pyrolýze, čo sa využíva na ich charakterizovanie. Plynový chromatograf sa skladá z niekoľkých súčastí, obr. Zásobníkom mobilnej fázy (nosného plynu) je tlaková fľaša obsahujúca vodík, dusík, hélium alebo argón (tlak do 15 MPa). Plyn má za úlohu prenášať v plynnej fáze súčasti vzorky kolónou a má byť inertný voči zložkám vzoriek. Pri výbere plynu sa zohľadňujú aj požiadavky na bezpečnosť práce a cenu. Zariadenie sa musí starostlivo

overovať na tesnosť, aby nedochádzalo k úniku plynu. Voľba nosného plynu je často daná druhom kolóny a použitého detektora. Čistiace zariadenie na plyny zachytáva vlhkosť, nežiadúce prímesi ostatných plynov, hlavne kyslíka. Čistota nosného plynu by mala byť lepšia ako 99,995 %. Zariadenie obsahuje časti zabezpečujúce reguláciu toku nosného plynu (redukčný ventil, stabilizátor tlaku alebo prietoku) a meranie parametrov toku (manometer a prietokomer). V moderných prístrojoch s elektronickou reguláciou sa dá udržiavať požadovaný prietok nosného plynu aj počas analýz s programovaným menením teploty (používajú tlakový a prietokový senzor so spätnou regulačnou väzbou na proporcionálne ventily). Dávkovač (dávkovací vstup) slúži na zavedenie vzorky do prúdu nosného plynu. Technika dávkovania musí zaistiť prenos vzorky v čo najkratšom čase, najčastejšie jej odparením v prípade kvapalných vzoriek. Roztoky sa dávkujú injekčnými striekačkami cez gumové (alebo silikónové) tesnenie ručne alebo pomocou dávkovacích automatov. Pre plynné vzorky sa používajú plynotesné striekačky alebo obtokové dávkovacie kohúty rôznych konštrukcií. Najčastejší dávkovač je vyparovač (vyhriaty zvyčajne na teplotu vyššiu ako je teplota varu všetkých zložiek vzorky aj rozpúšťadla), ktorý pracuje s delením alebo bez delenia prúdu plynu a vzorky. Dávkovanie s delením sa používa pre tenšie kapilárne kolóny a koncentrované vzorky. Kolóny s malým vnútorným priemerom, ktoré obsahujú menej stacionárnej fázy, majú menšiu kapacitu, preto sa pomocou deliča toku odvetví časť toku plynu so vzorkou tesne pred vstupom do kolóny. Do kolóny sa tak dostane len definovaný zlomok dávkovaného množstva (okolo 0,1-10 % z pôvodných 0,2-2μl). Pred delením sa musí zabezpečiť rovnomerné odparenie vzorky a účinné premiešanie pár s nosným plynom. Do náplňových kolón sa vzorka dávkuje bez delenia.

Kolóna je najdôležitejšia súčasť chromatografu, pretože v kolóne dochádza k separácii zložiek vzorky na relatívne samostatné zóny (podľa ich odlišnosti). Premiestňovanie zón zložiek vzorky v kolóne závisí od rýchlosti toku nosného plynu a od teploty. Preto sa teplota priestoru, v ktorom je umiestnená kolóna musí spoľahlivo regulovať. Izotermická separácia sa používa, ak sa zložky vzorky nelíšia príliš svojimi teplotami varu. Ak sú vo vzorke prítomné zlúčeniny s pomerne veľkým rozsahom teplôt varu a je ich veľa, separácia pri jednej teplote by bola časovo náročná. Teplota kolóny sa preto môže programovo meniť počas analýzy vzorky v rozsahu približne 40-320 °C, materiál kolóny musí odolávať vplyvu teploty. Detektor slúži na detekciu iných látok v nosnom plyne (signalizuje ich prítomnosť) hneď po výstupe z kolóny, poskytovaný signál súvisí aj s množstvom častíc (molekúl) látky práve prechádzajúcej detektorom. Zaznamená sa tak profil zóny určitej látky v čase, ktorý sa prejaví na výslednom zázname analýzy - chromatograme - ako chromatografický pík. Šírka píku zodpovedá v časových jednotkách intervalu, počas ktorého sa látka pozoruje na výstupe z kolóny, výška píku zodpovedá maximálnej pozorovanej koncentrácii látky (alebo počtu z nej vzniknutých častíc) v nosnom plyne pri prechode detektorom. Detektor má mať rýchlu odozvu, veľký lineárny rozsah, veľkú citlivosť a stabilný základný signál (pozadie).

Tepelno-vodivostný detektor (TCD) je univerzálny pre všetky látky, ktoré majú tepelnú vodivosť odlišnú od nosného plynu. Tok plynu z kolóny prúdi okolo Pt vlákna žeraveného stálym elektrickým prúdom a ochladzuje ho na určitú teplotu. Prítomnosť analytu v plyne zmení tepelnú vodivosť prostredia v okolí vlákna, tým sa teplota vlákna zníži a ovplyvní odpor voči vedeniu prúdu, ktorý sa porovná s vláknom v referenčnej cele a kompenzuje sa zmenou príkonu. Zaznamená sa zodpovedajúca elektrická veličina. Vývoj viedol k zmenšeniu objemu cely a použitiu iných odporových prvkov. Plameňovo ionizačný detektor (FID). Molekuly plynu sa ionizujú v plameni (pomocné plyny vodík/vzduch) a zaznamenáva sa prúd úmerný počtu iónov medzi elektródami, na ktoré je vložené jednosmerné napätie. Jednou elektródou je priamo výstupná dýza

horáka (prípoj je dotykový) a druhou je zberná elektróda v tvare plášťa valca. Prítomnosť inej látky (obsahujúcej C-H väzby) v plyne zvýši ionizáciu a elektrický prúd sa zväčší. Detektor indikuje prakticky všetky látky okrem anorganických pár a plynov. Voda znižuje odozvu detektora, zháša plameň a ochladzuje detektor. Odozva detektora sa zvyšuje s počtom uhlíkových atómov poskytujúcich ióny CHO+ a znižuje s prítomnosťou heteroatómov v molekule. Detektor je veľmi citlivý na uhľovodíky., pre ktoré medza detekcie dosahuje pg analytu. Detektor záchytu elektrónov (ECD). Rádioaktívny žiarič 63Ni svojím žiarením β (prúd rýchlych elektrónov) ionizuje molekuly dusíka (pomocný plyn) a uvoľnia sa pomalé elektróny, registruje sa zodpovedajúci prúd. Pri výstupe látky z kolóny chromatografu, ktorá obsahuje elektronegatívne atómy, sa pomalé elektróny môžu zachytiť týmito atómami, výsledkom je zníženie prúdu, ktoré sa kompenzuje a zaznamená sa zodpovedajúca elektrická veličina. Detektor je veľmi citlivý na halogenované zlúčeniny, a tiež poskytuje signál pre zlúčeniny obsahujúce fosfor, kyslík a síru, ďalej napr. nitroskupiny. Veľmi rozšírené použitie má v súčasnosti spojenie plynového chromatografu s hmotnostným spektrometrom (MS), v ktorom sa molekuly organických látok vystupujúce z kolóny ionizujú a štiepia, následne sa vytvorené ióny separujú a zaznamenajú (napr. dopadom na násobič). Poskytuje sa tak informácia o štruktúre organickej zlúčeniny prítomnej v prúde plynu, a na základe porovnania druhu iónov s databázovými údajmi pre rôzne zlúčeniny je možné konkrétnu látku potvrdiť. Zároveň sa dá počet vzniknutých iónov použiť na kvantitatívnu analýzu. Pre plynovú chrmatografiu sa používa niekoľko konštrukčných typov detektorov na princípe MS, ktoré sa líšia spôsobom tvorby a analýzy vzniknutých iónov.

CHARAKTERIZÁCIA NÁPLNÍ CHROMATOGRAFICKÝCH KOLÓN

VYHODNOTENIE NAMERANÝCH ÚDAJOV Kvalitatívna analýza Pre identifikáciu látky je podstatné umiestnenie maxima píku na chromatograme vzhľadom na časovú os. Toto umiestnenie sa dá vyjadriť elučnými (retenčnými) údajmi. Na potvrdenie prítomnosti určitej zlúčeniny vo vzorke sa využíva: - porovnanie elučných údajov získaných meraním pre vzorku aj dostupný štandard tej istej zlúčeniny, po vhodnej úprave na analýzu - napr. príprava homogénneho roztoku. Všetky podmienky analýzy musia byť rovnaké. - porovnanie relatívnych elučných údajov získaných meraním pre vzorku a publikovaných v databázach elučných údajov pre štandard tej istej zlúčeniny za zhodných podmienok analýzy (typ kolóny, teplota, rýchlosť toku nosného plynu). - kombinácia dostupných porovnávacích elučných údajov a identifikačných charakteristík poskytovaných detektorom (najčastejšie spektrálnym) - napríklad nameraných hmotnostne spektrometrických údajov. Ak sa zistí, že štandard predpokladanej zlúčeniny a určovaná zlúčenina majú odlišné elučné správanie, je to jednoznačné potvrdenie toho, že ide o rôzne chemické indivíduá. Ak nie sú známe iné doplňujúce údaje o zložkách vzorky, zhoda elučných údajov iba na jednej stacionárnej fáze pri jednej kombinácii tlakových a teplotných podmienok neznamená spoľahlivý dôkaz totožnosti oboch zlúčenín. Vzájomná zhoda elučných údajov štandardu a analyzovanej zložky vzorky sa musí pozorovať aj pri ich analýze na stacionárnych fázach inej polarity pri viacerých teplotách analýzy. Základné elučné (retenčné) údaje Elučný (retenčný) čas tR analytu sa dá použiť na priame porovnanie so štandardmi, len ak sú k dispozícii na analýzu a ak je zhoda opakovaných meraní za striktne rovnakých podmienok výborná a analyzujú sa veľmi jednoduché vzorky, v ktorých nie je problém s interferenciami a prekryvom píkov zložiek. Redukovaný elučný čas pre analyt t'R =tR-tM, kde tM je tzv. mŕtvy čas pri daných podmienkach. Hodnota tM sa určí ako elučný čas zlúčeniny (v plynovej chromatografii najčastejšie metán) ktorá sa v kolóne vôbec nezbrzďuje, jej zóna sa pohybuje v kolóne rovnako rýchlo ako nosný plyn. Elučný (retenčný) objem VR zodpovedajúci analytu je objem mobilnej fázy, ktorá prešla cez kolónu za elučný čas analytu tR. Podobne redukovaný elučný objem V'R zodpovedá času t'R a mŕtvy elučný objem VM zodpovedá mŕtvemu času tM. Prepočet časových údajov na objemy mobilnej fázy využíva znalosť objemového prietoku nosného plynu meraného na výstupe kolóny za atmosferických podmienok alebo prepočítaného na štandardné podmienky. Plyn je však stlačiteľný a preto voľný priestor v kolóne Vm cez ktorý prúdi nosný plyn sa nerovná priamo vypočítanej hodnote VM , hodnoty treba prepočítať na podmienky v kolóne počas separačného procesu. Vm=j.VM , kde j je kompresibilitný faktor.

Čistý elučný (retenčný) objem VN a jeho prepočet na špecifický retenčný objem Vs sa na identifikáciu analytu používa len výnimočne, pretože na spoľahlivý výpočet musia byť známe presné údaje o množstve stacionárnej fázy, objemovom toku, tlakoch na vstupe a výstupe kolóny a teplota kolóny. Údaje o toku často nie sú detailne známe. Relatívne elučné charakteristiky Retenčný faktor k (v starších textoch aj kapacitný pomer) je pomer redukovaného elučného času analytu a mŕtveho času (k = t'R/tM). Nezávisí od tlakového spádu a prietoku plynu. Elučný pomer (relatívna retencia) r1,2 je pomer redukovaných elučných časov (t'R,2/t'R,1) za sebou vystupujúcich zložiek 1 a 2 z kolóny, jednou z nich môže byť aj štandard zlúčeniny, ktorá sa použije ako referenčná látka na výpočet elučných pomerov viacerých analytov. Charakteristika nezávisí od tlakového spádu, prietoku plynu, ani množstva stacionárnej fázy v kolóne, platí pre rovnaký typ stacionárnej fázy v kolóne za rovnakej teploty. Vhodný štandard má poskytovať samostatný pík a r1,2 sa zvyčajne vyjadruje väčší ako 1. Pretože výber vhodného štandardu pri zisťovaní elučných pomerov nebol v literatúre jednotný, za základ unifikovaných relatívnych elučných údajov organických zlúčenín pre izotermické podmienky plynovej chromatografie sa navrhli elučné údaje homologického radu n-alkánov. Elučné (retenčné) indexy pre plynovú chromatografiu počítané z jednotnej stupnice kvalitatívnych štandardov, ktorými sú n-alkány, sa nazývajú Kovátsove indexy. Vhodné štandardy (dvojica n-alkánov líšiacich sa o jednu -CH2- skupinu ) sa vyberú tak, aby za rovnakých podmienok analýzy jeden n-alkán mal menší a druhý n-alkán väčší elučný čas ako neznáma látka. Index sa vypočíta:

- n je počet uhlíkových atómov n-alkánu s redukovaným elučným časom t'R,n, ktorý vystupuje z kolóny skôr ako určovaná zlúčenina. - redukovaný elučný čas pre určovanú zlúčeninu je t'R,x. - t'R,n+1 je redukovaný elučný čas vyššieho n-alkánu. Kovátsove indexy rôznych organických zlúčenín sú v literatúre dostupné, tabelované sú zvyčajne pre konkrétnu stacionárnu fázu, parametre kolóny a teplotu izotermickej analýzy, pretože závisia od teploty a polarity stacionárnej fázy. Spolu s indexom sa uvádza aj koeficient lineárnej zmeny indexu s teplotou. Kovátsov index organickej zlúčeniny je aditívna veličina pre molekulu, ak sú známe (publikované) príspevky jednotlivých funkčných skupín, ktoré sa určili analýzou homológov. Pre prácu s programovanou teplotou počas analýzy sa zaviedli tzv. lineárne indexy, ktoré sú ale ovplyvnené viacerými faktormi, preto pri porovnávaní s publikovanými údajmi aj analýzami štandardov sa musia dodržať pri meraní všetky parametre kolóny, teplotného režimu a zároveň pneumatických pomerov v kolóne. Preto sa pre programovanú teplotu pristúpilo v moderných zariadeniach k striktnej štandardizácii podmienok pre dosahovanie opakovateľných elučných časov analyzovaných látok. Podmienkou použitia je elektronická regulácia všetkých parametrov ovplyvňujúcich tok nosného plynu a spoľahlivá regulácia teploty.

Kvantitatívna analýza Výška píku a plocha píku príslušného analytu (integrál píkovej funkcie po odčítaní signálu pozadia) sa zvyšuje s nárastom nadávkovaného množstva analytu do kolóny, a teda aj s nárastom koncentrácie zložky vo vzorke pri rovnakom dávkovanom objeme (roztoku) vzorky. Výška píku sa dá ľahšie merať, ale je viac ovplyvnená malými odchýlkami podmienok. V súčasných prístrojoch sa určuje plocha píkov integráciou signálu. Šírka píku pri správnom dávkovaní nezávisí od množstva analytu (obmedzené kapacitou kolóny). Závislosť plochy píku od koncentrácie analytu v dávkovanom roztoku zvyčajne nie je lineárna v celom rozsahu, preto sa určuje pri odskúšaní analytickej metódy pracovný interval, v ktorom je závislosť lineárna. Na kvantitatívnu analýzu je potrebné veľkosť signálu kalibrovať, využíva sa niekoľko metód porovnávania signálu. Metóda vnútornej normalizácie Určia sa plochy píkov všetkých zložiek vzorky na úplnom chromatograme z analýzy vzorky a ich súčet sa považuje za základ 100 %. Plochy jednotlivých píkov vyjadrené v % zodpovedajú mólovému (alebo hmotnostnému) zlomku zložky vo vzorke podľa toho, aký princíp a typ detekcie sa použil. Prakticky je však nutné vopred zistiť pomocou referenčných látok a definovanej modelovej zmesi štandardov s podobným zložením, ako majú vzorky, odozvu detektora na jednotkové množstvo všetkých látok prítomných vo vzorke (relatívne voči jednej zložke zmesi). Len ak sú odozvy zhodné, dá sa použiť jednoduchý výpočet, inak sa relatívne hodnoty odozvy musia zahrnúť do výpočtu. Použitie metódy je obmedzené na relatívne vzorky s porovnateľným obsahom zložiek. Ak sa použije na zriedenie vzoriek rozpúšťadlo, jeho signály sa zvyčajne nezapočítavajú.

Metóda využívajúca externý štandard Zvlášť sa vykoná analýza známeho objemu (roztoku) vzorky a analýza známeho objemu (roztoku) štandardu analytu so známou koncentráciou za rovnakých podmienok. Porovnávajú sa zodpovedajúce plochy píkov (resp. výšky píkov). Pri metóde jedného externého štandardu sa predpokladá, že závislosť plochy píku od koncentrácie analytu v roztoku (alebo látkového množstva, resp. hmotnosti analytu zavedeného do kolóny a ďalej do detektora) je lineárna a prechádza bodom [0,0]. Potom platí, že plocha píku získaná integráciou Ai = Si.mi , kde Si je citlivosť detektora na analyt a mi je celková hmotnosť analytu v dávkovanom objeme roztoku. Musí sa striktne dodržiavať zhodný objem dávkovaných roztokov vzorky aj štandardu, analýzy sa musia opakovať a musí sa vyhodnotiť aritmetický priemer meraní a opakovateľnosť meraní - určením zodpovedajúceho intervalu spoľahlivosti. Pri metóde kalibračnej krivky sa musí pripraviť niekoľko roztokov štandardu analytu s rôznou koncentráciou v predpokladanom rozmedzí možných koncentrácií vo vzorkách. Nedá sa používať rôzny dávkovaný objem jedného roztoku, pretože zmena dávkovaného objemu v chromatografických metódach ovplyvňuje tvorbu zóny vzorky na vstupe do kolóny a môže zmeniť tvar píkov na chromatograme. Vykonajú sa opakovane analýzy všetkých roztokov štandardu analytu, vyhodnotí sa závislosť plochy píku analytu od koncentrácie analytu v roztoku (alebo látkového množstva, resp. hmotnosti látky nadávkovanej do kolóny). Z matematickej rovnice popisujúcej závislosť (lineárna, resp. polynomická) alebo z grafu závislosti sa určí zodpovedajúca x-súradnica (veličina, ktorá sa použila pri zostavení závislosti) pre roztok vzorky použitý na analýzu. Podľa postupu prípravy roztoku vzorky sa získaná hodnota prepočíta na obsah analytu v pôvodnej vzorke. Metóda využívajúca vnútorný (interný) štandard - používa sa prídavok štandardu zlúčeniny odlišnej od analytu Pri tejto metóde sa vyjadruje relatívna hodnota signálu analytu voči signálu porovnávacej zlúčeniny inej ako analyt, ale podobných chromatografických vlastností, ktorá sa vo vzorke pôvodne nenachádzala, ale pridala sa do roztoku vzorky v známom množstve (táto porovnávacia zlúčenina sa označuje ako interný alebo vnútorný štandard). Podmienkou je možnosť pripraviť zmesný kalibračný roztok oboch zlúčenín, nesmú spolu reagovať a musia poskytnúť samostatné neprekrývajúce sa píky na chromatograme. Výhodou tohto prístupu je eliminácia chýb v meraní objemu pri dávkovaní kvapalných vzoriek. Ak sa použije jeden kalibračný roztok, pripraví sa zo štandardu analytu a štandardu porovnávacej zlúčeniny do známeho objemu. V prípade malých množstiev látok sa pripravia zásobné roztoky oboch látok a z nich sa pripraví zmesný zriedený kalibračný roztok. Koncentrácie oboch látok by mali byť rádovo porovnateľné. Z chromatogramov opakovaných analýz známeho objemu tohto kalibračného roztoku sa vyhodnotí vzájomný pomer plôch píkov oboch látok a jeho priemerná hodnota.

Predpokladom použitia tohto prístupu je platnosť lineárnej závislosti plochy píku od koncentrácie látky v dávkovanom roztoku, alebo celkovej hmotnosti látky v nadávkovanom objeme roztoku aj pre analyt aj pre vnútorný štandard, napr. v tvare: Ai = Si.mi kde Si je citlivosť detektora na analyt a mi je celková hmotnosť analytu v dávkovanom objeme roztoku Aš = Sš.mš kde Sš je citlivosť detektora na vnútorný štandard a mš je celková hmotnosť vnútorného štandardu v dávkovanom objeme roztoku. Z podielu rovníc (Ai /Aš )= (Si. /Sš.) · (mi /mš) sa vypočíta relatívny odozvový faktor fi,rel. = (Sš. /Si). Roztok vzorky sa pripraví tak, že k známej hmotnosti (alebo objemu zásobného roztoku spracovanej vzorky) sa pridá návažok (alebo známy objem zásobného roztoku) štandardu porovnávacej zlúčeniny, a roztok sa doplní do známeho objemu. Z chromatogramu analýzy takého roztoku vzorky sa vyhodnotí vzájomný pomer plôch píkov a podľa určeného relatívneho odozvového faktora a známeho množstva (alebo koncentrácie) vnútorného štandardu sa vypočíta obsah analytu v roztoku vzorky. Podľa postupu prípravy roztoku vzorky sa získaná hodnota prepočíta na obsah zložky v pôvodnej vzorke. Ak sa použije kombinovaná metóda kalibračnej krivky s vnútorným štandardom, pripraví sa séria kalibračných roztokov (ako je uvedené pre jeden roztok) s rôznou koncentráciou analytu a zvyčajne rovnakou koncentráciou vnútorného štandardu. Rozsah koncentrácií analytu sa volí podľa predpokladanom rozmedzí možných koncentrácií vo vzorkách Všetky roztoky sa pripravujú na rovnaký objem. Kalibračné roztoky sa analyzujú chromatograficky za rovnakých podmienok. Z chromatogramov sa určia vzájomné pomery plôch píkov analytu a vnútorný štandard, a zhodnotí sa závislosť pomeru plôch píkov od pomeru koncentrácií analytu a vnútorného štandardu. Ak je koncentrácia vnútorného štandardu vo všetkých roztokoch rovnaká, nezávisle premennou môže byť priamo koncentrácia analytu v kalibračných roztokoch. Roztok vzorky s vnútorným štandardom sa pripraví ako v predošlej časti. Pre zistený pomer plôch analytu a vnútorného štandardu sa z kalibračnej závislosti určí zodpovedajúca koncentrácia analytu v roztoku vzorky. Metóda prídavku štandardu analytu Na analýzu sa použijú minimálne dva zhodné podiely vzorky (zásobného roztoku vzorky). K jednému z nich sa pridá známe množstvo (známy objem zásobného roztoku) štandardu analytu. Doplnením na rovnaký objem sa pripravia dva roztoky, ktoré sa analyzujú chromatograficky. Zväčšenie plochy píku je priamo úmerné pridanému množstvu štandardu. Podmienkou použitia tejto metódy je vopred potvrdená platnosť lineárnej závislosti plochy píku analytu od koncentrácie analytu, ktorá prechádza bodom [0,0] predošlou kalibráciou (t.j.závislosť v tvare Ai = Si.mi). Pre výpočet koncentrácie vzorky musí byť známy dávkovaný objem a dávkovanie musí byť veľmi spoľahlivé. Na elimináciu chýb dávkovania sa môže použiť aj prídavok porovnávacej inej látky (ako v metóde vnútorného štandardu).

Účinnosť separácie Separačnú účinnosť v plynovej chromatografii možno charakterizovať z nameraných údajov pre jednu látku: počtom teoretických priehradiek n, počtom efektívnych priehradiek N a výškovým ekvivalentom teoretickej priehradky H. Pre dvojicu zložiek je vhodnou mierou účinnosti oddelenia rozlišovací faktor R1,2. Účinnosťou kolóny charakterizujeme jej schopnosť separovať zložky zmesi. Čím je kolóna účinnejšia, tým lepšie dokáže od seba zložky zmesi oddeliť. Účinnosť kolóny rastie s počtom teoretických priehradiek kolóny n. Teoretická priehradka je (hypoteticky) časť kolóny, v ktorej dochádza k jednotkovému procesu ustálenia rovnováhy medzi mobilnou a stacionárnou fázou. Dĺžka tejto časti kolóny sa nazýva výškový ekvivalent teoretickej priehradky H. Pre kolónu s dĺžkou L je výškový ekvivalent teoretickej priehradky H=L/n. Počet teoretických priehradiek n sa dá určiť z chromatogramu podľa vzťahov: n = 16 (tR/Y)2 alebo n = 5,54(tR/Yh/2)2

kde Y je šírka píku pri jeho základni, Yh/2 je šírka píku v polovici jeho výšky. Dôležitá podmienka práce v plynovej chromatografii je vykonávanie analýz pri optimálnom prietoku a rýchlosti toku nosného plynu, pretože hodnota H závisí od priemernej rýchlosti toku nosného plynu (ū =L/tM) podľa rovnice: H = A + B/ū + C.ū, kde A,B,C sú konštanty charakterizujúce kolónu a procesy difúzie a prestupu látky medzi fázami. Uvedená závislosť vykazuje minimum H, ktorému zodpovedá optimálna rýchlosť mobilnej fázy. Líši sa podľa použitého nosného plynu a závisí od parametrov kolóny. Rozlíšenie (rozlišovací faktor) dvoch zložiek, ktorých píky susedia na chromatograme, sa zistí podľa vzorca: R1,2=2.(tR,2 - tR,1 ) / (Y1+Y2) Delí sa vlastne vzájomná vzdialenosť 2 píkov priemernou šírkou píkov pri základni. Pri hodnote rozlíšenia 1 sa dosiahne separácia píkov na 95 %, pri rozlíšení 1,5 na 99,7 % (minimálna podmienka kvantitatívnej analýzy). Separačné číslo nsep sa vypočíta z chromatogramu analýzy n-alkánov podľa vzorca: nsep = (t R,n+1 - t R,n )/ (Y h/2,n + Y h/2, n+1) - 1 kde index n a n+1 sa vzťahuje na 2 za sebou nasledujúce n-alkány. Separačné číslo tak vyjadruje počet látok, ktoré možno rozdeliť medzi dvomi n-alkánmi, čím sa charakterizuje separačná schopnosť kolóny v určitom rozmedzí teplôt varu analyzovaných látok.

9 KOLÓNOVÁ CHROMATOGRAFIA V SYSTÉMOCH KVAPALINA-TUHÁ FÁZA A KVAPALINA-KVAPALINA (str. 219-239, výber z textov, upravené)

+ čerpadlo pre HPLC --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------224

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------225

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------229

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------232

Zóny látok vystupujúce z chromatografickej kolóny možno priamo v roztoku mobilnej fázy dokázať chemickou reakciou, alebo charakterizovať niektorou fyzikálnochemickou metódou, najčastejšie spektrálne. Limitujúcim faktorom je koncentrácia analyzovaných látok v mobilnej fáze na výstupe z kolóny.

------------------------------------------------ končí výber str. 232-239-------------------------------------------------------

13 CHROMATOGRAFIA S PLOŠNÝM USPORIADANÍM EXPERIMENTU (str. 313-323, výber z textov, upravené)

-pozri str. 225-231

------------------

Kvantitatívna analýza Na dosiahnutie relatívne presných výsledkov je treba pracovať s tenkými vrstvami vysokej kvality. Priame vyhodnotenie škvrny analytu na tenkej vrstve sa vykonáva obvykle pomocou optických metód denzitometricky, kedy sa zisťuje stupeň stmavnutia tenkej vrstvy v mieste škvrny. Čím viac analytu škvrna obsahuje, tým je intenzívnejšie sfarbená a tým viac absorbuje žiarenie vhodnej vlnovej dĺžky. Škvrna analytu tiež silnejšie prekrýva materiál tenkej vrstvy a ak je tenká vrstva napustená napr. fluorescenčným činidlom, v mieste škvrny sa bude pozorovať znížená fluorescencia. Ak tenká vrstva neobsahuje flurescenčné činidlo, môže sa prejaviť prípadná fluorescencia analytu. Zariadenie fotodenzitometra zabezpečuje nasledujúcu funkciu: zo zdroja ultrafialového alebo viditeľného žiarenia vystupuje žiarenie s určitým prierezom lúča, prechodom cez monochromátor sa z neho vymedzí žiarenie požadovanej vlnovej dĺžky, ktoré dopadá na materiál tenkej vrstvy umiestnenej na pohyblivej podložke. Odrazené žiarenie alebo fluorescencia sa meria fotonásobičom. Pohybom podložky sa premeria signál cez celú tenkú vrstvu ako na obr. 13.7. Je vhodné, ak sú na tenkej vrstve zároveň nanesené aj rôzne podiely štandardu analytu. Ak je materiál tenkej vrstvy priehľadný, môže sa merať aj prechádzajúce žiarenie inou detekčnou fotodiódou. Moderné zariadenia preskenujú celú plochu tenkej vrstvy pri zvolenej vlnovej dĺžke a vyhodnotia 3-rozmerný záznam. Pri nepriamom postupe sa škvrna analytu uvoľní z podložky aj so sorpčným materiálom, alebo sa vystrihne, analyt sa extrahuje do vhodného rozpúšťadla, a stanovuje inou vhodnou inštrumentálnou metódou. Táto cesta je zdĺhavejšia, ale umožňuje aj predseparácie vybraných skupín zlúčenín.

14 ELEKTROFORÉZA (str. 331-336, výber z textov, upravené ) Elektromigračné separačné metódy využívajú dva elektrokinetické javy - elektroforézu a elektroosmózu. V jednotlivých metódach a ich modifikáciách sa využíva buď samotná elektroforéza alebo jej kombinácia s elektroosmózou, a tiež ďalšie separačné princípy, ktoré využívajú ďalšie rozdiely v správaní analyzovaných látok v danom prostredí (napr. molekulovo-sitový efekt, rozdeľovanie, adsorpcia). V prostredí obsahujúcom roztok s nabitými časticami a pevné povrchy stýkajúce sa s roztokom, ktoré môžu niesť elektrické náboje (steny kapiláry, povrchy prítomných častíc) sa vytvárajú elektrické dvojvrstvy. Časom vzniká určité rovnovážne rozdelenie nábojov. V elektromigračných separačných metódach sa na toto prostredie pripojí jednosmerné elektrické pole, ktoré poruší rovnováhu v rozložení nábojov a vyvolá ich pohyb v dôsledku 2 javov: - elektroforézy - nabité častice sa pohybujú k opačne nabitej elektróde, - elektroosmózy - uplatní sa v kapilárnych technikách, kedy sa po aplikácii napätia sa v kremennej alebo sklenej kapiláre pohybuje celý roztok (vodný) k zápornej elektróde vďaka povrchovému náboju kontaktnej steny kapiláry.

.....

V roztokoch slabých elektrolytov sú vedľa seba disociované (s nábojom) aj nedisociované molekuly. Podiel nabitých častíc je daný stupňom disociácie α. Molekula takého elektrolytu preto vykazuje efektívnu elektroforetickú pohyblivosť danú súčinom α.u Disociácia slabých kyselín a zásad sa dá ovplyvniť voľbou pH prostredia, a tým tiež ovplyvňovať separáciu týchto látok. Ak sa vykonáva zónová elektroforéza vo voľnom roztoku, oddeľovanie zón narušuje difúzia, ktorou sa v roztoku vyrovnávajú koncentrácie zložiek v celom objeme. Preto sa zložky počas separácie fixujú tým, že sa elektroforéza vykonáva vo vhodnom prostredí - lôžku, ktoré môže byť usporiadané plošne (napr. papier, alebo gél na podložke), alebo kapilárne (v géli).

------------------ Do elektródových nádob sa naleje elektrolyt (vhodný tlmivý roztok) do výšky asi 2,5 cm tak, aby v labyrintovom systéme voľne pretekal cez okraje priehradiek.

---------------- Po vyrovnaní hladiny elektrolytu v oboch nádobkách a zmočení celých prúžkov papiera vzlínaním roztoku sa veko uzavrie a prístroj je pripravený na elektroforézu. Pripojí sa prívod od zdroja jednosmerného napätia. Zaznamená sa čas pripojenia na elektrickú sieť. Po vložení napätia sa oddelia zóny obsahujúce jednotlivé zložky. Zóny sa pohybujú rôznou rýchlosťou. Separácia sa ukončí skôr než prvé zóny dosiahnu koniec nosiča, alebo dokonca skôr než dôjde k významnému rozšíreniu zón.

Po vysušení nosiča sa zóny detegujú a elektroforeogram sa vyhodnotí. Poloha zóny je kvalitatívnou charakteristikou, súvisí s druhom nabitých častíc. Kvantitatívne vyhodnotenie sa vykoná ako v tenkovrstvovej chromatografii.