Koneman. Diagnóstico microbiológico 2008.pdf

1CAPÍTULO

1

Introducción a la microbiología

Parte I: El papel del laboratorio demicrobiología en el diagnóstico de las

enfermedades infecciosas: guía parala práctica y el tratamiento

IntroducciónLineamientos del libroEl mundo de las enfermedades

infecciosas

La tríada de las enfermedadesinfecciosas

El agente infecciosoClases de agentes infecciosos

Interacciones entre huéspedes y agentes infecciosos

Función de los agentes infecciosos en la naturaleza

Virulencia

El ambienteEl huésped infectado

Defensa humoral innata (no celular)

Defensa celular innata

Tipos de inflamación

Defensa celular inmunitaria adaptativa

Defensa no celular inmunitaria adaptativa (humoral)

Signos y síntomas clínicos de infección

Efectos indirectos de los agentes infecciosos en seres humanos

Fases del ciclo diagnósticoFase preanalítica

Recolección de la muestra

Transporte de la muestra

Recepción de la muestra y observaciones preliminares

Criterios para el rechazo de las muestras

Relación costo-eficacia en la fase preanalítica

Fase analíticaExamen microscópico

Procesamiento de las muestras

Interpretación de los cultivos

Procedimientos para la identificación preliminar de las bacterias aisladas

Identificación de microorganismos diferentes de las bacterias

Antibiograma

Relación costo-eficacia en la fase analítica

Fase posanalíticaInforme de los resultados

Interacción con los epidemiólogos

Análisis de los resultados

Conservación de las muestras y de los registros

Koneman. Diagnóstico microbiológico ©2012. Editorial Médica Panamericana

Aspectos administrativos del laboratorio de microbiología

Regulación estatalGestión de riesgosSeguridad del laboratorio

Normas y reglamentaciones generales de seguridad

Precauciones habituales de seguridad

Agentes biológicos

Precauciones universales

Envío de muestras y de agentes etiológicos

Peligros no biológicos

BioterrorismoAseguramiento de la calidadControl de calidad

Componentes de un programa de control de calidad

Control de los aparatos del laboratorio

Control de los medios de cultivo, reactivos e insumos

2 CAPÍTULO 1 Introducción a la microbiología: Parte I

IntroducciónLineamientos del libro

Hay casi tantas formas de observar el mundo de las enfer-medades infecciosas como cantidad de agentes que las provo-can. En este libro nos centraremos en la detección e identifica-ción de los agentes infecciosos en el laboratorio clínico, segui-do de la determinación de la sensibilidad a los antibióticoscuando corresponda. Desde el punto de vista conceptual, ellibro se divide en tres secciones. Los primeros dos capítuloscubren los principios generales de las enfermedades infeccio-sas y el laboratorio diagnóstico. En la segunda sección, se pre-sentan las técnicas inmunológicas y moleculares que tienenaplicación casi universal. Por último, la tercera y más ampliasección es un extenso análisis de los grupos de agentes infec-ciosos y las enfermedades que generan. En un capítulo separa-do se explican los principios generales de la bacteriología de-bido a la diversidad de los organismos en este gran grupo depatógenos humanos.

El mundo de las enfermedades infecciosas

Durante la mayor parte de la existencia de la humanidad, lasenfermedades infecciosas han sido la causa predominante deenfermedad y de muerte, que no sólo han restringido el bienes-tar de las personas sino que, además, han cercenado la prospe-ridad social. Recién en el siglo XX las mejoras en las condicio-nes de vida, la sanidad y las intervenciones médicas lograronque las sociedades desarrolladas emergieran de la devastaciónprovocada por las enfermedades infecciosas. Lamentablemen-te, los beneficiarios de estos progresos se concentraron en lospaíses más ricos. El desafío para la comunidad mundial es ha-cer extensivos estos logros a todo el género humano.

Hacia la década de 1950, los avances de la medicina moder-na y de la salud pública parecían tan impresionantes quemuchos científicos prominentes se vieron impulsados a prede-cir el control de las enfermedades infecciosas y la erradicaciónde plagas como causas de miseria en toda la Tierra. William H.Stewart, un cirujano general de los Estados Unidos, afirmó en1969: “Es tiempo de concluir el capítulo de las enfermedadesinfecciosas”. Es lamentable que muchos hombres sabios sub-estimaran la capacidad de adaptación de las diversas y nume-rosas formas de vida que comparten el planeta con nosotros,

tanto agentes infecciosos como depredadores; por ejemplo, losartrópodos. Tampoco pudieron vislumbrar las consecuenciasnegativas inesperadas de los principales avances médicos queprolongan la vida, a veces con efectos devastadores sobre losmecanismos de defensa del huésped. Lejos estuvieron tambiénde apreciar los efectos de la incursión humana en el medioam-biente o las consecuencias de los desplazamientos irrestrictosde plantas y animales, incluidos los seres humanos, alrededordel mundo. Como resultado, la lista de nuevas enfermedadesinfecciosas o de enfermedades reactivadas que han resultadouna plaga para la humanidad a partir de aquellas prediccioneserróneas es larga y sigue creciendo. En el cuadro 1-1 se pre-senta una enumeración parcial.

La tríada de las enfermedades infecciosas

Para entender las enfermedades infecciosas el estudiantedebe considerar las interacciones entre las tres partes que inter-vienen:

1. El huésped infectado. Este huésped será casi siempre un serhumano, en nuestra perspectiva antropocéntrica. Los veteri-narios se ocuparán de los huéspedes animales, mientras queun botánico se ocupará de las plantas. El huésped infectadopuede, incluso, ser un agente infeccioso.

2. Un agente infeccioso. Esta designación es la descripciónmás amplia para diversas formas de vida que interactúaníntimamente con otras.

3. El ambiente. El ambiente natural, inanimado y animado, esesencial para el mantenimiento de la mayoría de los agentesinfecciosos y para su transmisión de un huésped a otro.

Una entretenida y muy educativa visión de estas relacionesque merece la pena leer ha sido presentada por E. W. Kone-man,54 en El otro extremo del microscopio: las bacterias cuen-tan su historia, donde el autor hace un relato fantástico sobreuna asamblea de bacterias que se reunieron para exponer susquejas respecto del “giro” que los seres humanos impusieron asus relaciones y pone “patas arriba” nuestra visión tradicionaldel mundo.

Cedric Mims, el distinguido microbiólogo británico, preparóun relato más tradicional, también muy interesante, sobre la


http://www.medicapanamericana.com/Libros/Libro/3803/Koneman-Diagnostico-microbiologico.html

dilucidación de las complejas interconexiones entre los sereshumanos y los agentes infecciosos. Esta obra ha sido actuali-zada por sus colegas y es un excelente modo de explorar el fas-cinante tema de la patogenia.69

El agente infecciosoCLASES DE AGENTES INFECCIOSOS

Los agentes infecciosos pueden dividirse en un número fini-to de tipos. La mayoría de ellos viven en forma libre, contie-nen todo lo necesario para el mantenimiento de su especie yson conocidos como microbios. Los agentes infecciosos tra-dicionales son las bacterias, los hongos, los parásitos y losvirus.

1. Las bacterias comprenden el mayor número de especiespatógenas para los seres humanos. Son organismos unicelu-lares y contienen DNA y RNA, pero no están diferenciadasen núcleo y citoplasma; se reproducen por fisión binaria.Existen unas pocas familias de bacterias que carecen dealgunas estructuras necesarias para la replicación y debeninteractuar con la célula del huésped para reproducirse, lasmás sobresalientes son Rickettsiaceae, Anaplasmataceae yChlamydiaceae.

2. Los hongos son agentes unicelulares o multicelulares quepresentan un núcleo y un citoplasma definidos. Las levadu-

ras son hongos unicelulares que se reproducen por fisiónbinaria. Los mohos u hongos filamentosos son organismosmulticelulares más complejos que se reproducen en formasexuada y asexuada. Algunos hongos tienen fases levaduri-forme filamentosa y se denominan hongos dismórficos.

3. Los parásitos son un grupo grande y complejo de microbios.Entre ellos se incluyen los animales unicelulares, como losprotozoos, y los organismos multicelulares muy complejosque tienen órganos y tejidos bien definidos, como el tractogastrointestinal y los sistemas genitales. Algunos de estosparásitos son, en efecto, pequeños animales. Otros, por logeneral los protozoos, carecen de las estructuras necesariaspara una reproducción independiente y deben obtener delhuésped las sustancias que necesitan.

4. Los virus comprenden un gran número de agentes infeccio-sos que, hablando estrictamente, no son microbios porquecarecen del equipamiento genético completo para su propiapropagación. Salvo raras excepciones contienen DNA oRNA, pero no ambos. Por lo tanto, deben infectar otra formade vida, como seres humanos, animales, plantas, bacterias eincluso, otros virus. Representan la forma más simple de unagente infeccioso. Los microbios se reproducen por multi-plicación; después de la división de su material genético sedividen en dos formas nuevas idénticas. Por el contrario, losvirus se reproducen por replicación, hacen copias de sus áci-

La tríada de las enfermedades infecciosas 3

Cuadro 1-1 Enfermedades infecciosas recién reconocidas y patógenos identificados desde la “conquista de las enfermedades infecciosas”*

AÑO

1977

1982

1983

1989

1991

1993

1994

1995

1996

1997

1999

2001

2003

* Con las contribuciones de Joseph McDade.

AGENTE

Virus Ébola

Especies de Legionella

Virus Hantann

Campylobacter jejuni

Escherichia coli 0157 (productora de verotoxina)

Borrelia burgdorferi

Helicobacter pylori

Virus de la inmunodeficiencia humana

Virus de la hepatitis C

Ehrlichia chaffeensis

Virus Guanarito

Virus Sin nombre

Bartonella henselae

Herpesvirus humano 8

Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophilum

Virus Hendra

Lyssavirus australiano

Virus influenza H5N1

Virus Nipha

Virus influenza H9N2

Metapneumovirus humano

Coronavirus del SARS

ENFERMEDADES

Fiebre hemorrágica del Ébola

Enfermedad de los legionarios

Fiebre hemorrágica con síntomas renales

Gastroenteritis

Colitis hemorrágica; síndrome urémico hemolítico

Enfermedad de Lyme

Úlcera gástrica/duodenal

Síndrome de inmunodeficiencia adquirida

Hepatitis no A, no B

Ehrlichiosis monocítica humana

Fiebre hemorrágica venezolana

Síndrome pulmonar por hantavirus

Enfermedad del arañazo de gato; angiomatosis bacilar

Sarcoma de Kaposi

Anaplasmosis (ehrlichiosis) granulocítica humana

Enfermedad respiratoria; meningoencefalitis

Rabia humana

Gripe aviar en seres humanos

Enfermedad respiratoria; meningoencefalitis

Nueva variante de la gripe aviar en seres humanos

Enfermedad respiratoria

Síndrome respiratorio agudo grave


dos nucleicos, luego de lo cual los nuevos genomas seempaquetan en forma individual dentro de los límites de lacélula infectada.

Además de los agentes infecciosos tradicionales, miembrosmás evolucionados del reino animal, como los insectos, puedenconsiderarse una forma de parásitos si su existencia está rela-cionada en forma íntima con un huésped. En el otro extremo,los priones, completamente no convencionales, no contienenácidos nucleicos y, por consiguiente, no pueden replicarse deacuerdo con las leyes establecidas de la naturaleza. No obstan-te, su estructura proteica anormal deriva en un proceso similara una infección con un ciclo de replicación.

INTERACCIONES ENTRE HUÉSPEDES Y AGENTES INFECCIOSOSSi un agente infeccioso y su huésped coexisten y ninguno de

ellos se beneficia o se perjudica, el proceso se denomina co-mensalismo y el agente, comensal.

Si el agente infeccioso obtiene un beneficio de su huésped,pero no le causa daño, el agente infeccioso se denomina sapró-fito. Si el agente infeccioso y el huésped obtienen un beneficiodel encuentro, el proceso se denomina simbiosis o mutualismo.

Por otro lado, si el huésped es dañado por el agente infec-cioso con beneficio de este último el proceso se denominaparasitismo y el agente infeccioso, parásito (un uso generalde la palabra más allá de la clase de los agentes infecciososconocidos como parásitos). Todos los tipos de agentes infec-ciosos pueden ser parásitos.

Cuando los microorganismos viven en la superficie externa(piel o cabello) o interna (vías respiratorias altas y tubo digesti-vo) del cuerpo, se describen como flora colonizante. La rela-ción entre la flora colonizante y el huésped puede ser comensal,saprófita o parásita. Incluso, puede cambiar de un momento aotro si se altera la virulencia del microbio o disminuye la capa-cidad de resistencia del huésped a la infección.

Un microorganismo capaz de ocasionar infecciones se deno-mina patógeno. Si el microbio produce enfermedad en formaocasional, es un patógeno potencial. Un patógeno potencial sedescribe como un agente oportunista si produce infeccionessólo en las personas que tienen comprometidos los mecanis-mos de defensa.

Los agentes infecciosos también establecen numerosos tiposde relaciones con sus huéspedes a nivel celular. Los microbios devida libre (algunas bacterias, los hongos y los parásitos) exis-

ten en forma extracelular y pueden crecer in vitro en ausenciade células. Los microbios intracelulares facultativos puedencrecer in vitro en ausencia de células; in vivo crecen en formaintracelular o extracelular, pero a menudo tienen una relaciónespecial con los macrófagos. Los agentes infecciosos intrace-lulares estrictos carecen de algunas estructuras necesarias parauna vida extracelular; por eso requieren una célula huésped queles suministre los elementos requeridos. Estas relaciones seresumen en el cuadro 1-2.

FUNCIÓN DE LOS AGENTES INFECCIOSOS EN LA NATURALEZAAunque las víctimas de los efectos nocivos de los agentes

infecciosos tengan una visión diferente, éstos no tienen la fun-ción de hacer penosa la vida de los seres humanos. Las bacte-rias son carnívoras y un componente esencial en la degradaciónde los tejidos muertos. Además, desempeñan un papel princi-pal en muchas reacciones químicas en la naturaleza y han sidoutilizadas para tareas tan desagradables como la descontamina-ción de los derrames tóxicos.

Por el contrario, los hongos son vegetarianos. Cumplen unafunción principal en la eliminación de la vegetación en des-composición. Nadie a quien le guste el pan, la cerveza, el vinoo el queso necesita que le recuerden la importancia de las leva-duras en nuestra sociedad. Y, por supuesto, los hongos superio-res sirven como fuente de alimento, desde los champiñoneshasta las trufas.

VIRULENCIALa virulencia es la suma de las características que le dan al

agente infeccioso una ventaja en la batalla contra sus huéspe-des elegidos (o víctimas). No es un fenómeno de todo o nada;existen grados muy variables de virulencia. La mayoría de losanálisis sobre la virulencia se centran en los factores microbia-nos, pero, en realidad, lo más importante es el balance entre lostres miembros de la tríada.11

El organismo más virulento no causará enfermedad si notiene acceso a un huésped vulnerable debido a una de estas dosrazones:

1. El organismo existe en un compartimento ambiental diferen-te del huésped potencial. Después de que se interrumpió elciclo del virus de la fiebre amarilla en los mosquitos urba-nos, la transmisión de la enfermedad se detuvo hasta que los


Cuadro 1-2 Relaciones entre los agentes infecciosos y sus huéspedes a nivel celular

RELACIÓN

Independencia

Intracelulares facultativos

Intracelular estricto

AGENTES INFECCIOSOS

La mayoría de las bacterias, hongosy parásitos

Ciertas bacterias, micobacterias,ciertos hongos

Ciertas bacterias, hongos y protozoos; virus

EJEMPLOS

Staphylococcus,Enterobacteriaceae,Candida, Aspergillus,protozoos, helmintos

Legionella, Brucella,Mycobacterium tuberculosis,hongos dismórficos

Rickettsia, Ehrlichia,Anaplasma; Toxoplasmagondii; virus influenza


seres humanos ingresaron en un ciclo de fiebre amarilla,hasta entonces desconocido, con especies de mosquitos quevivían en la selva.

2. Todos los huéspedes disponibles han desarrollado unainmunidad protectora. Por ejemplo, muchas infeccionesvirales que generan inmunidad protectora, como la delvirus del sarampión, se “consumen” luego de que todas laspersonas susceptibles han sido infectadas. Sólo después deque crezca una nueva generación de individuos no infecta-dos, y por lo tanto vulnerables, puede ocurrir una nuevaepidemia.

Por el contrario, un organismo que no causa enfermedad oque lo hace sólo en forma leve en personas inmunocompeten-tes (esencialmente de baja virulencia) puede provocar unaenfermedad devastadora en alguien cuyo sistema inmunitarioesté comprometido.

Se podría argumentar que los agentes infecciosos más exito-sos son los que tienen las mejores estrategias de supervivencia,que incluyen una virulencia mínima o ausente. Sobre todo paralos patógenos intracelulares estrictos, un agente que destruyarápidamente a su huésped pronto quedará excluido. Comoejemplo, se ha establecido una hipótesis acerca de que el virusde Epstein-Barr está diseñado para permanecer en los linfoci-tos de memoria y ha desarrollado estrategias para reducir losefectos negativos sobre su huésped.113

Sin embargo, un organismo puede ser virulento para suhuésped humano, pero sobrevivir porque tiene una relaciónpermisiva con otros huéspedes. En otras palabras, los seres

humanos pueden infectarse en forma letal, pero otros huéspe-des vertebrados pueden no enfermarse o hacerlo sólo de mane-ra leve.

La virulencia puede ser el resultado de factores que vir-tualmente operan en cualquier etapa del proceso infeccioso.Si se piensa en términos más amplios, la virulencia debeincluir características más allá de las que propician el desa-rrollo de la enfermedad en un huésped infectado. En el cua-dro 1-3 se resumen algunos ejemplos. Los lectores que deseeninformación más detallada pueden encontrar referencias exce-lentes.36,41,53,55,62,100,101

El ambiente

El espectro de huéspedes de algunos agentes infecciosos selimita a los seres humanos. El mantenimiento de estos organis-mos requiere el acceso a un nuevo huésped vulnerable y la capa-cidad de sobrevivir durante la transferencia. Por lo tanto, losfactores ambientales son relativamente de poca importancia.

No obstante, la mayoría de los agentes infecciosos tienenuna fase en la cual viven libres en el medioambiente, infectanhuéspedes no humanos o pasan a través de un vector, casi siem-pre un artrópodo, entre varios huéspedes vertebrados. Algunasde estas interacciones pueden ser extremadamente complejas,con múltiples transferencias a través de diferentes fases delambiente; por ejemplo, los numerosos estadios de desarrollo deun parásito en una serie de huéspedes animales.

El ambiente es el vínculo entre el agente infeccioso y elhuésped final. La transferencia a un nuevo huésped requiere


Cuadro 1-3 Factores de virulencia seleccionados

CATEGORÍA

Supervivencia en el medioambiente

Transferencia/transmisión eficaz

Evasión de las defensas del huésped

Confinamiento en un sitio inaccesible

Resistencia a los antibióticos

FACTOR DE VIRULENCIA

Replicación intracelular en amebas de vida libre

Resistencia a la desecación

Formas móviles que pueden buscar un huésped sensible

Adaptación a un vector que puede transmitir lainfección

Lisis de células polimorfonucleares inflamatorias

Destrucción de tejidos

Destrucción de tejidos

Destrucción de linfocitos

Modulación antigénica para subvertir la inmunidadhumoral (anticuerpos)

Localización intracelular en macrófagos

Localización intracelular en neuronas de los gan-glios espinales

Resistencia a los desinfectantes

Resistencia a los fijadores

Resistencia a los agentes antiinfecciosos

Resistencia a los agentes antivirales

EJEMPLO

Especies de Legionella

Virus de la viruela

Cercaria de esquistosoma

Rickettsia rickettsii en las garrapatas

Leucocidinas de Streptococcus pyogenes

Proteasas de Pseudomonas aeruginosa

Invasión de los vasos sanguíneos por Aspergillus fumigatus

Virus de la inmunodeficiencia humana

Deriva y cambio antigénico del virus influenza; variación anti-génica de Borrelia recurrentis o de Trypanosoma brucei

Mycobacterium tuberculosis

Virus varicela-zóster o virus del herpes simple

Pseudomonas aeruginosa y antisépticos

Priones y formaldehído

Staphylococcus aureus y meticilina

Virus de la inmunodeficiencia humana; citomegalovirus


una puerta de entrada. En el cuadro 1-4 se resumen las vías detransmisión y las puertas de entrada más comunes. En el recua-dro 1-1 se definen algunos de los términos utilizados para des-cribir enfermedades infecciosas en la población.

El huésped infectado

Una vez que un individuo ha sido infectado, se producendiversas respuestas en el huésped. La respuesta puede ser loca-lizada en el sitio de la infección o generalizada (sistémica). Lareacción local a la infección toma la forma de inflamación.Inflamación es un término general que hace referencia a la

alteración anormal de los tejidos u órganos causada por el dañoo la destrucción del tejido. La inflamación tiene componentesinmunitarios y no inmunitarios. En cada caso, la defensa puedeser celular o no celular (humoral). El sufijo “-itis” se utilizapara indicar inflamación; cuando se lo asocia con un sitio ana-tómico, describe un proceso de enfermedad. Por ejemplo, laapendicitis es un proceso inflamatorio que afecta el apéndice,mientras que la hepatitis es la inflamación del hígado y la endo-carditis es la inflamación del endocardio (el revestimiento delas cámaras del corazón).

La inmunidad innata y la inmunidad adaptativa son los dosbrazos principales de la respuesta inmunitaria.104,27,28,63 La res-puesta innata es la más primitiva de ambas. Proporciona unarespuesta inmediata contra los microbios invasores, sin teneren cuenta su carácter inmunitario. Los receptores que hacencontacto entre el invasor y la célula defensora son compuestosdenominados lectinas que se encuentran ampliamente distri-buidos en la naturaleza. La respuesta innata está limitada porla falta de un sistema de amplificación de defensas específi-cas. En su lugar, las defensas innatas envían señales que acti-van el segundo brazo: la inmunidad adaptativa. Para utilizaruna analogía militar, la respuesta inmunitaria innata es com-parable con una patrulla de frontera con poca dotación dearmamentos que envía señales a los rangos superiores delejército regular cuando detecta que un invasor ha cruzado loslímites nacionales.

La respuesta inmunitaria adaptativa es inmunológicamenteespecífica. Responde a componentes que detecta como no pro-pios o “extraños” mediante la multiplicación del número dedefensores con armas específicas dirigidas contra un determi-nado enemigo. Es decir, se adapta para combatir contra unaamenaza muy definida, en vez de reaccionar en forma univer-sal a todas las amenazas. Una vez que se activó, la respuestainmunitaria adaptativa sirve como misión de control para elresto de la campaña hasta la victoria, la derrota u, ocasional-mente, un empate.


Cuadro 1-4 Vías de transmisión y puertas de entrada comunes de los agentes infecciosos

FUENTE DEL AGENTE

Ser humano infectado



Ser humano infectado o paciente


Ambiente contaminado

Ambiente contaminado

Animal infectado

Garrapata infectada

Paciente

Paciente

Paciente

MECANISMO DE ENTRADA

Aerosoles

Contacto directo

Relaciones sexuales

Secreciones orales o nasofaríngeas hacia el ojo

Transfusión de productos de la sangre

Alimentos o agua

Acondicionadores de aire

Mordeduras de animales

Picadura de garrapatas

Aspiración de la flora endógena

Diseminación de la flora intestinal a través de la paredintestinal dañada

Migración de las bacterias desde la orofaringe hacia eloído medio a través de la trompa de Eustaquio

PUERTA DE ENTRADA

Respiratoria

Cutánea

Genital

Ocular

Intravascular

Gastrointestinal

Respiratoria

Cutánea

Cutánea

Respiratoria

Gastrointestinal

Oído

EJEMPLO

Virus influenza

Virus del herpes simple en losluchadores

Sífilis; gonorrea

Conjuntivitis bacteriana o viral

Virus de la hepatitis

Patógenos entéricos bacterianosy virales

Enfermedad de los legionarios

Rabia

Enfermedad de Lyme

Neumonía bacteriana

Peritonitis bacteriana

Otitis media bacteriana

Recuadro 1-1 Categorías de las enfermedades infecciosas

Enfermedad transmisible: afección que un individuo puede adquirir deuna fuente externa, animada o inanimada

Enfermedad contagiosa: afección que puede ser transmitida de unpaciente a otro

Infección iatrogénica: infección que se produce como consecuencia de laintervención médica

Enfermedad infecciosa: afección causada por un agente externo que sereplica o multiplica

Infección intrahospitalaria: infección que se adquiere en un centro desalud

Infección oportunista: infección en un paciente con las defensas compro-metidas causada por un agente de baja virulencia que no produciríainfección en una persona sana

Infección subclínica: infección que produce respuesta inmunitaria perono síntomas clínicos (también llamada infección asintomática)


DEFENSA HUMORAL INNATA (NO CELULAR)

La defensa más básica en esta categoría es el muco quereviste todas las superficies mucosas (p. ej., el muco gástrico ola sustancia tensioactiva [surfactante] que reviste la membranapulmonar) y los líquidos que barren los potenciales patógenoshacia afuera (p. ej., el flujo del líquido biliar, las lágrimas y laorina). Además, ciertos compuestos antibacterianos, como lalisozima, pueden ayudar a disminuirle el número de bacterias.Por último, algunas defensas “primitivas” o “preinmunitarias”desempeñan un papel importante en la defensa del huésped.Estos compuestos se denominan en forma general reactantes defase aguda.36 El primero que se identificó, en 1930, fue la pro-teína C reactiva, que reaccionaba con el polisacárido del neu-mococo C. La vía alternativa del sistema del complemento esuna defensa temprana contra algunas infecciones bacterianasantes de que se desarrollen los anticuerpos específicos. Final-mente, las defensas celulares innatas producen diversos modu-ladores inflamatorios entre los que se encuentran los quimioa-tractantes para otras células inflamatorias. Estos compuestosson el medio por el cual una célula se comunica con otra y sedenominan citocinas (a veces mencionadas como quimiocinaso linfocinas).25 La primera citocina que se descubrió (interleu-cina 1 o IL-1), el principal mediador responsable para la res-puesta febril, es sintetizada por los monocitos y los macrófa-gos.30 Como se describe más adelante, las citocinas tambiéncumplen una función preponderante en la respuesta inmunita-ria adaptativa.

DEFENSA CELULAR INNATALas células primarias no inmunitarias son los macrófagos

fijados a los tejidos (histiocitos), sus contrapartes circulantes(monocitos) y los neutrófilos polimorfonucleares. Los macró-fagos de tejido son las defensas primarias contra algunos agen-tes infecciosos invasores. Por ejemplo, los macrófagos alveola-res son muy efectivos para desechar las bacterias invasoras;mientras que los organismos que pueden sobrevivir en losmacrófagos (p. ej., micobacterias o especies de Legionella) tie-nen una ventaja competitiva. Los macrófagos tisulares delhígado, el bazo y los ganglios forman el sistema reticuloendo-telial; son críticos para la eliminación de partículas circulantes,como los agentes infecciosos de la sangre. Los pacientes aquienes se les ha eliminado el bazo o cuyo hígado está dañadotienen un mayor riesgo de contraer infecciones bacterianasserias.

Una segunda defensa celular es un sistema efector constitui-do por las células natural killer (NK). Este sistema es activoprincipalmente contra los microorganismos.

Por último, pero no menos importante, las barreras físicas dela piel, el aparato respiratorio, el tubo digestivo y el aparatogenitourinario tienen un importante papel en la resistencia a lasinfecciones. Las terribles consecuencias de los procesos infec-ciosos en las heridas por quemaduras son el testimonio de laeficacia de la piel. La barrera física del aparato respiratorio secomplementa con la acción de los cilios ubicados en su super-ficie que eliminan de él los materiales extraños. Esta defensa enforma conjunta con el revestimiento no celular se denomina“escalador mucociliar”.

TIPOS DE INFLAMACIÓN121

Inflamación aguda supurativa (o purulenta). Una infección agudasupurativa evoca una respuesta en la cual se forma pus. El pus

es un material líquido que contiene gran número de célulasinflamatorias y que tiene una densidad que excede 1,013. Lacélulas combatientes iniciales y dominantes son los neutrófilospolimorfonucleares.61 Luego, los macrófagos ingresan en elárea para ayudar en la limpieza de los desechos y los fibro-blastos pueden activarse en el proceso de cicatrización (fibro-sis o tejido cicatrizal).

El término celulitis se utiliza a menudo para describir laafectación del tejido conectivo subcutáneo laxo en el cual sedispersa el exudado purulento entre las capas del tejido invo-lucrado. Necrosis hace referencia a la muerte celular o a ladisolución del tejido, la cual puede ser ocasionada por laacción de enzimas destructivas o por la restricción de nu-trientes en ese sitio, debido casi siempre al bloqueo del flujosanguíneo. Absceso es el término que se utiliza cuando losneutrófilos segmentados se ubican en un área no delimitadade inflamación supurativa, con la resultante destrucción deltejido.

La inflamación purulenta es un marcador de las infeccionescausadas por las bacterias y algunos hongos, aunque ciertosvirus y parásitos también pueden provocar una respuesta infla-matoria supurativa o aguda. Sin embargo, los abscesos son casiexclusivamente causados por bacterias y algunas levaduras. Larespuesta inmunitaria humoral suele ser importante en lasinfecciones supurativas. Inflamación granulomatosa. La infección granulomatosa es unsubtipo de infección crónica en la cual se forman granulomas.Un granuloma puede definirse como la concentración focalde macrófagos o histiocitos grandes activados que tienen unacapacidad aumentada de fagocitosis y digestión de partículasextrañas. Estas células también se denominan “epitelioides”porque en ocasiones se alinean de manera que se asemejan alas células epiteliales escamosas. Los macrófagos suelen agre-garse para formar células gigantes multinucleadas. Otros com-ponentes celulares del granuloma son los linfocitos y losfibroblastos. La activación de los macrófagos se produce pormedio de los productos de los linfocitos inmunológicamenteespecíficos.

Ciertos granulomas contienen un tipo particular de necrosis,la necrosis caseosa, en la cual el tejido tiene una consistenciasimilar al queso. (Cabe destacar cuán a menudo los patólogoshan utilizado las analogías con los alimentos para describir losprocesos de las enfermedades). La presencia de células gigantesmultinucleadas y la necrosis caseosa son características de latuberculosis, pero también pueden verse en otras infecciones,sobre todo en las provocadas por hongos dismórficos. Si el gra-nuloma es sólido y las células están intactas, se lo describecomo no necrosante o no caseoso.

Los granulomas se encuentran en las infecciones por mico-bacterias y hongos y en algunas infecciones bacterianas y para-sitarias. El correlato inmunitario de los granulomas es la inmu-nidad mediada por células.Inflamación linfohistiocítica. Algunas infecciones, en especial lascausadas por virus, desencadenan una respuesta inflamatoriacompuesta por linfocitos y macrófagos. Están involucradas lasrespuestas inmunitarias humoral y celular.Inflamación atópica. Las reacciones alérgicas están mediadas porun grupo diferente de células: los eosinófilos, los basófilos ylos mastocitos (basófilos fijados a los tejidos). El alergeno esti-mulante puede ser químico, como la hierba y el polen, queafectan a las personas alérgicas durante los diferentes períodosestacionales.52 Ciertos patógenos, sobre todo los parásitos,desencadenan una respuesta inflamatoria mediada por los eosi-nófilos.



DEFENSA CELULAR INMUNITARIA ADAPTATIVA La “estación central” de las defensas inmunitarias es el lin-

focito, del cual existen dos clases principales. Los linfocitos By las células plasmáticas son responsables de producir anti-cuerpos inmunológicamente específicos y componen el siste-ma inmunitario humoral.

Sin embargo, el “intimidador” del sistema inmunitario es ellinfocito T, que conforma la inmunidad celular. Los linfocitosT se dividen en 1) linfocitos helper (fenotipo CD4), responsa-bles de la memoria inmunitaria y de la secreción de las citoci-nas que modulan la respuesta inmunitaria, y 2) los linfocitossupresores (fenotipo CD8), que son citotóxicos y responsablesde la eliminación del material celular extraño (p. ej., las célu-las infectadas por virus). Los linfocitos supresores a veces selos menciona en forma alarmante como “linfocitos T asesi-nos.” A su vez, los linfocitos CD4 se dividen en células de tipo1 (Th1) y de tipo 2 (Th2) de acuerdo con las citocinas quesecretan.

DEFENSA NO CELULAR INMUNITARIA ADAPTATIVA (HUMORAL)

Estas defensas humorales son conducidas y producidas porcélulas inmunitarias específicas. El sofisticado sistema decomunicación que coordina la actividad de todas las defensasdel huésped se compone de sustancias químicas producidaspor los linfocitos denominadas citocinas.25 Las citocinas tam-bién actúan como efectores moleculares de los linfocitos cito-tóxicos.

Otra defensa humoral importante es el sistema del comple-mento, que consiste en una cascada de enzimas que da comoresultado un grupo de compuestos (C7-C8-C9) conocido enforma conjunta como complejo de ataque.117,116 Estos com-puestos son moléculas efectoras críticas en la defensa contraciertos patógenos, como los meningococos. El sistema delcomplemento funciona en forma similar al sistema de la coa-gulación. Los componentes intermediarios del sistema, en par-ticular C3a y C5a, son extremadamente importantes como qui-mioatractantes, es decir, reclutan las diversas células inflama-torias hacia el sitio de la infección.

El sistema del complemento tiene dos ramas que convergenen C3; más allá de ese punto, la vía es la misma. La rama clá-sica es inmunológicamente específica; los complejos de antí-genos y sus correspondientes anticuerpos desencadenan suactivación. La rama alternativa (antes conocida como sistemade la properdina) y el sistema de unión a las lectinas, másrecientemente reconocido, no son inmunológicamente especí-ficos y forman parte de la respuesta inmunitaria innata.

En ocasiones, la respuesta inmunitaria se puede desviar.Durante el desarrollo normal el sistema inmunitario reconocelos constituyentes del huésped como “propios”, fenómenodenominado tolerancia.31 El problema surge cuando los com-ponentes normales del tejido se consideran por error “extra-ños” o “no propios” y son atacados. La fiebre reumática es elejemplo clásico de un daño no intencional, que ocurre cuandola respuesta inmunitaria confunde la miosina de las fibras delmúsculo cardíaco con la proteína M de Streptococcus pyoge-nes, que es muy similar.93 Además, a menudo hay un “dañocolateral” cuando el tejido normal se daña o incluso se destru-ye durante el proceso de eliminación del agente invasor o deltumor. Esta respuesta anómala se conoce como autoinmuni-dad.26 Los defectos en el sistema inmunitario innato tambiénpueden causar enfermedades serias y respuestas inflamatoriasanómalas.57

El sistema inmunitario es el resultado del control de los agen-tes infecciosos y la vigilancia de los cambios neoplásicos de lascélulas. No podemos sobrevivir sin él y nos encontramos frentea un gran riesgo cuando está comprometido, ya sea por defectosnaturales o por productos químicos. Estos últimos pueden pro-venir del ambiente o pueden administrarse en forma terapéutica,dado que son necesarios para la atención médica. El ejemplo clá-sico es el huésped receptor de un órgano trasplantado. Para evi-tar que el cuerpo rechace el órgano extraño, el sistema inmunita-rio debe suprimirse, al menos en forma temporaria. Durante esteproceso, las defensas contra los microbios invasores y las célulastumorales se encuentran comprometidas, a veces con conse-cuencias imprevisibles.88

La complejidad del sistema inmunitario es muy admirable.Su complicación es asombrosa y aún no se comprende porcompleto. El lector interesado puede referirse a varias revisio-nes excelentes sobre este tema.104,27,28,63

SIGNOS Y SÍNTOMAS CLÍNICOS DE INFECCIÓNLos signos y síntomas de infección pueden ser generales o

sistémicos o bien, focales o localizados en un órgano o un sis-tema determinado. Los primeros médicos griegos y romanosreconocían cuatro signos principales de la inflamación:

1. Dolor2. Calor3. Rubor (enrojecimiento)4. Tumor (tumefacción)

Los mecanismos subyacentes que predisponen a estos signosno se han dilucidado aún por completo. El mecanismo fisiopa-tológico inicial es la dilatación de los vasos sanguíneos causa-da por una compleja cascada de aminas vasoactivas y otrosmediadores químicos.23 La liberación local de mediadores quí-micos da como resultado 1) aumento del flujo sanguíneo concongestión capilar y venosa (calor y rubor) y 2) aumento de lapermeabilidad de los vasos que lleva a la extravasación de loslíquidos, la sangre y las proteínas hacia los espacios extracelu-lares (dolor y tumor). Los neutrófilos segmentados son atraídospor las sustancias quimiotácticas hacia el área de irritación y seescapan a través de la vasculatura permeable hacia los espaciosextracelulares (formación de pus). Signos y síntomas generales o sistémicos de infección. En la faseaguda de la infección, el paciente puede presentar fiebre (amenudo alta y en picos), escalofríos, ruborización (vasodilata-ción) y pulso rápido. Los pacientes con infecciones subagudaso crónicas pueden padecer síntomas mínimos o vagos, comofiebre leve intermitente, pérdida de peso o fatiga y cansancio.Las reacciones tóxicas a los productos bacterianos pueden pro-ducir eccemas o reacciones hemorrágicas en la piel o biendiversos signos y síntomas neuromusculares, cardiorrespirato-rios o gastrointestinales, que son los primeros indicadores deuna infección subyacente.

Las radiografías muestran infiltrados pulmonares, engrosa-miento fibroso del revestimiento de las cavidades, presencia degas y tumefacción de los tejidos blandos, masas radiopacas oacumulación de líquido dentro de las cavidades o los órganos.

Los parámetros de laboratorio que sugieren infección en lospacientes con síntomas mínimos o incipientes son elevación dela velocidad de sedimentación globular (eritrosedimentación),leucocitosis o monocitosis en sangre periférica y alteracionesen las proteínas plasmáticas. Otros indicadores pueden ser laelevación de las γ-globulinas; la presencia de ciertas proteínas



reactivas, como la proteína C reactiva, o la producción de anti-cuerpos tipo-específicos.Signos locales de infección. Los signos principales de inflama-ción son una manifestación inequívoca de infección local.Puede observarse enrojecimiento localizado, calor y tumefac-ción o una masa tumorosa si se presentan en las superficiesexternas, o se detectan en las radiografías con otras técnicas noinvasivas (ecografía, tomografía computarizada, resonanciamagnética, etc.). Si las terminaciones nerviosas están irritadaso estiradas por la masa que se expande o por sustancias quími-cas irritantes, se puede sentir dolor en el área inmediata o enotros sitios a través de las vías eferentes complementarias(conocido como dolor “referido”). Un seno con secreciones ylos exudados purulentos son también indicadores de un proce-so inflamatorio o infeccioso localizado. Cualquiera de estossignos y síntomas señalan al médico la necesidad de obtenermaterial para examen microscópico directo y cultivo.

En el capítulo 2 se detallan los signos y los síntomas especí-ficos de infección que se manifiestan en diversos aparatos (res-piratorio, gastrointestinal, urinario, genital y otros).

EFECTOS INDIRECTOS DE LOS AGENTES INFECCIOSOS EN SERES HUMANOS

Las luchas que los seres humanos hemos librado contra losagentes infecciosos han generado muchos cambios en nuestraimpronta genética. El desarrollo del sistema inmunitario es elejemplo más espectacular e importante, pero se pueden encon-trar otros. El paludismo es una de las infecciones más preva-lentes y devastadoras del mundo, aunque no es común en losEstados Unidos. Es posible que la aparición de la hemoglobinaS, que redunda en una infección menos grave por Plasmodiumfalciparum,58 sea un cambio adaptativo. Lamentablemente,cuando desaparece la exposición a la infección, las consecuen-cias negativas de esta hemoglobina, puestas de manifiestocomo anemia drepanocítica, son relevantes. De manera similar,la entrada de merozoítos de P. vivax a los eritrocitos requiere elantígeno Duffy de grupo sanguíneo. A pesar de que es un antí-geno prevalente, el reconocimiento de este fenómeno biológi-co proporcionó las herramientas para la creación de vacunasque bloquean la entrada de los parásitos causantes del paludis-mo en sus células diana.65


CICLO DE DIAGNÓSTICO

Fase analítica

Fase preanalítica

Fase posanalítica

El paciente con signos y síntomas de enfermedad infecciosa

consulta al médico

El médico examina al paciente y hace diagnóstico

clínico tentativo

Se recolecta(n) la(s) muestra(s) apropiada(s) para cultivo.

Todos los recipientes se rotulan debidamente

Se transcriben las órdenes escritas a un formulario de solicitud

de laboratorio. El formulario y las muestras se transportan

al laboratorio

Luego de la recepción en el laboratorio, los datos del formulario

de solicitud se ingresan en un archivo en el ordenador o en el

cuaderno de registro del laboratorio

La muestra se examina directamente. Pueden implementarse o no los montajes para microscopia,

los frotis y las tinciones

Se pueden emitir informes presuntivos o no

Se pueden emitir informes preliminares o no

El médico interpreta los informes e instituye

el tratamiento apropiado

Se prepara el informe final del cultivo y se envía al consultorio

médico, clínica u hospital

Se examinan los subcultivos y los resultados de los sistemas

de identificación

Luego de la incubación, se examinan los cultivos.

Se establecen los sistemas de identificación definitiva

Las muestras se procesan.Se seleccionan los medios

de cultivos, se inoculan e incuban

Figura 1-1 Diagnóstico clínico y de laboratorio de las enfermedades infecciosas: revisión esquemática del ciclo de diagnóstico.


Fases del ciclo diagnóstico

Es útil considerar los exámenes de laboratorio como unasecuencia de diversos sucesos (fig.1-1). Tradicionalmente, losmicrobiólogos, al igual que otros bioquímicos, se concentraronen las mediciones científicas, la fase analítica. En la actualidad,está claro que los sucesos que ocurren antes de la medición(fase preanalítica) y luego de que la determinación científica sehaya completado (fase postanalítica) son tan importantes comola exactitud de la medición. El control del funcionamiento através del ciclo completo es parte del aseguramiento de la cali-dad para el laboratorio,84 como se analizará más adelante eneste capítulo.

Fase preanalítica

RECOLECCIÓN DE LA MUESTRAUna vez que se sospecha una enfermedad infecciosa deben

ordenarse las pruebas apropiadas. Los enfoques diagnósticosposibles son: el cultivo, la detección serológica de antígenos oanticuerpos, o la detección molecular de ácidos nucleicos.Como se analizará en los capítulos 3 y 4, se utiliza cada vez conmayor frecuencia la detección directa de los antígenos y losácidos nucleicos en las muestras clínicas, como también laaplicación de este enfoque para la identificación de los micro-organismos aislados. En la mayoría de las instituciones ycomunidades, los patólogos, los microbiólogos y los auxiliaresde laboratorio colaboran con los médicos en la selección de lasmuestras adecuadas para el cultivo y en la elección de las prue-bas apropiadas para lograr la máxima eficiencia de aislamientoy detección de los microorganismos.

Los adecuados recolección y transporte de una muestra allaboratorio para su análisis es un paso crítico y principal en laconfirmación de que determinado microorganismo es respon-sable de una enfermedad infecciosa.68 Una muestra mal reco-lectada puede impedir el aislamiento de los agentes infecciososimportantes; más aún, puede conducir a terapias incorrectas e

incluso perjudiciales en el caso de que el tratamiento se dirijacontra un microorganismo comensal o contaminante. Por ejem-plo, presuponer que Klebsiella pneumoniae, un reconocidoagente causal de la neumonía, como su nombre de especie loindica, se aisló del esputo de un paciente con neumonía clíni-ca. Se sabe que Klebsiella pneumoniae también coloniza lanasofaringe. Si el esputo de este caso hipotético fue mal reco-lectado y consiste principalmente en saliva, el aislamiento deK. pneumoniae podría no reflejar la verdadera causa de la neu-monía, sino simplemente la colonización de la nasofaringe. Eltratamiento podría ser inadecuado o sólo eficaz por causalidadsi la especie bacteriana que causa la neumonía tiene el mismopatrón de sensibilidad a los antibióticos que K. pneumoniae. Siel agente causal hubiera sido Pseudomonas aeruginosa, el tra-tamiento hubiese sido equivocado. Esta situación teórica ocu-rrió realmente en Pensilvania en 1976. Los concurrentes a laconvención anual de la Legión Americana de Pensilvania seinfectaron en el hotel de la convención en Filadelfia, pero seenfermaron luego cuando regresaron a sus hogares. Fueron tra-tados con antibióticos ineficaces contra bacilos entéricos quecolonizaban las vías aéreas altas. El patógeno real, Legionellapneumophila, no se conocía en ese entonces y, lamentablemen-te, se utilizó un enfoque terapéutico equivocado sobre la basede los inconducentes resultados de laboratorio.33

A continuación se enumeran los principios que hay que teneren cuenta para la recolección de la muestra:1. El material debe provenir del sitio real de la infección y recolec-tarse con un mínimo de contaminación de los tejidos, órganos ysecreciones adyacentes. Por ejemplo, los hisopados de gargantapara la búsqueda de estreptococos deben tomarse de la fosaperitonsilar y de la pared posterior de la faringe, evitando elcontacto del hisopo con otras áreas de la boca. Debe tambiénreducirse al mínimo la contaminación del esputo o de las mues-tras de las vías aéreas bajas con secreciones orofaríngeas. Otrassituaciones en que una muestra recolectada en forma inadecua-da puede conducir a un resultado erróneo son:

a. No cultivar la zona más profunda de una herida o el dre-naje de una cavidad sin tocar la piel adyacente.

b. Limpieza incorrecta del tejido periuretral y perineal antesde recolectar una muestra de orina del chorro medio de lamicción obtenida en condiciones adecuadas de higiene enuna mujer.

c. Contaminación de una muestra de endometrio con secre-ciones vaginales.

d. No acceder a la parte profunda de un absceso con agujaso cánulas de aspiración.

En general, los hisopados no constituyen un método adecua-do de recolección de muestras en la mayoría de los casos; debe-ría alentarse la utilización de punciones y aspiración a través deagujas y catéteres. Los recipientes protectores para descartarlos objetos cortopunzantes deben estar accesibles y ser aptospara la eliminación de las agujas con el fin de reducir el riesgode accidentes.2. Se deben establecer los tiempos óptimos de recolección de mues-tras para proporcionar la mejor oportunidad de recuperar los micro-organismos que son agentes causales. El conocimiento de la evo-lución natural y de la fisiopatología de los procesos infecciososes importante para determinar el momento correcto de la reco-lección de muestras. A pesar de que la fiebre tifoidea es ahorapoco común en los Estados Unidos, la progresión del procesoinfeccioso en esta enfermedad es un ejemplo ilustrativo de laimportancia de recolectar las muestras adecuadas en diferentes


1 2 3 4 5 6 7 8

Semanas de infección

Aglutininas séricas

Heces

Orina

Por

cent

aje

de p

acie

ntes

con

cul

tivos

pos

itivo

s

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Sangre

Figura 1-2 Diagnóstico de fiebre tifoidea por cultivo y serología.


momentos (fig. 1-2). La bacteria causal puede aislarse en formaóptima en muestras de sangre durante la primera semana deenfermedad. El cultivo de heces o de orina es casi siempre po-sitivo durante la segunda y la tercera semanas. Las aglutininasséricas comienzan a aumentar durante la segunda semana,alcanzan un pico a la quinta semana, y se pueden detectar du-rante varias semanas después de la remisión clínica de la enfer-medad, pero no se las suele utilizar con fines diagnósticos enlos laboratorios modernos.

No deben recolectarse muestras clínicas para cultivo duran-te 24 horas, en especial esputo u orina, porque el riesgo de con-taminación o de sobrecrecimiento de las bacterias comensalesde rápido crecimiento es mayor que si se toma una muestraúnica y se envía al laboratorio.3. La muestra debe obtenerse en una cantidad suficiente para larealización de los análisis requeridos. Se deben establecer guíaspara definir el volumen de material requerido para los análisis.En la mayoría de las infecciones bacterianas activas se produ-ce suficiente cantidad de pus o secreción purulenta de modoque el volumen no debería significar un problema. Sin embar-go, muchas veces, un médico que no lo sabe puede enviar unamuestra pequeña y descartar el resto del material.

En las formas crónicas o leves de infección, puede ser difícilobtener material suficiente. El envío al laboratorio de un hiso-po seco o de una muestra escasa de secreciones con la espe-ranza de poder aislar algún patógeno es a menudo un ejercicioinútil y, posiblemente, de un costo considerable para el pacien-te. O lo que es peor aún, se puede considerar de manera inco-rrecta que la lesión no estaba infectada basándose en un culti-vo falso negativo.

En forma frecuente se envía al laboratorio una muestra de0,5 mL o menos de un material rotulado como “esputo” o“lavado bronquial” y se solicitan pruebas de rutina, tincionespara bacterias ácido-alcohol resistentes y cultivo para hongos.Estas muestras pueden no representar las secreciones pulmo-nares del sitio de la infección y el pequeño volumen puederesultar insuficiente para permitir la realización de todos losprocedimientos requeridos. Se pueden suministrar tubos quecontienen medios de transporte como solución fisiológica (nonutritivo) o caldo de fosfato, levadura y glucosa (PYG) (nutri-tivo). El médico puede inocular directamente cualquier canti-dad de material que pueda recolectar. Así, la muestra puededividirse en el laboratorio para inocularla en numerosos mediosde aislamiento primario. En algunas instituciones, se proveenvarios tubos cada uno de los cuales contiene los medios de cul-tivo óptimos para el aislamiento de micobacterias, hongos yvirus. Si las secreciones que se obtuvieron son mínimas, elmédico deberá elegir el tubo basándose en las consideracionesclínicas.

Cuando el tamaño de la muestra es demasiado pequeño paracumplir con los requisitos en forma apropiada, es convenientecomunicarse con el médico para establecer las prioridades decultivo. El informe debe indicar que el material enviado paraanálisis era escaso.4. Para asegurar la recuperación óptima de los microorganismos sedeben utilizar dispositivos de recolección de muestras, recipientesy medios de cultivo apropiados. Se deben utilizar recipientes esté-riles para la recolección de la mayoría de las muestras. Esimportante que estén diseñados para facilitar esa recolección,sobre todo si el paciente debe tomar su propia muestra. Losfrascos de boca angosta no son útiles para muestras de esputoo de orina. Los recipientes también deben tener tapas que cie-rren en forma ajustada para evitar los derrames o la contami-nación durante el transporte.

Los hisopos se utilizan para obtener diferentes tipos demuestras para cultivo; sin embargo, suelen ser menos conve-nientes que otros métodos para la recolección de muestras, porlo tanto, en la medida de lo posible, se debe desalentar su uso.Si se los utiliza, hay que tomar ciertas precauciones. Los hiso-pos de algodón pueden tener ácidos grasos residuales y el algi-nato de calcio puede liberar productos tóxicos que inhiben elcrecimiento de ciertas bacterias con requerimientos nutriciona-les especiales (fastidious). En general son preferibles los hiso-pos con puntas de poliéster de Dacron® o de Rayon®. No sedebe permitir que las muestras estén en contacto con el hisopomás tiempo que el necesario. Además de la toxicidad, la capa-cidad de los hisopos de absorber y luego liberar las muestrasvaría con el material utilizado en su fabricación.

Los hisopos deben colocarse en un medio de transporte o enun recipiente húmedo para evitar que las bacterias se sequen ymueran. Se ha demostrado un buen aislamiento de la mayoríade las especies bacterianas en estos tubos hasta 48 horas o másluego de la recolección de la muestra. La utilización de tubosque contienen medio de transporte semisólido de Stuart o deAmies, con carbón o sin él, también son útiles para mantenerlos hisopos de cultivo durante el transporte. Existen algunasexcepciones a esta normativa. Las muestras de raspado de pielo de cortes de uñas para el aislamiento de hongos dermatofíti-cos deben enviarse secas en un recipiente limpio para evitar elsobrecrecimiento de las bacterias. Los hisopados de gargantapara aislamiento de Streptococcus pyogenes pueden enviarseen medio de transporte, pero el aislamiento de esta bacteria“resistente a la sequedad” mejora si se envía el hisopo seco por-que mueren otras bacterias que colonizan la orofaringe.

La capacidad para recolectar casi cualquier muestra con unhisopo es un problema aún mayor que la toxicidad y la reten-ción de material. Mientras un aspirado o una biopsia garantizanuna muestra que puede generar resultados interpretables, posi-tivos o negativos, un hisopo puede haberse utilizado para tomaruna muestra de un proceso inflamatorio o de la flora que colo-

Fases del ciclo diagnóstico 11

Figura 1-3 Comparación de muestras de una articulación infectada, obteni-das por aspiración (pus) e hisopado. La aspiración dio origen a un cultivo purode Staphylococcus coagulasa positivo. El estafilococo también se aisló en lamuestra recolectada con el hisopo, pero estaba mezclado con otras bacterias dela flora contaminante. La interpretación con el aspirado fue inmediata; ladeterminación del significado del cultivo del hisopado es problemática, aun enpresencia de un patógeno potencial.

Aspirado Hisopado


niza. A veces, el verdadero patógeno puede estar escondido enuna mezcla de bacterias que se tomaron con un hisopo, pero escasi imposible estar seguro. Se puede llegar a interpretar en elcaso de un microorganismo que es un patógeno documentadoy nunca coloniza a seres humanos, pero esos criterios se cum-plen rara vez. En la figura 1-3 se comparan los resultados delcultivo de un aspirado y de un hisopo del mismo sitio.

Es posible hacer un frotis y un cultivo a partir de un únicohisopo si el portaobjetos se flamea para esterilizarlo antes deque se prepare el extendido. Sin embargo, muchos laborato-rios requieren que se envíen dos hisopos, uno para el frotis yotro para el cultivo, de modo que haya material adecuadopara ambos. En ese caso es importante proveer sistemas de

transporte con dos hisopos al personal auxiliar para evitar queenvíen un único hisopo en un pedido de extendido y de cultivo(fig. 1-4).

En particular, se desaconseja la obtención de muestras conhisopos para el aislamiento de bacterias anaerobias; en cambio,para este fin se recomiendan la aspiración con aguja y jeringa.Las muestras recolectadas deben siempre protegerse de suexposición al oxígeno ambiental y evitar que se sequen hastaque puedan procesarse en el laboratorio. Los sistemas de trans-porte seleccionados para las muestras anaerobias se enumeranen el cuadro 1-5.

Se requiere educación continua para impedir la utilizaciónerrónea de los hisopos, que constituye un hábito muy arraiga-


Figura 1-4 Sistemas de transporte de hisopos. El sistema más simple consta de un único hisopo en un tubo de transporte que contiene un medio sin nutrientespara mantener la humedad (arriba). Se comercializa un sistema similar con dos hisopos en un único tubo de transporte (abajo); en este caso uno de los hisopos puedeutilizarse para cultivo y el segundo hisopo, para realizar un frotis directo.

Sistema con un hisopo

Sistema con dos hisopos

Cuadro 1-5 Recipientes para el transporte de muestras anaerobias

RECIPIENTE

Jeringa y aguja para aspiración

Tubo o frasco ampolla

Hisopo con sistema de cubierta plástica

Bolsa para materiales biológicos o bolsa de plástico

FUNDAMENTO O DESCRIPCIÓN

Los exudados frescos o las muestras líquidas pueden transportarse al laboratorio luego de expelercon cuidado las burbujas de la jeringa e insertar la punta de la aguja en un tapón estéril. Este pro-cedimiento es válido sólo si la muestra puede ser transportada al laboratorio sin demora. Estapráctica está bajo discusión dada la probabilidad de transmisión de HIV por heridas con la aguja

Tubos o frascos ampolla que contienen un medio semisólido, una atmósfera con 5% de CO2, unagente reductor y el indicador resazurina para dar una señal visual de anaerobiosis. El tubo se uti-liza principalmente para la inserción de muestras en hisopos; los frascos ampolla se utilizan parala inoculación de las muestras líquidas

El tubo o cubierta plástica incluye un hisopo y contiene el medio Cary-Blair, Amies de transporte oprerreducido (PRAS). El sistema Culturette® también incluye un frasco ampolla o cámara separa-da por una membrana que contiene sustancias químicas que generan catalizadores de CO2 y dese-cantes para “atrapar” el O2 residual que pueda quedar dentro del sistema

Bolsas de plástico transparentes para materiales biológicos que contienen un sistema generador deCO2, un catalizador de paladio y un indicador anaerobio. La bolsa es lo suficientemente grandecomo para guardar una placa de Petri inoculada que contiene un medio prerreducido o una bande-ja de microtubos de identificación bioquímica, como las utilizadas para realizar las pruebasMinitek®. La bolsa para materiales biológicos o bolsa de plástico se sella luego que se introdujoen ella la placa inoculada y se activó el sistema generador de CO2. La ventaja de estos sistemas esque las placas pueden observarse directamente a través del plástico transparente y delgado de labolsa para efectuar la visualización del crecimiento temprano de las colonias


do. La educación se puede realizar mediante instrucciones derecolección de muestras impartidas por la dirección de los ser-vicios del laboratorio, a través de boletines informativos ocomentarios en los informes de muestras que se han enviado enhisopos.

En el quirófano no existen motivos que justifiquen la obten-ción de muestras con hisopos. Se debe llevar a cabo una cam-paña para eliminarlos del quirófano y evitar su reingreso. Unmedio útil para lograr este objetivo es la comunicación con losenfermeros del quirófano. En la Vermont University diseñamosun método propio para la recolección de muestras en el quiró-fano, porque no están disponibles comercialmente los recursosadecuados. En el laboratorio se preparan frascos ampolla esté-riles que contienen una rosca en la parte superior con un dia-fragma de goma. En el fondo del frasco se coloca una capa del-gada de agar no nutritivo para mantener la humedad. Luego selo coloca en un envase adecuado para ponerlo en el autoclave;de este modo, un asistente puede colocar el envase estéril sobrela bandeja de instrumentación en el quirófano. El cirujanopuede inyectar el material a través del diafragma de goma ocolocar el tejido dentro del frasco ampolla luego de desenros-car la tapa. El tejido se encuentra en un ambiente lo suficiente-mente anaerobio y, por lo tanto, el sistema es perfecto para elaislamiento de microorganismos anaerobios y facultativos. Sinla protección del envoltorio, el frasco ampolla sirve comomedio general de transporte (fig. 1-5).

Cualquiera que sea el sistema de transporte utilizado, la prin-cipal tarea es reducir al mínimo la demora entre la recolecciónde la muestra y su inoculación en el medio. Por ejemplo, si seutilizan los hisopados rectales para el aislamiento de Shigellade pacientes con disentería bacilar, el material recolectado debeinocularse directamente sobre la superficie del medio deMacConkey o en un caldo para enriquecimiento de gramnega-tivos. La utilización de un medio de mantenimiento o de trans-porte puede poner en peligro el aislamiento de ciertas cepas.Las secreciones uretrales o cervicales que se obtienen para elaislamiento de Neisseria gonorrhoeae también deben ser ino-culadas en una superficie de agar chocolate y en uno de losnumerosos medios de cultivo selectivos. En su defecto, sepuede utilizar un sistema de transporte comercial que incluyeuna tableta de la generación de CO2 (BD BBL® Jembec® sys-tem; BD, Franklin Lakes, NJ) para el aislamiento de N. gonorr-hoeae. En forma similar, las muestras de las vías aéreas altaspara el aislamiento de Bordetella pertussis deben inocularsesobre agar Bordet-Gengou, carbón Regan-Lowe94 recientemen-te preparado, o un medio equivalente a la cabecera del pacienteo en la clínica, a menos que se utilice un medio de transporteadecuado (como el medio Regan-Lowe).5. Cuando sea posible, deben obtenerse los cultivos antes de laadministración de los antibióticos. Se recomienda la obtención delos cultivos antes de prescribir los antibióticos, sobre todo parael asilamiento de los microorganismos que son muy sensibles aellos, como los estreptococos β-hemolíticos de las muestras dehisopado de garganta, N. gonorrhoeae de las muestras del apa-rato genitourinario o Haemophilus influenzae o N. meningitidisdel líquido cefalorraquídeo. La administración de antibióticosno impide siempre el aislamiento de los microorganismos delas muestras clínicas; en estas circunstancias, obtener unamuestra puede ser mejor que no hacerlo, en tanto y en cuantolos médicos entiendan que los resultados deben analizarse concierto reparo.6. En muchas instancias, además de los cultivos se deben realizarfrotis. Los frotis proporcionan una información extremadamen-te útil que complementa al cultivo. En ciertas situaciones el fro-

tis es mucho más útil que el cultivo, como en el caso del espu-to expectorado. Los extendidos permiten la determinación dela naturaleza inflamatoria de una muestra e indican si losresultados del cultivo tienen significado clínico. Por ejemplo,la muestra de una herida que no contiene neutrófilos polimor-fonucleares y da un cultivo positivo de flora bacteriana mixtano puede considerarse válida. Es muy probable que los médi-cos que confían en los resultados de este cultivo se sientandecepcionados.

Además, las tinciones de Gram indican la flora microbianapresente. Un frotis que tiene muchos bacilos gramnegativosque no pueden crecer en un cultivo aerobio clásico indica quelas condiciones del cultivo no eran las óptimas o que los micro-organismos no eran viables. Las condiciones de cultivo subóp-timas incluyen una atmósfera incorrecta de incubación (anae-robios) o un medio incorrecto (organismos con requerimientosnutricionales especiales como Legionella o Bordetella). Losmicrobios pueden no ser viables como consecuencia de unaterapia antimicrobiana apropiada o de una respuesta inflamato-ria eficaz.

Las reglamentaciones estatales sobre fraude y abuso exigenque un laboratorio realice sólo los análisis que le han sido soli-citados. Más adelante se comentarán los mecanismos paraintensificar el uso apropiado del laboratorio en la fase preana-lítica.7. El recipiente de cultivo debe estar rotulado en forma adecuada.Cada recipiente de cultivo debe tener una etiqueta legible, conla siguiente información mínima:

Nombre del pacienteNúmero de identificación del pacienteFuente de la muestraMédicoFecha y hora de la recolección


ABC

Figura 1-5 Sistema de transporte para cultivos aerobios o anaerobios. Se cie-rra un frasco ampolla con una tapa a rosca que contiene un diafragma de goma.Una capa de agar en el fondo del frasco ampolla mantiene la humedad; un indi-cador de oxidorreducción en el agar indica visualmente la oxigenación de laatmósfera. El frasco ampolla A contiene un líquido aspirado que ha sido ino-culado a través del diafragma de goma. El frasco ampolla B contiene un frag-mento de tejido que se colocó dentro del frasco ampolla destapado en la ciru-gía. El frasco ampolla C ha sido esterilizado dentro de un envoltorio fabricadopara instrumentos quirúrgicos; está listo para abrirse sobre un campo estéril.


Utilice el nombre completo del paciente y evite las iniciales.El número de identificación debe ser el número del hospital,del consultorio o de la clínica, la dirección de su casa o elnúmero del seguro social, según las circunstancias. El nombredel médico o del contacto en el consultorio es necesario por sise requiere alguna consulta o adelantar un informe. El origende las muestras debe anotarse para que, si es necesario, seseleccione un medio especial de cultivo. La fecha y hora de larecolección deben aparecer en la etiqueta para determinar suprocesamiento a tiempo. Otra información útil es el diagnósti-co clínico y la historia de tratamiento con antibióticos delpaciente.

TRANSPORTE DE LA MUESTRAEl objetivo principal del transporte de la muestra para diag-

nóstico, ya sea dentro del hospital, desde la clínica o su envíopor correo hacia un laboratorio de referencia, es mantenerla,dentro de lo posible, de la manera más parecida a su estado ori-ginal. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)85

ha creado diversas guías para los fabricantes de los dispositivospara la recolección y el transporte de muestras. Los peligrospara las personas que manipulan las muestras se reducen si losdispositivos de recolección cierran en forma ajustada y se colo-can dentro de recipientes de protección adecuados. Para man-tener la integridad de la muestra se deben evitar las condicio-nes ambientales adversas, como la exposición al frío o al calorextremos, los cambios rápidos de presión (durante el transpor-te aéreo) o el secado excesivo. Si se estima una demora pro-longada hasta el procesamiento de la muestra (p. ej., más de 4días), es preferible congelarla a –70 °C. Para períodos cortos dealmacenamiento, un congelador con temperaturas de –20 °Cpuede ser útil para algunas muestras siempre que el aparato nosea del tipo que no produce escarcha. Muchos virólogos creenque las muestras para cultivo de virus (y los aislamientos vira-les) nunca deben almacenarse a –20 °C.

Las muestras de esputo que se recolectan principalmentepara el aislamiento de micobacterias y hongos en recipientes depropileno o polietileno pueden enviarse sin ningún acondicio-namiento posterior. No se deben utilizar recipientes de vidriopara evitar roturas durante el transporte.

La mayoría de las muestras líquidas deben ser transportadasal laboratorio lo antes posible. En un hospital, se recomienda unmáximo de 2 horas entre la recolección y el envío de la mues-tra.5,49 Este límite de tiempo resulta un problema para lasmuestras que se toman en el consultorio médico. Si no es po-sible su transporte rápido, se pueden utilizar recipientes conuna pequeña cantidad de ácido bórico para el transporte deorina. De manera alternativa, las muestras de orina puedenrefrigerarse hasta 24 horas antes de su cultivo. Para la mayoríade las otras muestras se puede utilizar un medio de manteni-miento o transporte, siguiendo las instrucciones del fabricante.Los medios de transporte empleados con mayor frecuencia sonStuart, Amies y Carey-Blair (recuadro 1-2).

Estos medios son esencialmente soluciones amortiguadoras(buffers) con hidratos de carbono, peptonas y otros nutrientes,sin factores de crecimiento, diseñados para mantener la viabi-lidad de las bacterias durante su transporte pero sin permitir sumultiplicación. Se les agrega tioglicolato de sodio como reduc-tor para mejorar el aislamiento de las bacterias anaerobias y lapequeña cantidad de agar les proporciona una consistenciasemisólida que evita la oxigenación y el derrame durante eltransporte. Para enviar a laboratorios distantes muestras en lasque se sospecha la presencia de micobacterias, se recomienda

una solución de borato de sodio como conservante.98 Para elaislamiento de ciertos virus, como los del herpes, un buenmedio buffer de transporte es sacarosa-fosfato-glutamato. Enalgunos centros también se utilizan con éxito los hisoposCulturette® para el transporte de muestras para aislamientosvirales.107

RECEPCIÓN DE LA MUESTRA Y OBSERVACIONES PRELIMINARESEn la mayoría de los laboratorios clínicos se designa un área

para la recepción de las muestras. Las observaciones inicialesy la manipulación deben realizarse en una cabina de seguridadbiológica (véase más adelante) debido al riesgo de que el per-sonal pueda sufrir una infección adquirida en el laboratorio apartir de muestras que contienen patógenos. El personal debevestirse con indumentaria de protección adecuada, bata, guan-tes de goma y, en ciertos casos, máscaras de protección. Estasprecauciones se tomaban antes sólo con las muestras que lle-vaban etiquetas de peligro. Sin embargo, es imposible determi-nar si un paciente está infectado con un agente transmisible osi una muestra contiene un patógeno muy contagioso. Por lotanto, es prudente tener un cuidado especial cuando se mani-pulan todas las muestras (cuidados universales).

El procesamiento de las muestras incluye: 1) el registro delos datos fundamentales en un cuaderno o base de datos de or-denador, 2) el examen visual y la evaluación de si se cumplentodos los criterios para aceptarla (véase la sección inmediataadelante sobre los criterios para el rechazo de una muestra) y3) para ciertas muestras, el examen microscópico de los mon-tajes directos o las tinciones de los frotis para establecer undiagnóstico presuntivo.

CRITERIOS PARA EL RECHAZO DE LAS MUESTRASEn todos los laboratorios se deben establecer los criterios

para el rechazo de las muestras que no son adecuadas para elcultivo.112 A pesar de que existen normas generales y de que lasagencias acreditadas han establecido los estándares, cada direc-tor de laboratorio debe decidir los parámetros por utilizar,según las condiciones locales. Se deben verificar los formula-rios de pedido y las etiquetas de las muestras para corroborarque se incluya toda la información fundamental y que ésta seacoherente. Ante un problema, la recolección de una nuevamuestra es lo más recomendable. Si la muestra no puedetomarse nuevamente, se debe buscar a una persona responsablepara adoptar las medidas pertinentes. Se debe incluir uncomentario en el informe final en el cual se indique que lamuestra fue recibida con un problema (específico) y agregar el


Recuadro 1-2 Medio de transporte de Stuart

Cloruro de sodio 3 gCloruro de potasio 0,2 gFosfato disódico 1,25 gFosfato monopotásico 0,2 gTioglicolato de sodio 1 gCloruro de calcio, 1% en agua 10 gCloruro de magnesio, 1% en agua 10 gAgar 4 gAgua destilada cantidad suficiente para 1 L

pH = 7,3


nombre de quien resolvió ese problema. Si es posible determi-nar el tipo de muestra, puede aceptarse que en ciertos casos seincluya en el informe: “la muestra parece ser...”; de lo contra-rio, se la debe rechazar. Siempre que haya discrepancia, sedebe hacer un informe escrito de cómo se manejó la situacióny de los nombres de las personas que se contactaron, en la partede atrás de la solicitud del estudio, en el cuaderno de registro oen la base de datos del ordenador.

En el recuadro 1-3 se enumeran los tipos de muestras y lospedidos de cultivos que deben aparecer en una lista de recha-zos y que no deben procesarse.

Cuando se rechaza una muestra, debe contactarse a la perso-na que la envió y ponerla al tanto sobre la situación. Se debeintentar en lo posible no rechazar las muestras difíciles de reco-lectar nuevamente, como el líquido cefalorraquídeo o los lava-dos bronquiales. Si no se puede resolver un problema en formaexpeditiva, se deben realizar los cultivos para evitar la pérdidade la integridad de la muestra. La decisión sobre informar o nolos resultados se puede tomar con posterioridad. Si correspon-de, las condiciones de la muestra se deben incluir en el infor-me. Luego, el médico tendrá la responsabilidad sobre la inter-pretación del informe a la luz de los datos disponibles.

Los criterios de rechazo deben enumerarse en forma clara enlas directivas de los servicios del laboratorio. Se debe instruir alpersonal del hospital sobre la importancia del envío de muestrasaptas para el cultivo. Además, se deben publicar los problemasrecurrentes y sus soluciones en los boletines del laboratorio y enotras publicaciones que estén al alcance del personal del hos-pital y de los médicos de planta.

RELACIÓN COSTO-EFICACIA EN LA FASE PREANALÍTICALa relación costo-eficacia fue una mala palabra durante

muchos años en microbiología clínica. Los microbiólogos tra-dicionales consideraban este tema antiacadémico, impuro eincluso peligroso. Sin embargo, otro punto de vista es la apli-cación de lo que es clínicamente relevante al diagnósticomicrobiológico. El objetivo no es identificar todo microorga-nismo que pueda ser aislado o hacer el antibiograma a cadauno que crece en el laboratorio. La idea es proporcionarle a losmédicos la información que les permita brindar la mejor aten-ción a los pacientes. Desde este enfoque, el trabajo del micro-biólogo puede ser usualmente más económico que hacer todolo que sea posible. Es decir, el criterio de relevancia clínicaiguala a la relación costo-eficacia. La relación costo-eficaciano significa barato: significa el mejor valor para el dinero.

Raymond Barlett, un distinguido patólogo y director duran-te muchos años del laboratorio de microbiología del HartfordHospital de Connecticut, es reconocido como el padre del cri-terio de relevancia clínica en los laboratorios de diagnósticomicrobiológico. Aún hoy es importante que los microbiólogoslean su libro original sobre el tema.5,6 Todos los que siguieronal doctor Barlett tienen con él una deuda de gratitud.

En cada paso del procesamiento de laboratorio debe infor-marse la relevancia clínica y la relación costo-eficacia. En elcuadro 1-6 se detallan algunas sugerencias para la fase preana-lítica. Se pueden lograr ahorros sustanciales de materiales ytiempo.70 Las condiciones varían en cada institución, por lotanto, cada director de laboratorio debe decidir sobre las opcio-nes más adecuadas.

Fase analítica

EXAMEN MICROSCÓPICO

Se han enfatizado las razones por las cuales se debe realizarel examen microscópico de los materiales clínicos.5,7

1. El número y el porcentaje de neutrófilos segmentados queestán presentes indican la magnitud y el tipo de respuestainflamatoria. La calidad de la muestra se puede validar.

2. La observación de bacterias, elementos miceliales, formasde levaduras, estructuras de parásitos o inclusiones viralespuede proporcionar información suficiente para la elabora-ción de un diagnóstico presuntivo inmediato.

3. El examen microscópico directo puede también proporcionarevidencia presuntiva inmediata de la presencia de bacteriasanaerobias. Con estos datos en la mano, el médico puedetomar una decisión más racional sobre el tratamiento antimi-crobiano inicial.

El examen por microscopia de contraste de fase o de campooscuro de material sin tinción de muestras húmedas es útil parademostrar movilidad y la resistencia de espiroquetas y endos-poras. Las tinciones de Giemsa, de Wright o naranja de acridi-na pueden ser de ayuda para la observación de formas bacteria-


Recuadro 1-3 Tipos de muestras o solicitudes de cultivoque deben rechazarse

1. Cualquier muestra recibida en formol. La única excepción podríanser las muestras grandes con un corto tiempo de exposición al for-mol (menos de 1 hora). En estas circunstancias, el tejido deberá sercortado en dos con una cuchilla o tijera estéril y se tomará unamuestra de la porción más interna para su cultivo

2. Los esputos recolectados durante 24 horas. Es difícil evitar la conta-minación y las muestras individuales que contienen una alta concen-tración de microorganismos se diluirán por las muestras siguientesmenos concentradas

3. Los frotis de secreciones del cuello interno, del canal vaginal o deano para la detección de Neisseria gonorrhoeae por tinción de Gram

4. Hisopado único enviado para múltiples solicitudes, por ejemplo;“aerobios, anaerobios, hongos y tuberculosis”

5. El envío en un recipiente inadecuado, no estéril u obviamente conta-minado, en el cual parte de la muestra se ha derramado. Cualquierrecipiente con filtraciones que tenga un rótulo de peligro biológicodebe ser manipulado con extremo cuidado

6. Las placas de cultivo que están sobrecrecidas o resecas. Una excep-ción podría ser una placa de cultivo de un aislamiento de uno de loshongos patógenos (véase cap. 19). A veces, uno de los hongos pató-genos de crecimiento más lento puede aún crecer por encima de bac-terias u otro hongo filamentoso. Puede ser adecuada la consulta conel médico

7. Las muestras que están obviamente contaminadas como lo pone enevidencia la presencia de materiales extraños, como bario, colorantescoloreados o sustancias químicas oleosas

8. Las siguientes muestras no son aceptables para cultivos anaerobios:lavados gástricos, orina del chorro medio, secreciones prostáticas porrecolección transuretral, heces (excepto para el aislamiento de espe-cies de Clostridium asociadas con enfermedad gastrointestinal comoC. difficile, C. perfringens, C. septicum), hisopados de ileostomía ocolostomía, muestras de faringe, nariz u otras zonas orofaríngeas(excepto las muestras obtenidas de un tejido profundo durante unacirugía bucal), piel superficial y cultivos del ambiente



Cuadro 1-6 Relación costo-eficacia en la fase preanalítica de las pruebas

ACCIÓN

Cultivo selectivo de LCR para hon-gos70

Cultivo selectivo de LCR paramicobacterias70

Cultivo selectivo de heces parapatógenos bacterianos o análisispara huevos y parásitos70,105

Cultivo selectivo de aspiradosendotraqueales o esputos expec-torados70

Utilización selectiva de caldos decultivo de apoyo para los cultivosbacterianos

No utilizar pruebas de antígenosbacterianos en LCR70,111

Cultivo selectivo de líquido peritoneal

Cultivo selectivo de muestras de faringe

Cultivo selectivo de bacterias anae-robias

Limitar la frecuencia del cultivo

Limitar la frecuencia de los exá-menes de huevos y parásitos

Limitar la frecuencia de pruebaspara C. difficile96

Limitar las pruebas de DNA paravirus del herpes simple enLCR106,110

Limitar el envío de muestras dupli-cadas del mismo sitio en elmismo día

Limitar la repetición de muestrasde un sitio no estéril dentro deun período definido

No cultivar puntas de catéteres uri-narios permanentes114

FUNDAMENTO

Bajo rendimiento en pacientes inmunocompetentes quetienen valores normales en las pruebas químicas y enel recuento de células en el LCR

Bajo rendimiento en pacientes inmunocompetentes quetienen valores normales en las pruebas químicas y enel recuento de células en el LCR

Bajo rendimiento en pacientes que han sido hospitaliza-dos durante más de 3 días

Incremento en el aislamiento de flora orofaníngea conta-minante si se observan más de 10 células epitelialespavimentosas por campo de bajo aumento

Utilidad cuestionable excepto para biopsias de tejidos yciertos líquidos, como pacientes con desvíos de LCR oque son sometidos a diálisis peritoneal crónica

Escasa sensibilidad y especificidad que limitan su utilidad

Patrón de aislamiento de patógenos y perfiles de sensibi-lidad predecibles en pacientes con peritonitis secunda-ria (adquirida en la comunidad)

Streptococcus pyogenes es el principal agente etiológicode la faringitis: el “cultivo de rutina” con múltiplesmedios probablemente proporcione información falsa

Los cultivos de anaerobios deberían realizarse en formasistemática sólo en tejidos o líquidos aspirados/pus

Las muestras de faringe, orina y heridas se limitan a unacada 24 horas; las muestras de sangre se limitan a doso tres cultivos (10 a 20 mL por cultivo) cada 24 horas

El rendimiento a partir de los exámenes de Giardiacomo mínimo luego de tres muestras, las cuales debe-rán recolectarse en días alternos

Rendimiento luego de dos exámenes negativos comomínimo

Rendimiento mínimo si el recuento de células en LCR es normal y no hay evidencias de lesiones focales por resonancia magnética

Unificar las muestras o seleccionar la mejor muestra (ba-sado en la tinción de Gram o el tiempo de transporte)

Enviar las muestras siguientes a la evaluación previa; sila muestra siguiente ha sido inoculada en un medio yse presentan diferencias sustanciales con la muestraoriginal, consultar con el médico acerca de las accio-nes futuras

Rechazar la muestra para cultivo

COMENTARIOS

Cryptococcus neoformans puede causar infección crónica sinpleocitosis en el LCR

En las poblaciones con bajo riesgo de tuberculosis el rendi-miento puede ser aún menor

Los investigadores han aplicado varios criterios diferentes

Los caldos de cultivo pueden utilizarse en otras situacionessi se examinan sólo cuando un microorganismo presenteen frotis no se recupera en las placas. Éstos nunca debenaplicarse a muestras de las superficies mucosas

Cultivos indicados en peritonitis primaria (peritonitis bacte-riana espontánea) y en peritonitis adquirida en el hospital

Los cultivo para Corynebacterium diphteriae, Neisseriagonorrhoeae o virus del herpes simple deben solicitarseespecíficamente si es apropiado. Arcanobacterium hemoly-ticum causa faringitis en niños mayores y adolescentes,pero se aísla en medios aptos para Streptococcus pyogenes

Nunca realizar cultivos de anaerobios en muestras de sitiosque pueden estar contaminadas con flora de las mucosas oheces

Se debe sugerir el cultivo con una frecuencia no menor de48 a 72 horas (tiempo requerido para evaluar la primeramuestra)

Para otros parásitos intestinales probablemente sea adecuadorealizar menos de tres exámenes

Se describieron excepciones, especialmente en niños

Si existe cualquier incertidumbre en lo que se refiere a laequivalencia de las muestras, consultar con el médico antesdel procesamiento; cuando sea dudoso, procesarlas deinmediato en forma separada y consultar en el tiempolibre; preservar las muestras al menos por 24 horas

Preservar las muestras al menos por 24 horas; preservar lasplacas inoculadas que son evaluadas de manera incompletapor un período definido (p. ej., 7 días)

Informar al médico que debe remitirse la orina

LCR = líquido cefalorraquídeo.Para más información el lector puede consultar las referencias48,67.


nas que se tiñen débilmente o que tienen poco contraste con elmaterial de fondo.

También se puede utilizar la tinción de Gram directa sobrelos materiales clínicos para determinar si una muestra es repre-sentativa del sitio de infección. Esta técnica se aplica para laevaluación de las muestras de esputo. A partir del número decélulas epiteliales escamosas y de neutrófilos segmentados delas muestras de esputo teñidas con Gram en forma directa,Barlett5 diseñó un sistema de graduación para evaluarlas(recuadro 1-4). En este sistema se le asignan números negati-vos a un frotis en el que se observan células epiteliales esca-mosas, lo cual indica la contaminación con secreción orofarín-gea (saliva). Cuando se observa la presencia de neutrófilos seg-mentados se le asignan números positivos, que indican la pre-sencia de inflamación activa. La magnitud de esta calificaciónnegativa y positiva depende de la cantidad relativa de célulasepiteliales y neutrófilos segmentados, como se observa en elesquema del sistema de graduación de Barlett. Un puntaje finalde 0 o menor indica la ausencia de respuesta inflamatoria o lapresencia de contaminación significativa con saliva y, por lotanto, invalida la muestra. En la lámina en color 1-1 se obser-van microfotografías que ilustran este sistema de graduación enpreparaciones de esputo con tinción de Gram.

Murray y Washington72 propusieron un sistema similar(recuadro 1-5). El número elevado de células epiteliales en losgrupos 1 a 4 de este sistema indica contaminación con secre-ciones orofaríngeas e invalida la muestra. Sólo las muestras del

grupo 5 se consideran clínicamente relevantes. En un estudioclínico, Van Scoy115 recomendó que las muestras de esputo quecontuvieran más de 25 neutrófilos se acepten para el cultivo aunsi tenían más de 10 células epiteliales (grupo 4). Este criteriosugerido de evaluación ha sido valorado mediante su aplicacióna muestras apareadas de secreciones respiratorias obtenidas porexpectoración y por aspiración transtraqueal, una técnica queevita la contaminación con la flora de la orofaringe.39

El sistema de graduación de los esputos no puede aplicarsesi se sospechan infecciones pulmonares causadas por micobac-terias, la mayoría de los hongos, especies de Legionella y virus.Además, el significado de la presencia de neutrófilos polimor-fonucleares se altera en algunas situaciones: 1) cuando elpaciente está neutropénico a causa de una enfermedad o de untratamiento, 2) cuando el paciente no presenta una respuestainflamatoria eficaz y 3) cuando un cuerpo extraño causa irrita-ción de la superficie de la mucosa. La neutropenia puede ser elresultado de una deficiencia hereditaria o de que las célulasinflamatorias o sus precursores se destruyen por un proceso deenfermedad o por la quimioterapia para el tratamiento de unaenfermedad. En ciertas condiciones, la capacidad de los neu-trófilos de migrar hacia el sitio de la infección está disminuida.Es poco probable que el microbiólogo clínico pueda determi-nar si un paciente está neutropénico a partir de la informaciónque le proporcionan los médicos. Una de las excepciones, queaún no se comprende con claridad, es la movilización deficien-te de los neutrófilos observada en la infancia.24 La edad exactaa la cual se puede instalar una respuesta de neutrófilos comple-ta no está bien definida, pero en el caso de niños muy peque-ños (menores de 2 meses) las decisiones de rechazar una mues-tra o de evaluar un aislamiento en forma incompleta no debebasarse en la ausencia de neutrófilos en la muestra.

Las dos situaciones en las que un cuerpo extraño modifica lainterpretación acerca de los neutrófilos son la presencia de uncatéter endotraqueal en las vías aéreas bajas o la de un catéterpermanente, como un catéter de Foley, en el tracto urinarioinferior. En cada una de estas situaciones la aparición de neu-trófilos en la muestra puede reflejar irritación causada por elcatéter en lugar de un agente infeccioso (a pesar de que ambosfactores pueden estar presentes). En las vías aéreas, la inflama-ción puede originarse de una infección local (traqueítis) en vezde una neumonía, incluso si hay un elemento infeccioso. En eltracto urinario inferior, la presencia de leucocitos no puede uti-lizarse como indicador de infección clínica importante si se hacolocado un catéter en el lugar,108 o incluso, si se realizaroncateterismos en forma intermitente.40 La infección sintomáticaes el factor determinante para el tratamiento de una infeccióndel tracto urinario en el paciente con cateterismo crónico(véase cap. 2). La presencia de neutrófilos en muestras respira-torias no puede utilizarse como indicador de neumonía; estediagnóstico se realiza en forma clínica y radiográfica, como seanaliza en el capítulo 2.Técnicas de microscopia. Se pueden utilizar diversas técnicas enel examen microscópico directo de la muestra clínica parademostrar la presencia de microorganismos o para observarciertas características bioquímicas, fisiológicas o serológicas.Las técnicas más comunes en los laboratorios de microbiologíaclínica se enumeran en el cuadro 1-7. Como el índice de refrac-ción de las bacterias y de otros microorganismos es similar aldel medio de montaje, éstos no son visibles cuando se los exa-mina con luz brillante. En consecuencia, se puede necesitarcierta manipulación de la fuente de luz. A menudo, es de granayuda reducir la cantidad de luz que ingresa en el campo a tra-vés del cierre del iris del diafragma, lo cual aumenta el con-


Recuadro 1-4 Sistema de clasificación de Bartlett para laevaluación de la calidad de las muestras deesputo

Número de neutrófilos por campo de bajo aumento (10 ××)< 1010–25> 25Presencia de moco

Número de células epiteliales por campo de bajo aumento(10 ××)

10–25> 25Total*

Grado0

+1+2+1

–1–2

Recuadro 1-5 Sistema de clasificación de Murray yWashington para la evaluación de la calidadde las muestras de esputo

Grupo 1Grupo 2Grupo 3Grupo 4Grupo 5

Leucocitos por campo de bajo aumento

1010–25

252525

Células epiteliales por campo de bajo aumento

252525

10–25< 10

* Promedie el número de células epiteliales y neutrófilos de alrededor de 20 o 30 cam-pos separados de observación a 10 × y calcule el total. Un resultado final de 0 o menosindica ausencia de inflamación activa o contaminación con saliva. Debe pedirse unanueva muestra de esputo.



Cuadro 1-7 Técnicas para el análisis directo de muestras no teñidas

MÉTODOS Y MATERIALES

Preparación con solución fisiológicaCloruro de sodio, 0,85% (acuoso)Portaobjetos de vidrio, 7,5 × 2,5 cmCubreobjetosMezcla parafina-vaselina (Vaspar®)

Procedimiento de la gota gruesaPortaobjetos para gota gruesa (este es

un portaobjeto de vidrio con unpocillo central cóncavo)

CubreobjetosSolución fisiológica o aguaMezcla parafina-vaselina

Preparación con yodoSolución yodada de Lugol:Cristales de yodo, 5 gYoduro de potasio, 10 gAgua destilada, 100 mLDisolver el KI en agua y adicionar len-

tamente los cristales de yodo hastasu disolución. Filtrar y guardar enuna botella con tapón apretado.Diluir 1:5 con agua antes de usar

Portaobjetos de vidrio, 7,5 × 2,5 cmCubreobjetos

Preparación con hidróxido de pota-sio (KOH)

Hidróxido de potasio, 10% (acuoso)Portaobjetos de vidrio, 7,5 × 2,5 cmCubreobjetos

Preparación con tinta chinaTinta china (Pelikan®)oNigrosina (granular)*Portaobjetos de vidrio, 7,5 × 2,5 cmCubreobjetos

Examen en campo oscuroMicroscopio equipado con un con-

densador de campo oscuroPortaobjetos de vidrio, 7,5 × 2,5 cmCubreobjetosSolución fisiológicaPalillos aplicadores o raspadores de

cirugía Mezcla parafina-vaselina

PROPÓSITO

Para determinar la actividad biológica de los microor-ganismos, como movilidad y reacciones a ciertosquímicos o reactividad serológica contra suerosespecíficos. Esto último incluye la reacción de hin-chazón capsular de Neufeld usada para identificardiferentes tipos capsulares Streptococcus pneumo-niae y Haemophilus influenzae

La preparación de la gota gruesa sirve para el mismopropósito que la preparación con solución fisiológi-ca, excepto que existe menor distorsión debida alpeso del cubreobjetos y puede lograse un campo defoco más profundo dentro de la gota. Esta técnica seutiliza por lo general para el estudio de la movilidadbacteriana

La preparación con yodo suele utilizarse en paralelocon la preparación de solución fisiológica cuando seexaminan heces u otros materiales para la búsquedade protozoos o huevos de helmintos intestinales. Elyodo tiñe el núcleo y los orgánulos intracitoplasmáti-cos de manera que son más fáciles de visualizar

La preparación con yodo no pueden utilizarse en reem-plazo de las preparaciones con solución fisiológicadado que el yodo paraliza la movilidad de bacteriasy trofozoítos de protozoos

La preparación con KOH se utiliza para ayudar en ladetección de elementos fúngicos en materialesmucosos gruesos o muestras que contengan materialqueratinoso, como escamas de piel, uñas o pelos. ElKOH disuelve el fondo de queratina y, por lo tanto,desenmascara los elementos fúngicos y los hace másevidentes

Las preparaciones con tinta china o nigrosina se utili-zan para el examen microscópico directo de las cáp-sulas de muchos microorganismos. Los gránulosfinos de la tinta china o la nigrosina dan un fondosemiopaco contra el cual las cápsulas claras son fáci-les de visualizar. Esta técnica se utiliza sobre todo enla visualización de las grandes cápsulas deCryptococcus neoformans en líquido cefalorraquí-deo, esputo y otras secreciones

El análisis en campo oscuro se utiliza para visualizarciertos microorganismos delicados que son invisiblesen el examen microscópico con campo brillante ópti-co y se tiñen sólo con gran dificultad. Este métodose utiliza sobre todo en la demostración de espiro-quetas en chancros sifilíticos en los que se sospechaTreponema pallidum

TÉCNICAS

Dispersar una pequeña cantidad de la muestra para ser exa-minada dentro de una gota de solución fisiológica en unportaobjetos de vidrio. Cubrir con un cubreobjetos y exa-minar directamente con un objetivo (de inmersión) delmicroscopio de 40 × o 100 ×, mientras se cierra el iris deldiafragma para reducir la cantidad de luz transmitida.Para evitar que se seque, se realiza un círculo sobre elcubreobjetos con una pequeña cantidad de parafina-vase-lina antes de cubrir la gota de muestra que se encuentraen el portaobjetos

Se coloca una pequeña cantidad de mezcla parafina-vaseli-na alrededor del reborde del pocillo en la superficie infe-rior del portaobjetos para gota gruesa. Se colocan las bac-terias de una colonia que se va a examinar en el centro delcubreobjetos, dentro de una pequeña gota de agua o solu-ción fisiológica. Se invierte el portaobjetos y se presionasobre el cubreobjetos, guiando la gota de la suspensiónbacteriana dentro del centro del pocillo. El portaobjetos selleva con cuidado a la posición derecha para el examendirecto con el microscopio

Una pequeña cantidad de materia fecal u otro material semezcla en una gota de solución yodada en un portaobje-tos. Esto se mezcla para formar una suspensión y se colo-ca un cubreobjetos sobre la gota. Luego, el preparado seexamina directamente con el microscopio. Si el examendirecto se retrasa o si se desea realizar una preparaciónsemipermanente para un estudio futuro, los bordes delcubreobjetos pueden sellarse con una mezcla de parafina-vaselina

Se prepara una suspensión con las escamas de piel, uñas opelos en una gota de KOH al 10%. Se coloca un cubreob-jetos sobre la gota y se deja a temperatura ambiente poralrededor de media hora. El preparado se puede calentarsuavemente a la llama de un mechero Bunsen para acele-rar el proceso de clarificación. No hervir la preparación.Examinar con el microscopio para visualizar hifas fúngi-cas o esporas

Se centrifuga ligeramente el líquido cefalorraquídeo u otramuestra líquida para concentrar cualquier microorganismoen el sedimento. Se emulsiona una pequeña cantidad delsedimento dentro de una gota de tinta china o nigrosinasobre un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. Norealizar la emulsión de contraste demasiado gruesa o laluz transmitida puede bloquearse por completo. Examinarel preparado directamente con el microscopio, usando elobjetivo de 10 × para la búsqueda inicial y el objetivo de40 × para la confirmación de sospecha de microorganis-mos encapsulados

Se obtiene del paciente la secreción para ser examinada. Enel caso de un chancro, la costra de la superficie se raspacon bisturí y una pequeña cantidad del material seroso secoloca sobre un portaobjetos. Realizar un círculo sobre uncubreobjetos con una mezcla de parafina-vaselina y colo-car sobre la gota de material

(Continúa)


traste entre el objeto que se está observando y el fondo. Se debedesalentar la práctica habitual de bajar el condensador paralograr este efecto. Tinciones directas. Para visualizar las bacterias de manera ade-cuada y demostrar los detalles finos de sus estructuras internas,en general se requieren tinciones biológicas. La introducciónde las tinciones a mediados del siglo XIX fue, en gran parte, res-ponsable de los principales avances que tuvieron lugar en lamicrobiología y en otros campos de la microscopia de diag-nóstico durante los últimos 100 años. Hoy dependemos tantode las tinciones biológicas que es difícil darse cuenta cómohubiera progresado el estudio de las bacterias sin su imple-mentación. En el cuadro 1-8 se enumeran las fórmulas quími-cas, los componentes y las aplicaciones de las tinciones que seutilizan con mayor frecuencia en el laboratorio microbiológico.

Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u orgáni-cas de colorantes o grupos de colorantes que proporcionan unavariedad de colores a los microorganismos y a los tejidosvegetales y animales, u otras sustancias de importancia bioló-gica. Los colorantes pueden utilizarse como tinciones directosde materiales biológicos, como indicadores de cambios de pHen los medios de cultivo, como indicadores de oxidación-reducción para demostrar la presencia o la ausencia de condi-ciones anaerobias o para demostrar las funciones fisiológicasde los microorganismos utilizando las técnicas denominadassupravitales.

Casi todos los colorantes con utilidad biológica son deriva-dos del alquitrán de hulla. La estructura química básica de lamayoría de los colorantes es el anillo de benceno. Los coloran-tes están compuestos, en general, por dos o más anillos de ben-ceno conectados por enlaces químicos bien definidos (cromó-foros) que se asocian con la producción de color. A pesar deque el mecanismo subyacente del desarrollo del color no secomprende por completo, en teoría, ciertos radicales químicostienen la propiedad de absorber la luz a diferentes longitudes de

onda y actúan así como prismas químicos. Algunos de los gru-pos cromóforos más comunes que se encuentran en los colo-rantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O y NO2.(Nótese la presencia de estos grupos en las fórmulas químicasde los colorantes que se muestran en el cuadro 1-8). La inten-sidad del color de un colorante es proporcional al número deradicales cromóforos presentes en el compuesto.

Los colorantes difieren unos de otros en el número y el orde-namiento de estos anillos y en la sustitución de los átomos dehidrógeno con otras moléculas. Por ejemplo, existen tres susti-tuciones únicas claves para un átomo de hidrógeno del bence-no que constituyen la estructura básica de la mayoría de loscolorantes: 1) sustitución con un grupo metilo para formartolueno (metilbenceno), 2) sustitución con un grupo hidroxilopara formar fenol (ácido carbólico) y 3) sustitución con ungrupo amino para formar anilina (fenilamina). La mayoría delos colorantes utilizados en microbiología son derivados de laanilina y por eso se denominan colorantes anilina.

Todos los colorantes biológicos tienen alta afinidad por elhidrógeno. Cuando todos los sitos de la molécula que puedenunir hidrógeno están completos, el colorante se encuentra en suestado reducido y, por lo general, es incoloro. En este estado,se lo denomina compuesto leuco. Siguiendo con este razona-miento, pero de manera opuesta, un colorante retiene su colorsólo en la medida en que su afinidad por el hidrógeno no esté


Cuadro 1-7 Técnicas para el análisis directo de muestras no teñidas (cont.)

MÉTODOS Y MATERIALES

Reacción de hinchazón capsular deNeufeld

Suero homólogo anticapsularSolución fisiológicaPortaobjetos de vidrio, 7,5 × 2,5 cmCubreobjetos

PROPÓSITO

Cuando las especies de bacterias encapsuladas seponen en contacto con un suero que contiene anti-cuerpos anticapsulares homólogos, sus cápsulasexperimentan un cambio en el índice de refracciónpara producir “hinchazón” que es visible en el exa-men microscópico. El procedimiento serológico seutiliza para la identificación de varios tipos deStreptococcus pneumoniae y Haemophilus influen-zae en líquidos biológicos o en cultivos

TÉCNICAS

Examinar el preparado directamente con el microscopioadaptado con un condensador de campo oscuro con obje-tivos de 40 × o 100 ×. Las espiroquetas aparecerán como“sacacorchos” móviles y brillantes contra un fondo negro

Se dispersa el volumen de un ansa de material, como espu-to emulsionado, líquido corporal o caldo de cultivo,sobre un área de 1 cm en dos lugares en los extremosopuestos de un portaobjetos de vidrio. El volumen de unansa de suero anticapsular específico de tipificación sedispersa sobre el área de una de las preparaciones secas,se recubre el área opuesta con un ansa de solución fisio-lógica que sirve como control. Cada área se recubre conun cubreobjetos y se examina con el microscopio usandoun objetivo de 100 × (de inmersión). Los microorganis-mos que muestran una reacción positiva aparecen rodea-dos con un halo esmerilado, refractario que correspondea la hinchazón de la cápsula. Compare la preparación dela prueba con un control con solución fisiológica dondeno existe hinchazón capsular

* Disponible en Harleco Co., Filadelfia, PA.

Tolueno (metilbenceno)

Fenol (ácido carbólico)

Anilina (fenilamina)



Cuadro 1-8 Tinciones biológicas comunes utilizadas en bacteriología

TINCIÓN

Azul de metileno de Loeffler

Tinción de Gram

Tinción de Ziehl-Neelsen parabacilos ácido-alcohol resis-tentes

Fluorocromo

FÓRMULA QUÍMICA PROPÓSITO

Esta es una tinción simple y directa utiliza-da para una variedad de microorganis-mos, se utiliza específicamente paradetectar bacterias en frotis de líquidocefalorraquídeo en casos de sospecha demeningitis bacteriana

Esta es una tinción diferente que se utilizapara demostrar las propiedades de tinciónde bacterias de todo tipo

Las bacterias grampositivas retienen elcolorante violeta de genciana luego de ladecoloración y se observan de color azulintenso

Las bacterias gramnegativas no son capacesde retener la tinción de violeta de gencia-na luego de la decoloración y se tiñen derojo con el colorante safranina

Las características de la tinción de Grampueden ser atípicas en cultivos muy jóve-nes, viejos, muertos o degenerados

Tinción de formas quísticas dePneumocystis jiroveci (modificación deGram-Weigert)

Los bacilos ácido-alcohol resistentes sedenomina así porque están recubiertospor una cubierta cerosa que es resistentea la tinción. Se requiere calor o un deter-gente (Tergitol®) para permitir que elcolorante penetre la cápsula. Una vezteñidas, estas bacterias resisten la decolo-ración, mientras que otras bacterias sedestiñen con ácido-alcohol

Este colorante fluorocromo tiñe selectiva-mente micobacterias porque se une a losácidos micólicos de la pared celular. Esta tinción muestra mejor a la micobac-terias que la tinción para bacilosácido–alcohol resistentes convencional y permite el cribado de los frotis a bajoaumento porque los organismos se venmás fácilmente

El naranja de acridina es una coloraciónparticularmente adaptada para la demos-tración de bacterias en hemocultivos, fro-tis de líquido cefalorraquídeo y uretralesu otros exudados donde pueden estar pre-sentes en un relativo bajo número, tantocomo 104 UFC/mL, o cuando son oscure-cidas por un fondo intenso de leucocitospolimorfonucleares u otros desechos. Aun pH por debajo de 4, las bacterias y laslevaduras se tiñen de naranja brillantecontra un fondo negro, verde claro oamarillo

INGREDIENTES

Azul de metileno 0,3 gAlcohol etílico, 95% 30 mLAgua destilada 100 mL

Violeta de gencianaVioleta de genciana 2 gAlcohol etílico, 95% 20 mLOxalato de NH4 0,8 gAgua destilada 100 mL

Yoduro de GramYoduro de potasio 2 gCristales de yodo 1 gAgua destilada 100 mL

DecoloranteAcetona 50 mLAlcohol etílico, 95% 50 mL

ContracoloraciónSafranina O 2,5 gAlcohol etílico, 95% 100 mLAdicionar 100 mL al 100 mL

agua destilada

CarbolfucsinaCristales de fenol 2,5 mLAlcohol, 95% 5 mLFucsina básica 0,5 gAgua destilada 100 mL

Alcohol ácido, 3%HCl, concentrado 3 mLAlcohol, 70% 100 mL

Azul de metilenoAzul de metileno 0,5 gÁcido acético glacial 0,5 mLAgua destilada 100 mL

Auramina O 1,5 gRodamina B 0,75 gGlicerol 75 mLFenol 10 mLAgua destilada 50 mL

AO en polvo 20 mgBuffer acetato de sodio 190 mL

(pH 3,5) (Adicionar alrededor de 90 mL de HCl 1 M a 100 mL de acetato Na 1 M)

Tetrametil tionina

Violeta de genciana(hexametilpararosaanilina)

Dimetil fenosafranina

Auramina O

Rodamina B

Naranja de acridina (AO)

Carbolfucsina (triaminotrifenilmetano)

(Continúa)


satisfecha por completo. Dado que el oxígeno suele tenermayor afinidad por el hidrógeno que muchos colorantes, seretiene color en presencia de aire. Esto permite la utilización deciertos colorantes, como el azul de metileno, como indicadoresde oxidación-reducción en ambientes anaerobios, dado que elindicador se vuelve incoloro en ausencia de oxígeno.

En términos generales, los colorantes se clasifican como áci-dos o básicos; esta denominación no indica necesariamente supH de reacción en solución, sino en cambio, si una parte signi-ficativa de la molécula es aniónica o catiónica. Desde el puntode vista práctico, los colorantes básicos tiñen estructuras áci-das, como la cromatina del núcleo de las células; los coloran-tes ácidos reaccionan con sustancias básicas, como las estruc-turas citoplasmáticas. Si en un preparado se quieren teñir lasestructuras del núcleo y del citoplasma, se pueden utilizar com-binaciones de colorantes ácidos y básicos. Un ejemplo comúnes la hematoxilina (básica) y la eosina (ácida), o coloración Hy E, utilizada para el análisis de cortes de tejido.Utilización de colorantes en microbiología. Es conveniente que losmicrobiólogos realicen un análisis microscópico directo de lasmuestras enviadas para cultivo. Esto no sólo le puede propor-cionar al médico un rápido diagnóstico presuntivo, sino ade-más, la detección de microorganismos específicos puede servircomo guía para seleccionar el medio de cultivo adecuado ysuministrar un valioso control de calidad comparativo con losaislamientos obtenidos. En el cuadro 1-9 se enumeran, sobreuna selección de muestras que se envían en forma habitual a loslaboratorios de microbiología, los hallazgos positivos de variosprocedimientos de tinción y las enfermedades asociadas. Acontinuación se hace una breve descripción de las tincionesmás utilizadas.Tinción de Gram. La tinción de Gram, descubierta hace pocomás de 100 años por Hans Christian Gram, suele utilizarse parael examen directo por microscopia de las muestras y los sub-cultivos (en el cuadro 1-8 se puede hallar la fórmula). En elrecuadro 1-6 se explica el procedimiento de la tinción.

El violeta de genciana (cristal violeta) es el colorante princi-pal; se une a la pared bacteriana luego del tratamiento con unasolución débil de yoduro, que actúa como mordiente para fijarel colorante. Algunas especies de bacterias, como consecuenciade la naturaleza química de sus paredes celulares, tienen lacapacidad de retener el violeta de genciana aun luego del trata-miento con un decolorante orgánico, como la mezcla de partesiguales de acetona y alcohol etílico al 95%. Las bacterias queretienen el colorante aparecen de color azul-negro cuando seobservan con el microscopio y se denominan grampositivas.Ciertas bacterias pierden el colorante principal violeta de gen-ciana cuando se las trata con el decolorante, debido tal vez alalto contenido de lípidos de su pared celular. Estas bacteriascambian de color, toman la contracoloración de safranina yaparecen de color rojo vistas con el microscopio: son las gram-negativas (lámina en color 1-2A). Se puede mejorar la visuali-zación de ciertos bacilos gramnegativos con requerimientosnutricionales especiales mediante el agregado de 0,05% de car-bolfucsina al contracolorante safranina. Esta reacción de Grampuede emplearse para hacer identificaciones presuntivas cuan-do se la utiliza en forma conjunta con la observación de la mor-fología (cocos y bacilos) y con la disposición bacteriana.

Friedly ha revisado las aplicaciones comunes de la tinción deGram.34 Los cocos grampositivos dispuestos en grupos sugie-ren estafilococos; la disposición en cadena indica estreptoco-cos. Los diplococos grampositivos, con forma de lanceta soncaracterísticos de Streptococcus pneumoniae cuando se losobserva en los frotis de muestras de esputos; estas característi-cas no pueden utilizarse como diagnósticas en otras muestrasya que la apariencia de los enterococos es similar. Los diplo-cocos gramnegativos arriñonados son característicos de lasespecies de Neisseria. Los bacilos grandes grampositivosdenotan especies de Bacillus o Clostridium; los bacilos peque-ños grampositivos sugieren especies de Listeria o alguna de lascorineformes (difteroides) si se observan ordenamientos simi-lares a las “letras chinas”. Los bacilos gramnegativos curvos en


Cuadro 1-8 Tinciones biológicas comunes utilizadas en bacteriología (cont.)

TINCIÓN

Wrigth-Giemsa

Azul de anilina en lactofenol

FÓRMULA QUÍMICA

Azul de metileno policromáticoAzul de metilenoAzur de metilenoEosina

PROPÓSITO

La tinción de Wright-Giemsa se utilizacomúnmente para teñir los elementoscelulares de frotis de sangre periférica. Esútil en microbiología para demostrar lapresencia de organismos intracelularescomo Histoplasma capsulatum y lasespecies de Leishmania (véase lámina encolor 1-2G). La tinción también es de uti-lidad para demostrar inclusiones intrace-lulares en frotis directos de piel o muco-sas, como raspados de córnea para tracoma

El colorante es fuertemente ácido debido alos grupos sulfónicos y ha sido utilizadocomo contracoloración para tejidos nofijados, bacterias y protozoos, en combi-nación con otros colorantes. Actualmentese utiliza para la tinción directa de mice-lios fúngicos y estructuras de fructifica-ción, las cuales toman un delicado colorazul claro

INGREDIENTES

Colorante de Wright en polvo 9 g

Colorante de Giemsa en polvo 1 g

Glicerina 90 mLAlcohol metílico

absoluto 2 910 mLMezclar en una botella

color caramelo y dejarreposar un mes antes

de usar

Cristales de fenol 20 gÁcido láctico 20 gGlicerol 40 mLAgua destilada 20 mLDisolver los

ingredientes,luego adicionar:

Azul de anilina 0,05 g

Azur B de metileno

Azul de anilina



Cuadro 1-9 Diagnóstico de enfermedades infecciosas por análisis directo de muestras de cultivo

MUESTRAS

Cultivo faríngeo

Úlceras orofaríngeas

EsputoAspirados transtraquealesLavados bronquiales

Lesiones cutáneas o dre-najes purulentos desenos subcutáneos

Líquido cefalorraquídeo

Orina

ENFERMEDAD SUPUESTA

Difteria

Faringitis estreptocócica aguda

Enfermedad de Vincent

Neumonía bacteriana

TuberculosisMicosis pulmonar

Celulitis bacteriana

Gangrena gaseosa (mionecrosis)

Micetoma actinomicótico

Micetoma eumicótico

Meningitis bacteriana

Meningitis neumocócica

Meningitis criptocócica

Listeriosis

Infección por levaduras

Infección bacteriana

Leptospirosis

HALLAZGOS POSITIVOS

Delicados bacilos grampositivos pleomórficos enuna disposición similar a letras chinas

Bacilos teñidos de azul claro; con gránulos meta-cromáticos prominentes

Cocos encadenados fluorescentes; usar controlespositivos y negativos en cada tinción

Presencia de bacilos gramnegativos y bacilos del-gados con forma de espiral

Variedad de tipos bacterianos; Streptococcus pneumoniae con cápsulas particularmente diagnósticas

Bacilos ácido-alcohol resistentesLevaduras en brotación, seudohifas, hifas

verdaderas o cuerpos de fructificación

Variedad de tipos bacterianos; sospecha de espe-cies anaerobias

Bacilos grampositivos que sugieren Clostridiumperfringens; usualmente no se observan esporas

“Gránulos sulfurosos”Delicados filamentos ramificados grampositivos;

las especies de Nocardia pueden ser débilmenteácido-alcohol resistentes

Gránulos blancos, grisáceos o negrosHifas verdaderas con tumefacción focal o clami-

dosporas

Bacilos gramnegativos pleomorfos pequeños(Haemophilus influenzae)

Diplococos gramnegativos (Neisseria meningitidis)Diplococos grampositivos (Streptococcus

pneumoniae)Formas bacterianas que se tiñen azul-negro

Formas bacterianas que resplandecen naranja bri-llante bajo iluminación ultravioleta

Hinchazón o apariencia de vidrio esmerilado de lascápsulas bacterianas

Levaduras encapsuladas con brotes unidos por unahebra fina

Bacilos grampositivos delicadosBacterias con movilidad “en paraguas” (tumbling)

Seudohifas o levaduras en brotación

Variedad de tipos bacterianos

Espiroquetas levemente espiraladas móviles

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO

Tinción de Gram

Tinción con azul de metileno

Técnica de fluorescencia directa con anti-cuerpo (luego de 4-6 horas de incubaciónen caldo de Todd-Hewitt)

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentesTinción de Gram, tinción de Wright-Giemsa

o blanco de calcoflúorTinción de Gram-Weigert

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Preparación directa con solución fisiológica

Tinción de Gram o tinción para bacilosácido-alcohol resistentes modificada

Preparación directa con solución fisiológica

Tinción de Gram o montaje azul de algodón en lactofenol

Tinción de Gram

Tinción con azul de metileno

Tinción con naranja de acridina

Reacción de hinchazón capsular de Neufeld(antisuero tipo específico)

Tinta china o preparación con nigrosina

Tinción de GramPreparación de la gota gruesa

Tinción de Gram o tinción de Wright-Giemsa

Tinción de Gram

Examen en campo oscuro

(Continúa)


muestras de heces diarreicas indican especies de Vibrio, o sitambién se ven formas de sacacorchos sugieren especies deCampylobacter. Los bacilos gramnegativos son las bacteriasque se encuentran con mayor frecuencia en los laboratorios clí-nicos e incluyen Enterobacteriaceae, bacilos no fermentado-res, especies de Haemophilus y una variedad con requerimien-tos nutricionales especiales. En la lámina en color 1-3 se inclu-yen imágenes seleccionadas de tinciones de Gram, las cuales seanalizarán con mayor detalle en una sección posterior de estecapítulo.

La tinción de Gram es un procedimiento engañosamentesimple. Puede realizarse en forma rápida y fácil. Sin embargo,la preparación e interpretación de los frotis es otro tema. Esesencial una considerable experiencia y un cuidadoso entrena-

miento para su ejecución correcta. Un observador casual no lohará tan bien como alguien que mira regularmente las tincionesy tiene la oportunidad de cotejar los hallazgos morfológicoscon los resultados del cultivo. Un ejemplo excelente de estehecho es un interesante estudio que comparó el desempeño delpersonal del hospital respecto de los microbiólogos experimen-tados en el diagnóstico de la neumonía adquirida en la comu-nidad.31 El personal del hospital fue mejor para obtener el espu-to purulento que el personal de enfermería, pero la preparacióne interpretación de los frotis fue inferior a la de los microbió-logos.

Algunas razones técnicas y microbiológicas justifican laimportancia de la experiencia. La mayoría de las veces la mor-fología de las bacterias coincide con las descripciones clási-


Cuadro 1-9 Diagnóstico de enfermedades infecciosas por análisis directo de muestras de cultivo (cont.)

MUESTRAS

Secreción uretral-purulenta

Secreción vaginal purulenta

Úlcera de pene o vaginal (chancro)

Ojo

Heces

Raspado de piel,fragmentos de uñas o pelos extraídos

Sangre

ENFERMEDAD SUPUESTA

Gonorrea

Infección por Chlamydias

Infección por levaduras

Infección por tricomonas

Gardnerella vaginales

Sífilis primaria

Chancroide

Conjuntivitis purulenta

Tracoma

Enterocolitis purulenta

Cólera

Enfermedad parasitaria

Dermatofitosis

Tiña versicolor

Fiebre recurrente (Borrelia)

Parásitos sanguíneos: paludismo,tripanosomiasis, filariasis

HALLAZGOS POSITIVOS

Diplococos gramnegativos intracelulares

Cuerpos elementales

Seudohifas o levaduras en brotación

Flagelados con rápida movilidad

Células epiteliales cubiertas con cocobacilos(células clave) o pH vaginal > 5,5

Espiroquetas fuertemente espiraladas móviles

Bacilos pequeños gramnegativos intracelulares oextracelulares

Variedad de especies bacterianas

Agrupamientos de inclusiones perinucleares intracelulares

Neutrófilos y agregados de estafilococos

Bacilos con movilidad rápida característica; sinneutrófilos

Parásitos adultos o fragmentos de parásitos; pro-tozoos o huevos

Hifas delicadas o agrupamiento de esporas

Hifas y esporas que se asemejan a espaguetis yalbóndigas

Espiroquetas con morfología típica

Parásitos intracelulares (plasmodium, babesia)Formas extracelulares: tripanosomas

o microfilarias

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO

Tinción de Gram

Técnica de fluorescencia directa con anti-cuerpo del frotis

Examen directo o con tinción de Gram

Examen directo

Tinción Pap o tinción de GramMedición del pH de las secreciones vaginales

Montaje para el examen en campo oscuro dela secreción del chancro

Tinción de Gram de la secreción de la úlcera o del aspirado del bubón (forúnculo)inginal

Tinción de Gram

Tinción de Giemsa del raspado de córnea

Tinción de Gram

Examen directo con agua peptonada alcalinade enriquecimiento

Examen directo con solución fisiológica oyodo

Examen de las muestras obtenidas por purgas

Preparación con KOH al 10%

Preparación con KOH al 10% o con azul dealgodón en lactofenol

Tinción de Wright o de GiemsaExamen en campo oscuroTinción de Wright o de GiemsaExamen directo de sangre anticoagulada para

la búsqueda de microfilarias


cas. Lamentablemente, las bacterias no siempre leyeron elreglamento. Los microbiólogos con buen entrenamiento, prác-tica y deseos de aprender de los errores pueden superar las

dificultades. En el cuadro 1-10 se resumen algunas de las“trampas” clásicas que puede presentar la tinción de Gram. Laregla esencial es que la interpretación final debe hacerse sobrela base del color de la tinción, la morfología bacteriana y lasvariantes que se conocen. Para complicar aún más la situación,diversos artefactos pueden asemejarse a los agentes infeccio-sos y ser informados de manera errónea como microbios. Enla lámina en color 1-4 se ilustran algunas de estas posiblesfuentes de error. Si se considera la posibilidad de un artefacto,una estrategia es teñir otro frotis con naranja de acridina(véase más adelante); con esa tinción se puede establecer si laestructura contiene DNA, y por lo tanto, es biológica. A pesarde que el procedimiento es simple, el paso de cambio de colorpuede ocasionar problemas si no se realiza de manera adecua-da. Si se utiliza acetona como decolorante, debe tenerse espe-cial cuidado porque actúa en forma muy rápida. El cambio decolor insuficiente puede controlarse observando el núcleo de las células inflamatorias; si éstas no están completamentegramnegativas, el cambio de color del frotis no se realizó enforma adecuada. La única receta para detectar un exceso en elcambio de color es la comparación entre la reacción de Gramy la morfología de la bacteria. Si el programa de asegura-miento de la calidad (véase más adelante) incluye una revisiónde los frotis que no se correlacionan con los cultivos, es posi-ble detectar el cambio de color inadecuado y los artefactos nobacterianos que se informaron de manera errónea y el obser-vador puede aprender del error.

La tinción de Gram también puede aplicarse a la identifica-ción de formas no bacterianas, como tricomonas, larvas deestrongiloides, quistes de Pneumocystis jiroveci (carinii) y tro-fozoítos de Toxoplasma gondii, aunque no es tan sensible comootras tinciones especiales que se utilizar para visualizar estosmicroorganismos. Estas diversas aplicaciones demuestran laversatilidad de la tinción de Gram.Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes. Las micobacteriasestán recubiertas con un material grueso y ceroso resistente a latinción. Sin embargo, una vez que se tiñen, las bacterias resis-


Recuadro 1-6 Técnica de la tinción de Gram

1. Realice un frotis fino del material de estudio y déjelo secar al aire2. Fije el material al portaobjetos pasándolo tres o cuatro veces a través

de la llama de un mechero Bunsen, de manera que el material no selave durante la tinción. Algunas personas ahora recomiendan la utili-zación de alcohol para la fijación de material para teñir con tinciónde Gram (cubrir el frotis por completo con metanol o etanol durantealgunos minutos)

3. Coloque el frotis en un soporte para tinción y recubra la superficiecon solución de violeta de genciana.

4. Luego de 1 minuto (se puede utilizar menos tiempo con algunas solu-ciones) de exposición al colorante violeta de genciana, lave exhausti-vamente con agua destilada o buffer

5. Cubra el frotis con solución yodada de Gram durante 1 minuto.Nuevamente, lave con agua

6. Sujete el frotis entre el pulgar y el dedo índice e impregne la superficie con unas gotas de decolorante alcohol-acetona, hasta queel lavado deje de tener color violeta. Esto suele tomar 10 segundos o menos

7. Lave con agua corriente y coloque el frotis nuevamente en el soportepara tinción. Cubra la superficie con la tinción de safranina durante 1minuto. Lave con agua corriente

8. Coloque el frotis en posición vertical en el soporte para tinción, parapermitir que el exceso de agua drene y el frotis se seque

9. Examine el frotis teñido bajo el objetivo de 100 × (de inmersión) deun microscopio. Las bacterias grampositivas se tiñen de azul oscuro;las bacterias gramnegativas aparecen de color rosa o rojo

Cuadro 1-10 Dificultades en la interpretación de la tinción de Gram

MICROORGANISMO

Streptococcus pneumoniae

Especies de Acinetobacter

Clostridium perfringens

Levaduras, especialmenteCryptococcus neoformans

PRESENTACIÓN CLÁSICA

Diplococos grampositivos conforma de lanceta

Cocobacilos gramnegativos

Bacilos grampositivos en tándem

Células grampositivas redondasu ovales con brotaciones

VARIANTE DE PRESENTACIÓN

Cocos alargados, semejantes a bacilos cortos

Cocos gramnegativos

Cocos grampositivos

Bacilos gramnegativos o con tinción de Gram variable

Células con tinción de Gram variable

COMENTARIOS

Puede ser mal interpretado como una mezcla demicroorganismos

Puede confundirse con especies de Neisseria e infor-marse como cocos gramnegativos; buscar el frotispara comprobar la presencia de algunos microorga-nismos que demuestren las formas alargadas, lascuales no han sido vistas en las especies deNeisseria

Puede confundirse con Streptococcus pneumoniae einformarse como cocos grampositivos; sumado a laforma de coco las células retienen fuertemente elcristal violeta durante la decoloración

Puede confundirse con bacilos gramnegativos; laforma de vagón es un indicio de que el organismoes grampositivo; otros clostridios y las especies deBacillus pueden también aparecer en forma similar

Puede confundirse con artificios; el tamaño y la forma los distinguen de las bacterias


ten el cambio de color con solventes orgánicos fuertes, como elácido-alcohol. En consecuencia, se las conoce como bacilosácido-alcohol resistentes, un fenómeno descrito por primeravez en 1881 por Ziehl y Neelsen.

Para esta tinción se requiere un tratamiento especial con elfin de que el colorante primario, la carbolfucsina, penetre elmaterial ceroso de los bacilos ácido-alcohol resistentes. En latécnica convencional de Ziehl-Neelsen se utiliza el calor.Luego de que la superficie del frotis que se va a teñir se cubrecon una capa de carbolfucsina, se flamea por debajo del porta-objetos con la llama de un mechero Bunsen hacia adelante yhacia atrás. El frotis se calienta hasta que se observa la presen-cia de vapor, justo antes de que hierva. La modificación de latinción para bacilos ácido-alcohol resistentes realizada porKinyoun se denomina “método frío”, porque se utiliza undetergente tensioactivo, como Tergitol®, en lugar del trata-miento con calor.

Con cualquiera de estas tinciones, los bacilos ácido-alcoholresistentes aparecen de color rojo contra un fondo verde o azul,según el contracolor utilizado (lámina en color 1-2B). A pesarde que este método es satisfactorio para la mayoría de las mico-bacterias, ciertas cepas de bacilos ácido-alcohol resistentesdébiles de especies de rápido crecimiento (complejo Mycobac-terium fortuitum/chelonae) se pueden teñir mejor con el méto-do de Ziehl-Neelsen (en el capítulo 19 se encuentra un análisismás detallado). Además, ciertas bacterias, como las especies deNocardia, muestran de manera característica una débil o par-cial tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes.Tinciones por fluorescencia. El isotiocianato de fluoresceína(FITC) y el isetionato de tetrametilrodamina (TMRI) son dosfluorocromos utilizados con frecuencia, que en su estado exci-tado por acción de la luz ultravioleta o visible de corta longitudde onda emiten ondas de luz en el espectro visible, con unaabsorción máxima de 490 nm y 555 nm, respectivamente. Es-tos fluorocromos se unen químicamente con diversas proteínas,como antígenos y anticuerpos, y funcionan como una etiquetao marca a través de la cual se pueden visualizar las reaccionesinmunitarias en frotis directos de líquidos biológicos o secre-ciones, o en cortes de tejidos. La variación en la relación fluo-rocromo/proteína de los diferentes reactivos permite lograr unaóptima tinción de los objetos deseados con un mínimo de fondono específico. El desarrollo actual de los anticuerpos monoclo-nales, que son monoespecíficos para sus antígenos respectivos,condujo a la preparación de reactivos fluorescentes para ladetección directa o indirecta de numerosos patógenos:Chlamydia trachomatis, especies de Legionella, Treponemapallidum, Toxoplasma gondii y varios virus, como varicela-zóster, herpes simple, influenza, citomegalovirus y sincitialrespiratorio, entre otros.

La microscopia de fluorescencia es una técnica minuciosaque requiere un microscopio de alta calidad, la combinaciónadecuada de los objetivos, condensadores de campo brillante yoscuro, un arco de mercurio o una fuente de luz ultravioletahalógena y la combinación adecuada de los filtros de excitacióny barrera o supresión.21 Los objetivos acromáticos son apropia-dos para la mayoría de las aplicaciones, excepto en investiga-ción, en que pueden requerirse lentes apocromáticas de mayorcosto para alcanzar el máximo de iluminación y resolución.Para un rendimiento óptimo es crítica la selección de portaobje-tos y cubreobjetos de grosor adecuado y la utilización de acei-tes de inmersión y líquidos de montaje de baja fluorescencia.

La elección de los filtros para el microscopio de fluorescen-cia también es decisiva para un trabajo exitoso. Se requierencuatro filtros en forma secuencial: 1) uno que absorba el calor

(para evitar el daño al filtro excitador), 2) un filtro excitadorcon un ancho de banda de onda apropiado para la longitud deonda de la luz que produce el fluorocromo excitado, 3) un fil-tro que absorba el color rojo para bloquear cualquier luz rojaque emitan los filtros de excitación azul y 4) un filtro barrerapara que absorba cualquier luz residual de excitación inciden-tal de corta longitud de onda (que dañaría los ojos del operadordel microscopio) y que permita sólo el pasaje de la luz visiblede mayor longitud de onda. El rendimiento subóptimo de unmicroscopio de fluorescencia se debe a menudo a la malaselección de la combinación de los filtros. Los fabricantes demicroscopios proporcionan la información y el asesoramientode modo que los usuarios puedan obtener un rendimiento ópti-mo. Hoy se comercializan, con un precio aceptable para lamayoría de los laboratorios clínicos, los sistemas de fluores-cencia que utilizan 1) epiluminación, 2) lámparas halógenas deluz azul que no requieren transformadores de alto costo y 3) fil-tros de interferencia con máximos picos de absorción con lon-gitudes de onda visibles más largas.Tinciones con fluorocromos para micobacterias. Para demostrar lapresencia de bacilos ácido-alcohol resistentes se pueden utili-zar los fluorocromos colorantes auramina y rodamina. Losbacilos aparecen de color amarillo, rojo o naranja cuando se losobserva con el microscopio de fluorescencia (según la combi-nación de filtros y los colorantes utilizados) y el fondo es oscu-ro si se emplea permanganato de potasio como contracolora-ción (lámina en color 1-2C). La utilización del procedimientode fluorescencia facilita el examen de los frotis, sobre todocon un objetivo de 25 ×. Este objetivo proporciona un aumen-to lo suficientemente bajo como para examinar camposmicroscópicos amplios, y lo suficientemente alto para ver lospuntos de luz amarilla que emanan de las bacterias fluores-centes (lámina en color 1-2C). Se puede utilizar mayor aumen-to para confirmar los objetos sospechosos observados con lalente de 25 ×.

La tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes se puedeutilizar también para la identificación de microorganismosdiferentes de las micobacterias. Los ovocitos de las especies deCryptosporidium y de Isospora belli, dos microorganismos coc-cídeos que han resultado importantes agentes etiológicos de lasgastroenteritis, son ácido-alcohol resistentes y pueden detec-tarse con facilidad en preparaciones de heces teñidas de mane-ra adecuada (lámina en color 1-2J).Naranja de acridina. La tinción con naranja de acridina (NA) seestá utilizando cada vez más en los laboratorios de microbiolo-gía para detectar bacterias en frotis preparados de líquidos yexudados, en los cuales se espera que las bacterias se hallen enbaja concentración (103 a 104 unidades formadoras de colonias[UFC]/mL) o están atrapadas dentro de un denso agregado dedesechos del fondo, lo cual dificulta visualizarlas mediante losprocedimientos de tinción convencionales. En un principio, latinción con NA fue utilizada por los microbiólogos parademostrar la presencia de bacterias en muestras de tierra. Enforma similar a cuando se aplican colorantes fluorocromospara el estudio de los bacilos ácido-alcohol resistentes, los fro-tis teñidos con NA y examinados bajo luz ultravioleta puedenser explorados de manera más rápida y eficiente con bajoaumento (100 ×) y se examinan con aumento de 450 × o mayorcuando se visualizan formas sospechosas. Esta tinción detectabacterias vivas y muertas, pero no indica si son grampositivaso gramnegativas. Una vez que la bacteria se ha sido detectadautilizando la tinción con NA, se debe aplicar tinción de Grampara establecer sus características diferenciales de tinción(lámina en color 1-2D).



Lauer y cols. encontraron que la tinción con NA es más sen-sible que la de Gram para detectar bacterias en los sedimentos deLCR, sobre todo cuando están presentes bacterias gramnegati-vas.56 La tinción con NA también es útil para el análisis de mues-tras de orina en busca de bacteriuria significativa.45 En el recua-dro 1-7 se esquematiza la preparación de la tinción con NA.Azul de toluidina y azul de metileno. El azul de toluidina, un colo-rante muy relacionado con el azur A y el azul de metileno, seutiliza para teñir improntas de biopsias de pulmón y frotis desecreciones respiratorias para la detección de Pneumocystisjiroveci (carinii) en forma rápida. Las tinciones con azul demetileno se pueden realizar sobre sedimentos de líquido cefa-lorraquídeo en forma conjunta con la tinción de Gram. Las bac-terias gramnegativas H. influenzae y N. meningitidis, no suelenresaltar sobre el fondo teñido de rojo en la tinción de Gram.Con el azul de metileno, los leucocitos polimorfonucleares setiñen de azul y las bacterias que también se tiñen de azul inten-so son más fáciles de detectar contra el fondo teñido de grisclaro (lámina en color 1-2E). La tinción con azul de metilenodebería considerarse un complemento de la tinción de Gram enlos laboratorios donde la falta de acceso al microscopio defluorescencia imposibilita la utilización del procedimiento detinción con NA.Blanco de calcoflúor. El blanco de calcoflúor, un colorante inco-loro utilizado en la industria para blanquear telas y papeles,tiene dos propiedades que lo hacen útil en microbiología: 1) launión a los polisacáridos con uniones β1-3 o β1-4 (específica-mente a la celulosa y a la quitina) y 2) la fluorescencia cuan-do es expuesto a luz ultravioleta de longitudes de onda larga ya la luz visible de longitud de onda corta. El blanco de calco-flúor es una valiosa tinción con fluorocromo para la detecciónrápida de hongos en preparados húmedos, frotis y cortes detejido, debido a que la pared celular de los hongos y las plan-tas es rica en quitina. Esta tinción ha sido útil principalmenteen la detección de levaduras, hifas y seudohifas en raspados depiel y de mucosas. Cuando se lo mezcla con hidróxido depotasio al 10%, se puede realizar la búsqueda rápida de der-matofitos en los montajes de raspado de piel. Las estructurasfúngicas muestran un color verde manzana brillante o un blan-co azulado fantasmal, según la longitud de onda de la luz de

excitación y de la combinación de filtros utilizada, cuando selas observa con el microscopio bajo luz ultravioleta (lámina encolor 1-2F). Los hongos se diferencian con facilidad de losdesechos del fondo, las células y los fragmentos de tejidos. Elblanco de calcoflúor tiene como ventaja adicional que los cor-tes de tejidos pueden teñirse luego con ácido peryódico deSchiff (PAS), metenamina argéntica de Gomori (GMS) u otrastinciones especiales sin interferencia, si se desea la confirma-ción de los hallazgos o disponer de frotis permanentes. La téc-nica es rápida y proporciona una buena definición de las finasestructuras fúngicas y un mejor contraste respecto del fondoque la tinción con azul de anilina en lactofenol ampliamenteutilizada.42

Tinción de impregnación argéntica. Ciertas bacterias, por ejemplolas espiroquetas (incluido el agente etiológico de la enferme-dad de Lyme, Borrelia burgdorferi) y los pequeños microorga-nismos con forma de bacilo asociados con la enfermedad delarañazo de gato (Bartonella henselae y Bartonella quintana),no se tiñen con los métodos convencionales. Estos microorga-nismos son muy delgados para ser visualizados por microsco-pia de campo brillante, no se encuentran presentes en concen-tración suficiente como para ser detectados o su composiciónquímica no interactúa con los colorantes. La microscopia decampo oscuro ha sido utilizada para identificar Treponemapallidum, el agente etiológico de la sífilis y otras espiroquetasno treponémicas, como Leptospira interrogans, el agente cau-sal de la leptospirosis. Una limitación del procedimiento decampo oscuro es la necesidad de examinar enseguida las mues-tras húmedas que contienen microorganismos vivos ya que lavisualización de la bacteria en movimiento es esencial para sudetección. La tinción argéntica se ha sido utilizado para obser-var estos microorganismos en cortes de tejido y se dispone dereactivos inmunofluorescentes para la detección de algunospatógenos, como T. pallidum.

Las tinciones de impregnación argéntica de Warthin-Starry,Dieterle y Steiner se han utilizado durante años para demostrarla presencia de espiroquetas en cortes de tejidos fijados en for-mol. Estas técnicas se realizan en forma equivalente.Tinción de Wright-Giemsa. La tinción de Wright-Giemsa sueleutilizarse para teñir los elementos celulares de los frotis de san-gre periférica. Tiene poca utilidad para teñir bacterias, pero seutiliza principalmente para detectar las formas de levadurasintracelulares de Histoplasma capsulatum o los amastigotesintracelulares de las especies de Leishmania o Trypanosomacruzi (lámina en color 1-2G). También es de utilidad parademostrar ciertas inclusiones virales intracelulares (véase cua-dro 1-8).Ácido peryódico de Schiff. La tinción con ácido peryódico deSchiff se basa en la oxidación de las hexosas y las hexosaminaspor medio del ácido peryódico, que rompe sus anillos de pira-nosa y produce dialdehídos que reaccionan con el reactivo deSchiff. Éste es un colorante trifenilmetano preparado a partirde fucsina básica o p-rosanilina mediante la reducción conácido sulfúrico. La mayoría de las sustancias que contienenhexosas o hexosaminas son PAS positivas y se tiñen de colorrojo contra un fondo verde o azul de acuerdo con la contraco-loración utilizada. Esta tinción se utiliza en forma muy fre-cuente para demostrar la presencia de hongos en cortes de teji-dos (lámina en color 1-2H).

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRASUna vez recibida la muestra para cultivo en el laboratorio de

microbiología, se deben tomar las siguientes decisiones:


Recuadro 1-7 Preparación de una tinción NA

Ingredientes: NA en polvo 20 mg, buffer acetato de sodio 290 mL,HCl 1 M

Preparación del reactivo: agregar 20 mg de NA en polvo (JT BackerChemical Co, Philipsburg NJ) a 290 mL de buffer acetato de sodio (solu-ción de reserva 100 mL de 2 molar [M] CH2COONa.3H2O y 90 mL de 1M HCl); el HCl 1 M debe agregarse en cantidad suficiente para mantenerla tinción diferencial de las bacterias contra el fondo de desechos.56 Lasolución debe ser almacenada en una botella color caramelo a temperatu-ra ambiente.

Procedimiento: la tinción se realiza cubriendo completamente la superficiedel frotis del material para ser examinado, previamente fue secado al airey fijado con metanol, con el colorante NA durante 2 minutos, seguido porun lavado con agua corriente. Los portaobjetos teñidos se secan y examinan con un microscopio equipado con una fuente de luz ultravioleta.


1. Seleccionar el medio de cultivo primario apropiado para lamuestra en particular.

2. Determinar la temperatura y la atmósfera de incubación parael aislamiento de todos los microorganismos potencialmen-te importantes.

3. Determinar cuál de los aislamientos que se recuperaron en elmedio primario requieren caracterización posterior.

4. Establecer la necesidad de realizar el antibiograma.

No se puede esperar que un único enfoque cubra todas lasnecesidades de los laboratorios y del ámbito clínico. El proto-colo utilizado en un hospital de 50 camas de una comunidadrural diferirá del que se emplea en un gran centro médico conmúltiples departamentos. Sin embargo, todos reconocen lasdificultades de mantener la calidad del servicio frente a lademanda cada vez más exigente en la contención de los costos.Los directores y los supervisores deben eliminar gran parte deltrabajo sin relevancia clínica que se realizaba en el pasado. Seespera que los tiempos del “pancultivo” (la solicitud indiscri-minada de cultivos de todos los sitios accesibles del cuerpo conla esperanza de aislar un patógeno) se hayan terminado.Durante las décadas pasadas muchos microbiólogos han trata-do de ejercer lo que Barlett llama “control del procesamiento”:5

“restricción del procesamiento e informe de muestras para cul-tivo sólo a aquellas que proporcionarán una información previ-siblemente útil”.Selección del medio para un cultivo primario. En un laboratoriodiagnóstico se requieren sólo unos pocos medios de uso dia-rio. Comúnmente se utilizan placas de agar. La inoculación decaldos de cultivo para el aislamiento primario de microorga-nismos debe limitarse a algunos tipos de muestras para lascuales se ha demostrado la utilidad de estos caldos suplemen-tarios (véase cuadro 1-6). En la mayoría de los laboratorios seha abandonado la práctica de inocular de rutina el caldo de tio-glicolato para el aislamiento de anaerobios o como un proce-so de enriquecimiento para recuperar patógenos de las heces.En casi todas las circunstancias, el aislamiento de un microor-ganismo en caldo de cultivo luego de 4 o 5 días de incubacióntendrá muy poca relevancia clínica. La incubación de los cal-dos de cultivo por períodos prolongados también lleva al ais-lamiento frecuente de contaminantes.71 Los aislamientos bac-terianos en muy baja concentración rara vez son significativosy el tiempo prolongado de aislamiento suele dar informaciónirrelevante para el tratamiento eficaz del paciente. En algunoslaboratorios se inoculan los caldos de cultivo para ciertasmuestras, pero sólo se los examina si no se detecta crecimien-to en las placas de agar o si las bacterias, cuya morfología seobservó en un frotis directo de un material de un paciente, nose aislaron en el agar.

En algunas situaciones los caldos de cultivo son útiles o inclu-so esenciales. El caso más obvio es el hemocultivo, en el cual lamayoría de las veces se espera un único patógeno y no floracomensal. Otras situaciones clínicas cumplen con estos princi-pios y en ellas los caldos de cultivo pueden ser útiles: la perito-nitis bacteriana espontánea (primaria) (opuesta a la peritonitisque se produce luego de la rotura de una víscera abdominal),9 lasinfecciones peritoneales en pacientes que reciben diálisis perito-neal2 y la artritis séptica.46

Los medios pueden ser selectivos o no selectivos. Losmedios no selectivos no contienen inhibidores y en ellos pue-den crecer la mayoría de los microorganismos que se aíslan enlos laboratorios clínicos. El medio no selectivo más utilizado esel agar sangre de carnero al 5% y se lo incluye en el conjunto delos medios de aislamiento primarios para casi todas las mues-

tras clínicas. Para el aislamiento de Haemophilus influenzae senecesita agar sangre de caballo, agar sangre de carnero con adi-tivos, como IsoVitaleX® (o un suplemento similar que incluyanicotinamida adenina dinucleótido [NAD] y un producto deri-vado del hemo) porque no tiene efectos inhibitorios sobre elcrecimiento bacteriano y es una fuente rica de factor X. El agarchocolate también es importante para el aislamiento deNeisseria gonorrhoeae.

El agar sangre puede hacerse selectivo mediante el agregadode antibióticos o inhibidores químicos. Es una regla general quelos agares con inhibidores no deben utilizarse solos, porque sue-len inhibir los organismos de interés, sólo menos que a la otraflora. Muchas veces la inhibición es sólo parcial, por lo tanto elcrecimiento en un agar selectivo no debe tomarse como pruebade que se aisló el microorganismo diana. Por ejemplo, los ente-rococos y las levaduras a menudo crecen y producen pequeñascolonias en el agar de MacConkey sobre todo si la formulaciónno contiene violeta de genciana.

También se puede lograr que un medio sea diferencialmediante el agregado de ciertos colorantes u otras sustanciasquímicas y obtener así algunos indicios acerca de la identidaddel microorganismo aislado. En el cuadro 1-11 se resumenalgunos de los medios inhibidores y diferenciales preparadoscon agar.Técnicas para la transferencia y el cultivo de muestras clínicas. Unavez que una muestra “superó” los numerosos criterios derechazo y fue aceptada para su cultivo, se deben transferircantidades adecuadas de ésta a los medios de cultivo ya des-critos. Esta actividad suele llevarse a cabo en un área dellaboratorio diseñada para tal fin. La transferencia de todas lasmuestras a los medios de cultivo debe realizarse en una cabi-na de seguridad biológica (véase más adelante). La mejorpolítica es manipular todas las muestras como si fueran alta-mente infecciosas. Se debe exigir que el personal utiliceguantes de goma cuando manipula la mayoría de las mues-tras; el uso de una máscara de cirugía es opcional, ya que noes necesario para gran parte de los procedimientos que se rea-lizan en el laboratorio de diagnóstico microbiológico (excep-to para la micobacteriología).

El área de inoculación debe estar equipada con todos losimplementos necesarios y se debe contar con reserva de mediosde cultivo. Para un almacenamiento prolongado, la mayoría delos medios deben refrigerarse, pero se los debe templar a tem-peratura ambiente para su inoculación.

A pesar de que el personal que trabaja tiempo completo enel área de organización puede conocer de memoria los mediosde cultivo que requiere cada tipo de muestra, es esencial tenerlos protocolos adecuados y las instrucciones escritas en unboletín de anuncios o incluidas en el manual de políticas yprocedimientos para las personas que realizan estas tareas enforma ocasional. Se debe procurar que el procesamiento delas muestras sea llevado a cabo por personal bien entrenado,bajo una estricta supervisión. Los errores o los juicios equi-vocados que se cometen durante esta fase del ciclo de diag-nóstico pueden anular toda la pericia profesional que se puedaaplicar en la lectura e interpretación de los cultivos. Losmicrobiólogos y los técnicos expertos a menudo no puedenllegar a un diagnóstico definitivo porque se seleccionó unmedio inadecuado o incorrecto para una muestra.Técnicas para el cultivo de las muestras. El equipamiento necesa-rio para la inoculación primaria de las muestras es bastantesimple. Se recomienda el uso de un ansa o ansa recta de inocu-lación de Nichrome® o de platino (fig. 1-6), con un extremoinsertado en una empuñadura cilíndrica para facilitar su utili-




Cuadro 1-11 Agares diferenciales e inhibidores utilizados con mayor frecuencia

AGAR INHIBIDOR (I) O DIFERENCIAL (D)

Bacteriodes bilis-esculina(BBE) (I, D)

Campy-BAP (I)

CCFA (I, D)

CHROMagar (D)

CIN (I)

CNA (I)

EMB (I, D)

Hektoen entérico (HE) (I, D)

LKV (I)

MacConkey (I, D)

Manitol-sal (I, D)

Micobiótico/micosel (I)

COMPUESTOS AGREGADOS (I O D)

Sales biliares (I); esculina (D)

Bacitracina, novobiocina, colisti-na, cefalotina, polimixina B (I)

Cicloserina, Cefoxitina (I);Fructosa (D)

Varios (D)

Cefsulodina, Irgasan,novobiocina (I)

Colistina, ácido nalidíxico (I)

Eosina (I); eosina, azul de metile-no, lactosa, sacarosa (D)

Sales biliares (I); lactosa, sacarosa, salicina, azul de bro-motimol, fucsina ácida (D); tio-sulfato de sodio, citrato amónicoférrico para la producción desulfuro (D)

Kanamicina, vancomicina (I)

Sales biliares, cristal violeta (I);lactosa, rojo neutro (D)

NaCl (I); Manitol, rojo fenol (D)

Cloranfenicol, cicloheximida (I)

MICROORGANISMOS INHIBIDOS

Mayoría de las bacterias



ND (no disponible)


Bacterias gramnegativas

Bacterias grampositivas


Bacterias aerobias; bacterias grampositivas anaerobias


Bacterias gramnegativas;bacterias grampositivasque no seanStaphylococcus

Bacterias; hongos saprofíticos (y algunos patógenos fúngicos)

MICROORGANISMOS ENRIQUECIDOS

Grupo de Bacteroides fragilis

Campylobacter jejuni

Clostridium difficile

Varios

Especies de YersiniaEspecies de Aeromonas



Patógenos entéricos*

Bacilos gramnegativosanaerobios, particular-mente Bacteroides


Staphylococcus aureus

Dermatofitos, hongos dis-mórficos

COMENTARIOS/REFERENCIA DE CAPÍTULO

La bilis estimula el crecimiento de B.fragilis

La incubación a 42 °C también selec-ciona a C. jejuni

Colonias amarillas; muy inhibidor

El color sugiere la identificación de lascolonias

Varias formulaciones disponibles

Se inhiben la mayoría de las cepas deStaphylococcus saprophyticus34 yalgunas cepas de S. aureus

Ligeramente selectivo (inhibidor); losorganismos fermentadores de lactosao sacarosa producen colonias azul-negro (los fermentadores de sacarosa,como Yersinia enterocolitica, apare-cen idénticos a los fermentadores delactosa); los fuertes fermentadores delactosa (como Escherichia coli oCandida kefyr) producen brillo verdecaracterístico

Moderadamente inhibidor; los fermen-tadores de lactosa (sacarosa, salicina)producen colonias verdes; los pro-ductores de sulfuro de hidrógeno for-man colonias negras

Se agrega sangre hemolizada comofuente de nutrientes; en este mediopueden seleccionarse enterococosresistentes a la vancomicina

Moderadamente inhibidor (selectivo);los fermentadores de lactosa produ-cen colonias rojas; están disponiblesformulaciones sin cristal violeta

Los estafilococos coagulasa negativoscrecen en agar sal, pero no fermentanmanitol

(Continúa)


zación. La muestra puede ser inoculada de diferentes manerassobre la superficie del agar en la placa de Petri, una de las cua-les se muestra en la figura 1-7. La inoculación primaria puederealizarse con un ansa, un hisopo u otro dispositivo adecuado.Una vez que se realizó el inóculo primario, se puede utilizar unansa o un ansa recta para esparcir el material dentro de los cua-tro cuadrantes de la placa, como se muestra en la figura 1-8. Elinóculo se siembra en estría con un movimiento hacia atrás yhacia adelante dentro de cada cuadrante girando la placa enángulos de 90°. El ansa o el ansa recta debe esterilizarse entrelas sucesivas siembras en estría en cada cuadrante. El propósi-to de este proceso es diluir suficientemente el inóculo sobre lasuperficie del medio con agar de manera de obtener colonias debacterias bien aisladas, conocidas como unidades formadorasde colonias (UFC). Las colonias aisladas pueden subcultivar-se de manera individual en otro medio para obtener poblacio-nes puras de microorganismos para su estudio posterior.Cuando se siembran en estría en una placa de agar sangre loshisopados faríngeos enviados para la búsqueda de estreptoco-cos, se deben realizar múltiples punzadas en las áreas de ino-

culación para desenmascarar las hemolisinas lábiles a la pre-sencia de oxígeno, lo cual aumenta la detección de estreptoco-cos β-hemolíticos. También se deben sumergir en la profundi-dad del agar los pequeños fragmentos de tejido que se enviaronpara el aislamiento de hongos. El crecimiento inicial demuchas especies de hongos se ve favorecido por la atmósferamicroaerófila que se encuentra debajo de la superficie del agar.

En la figura 1-9 se muestra la técnica de siembra en estríautilizada para inocular el agar para el recuento semicuantitati-vo de colonias. Las ansas de inoculación desechables de plás-tico o de materiales diferentes del hierro (Nichrome® o de pla-tino), calibradas para contener 0,01 o 0,001 mL de líquido, sesumergen en una muestra de orina no centrifugada. Luego,se retira el ansa con cuidado y se coloca el volumen completosobre la superficie del agar haciendo una única estría a travésdel centro. El inóculo se esparce de modo uniforme en ángulosrectos respecto de la primera estría; luego se gira la placa 90º yse esparce el inóculo hasta cubrir la superficie completa. Enalgunos laboratorios, se inoculan dos placas, una con el ansa de0,01 mL y la otra con la de 0,001 mL, lo cual se utiliza como


Cuadro 1-11 Agares diferenciales e inhibidores utilizados con mayor frecuencia (cont.)

AGAR INHIBIDOR (I) O DIFERENCIAL (D)

PC (Pseudomonas[Burkholderia] cepacia)(I, D)

PEA (I)

Salmonella-Shigella (SS)(I, D)

Sorbitol- MacConkey (I,D)

TCBS (I, D)

Medio selectivo GC(Thayer-Martin, Martin-Lewis, etc. modificados)(I)

XLD (I, D)

COMPUESTOS AGREGADOS (I O D)

Violeta de genciana, sales biliarespara bacterias grampositivas (I);polimixina B, ticarcilina parabacterias gramnegativas (I);piruvato (D)

Feniletil alcohol (I)

Sales biliares, verde brillante (I);lactosa, rojo neutro (D); tiosul-fato de sodio, citrato amónicoférrico para sulfuro de hidróge-no (D)

Sales biliares, violeta de genciana(I); sorbitol, rojo neutro (D)

Tiosulfato de sodio, citrato desodio, NaCl para bacteriasgramnegativas (I); sales biliares,NaCl para bacterias grampositi-vas (I), sacarosa, azul de timol-azul de bromotimol (D)

Vancomicina para bacterias gram-positivas (I); colistina para bac-terias gramnegativas (I); trime-toprima para los abundantesProteus (I); nistatina, anfoterici-na B o anisomicina para levadu-ras (I); suplementos para el cre-cimiento

Sales biliares, NaCl (I); lactosa,sacarosa, xilosa, rojo fenol (D);tiosulfato de sodio, citrato amó-nico fèrrico para producción desulfuro de hidrógeno (D)

MICROORGANISMOS INHIBIDOS

Bacterias grampositivas; la mayoría de las bacte-rias gramnegativas




Bacterias grampositivas; lamayoría de las bacteriasgramnegativas

Bacterias grampositivas;bacilos gramnegativos


MICROORGANISMOS ENRIQUECIDOS

Burkholderia cepacia



Escherichia coli O157(sorbitol negativa)

Especies de Vibrio

Neisseria gonorrhoeae,Neisseria meningitidis


COMENTARIOS/REFERENCIA DE CAPÍTULO

Alta selectividad; las colonias rosasno son completamente específicaspara B. cepacia

Más inhibidor (selectivo) que el agarde MacConkey y el agar EMB;pueden inhibirse las especies deShigella

Agar para búsqueda de E. coli pro-ductora de verotoxina

Las especies fermentadoras de saca-rosa aparecen amarillas, las espe-cies que utilizan citrato aparecenazules

Múltiples formulaciones disponibles.Algunas cepas de N. gonorrhoeaese inhiben con vancomicina. Demanera óptima debería inocularsetambién agar chocolate

Funciona de manera similar al agarde Hektoen entérico

* Patógenos entéricos = especies de Salmonella, especies de Shigella y especies de Yersinia.


control de calidad. A pesar de que las ansas de inoculaciónestán calibradas para tomar el volumen de orina establecido, laexactitud tiene una tasa de error de ± 50% sobre todo cuandose utiliza el ansa de 0,001 mL.1 La toma de muestra en posiciónvertical de un recipiente pequeño puede sólo contener el 50%del volumen establecido; mientras que la toma de muestra hori-zontal en un ángulo de 45° de un recipiente grande puede con-tener 150% del volumen. Los microbiólogos deben estar aler-tados sobre estos posibles errores y utilizar un ángulo estándarpara el muestreo en el laboratorio, basándose en el volumen delos recipientes.

Se pueden realizar estudios de exactitud y precisión delvolumen del inóculo: 1) en forma fotométrica, agregando unansa de violeta de genciana tomada a partir de un recipiente de

60 mL de colorante a una cubeta con 2 mL de agua que luegose lee en un espectrofotómetro a 590 nm, o 2) en forma mano-métrica, anotando el cambio en el peso de un disco de papelde filtro ubicado sobre la bandeja de una balanza analítica muysensible, cuando se le agrega un ansa de agua. Existen dispo-sitivos para tomar un inóculo estándar a partir de muestraslíquidas.59

Luego de 18 a 24 horas de incubación se estima el númerode bacterias en una muestra de orina mediante el recuento decolonias sobre la superficie del agar. Como se muestra en lafigura 1-10, hay aproximadamente 50 colonias. Si se utilizó unansa de 0,001 mL para inocular el medio, el número de colo-nias debe multiplicarse por 1 000. Por lo tanto, el recuento deesta figura es 50 000 UFC/mL.


Figura 1-6 Ansa y ansa recta utilizadas para la transferencia e inoculación demuestras y cultivos. Figura 1-8 Patrón de siembra en estría para la inoculación de muestras sobre

placas de cultivo para obtener colonias bacterianas aisladas.

Figura 1-7 La superficie de una placa de agar se inocula con una muestracontenida dentro de un ansa de inoculación. La inoculación se logra tocandoprimero la superficie del agar en un área pequeña, luego haciendo un movi-miento en forma de estría de un lado a otro sobre la superficie mediante unpatrón que se muestra en la figura 1-8.

Figura 1-9 Placas de cultivo donde se muestran los patrones de siembra enestría de muestras en las cuales se realizará un recuento semicuantitativo debacterias.

1Inoculación primaria

2Estrías

en ángulo recto

3Estrías en ángulo

recto para producir una superficie de crecimiento

1 2

43


Las técnicas semicuantitativas se utilizan más a menudo conlas muestras de orina, pero también se han empleado para otrostipos de situaciones. La cuantificación de bacterias aisladas delas vías aéreas bajas por técnicas de broncoscopia puede ayu-dar en la interpretación de estos cultivos.20 Cuando las bacteriasestán presentes en concentraciones mayores de 103–104 UFC,la probabilidad de que sean el agente causal de la neumonía esmayor que cuando se encuentran en menor cantidad. Se puedeevitar un trabajo considerable si no se realiza el análisis de losrecuentos bajos que corresponderían a flora contaminante de lafaringe.

Para evaluar la probabilidad de que los catéteres intravascu-lares sean la fuente de una bacteriemia, suelen emplearse loscultivos semicuatitativos. A pesar de que se han utilizadonumerosas técnicas, el enfoque más usual es hacer rodar el seg-mento amputado del catéter sobre la superficie del agar.60 Si losrecuentos muestran más de 15 colonias bacterianas, existe unaasociación estadística entre el aislamiento de la bacteria y labacteriemia relacionada con los catéteres. En este enfoque, elcatéter se extrae con el objeto de realizar el análisis. La cuanti-ficación de las bacterias en una muestra de sangre obtenida através de un catéter intravascular permanente se ha utilizado,además, para determinar el papel del catéter en un procesoinfeccioso.32

La cuantificación también puede ser de utilidad en virologíapara determinar el significado de un virus, como citomegalovi-rus, que puede provocar una infección persistente.10 Además,puede controlarse la eficacia de la quimioterapia antiviral a tra-vés del seguimiento de la cantidad de virus presente.47 Muchosde los análisis cuantitativos para las enfermedades virales (car-gas virales) emplean la detección molecular en lugar de los cul-tivos.

Los medios en los tubos pueden ser líquidos, semisólidos(0,3% a 0,5% de agar) o sólidos (1% a 2% de agar). El agarsemisólido es adecuado para ensayos de movilidad. Un tubocon caldo puede inocularse con los métodos que se muestran enla figura 1-11. El tubo debe inclinarse en un ángulo aproxima-do de 30° y el ansa de inoculación con la muestra debe tocar lasuperficie interna del vidrio, justo por arriba del punto dondela superficie del caldo forma un ángulo agudo. Cuando el tubode cultivo retorna a su posición vertical, el área de inoculaciónqueda sumergida por debajo de la superficie. Los directores delaboratorio y los supervisores de microbiología deben determi-nar qué muestras deben transferirse a caldos de cultivo de ruti-na (véase cuadro 1-6).

El agar “en pico de flauta” (en tubo inclinado) se inoculapunzando primero la profundidad del agar y luego haciendouna estría sobre el agar inclinado desde abajo hacia arriba conun movimiento de S a medida que se retira el ansa recta de ino-culación (figs. 1-12 y 1-13). Cuando se inocula un tubo de agarsemisólido para ensayos de movilidad, es importante que elansa recta de inoculación se retire exactamente por el mismositio en que se punzó el medio. Un movimiento en abanicopuede dar como resultado un patrón de crecimiento a lo largode la línea de punción que puede interpretarse en forma erró-nea como movilidad bacteriana.

Ciertas muestras pueden necesitar centrifugación o filtradopara concentrar cualquier microorganismo presente. Las mues-tras densas y mucosas de esputo pueden hacerse más líquidascon N-acetilcisteína (Mucomyst®, WellSpring PharmaceuticalCorp., Neptune, NJ) para facilitar la siembra en estría sobre lasuperficie del agar. Las muestras de esputo que se procesanpara el aislamiento de las especies de Mycobacterium debentambién tratarse con hidróxido de sodio para reducir el sobre-

crecimiento de las bacterias contaminantes. Otras muestras quese envían para el aislamiento de micobacterias, como la orina ola suspensión de heces, también pueden ser tratadas brevemen-te con NaOH para eliminar las bacterias colonizantes. Demanera similar, se pueden utilizar antibióticos para controlar elcrecimiento bacteriano en el medio de cultivo y en las mono-capas de células que se emplean para el aislamiento de virus.

Los líquidos corporales, como los obtenidos por toracentesisy paracentesis, primero deben dejarse sedimentar, luego de lo


Figura 1-10 Placa doble de agar sangre-agar de MacConkey previamenteestriada para un recuento semicuantitativo de colonias como se ilustra en lafigura 1-9. Aparecen, aproximadamente, 50 colonias a cada lado de la placa.Si se utilizó para la siembra en estría en cada medio un ansa de inoculación deorina semicuantitativa calibrada de 0,001 mL, el recuento de colonias sería de 50 000 unidades formadoras de colonias (UFC) por mL.

Figura 1-11 Técnica para la inoculación de un caldo de cultivo en un tubo.(A) Inclinar el tubo e inocularlo tocando la superficie interna húmeda delvidrio en el ángulo agudo del menisco. (B) Retornar el tubo a la posición ver-tical, lo cual tiene el efecto de sumergir el punto de inoculación bajo la super-ficie.

Punto de inoculación

Punto de inoculación

A B


cual las alícuotas de sedimento se centrifugan para concentrarcualquier bacteria que pudiera estar presente. Se deben propor-cionar frascos de hemocultivo para inocular en forma directaciertas muestras, como ya se analizó. Esta práctica es adecua-da en las pocas situaciones en las que se esperan pequeñas can-tidades de un único patógeno. En otras situaciones debe desa-lentarse esta práctica por numerosas razones:

1. Si se encuentran presentes especies bacterianas mixtas, lasbacterias que crezcan más rápido sobrepasarán en número asus parientes que crecen más lentamente.

2. Las relaciones semicuatitativas de los tipos bacterianos ais-lados se pueden ver en una placa de agar pero se pierden enun caldo de cultivo.

3. El frotis directo, tan importante para determinar la naturale-za inflamatoria de una muestra, y los tipos de bacterias pre-sentes, se pierden si se inocula la muestra completa en uncaldo.

Las muestras de líquido cefalorraquídeo, en particular parael aislamiento de Cryptococcus neoformans, deben centrifu-garse y parte del sedimento transferirse al medio de cultivoapropiado; o preferiblemente, se debe pasar el líquido por unfiltro microbiológico de 0,45 μm para atrapar a las levadurasmás grandes que pudieran estar presentes.

Los microorganismos difieren en su temperatura óptima deincubación. En los laboratorios pequeños que cuentan conrecursos limitados, a veces no es posible disponer de las tem-peraturas óptimas de incubación para el crecimiento de todoslos aislamientos clínicos. La mayoría de los microorganismoscrecen a 35 °C; por lo tanto, si se dispone de un solo incuba-dor, éste debe fijarse a 35 °C. Incluso los microorganismoscomo Campylobacter jejuni, que crece en forma óptima a42 °C, crecerán a 35 °C si se los incuba por 24 a 48 horas más.Sin embargo, en este caso se pierde el efecto diferencial de laincubación a temperaturas mayores en las que otras bacteriasno crecen. El crecimiento de la mayoría de los microorganis-mos se ve favorecido en una atmósfera de 5% a 10% de CO2.Si se dispone sólo de aire ambiental, es decir de un incubadorsin CO2, los tubos y las placas de cultivo pueden ubicarse enuna jarra de anaerobiosis por extinción con una vela y colocarentonces todo este dispositivo en incubación. Por el contrario,se puede mantener una atmósfera de aire ambiental en un incu-bador con CO2 colocando los cultivos dentro de una jarra conla tapa muy ajustada (es adecuada una jarra o cámara de anae-robiosis). Sin embargo, hay que tener en cuenta que un micro-organismo como C. jejuni, que requiere una tensión reducidade oxígeno del 5% o menor, tendrá dificultades para crecer enuna jarra de anaerobiosis por extinción de una vela, en la cualla concentración de oxígeno se encuentra en el rango de 10%.

Muchos microorganismos crecen en forma óptima dentro deun estrecho rango de temperatura; otros tienen un espectro rela-tivamente amplio dentro del cual pueden aislarse. Ya se men-cionó la temperatura óptima de crecimiento de C. jejuni s de42 °C. La mayoría de los hongos crecen a 30 °C; sin embargo,pueden ser aislados a temperatura ambiente o a 35 °C en elmedio adecuado. Yersinia enterocolitica crece de manera ópti-ma apenas por encima de la temperatura ambiente. No obstan-te, la mayoría de las cepas también crecerán a 35 °C, aunque lascolonias pueden ser pequeñas o requerir un período de incuba-ción adicional de 24 horas. Por consiguiente, no es habitual quela disponibilidad de una única estufa de incubación comprome-ta la capacidad del microbiólogo de aislar la mayoría de las bac-terias de importancia clínica. En los grandes laboratorios dondeexiste posibilidad de contar con varias temperaturas de incuba-ción, el aislamiento de los microorganismos es, a menudo, másrápido y la apariencia de las colonias se asemeja más a la mor-fología verdadera. En ocasiones, la incubación a temperaturaambiente por un período prolongado puede ser necesaria parademostrar ciertas características bioquímicas o físicas, como laproducción de un pigmento y la movilidad. Estos ajustes seaprenden con la experiencia y por ensayo y error.

Aun más importante que una temperatura específica de incu-bación es, probablemente, evitar las fluctuaciones en la tempe-ratura de la estufa. Se debe controlar esa temperatura de modo


Figura 1-13 Técnica para la inoculación de la profundidad de un agar con unansa recta como se mostró en la figura 1-12A. La parte profunda del medio sepincha con el ansa recta hasta una distancia de 2-3 mm del fondo del tubo; des-pués de sacar lentamente la aguja, se estría la superficie del agar con un movi-miento de un lado a otro en forma de “S”, como se muestra en la figura 1-12B.

Figura 1-12 Técnica de inoculación en agar inclinado con un ansa recta. (A)Pinchar en profundidad el agar en pico de flauta hasta una distancia de 2-3 mmdel fondo del tubo. Si se toca el fondo del tubo puede ingresar aire e invalidarlas condiciones anaerobias. (B) Retirar lentamente el ansa recta y estriar lasuperficie del agar con un movimiento de un lado a otro en forma de “S”.

A B


muy estricto con fluctuaciones no mayores de ± 1–2° de un díapara otro. Las estufas de incubación deben ubicarse y prote-gerse de manera que las perillas de control no puedan ser fácil-mente alteradas por el personal de limpieza durante las horasen que el laboratorio está cerrado.

También es importante el control de la humedad interna dela estufa. La mayoría de los microorganismos crecen al máxi-mo cuando la humedad es de 70% o mayor y los medios decultivos tienden a deteriorarse más rápidamente cuando sesecan de manera inapropiada. El aislamiento en particular deH. pylori, y en menor medida, de N. gonorrhoeae requiere unaatmósfera de alta humedad. La mayoría de las estufas com-pradas durante los últimos años contienen reservorios de aguamediante los cuales se puede controlar la humedad en la cáma-ra de incubación. De lo contrario, se pueden ubicar sobre losestantes recipientes abiertos de boca ancha con agua para queproporcionen por evaporación la humedad necesaria. Tambiénse debe controlar periódicamente las estufas para verificar queno se produzcan derrames que pasan inadvertidos y que pue-den producir contaminaciones o una acumulación de sustan-cias químicas de los reactivos que inhiban el crecimiento bac-teriano.

INTERPRETACIÓN DE LOS CULTIVOSLa interpretación de los cultivos primarios después de 24 a

48 horas de incubación requiere una habilidad considerable. Apartir de la observación inicial el microbiólogo debe determi-nar la naturaleza de las colonias aisladas y decidir si se requie-ren otros procedimientos. Los parámetros relevantes son lascaracterísticas y el número relativo de cada tipo de colonia quese aisló en el cultivo en agar; la pureza, la reacción de Gram yla morfología de las bacterias en cada tipo de colonia; y loscambios en el medio, los cuales reflejan la actividad metabóli-ca de las bacterias en las colonias adyacentes.

Durante el proceso de obtención de las muestras de lospacientes o de su manipulación en el laboratorio se puedenintroducir microorganismos extraños del ambiente o de la florapropia del individuo que manipula el cultivo. Por ejemplo, enlos hemocultivos es frecuente el hallazgo de flora de la piel quedebe interpretarse con cuidado. Además, se pueden introducir“contaminantes” en el proceso de fabricación y manipulaciónde los productos microbiológicos, como las placas de agar.Puede ser extraño que una colonia aparezca en la segunda o latercera área de siembra en estría de la placa, sin que haya cre-cido en la zona de inoculación inicial. Estas colonias puedenignorarse aunque se les debe prestar especial atención a lospatógenos importantes que son “contaminantes” poco comu-nes. Un problema mayor se presenta cuando desarrolla unaúnica colonia de un microorganismo de la piel, comoStaphylococcus coagulasa negativo, en la zona primaria de ino-culación. Existe, por supuesto un tercio o un cuarto de proba-bilidad de que un contaminante de la placa se encuentre en laprimera zona. Si la muestra es crítica, como líquido cefalorra-quídeo, y se conservó en el laboratorio, puede inocularse nue-vamente sobre la superficie del agar. Aunque no es apropiadoignorar la cepa aislada en estas circunstancias, correspondeadjuntar un comentario donde conste que se aisló una únicacolonia y que no fue nuevamente aislada en la muestra. Luego,el médico puede reunir la evidencia del laboratorio y clínicaantes de hacer la interpretación final del significado.

A veces se presentan situaciones atípicas. Por ejemplo, sepueden aislar microorganismos mixtos que se asemejan a laflora propia de las vías aéreas altas de un sitio normalmente

estéril. Es difícil evitar la sospecha de que alguien “estornudó”sobre la placa, pero la evaluación posterior dependerá del aná-lisis de todos los factores, quizás incluso consultando con elmédico. En la figura 1-14 se muestra un fenómeno de labora-torio muy inusual.Características macroscópicas de las colonias. La determinaciónde las características generales de las colonias suele realizarsea través de la inspección de la superficie de la placa de agar.Este análisis se realiza sosteniendo la placa en una mano yobservando la superficie del agar para verificar la presencia decrecimiento bacteriano (fig. 1-15). Las placas de cultivo están-dares tienen un diámetro de 100 mm y son adecuadas para sos-tenerlas con una mano. Debe estudiarse cada placa con cuida-do, porque la bacteria que se aísla inicialmente de las muestrasse encuentran a menudo en un cultivo mixto y puede haber pre-sentes diversos tipos de colonias. Las colonias puntiformes debacterias de crecimiento lento pueden pasarse por alto entrecolonias más grandes, sobre todo si hay una tendencia de cre-cimiento a esparcirse sobre la superficie de la placa.

Durante el examen, las placas deben ser inclinadas en variasdirecciones, bajo iluminación directa brillante, de manera quela luz se refleje desde varios ángulos. Se recomienda la utiliza-ción de una lupa o de un microscopio de disección para ayudaren la detección de las colonias pequeñas o inmaduras y mejo-rar la observación de sus características (fig. 1-16). Las placasde agar sangre deberían examinarse con un transiluminador deluz brillante por detrás para detectar las reacciones de hemóli-sis en el agar (fig. 1-17).

La figura 1-18 contiene términos e ilustraciones útiles parala descripción de las colonias bacterianas. En los recuadros 1-8 a 1-10 se esquematizan guías adicionales.

Aunque son difíciles de describir en forma específica, losolores producidos por la acción de ciertas bacterias en los me-dios de cultivo sólidos y líquidos pueden ser muy útiles en laidentificación tentativa de los microorganismos involucrados(cuadro 1-12). El olfateo siempre debe realizarse con precau-ción, levantando la tapa de la placa de Petri levemente para


Figura 1-14 Placa de agar, la cual ha sido inoculada con una muestra de piel,que contiene flora bacteriana mixta. Se puede ver el rastro zigzagueante debacterias en medio de las colonias aisladas (flecha). Además, los patrones line-ales inusuales de las colonias maduras pueden representar el mismo proceso(puntas de flecha). La explicación más probable es que un insecto que estabapresente en la muestra transportó las bacterias alrededor de la placa. Se des-cribió que este fenómeno es producido también por las amebas de vida libre.



Figura 1-18 Ilustraciones de diversas formas morfológicas de las colonias,con el nombre de los términos de cada una.

Forma

irregular

rizoide

ahusada

puntiforme

circular

filamentosa

plana

elevada

convexa

pulviniforme

en forma de botón

umbilicada

liso o continuo

onduladoo festoneado

lobulado

corroído

filamentoso

encrespado

Elevación

Borde

Figura 1-15 Técnica para el análisis de la superficie de la placa de agar pormedio del reflejo directo y oblicuo de la luz.

Figura 1-17 Técnica para el análisis del crecimiento de las colonias en lasuperficie de una placa de agar utilizando la luz transmitida. Esta técnica es útilpara la evaluación de las propiedades hemolíticas de las colonias que crecen enagar sangre.

Figura 1-16 Técnica para el análisis del crecimiento de las colonias en lasuperficie de una placa de agar que utiliza una lente de mano.


detectar el olor. Se debe advertir al personal del laboratorio quealgunas especies pueden infectar a las personas y no deben olfa-tearse nunca. Si se sospecha la presencia de Bacillus anthracis,Francisella tularensis, Burkholderia pseudomallei, especies deBrucella o Neisseria meningitidis, el cultivo debe ser trasladadoa una cabina de seguridad biológica, donde puede realizarsetodo el trabajo siguiente sin riesgo de transmisión al operador.Por supuesto que las placas y los tubos nunca deben abrirse enun laboratorio de micobacteriología o cuando en un laboratoriode micología hay hongos filamentosos. Algunos olores, comolos de Nocardia y Streptomyces, son tan fuertes que pueden per-cibirse aun sin levantar la tapa de la placa de Petri.

El microbiólogo puede hacer una identificación preliminarde la bacteria aislada en el cultivo primario a través de la deter-minación de las características de las colonias descritas y de laacción sobre el medio. Estas características son útiles paraseleccionar otros medios diferenciales y ensayos apropiadospara completar la identificación de los aislamientos. En el cua-dro 1-13 se enumeran algunos de los tipos de colonias que seencuentran en forma más frecuente, junto con los grupos debacterias que se asocian con cada una, los ensayos adicionalesque se requieren para la identificación definitiva y la referenciade la imagen correspondiente a la lámina en color 1-5.

La inspección inicial de las colonias para la identificaciónpreliminar de las bacterias es uno de los puntos principales deldiagnóstico microbiológico y se analiza en detalle en los capí-tulos siguientes dedicados a los grupos específicos de bacteriasy de otros microorganismos patógenos. Diferenciación de distintos tipos morfología bacteriana en los culti-vos mixtos. Cuando las placas de agar son sembradas para elaislamiento de bacterias, es fácil seleccionar las colonias aisla-


Recuadro 1-8 Características utilizadas para la identifica-ción de las colonias bacterianas

Tamaño: diámetro en milímetrosForma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, ahusadaElevación: plana, elevada, convexa, pulviniforme (en forma de almoha-

da), en forma de botón, umbilicadaMargen (borde de la colonia): liso o continuo, ondulado, lobulado,

corroído, filamentoso, encrespadoColor: blanca, amarilla, negra, beige, naranja, otrosSuperficie: brillante, mate, otrasDensidad: opaca, translúcida, transparente, otrasConsistencia: untuosa o mantecosa, viscosa, membranosa, quebradiza,

otras

Véanse también fig. 1-18 y lámina en color 1-5.

Recuadro 1-9 Reacciones en medio agar utilizadas en laidentificación de las bacterias

Hemólisis en agar sangreAlfa: clarificación parcial de la sangre alrededor de las colonias con

un cambio de color al verde del medio; contorno de los eritrocitos intactos

Beta: zona de clarificación completa de la sangre alrededor de las colo-nias debido a la lisis de los eritrocitos

Gamma: sin cambios en el medio alrededor de la colonia; sin lisis ocambio de color de los eritrocitos

Alfa prima: halo de lisis incompleta inmediatamente alrededor de lascolonias, con una segunda zona de hemólisis completa en la periferia

Producción de pigmentos en medio agarPigmentos solubles en agua que producen un cambio de color en el

medioPiocianinaPigmentos fluorescentesPigmentos que no se difunden confinados a las colonias

Reacción en agar yema de huevoLecitinasa: zona de precipitado en el medio que rodea las coloniasLipasa: “capa perlada“, una película iridiscente dentro e inmediata-

mente alrededor de las colonias, visible por reflejo de la luzProteólisis: zona clara que rodea las colonias

Recuadro 1-10 Cambios en los medios diferenciales

Varios colorantes, indicadores de pH y otros ingredientes se incluyenen los medios diferenciales de siembra en placa, sirven como indica-dores de actividades enzimáticas y ayudan a la identificación de losaislamientos bacterianos

Cuadro 1-12 Olores característicos de los microbios seleccionados*

MICROBIO

Alkaligenes faecalis (odorans)

Grupo EF-4 de los CDC

Especies de Candida

Especies de Citrobacter

Clostridium difficile

Especies de Corynebacterium, DF-3

Eikenella corrodens

Especies de Haemophilus

Especies de Nocardia

Pasteurella multocida

Peptostreptococcus anaerobius

Grupo de Bacterioides pigmentados

Especies de Proteus

Pseudomonas aeruginosa

Especies de Staphylococcus

Especies de Streptococcus

Especies de Streptomices

OLOR

A manzanas recién cortadas

Similar a las palomitas de maíz

A levadura

A calzado sucio

A podrido, heces

Frutal

A lejía

A pelaje húmedo

A sótano con moho

Pungente (indol)

Fecal

Acre

A chocolate quemado

A jugo de uvas

A calzado sucio

A manteca

A sótano con moho

* Ciertos microorganismos (que aquí no se enumeran) son peligrosos si se huelen.Véase el texto para el estudio.


das para su subcultivo. Sin embargo, en ocasiones el creci-miento muestra tal amontonamiento que es difícil elegir colo-nias individuales aisladas. Ante esta eventualidad, los micro-biólogos cuentan con varios recursos (cuadro 1-14).Examen de las tinciones de Gram de los cultivos. Las impresionespreliminares, basadas en la observación de las característicasde las colonias, pueden confirmarse mediante el estudio de losfrotis teñidos con Gram, una técnica de realización bastantesimple. La parte superior y el centro de la colonia que se va aestudiar se tocan primero con el extremo de un ansa de inocu-lación recta, cuidando de no tocar el agar adyacente (fig. 1-19).La parte de la colonia que conforma la muestra se emulsiona enuna pequeña gota de agua o solución fisiológica sobre un por-taobjetos para dispersar las bacterias individuales (fig. 1-20).Luego de que el portaobjetos se secó al aire, se fija la película

bacteriana a la superficie del vidrio con calor, pasando rápida-mente el portaobjetos cuatro o cinco veces a través de la llamade un mechero Bunsen o cubriendo el frotis con metanol o eta-nol durante algunos minutos. El frotis fijado se ubica sobre unsoporte para tinción y se realiza la tinción de Gram como sedescribe en el recuadro 1-6.

El frotis teñido debe examinarse con el microscopio utili-zando un objetivo de inmersión (las bacterias grampositivasaparecen azules; las gramnegativas aparecen rojas o rosas).Otras tres características son útiles para realizar la identifica-ción preliminar de las cepas aisladas: 1) el tamaño y la formade las bacterias, 2) el ordenamiento de las bacterias y 3) la pre-sencia o la pérdida de estructuras específicas u orgánulos(esporas, gránulos metacromáticos, cuerpos de inclusión uotras características).


Cuadro 1-13 Identificación preliminar de las bacterias por los tipos de colonias

TIPO DE COLONIA

Convexa, bordes lisos, 2–3mm, cremosa, amarillenta,zona de β-hemólisis

Convexa o pulviniforme,translúcida, de tamaño pun-tiforme, mantecosa, zonaancha de β-hemólisis

Umbilicada o plana, translú-cida, mantecosa o mucosa,zona amplia de α-hemólisis

En forma de almohada,semiopaca, gris, desdehúmeda hasta algo seca,puede o no estar presente laβ-hemólisis

Plana, gris, dispersa comouna película delgada sobrela superficie del agar; olor achocolate quemado

Plana, opaca, gris a verdosa,márgenes corroídos o dis-persos, pigmento verde-azul, olor similar a uvas

GRUPO BACTERIANO

Staphylococcus

Streptococcus

Pneumococcus

Escherichia coli y otras Entero-bacteriaceae

Proteus

Pseudomonas

PRUEBAS ADICIONALES

CatalasaCoagulasaDNasaUtilización de manitolReducción de teluritoResistencia a la novobiocinaResistencia a la furazolidona

CatalasaDisco ATolerancia al NaCl 6,5%Bilis-esculinaPrueba de CAMPHidrólisis de hipuratoL-pirrolidonil-β-naftilamida (PyR)

Disco PSolubilidad en bilis

Pruebas múltiplesIndolRojo de metiloReacción de Voges-ProskauerCitratoDescarboxilasasUreasa

FenilalaninaFermentaciones de hidratos de carbonoFenilalanina desaminasaUreasaLisina desaminasa

Citocromo oxidasaFlourescencia por asimilación de hidra-

tos de carbonoDesnitrificación DNasaHidrólisis de acetamidaCrecimiento a 42 °C

MARCO DE PLACAS ILUSTRANDO EL TIPO

1–5A

1–5B, C

1–5G

1–5D


Para realizar la identificación preliminar de un aislamientobacteriano, el microbiólogo debe evaluar cada una de estascaracterísticas. En la lámina color 1-3 se muestra una serie demicrofotografías de varias tinciones que ilustran numerosostipos de morfología y ordenamientos espaciales de las bacteriasque se encuentran con mayor frecuencia en los laboratorios clí-nicos.

Con la información que se obtiene del análisis de las colo-nias bacterianas y la tinción de Gram de los frotis bacterianos,el microbiólogo puede orientarse hacia los ensayos particularesque le permitan realizar la identificación correcta. Por ejemplo,una colonia hemolítica amarilla cremosa y elevada presente enun agar sangre que consiste en cocos grampositivos agrupadoses muy probablemente Staphylococcus (véase lámina color 1-3C). Una colonia β-hemolítica translúcida puntiforme sobreagar sangre formada por cocos grampositivos organizados encadena es muy probable que sea un estreptococo (véase láminaen color 1-3D).

Sin embargo, los microbiólogos aprenden enseguida a nobasarse sólo en el examen de la tinción de Gram de los frotisporque las reacciones de tinción pueden ser variables, sobretodo en el caso de las colonias muy jóvenes o muy viejas. Lamorfología de las bacterias en una tinción de Gram es máscaracterística cuando los frotis se preparan de un caldo de sub-cultivo fresco (4-6 horas), momento en el cual las bacterias seencuentran en la fase logarítmica de crecimiento. A menudo,cuando los frotis se preparan de colonias que crecen en lasuperficie del agar, la morfología en la tinción de Gram esmenos característica.

Los microbiólogos deben proporcionar a los médicos tantainformación preliminar como sea posible. En ciertos casosespeciales, como cuando se observan bacterias en un hemocul-tivo o directamente en LCR, esta información preliminar puedeser lo suficientemente útil para indicar el tratamiento con anti-

bióticos específicos antes de que se cuente con la identificaciónfinal o el antibiograma.

PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR DE LAS BACTERIAS AISLADAS

La mayoría de los ensayos utilizados para determinar laactividad bioquímica o metabólica de las bacterias con el pro-pósito de identificar una cepa aislada se realizan mediante lainoculación de la cepa aislada primaria en medios de pruebas


Cuadro 1-14 Técnicas de preparación de aislamientos purosa partir de cultivos mixtos

TÉCNICA

Subcultivo directo

Uso de medios selectivos

Uso de sustancias quími-cas inhibidoras incorpo-radas dentro del agar(análogo a un medioselectivo)

Uso de discos de antibió-ticos (análogo a unaplaca de agar que con-tiene antibióticos, peromás flexible)

DESCRIPCIÓN

Tocar con cuidado la superficie de la coloniadeseada con la punta de una aguja de ino-culación (no un ansa); estriar una nuevaplaca para el aislamiento

Subcultivar la colonia de interés sobre unagar que inhibirá el crecimiento de lascolonias no deseadas; por ejemplo, subcul-tivar un bacilo gramnegativo sobre un agarde MacConkey para separarlo de cocosgrampositivos

Subcultivar la colonia de interés sobre unagar que contenga antibióticos o sustanciasquímicas que inhibirán el crecimiento delas colonias no deseadas

Subcultivar la colonia de interés sobre lasuperficie de una placa con agar y ubicarun disco impregnado en antibiótico diseña-do para inhibir la bacteria no deseada

Figura 1-20 Técnica para la preparación de un frotis para la tinción de Gram.La parte superior de una colonia bacteriana aislada, como se ilustra en la figu-ra 1-19, se toca con un ansa recta o ansa de inoculación, luego la punta del ansase sumerge en una gota de agua o solución fisiológica en un portaobjetos devidrio. El inóculo se emulsiona y la preparación se seca al aire antes de fijarlacon calor y teñirla.

Figura 1-19 Técnica para tomar una colonia bacteriana aislada con un ansarecta con el objeto de realizar un subcultivo en otro medio.


diferenciales o en soluciones. La observación inicial y la inter-pretación de un medio de cultivo deben utilizarse para deter-minar si el o los microorganismos aislados merecen identifica-ción posterior y si se debe realizar el antibiograma.Procedimientos bioquímicos directos para la identificación bacteria-na preliminar. Se pueden realizar ciertas observaciones prelimi-nares o un ensayo rápido directo sobre las colonias selecciona-das. Con frecuencia, una bacteria puede identificarse hasta unnivel de utilidad clínica basándose sólo en estas determinacio-nes. Por ejemplo, las propiedades de utilización de la lactosa delos bacilos gramnegativos pueden evaluarse directamente sobreel agar de MacConkey observando la pigmentación roja de lascolonias; la producción de H2S puede detectarse en los agaresde Hektoen y XLD observando un centro negro en las colonias.También se puede sospechar la descarboxilación de la lisinacuando se advierte crecimiento de colonias en el agar XLD. Unhalo rojo alrededor de la colonia, que indica una variación a pHalcalino, revela la descarboxilación de la lisina.

A continuación se describen los ensayos directos que puedenrealizarse sobre colonias aisladas que se recuperaron a partir deplacas de cultivo primario:

Prueba de la catalasa. Se colocan unas gotas de peróxidode hidrógeno al 3% directamente sobre la colonia. La rápidaefervescencia indica la producción de oxígeno molecular y unresultado positivo (véase protocolo 1-1). Puede ser difícil obte-ner resultados exactos si el ensayo se realiza en colonias quecrecen sobre placas de agar sangre debido a la presencia deperoxidasa en los eritrocitos. Sin embargo, la reacción de pero-xidasa que producen los eritrocitos es tardía y débil y puedediferenciarse con facilidad de la reacción inmediata y fuerte-mente activa que causan las bacterias catalasa positivas. Laprueba de la catalasa se usa muy a menudo para diferenciar losestafilococos (positiva) de los estreptococos (negativa) o lasespecies de Bacillus (positiva) de las de Clostridium tertium(negativa).

Prueba de solubilidad de la bilis. Se utilizan dos métodospara determinar la solubilidad de la bilis. A modo de análisisinicial, se colocan unas gotas de una solución de desoxicolatode sodio al 10% sobre las presuntas colonias de Streptococcuspneumoniae. Las colonias de neumococos se lisan por completoy desaparecen luego de unos 30 minutos (véase protocolo 1-2).Esta prueba es a veces difícil de interpretar; el ensayo en tuboes más directo. Se puede resuspender un inóculo de la coloniabacteriana desconocida en una solución de desoxicolato al 10%(sales biliares) hasta que se alcanza turbidez. La clarificaciónde la turbidez luego de una incubación de 30 a 60 minutos a 35°C indica la solubilidad de la bilis (véase protocolo 1-2). Enforma simultánea se debe efectuar un ensayo de control conStreptococcus viridans, que no se disuelve en la bilis. Comoalternativa, se puede realizar un ensayo rápido de aglutinaciónde partículas de látex para neumococos.

Prueba de la coagulasa en portaobjetos. Se emulsiona unacolonia que se presume de Staphylococcus en una gota de plas-ma de conejo sobre un portaobjetos de vidrio. La agregación delas bacterias dentro de los 2 minutos indica la presencia de coa-gulasa unida y constituye un resultado positivo de la prueba(véase protocolo 1-3). Luego de una prueba de la coagulasa enportaobjetos con resultado negativo debe realizarse una pruebade la coagulasa en tubo convencional. También se pueden uti-lizar las pruebas de aglutinación para la detección de la proteí-na A de estafilococos como un marcador de Staphylococcusaureus. Muchos laboratorios basan la identificación de los esta-filococos en la presencia o la ausencia de coagulasa. En esecaso, el informe debe indicar la presencia de estafilococos coa-

gulasa positivos o negativos, en lugar de un nombre específicode especie (p. ej., S. aureus).

Prueba de la mancha directa de indol. Se transfiere unapequeña porción de la colonia que se va a ensayar desde unmedio no selectivo, como agar sangre o chocolate, a una tira depapel de filtro previamente saturada con el reactivo de Kovac ouna solución de p-dimetilaminocinamaldehído (PACA). Laaparición inmediata de color rojo con el reactivo de Kovac indi-ca la presencia de indol y la prueba es positiva (véase protoco-lo 1-4). El PACA es más sensible que el reactivo de Kovac y larápida aparición de color azul indica una reacción positiva. Enmuchos laboratorios, aparecen luego de 24 horas de incubaciónen el agar de MacConkey colonias de aspecto seco, lactosapositivas y mancha de indol positiva, sobre todo en aislamien-tos de las vías urinarias, que se identifican presuntamente comoE. coli y casi nunca se realizan otras pruebas posteriores. Enestos casos, la prueba de la mancha de indol debe efectuarsesobre colonias que están creciendo en placas de agar sangre enparalelo, debido a que la pigmentación de las colonias lactosapositivas en el agar de MacConkey dificulta la interpretaciónde la reacción de color.

Prueba de la citocromooxidasa. Se extiende una parte de lacolonia que se va a ensayar sobre un área de una tira para la prue-ba de oxidasa impregnada con el reactivo. La aparición inme-diata de color azul indica actividad de citocromo oxidasa y unresultado positivo de la prueba (véase protocolo 1-5). La prue-ba de citocromo oxidasa es de utilidad para la categorizacióninicial de muchas especies bacterianas que tienen diferentemorfología de colonia. Se puede descartar que las colonias oxi-dasa positivas pertenezcan a las Enterobacteriaceae, las cualesson uniformemente negativas. Las especies bacterianas queproducen citocromo oxidasa incluyen las especies deAeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas y Pasteurella.

Prueba de MUG. Se pueden utilizar otras pruebas directaspara el análisis inicial de ciertos microorganismos a partir decultivos primarios, lo cual ofrece un posible ahorro en procedi-mientos de diferenciación que insumen más tiempo y son cos-tosos. La prueba de MUG (4-metilumberiferil-β-D-glucuroni-dasa), una de ellas, se basa en la capacidad de un microorga-nismo desconocido para producir β-glucuronidasa. Esta pruebapuede utilizarse como análisis preliminar de E. coli en lugar dela prueba del indol. Se inocula una suspensión concentrada delmicroorganismo desconocido dentro del reactivo MUG, que hasido resuspendido en tubos o impregnado en discos deshidrata-dos. Si la β-glucuronidasa está presente, el reactivo fluorescedebido a la liberación de 4-metilumbeliferona. También puededetectarse indol mediante el agregado del reactivo de Kovac altubo de MUG, lo cual convierte esta prueba combinada en unmétodo de valor para el análisis de los bacilos entéricos fer-mentadores de lactosa.

Prueba de PYR. El sustrato L-pirrolidonil-β-naftilamida(PyR) es un método simple para la identificación rápida deenterococos. Luego de 4 horas de incubación, a partir de la ino-culación del sustrato con una suspensión líquida concentradadel microorganismo desconocido preparada a partir de unaplaca de aislamiento primario, la producción de color rojoluego del agregado del reactivo N,N-metilaminocinamaldehídoindica la presencia de enterococos (los estreptococos del grupoA son también PyR positivos, pero pueden diferenciarse me-diante criterios morfológicos; véase protocolo 1-6).Identificación de las bacterias según las especies y selección de lascaracterísticas diferenciales. La caracterización final de unacepa bacteriana aislada desconocida suele lograrse mediante elensayo de sistemas enzimáticos característicos para cada espe-



cie. Estos sistemas de enzimas se detectan por la inoculaciónde pequeñas porciones de una colonia bacteriana bien aisladadentro de diversos medios de cultivo que contienen sustratosespecíficos e indicadores químicos. A través de ellos, el micro-biólogo puede detectar cambios en el pH del medio provoca-dos por la utilización de los sustratos químicos o cambios decolor causados por productos derivados específicos. El micro-biólogo clínico debe seleccionar grupos apropiados de carac-terísticas diferenciales que le permitan la identificación decada grupo de bacterias. Uno de los mayores avances en eldiagnóstico microbiológico ha sido la miniaturización de lossistemas bioquímicos, de modo que se pueden examinar múl-tiples características de manera expeditiva y a un costo relati-vamente bajo. Antes de estos progresos, se realizaba un núme-ro pequeño de pruebas en tubos o placas, seguidas de análisisbasados en los resultados iniciales. Este proceso era lento, cos-toso y más proclive al error que los enfoques modernos.87

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DIFERENTES DE LAS BACTERIASHongos. Las levaduras comparten muchas características conlas bacterias y, en consecuencia, se aplican enfoques similares.Se puede utilizar la prueba de la ureasa (incluida la versiónrápida) para examinar microorganismos aislados de muestrasrespiratorias, debido a que el patógeno más frecuente (Crypto-coccus neoformans) produce ureasa, mientras que la levaduracomensal aislada más a menudo (especies de Candida) no con-tiene esta enzima, salvo raras excepciones. Las levaduras seidentifican por sus características morfológicas, además de porla asimilación o fermentación de los hidratos de carbono. Parala identificación de las levaduras suelen emplearse variacionesde los enfoques que se aplican para las bacterias.

Sin embargo, la base de la identificación de las cepas de hon-gos filamentosos es el estudio morfológico de los caracteresreproductivos asexuales. Las pruebas bioquímicas tienen unpapel secundario.Micobacterias. Dado que se trata de bacterias especializadas, elenfoque para su identificación es similar al de las bacterias. Noobstante, las pruebas bioquímicas son mucho más difíciles enel caso de las micobacterias que de las bacterias convenciona-les. La mayoría de los directores de los laboratorios eligenenviar las muestras a laboratorios especializados o utilizar téc-nicas de biología molecular con sondas moleculares específicaspara la identificación de las especies aisladas con mayor fre-cuencia.Parásitos. Salvo raras excepciones, la caracterización de losparásitos se efectúa por medio de estudios morfológicos. Esmuy raro que se realice el cultivo de los parásitos.Virus. Dado que se trata de patógenos intracelulares estrictos,los virus requieren un enfoque diagnóstico muy diferente. Lastécnicas predominantes utilizadas para el diagnóstico virológi-co son la caracterización de antígenos y la de ácidos nucleicos.

ANTIBIOGRAMAEn muchos aspectos, la determinación de la sensibilidad de

un patógeno a un antibiótico determinado es la tarea másimportante que se realiza en los laboratorios de diagnósticomicrobiológico. En el recuadro 1-11 se resumen algunos de losfactores que deben evaluarse cuando se consideran los antibio-gramas.

Los antibiogramas se usan muy a menudo como guía para eltratamiento de las infecciones bacterianas y micobacterianas

(véanse caps. 17 y 19). La tarea del microbiólogo clínico esasegurar, en el mayor grado posible, que el ensayo se realicesobre el aislamiento apropiado y con los métodos válidos. Elcamino más fácil es ceder ante la insistencia de un médico querequiere un ensayo sobre una cepa para la cual no existenestándares de interpretación, pero el microbiólogo debe resistirla tentación de hacerlo.

En ciertas situaciones se puede requerir un análisis de sensi-bilidad para bacterias anaerobias, hongos y virus, pero no esnecesario realizarlo en forma sistemática. Si se analizan estosagentes, es importante que un médico experimentado, capaz deinterpretar los resultados de manera apropiada, participe en laatención del paciente.Utilización de los resultados del antibiograma para el control decalidad de los datos de identificación bacteriana. Algunas bacte-rias presentan una sensibilidad predecible a ciertos antibióti-cos y no necesitan ensayarse. Muchas más tienen patrones desensibilidad característicos que no son lo suficientementeabsolutos como para obviar el ensayo. Sin embargo, estospatrones pueden utilizarse como control de la caracterizacióntaxonómica. Por ejemplo, Klebsiella pneumoniae es casi siem-pre resistente a la ampicilina, pero sensible a las cefalospori-nas de primera generación. Por el contrario, las especies deEnterobacter suelen ser resistentes a ambos grupos de antibió-ticos. Si una bacteria se identificó como Enterobacter, pero essensible a estos agentes, se deben poner en duda estos resul-tados. Se deben repetir los ensayos para caracterización ysensibilidad, dado que uno, ambos o ningún resultado podrí-an estar equivocados. De manera óptima se debería utilizar unmétodo diferente del que se empleó al principio para repetirla prueba.

RELACIÓN COSTO-EFICACIA EN LA FASE ANALÍTICAEn la fase analítica, los recursos pueden utilizarse de mane-

ra eficaz si se presta particular atención a algunas de las áreasde esta fase. Es posible utilizar protocolos abreviados para laidentificación de ciertos microorganismos (cuadro 1-15). ElNCCLS ha proporcionado recomendaciones de consenso paraciertos enfoques.80 En el cuadro 1-16 se resumen otras formaspara optimizar los recursos. El fundamento de estos enfoquesse centra en los resultados que pueden interpretarse en formacorrecta y que conducirán al mejor tratamiento para el pacien-te. Un principio conceptual es pensar que las muestras puedenagruparse en dos categorías amplias: 1) aquellas a partir de lascuales se aíslen agentes que son muy probablemente patógenosy 2) aquellas a partir de las cuales se aíslen agentes que no pue-den interpretarse con confianza. Si un microbiólogo le presta


Recuadro 1-11 Factores que influyen en el antibiograma

Factor

Aislamiento

Sensibilidad

Situación clínicaEstándares de

interpretación

Criterio

Patógeno potencial de una muestra válida (pro-bablemente no representa flora colonizante)

No predecible para agentes infecciosos y anti-bióticos

Indicación del tratamiento con antibióticosDisponibilidad de criterios validados para la

determinación del significado clínico delresultado



Cuadro 1-15 Identificación abreviada de las bacterias y los hongos

SITUACIÓN

Gramnegativo, no abundante, oxidasa negativo, β-hemolítico enagar sangre de carnero*

Gramnegativo, no abundante, oxidasa negativo, no hemolítico enagar sangre de carnero, fermentador de lactosa*

Gramnegativo, no abundante, oxidasa negativo, no hemolítico enagar sangre de carnero, no fermentador de lactosa*

Bacilos pequeños o cocobacilos gramnegativos aislados de muestrasrespiratorias o de líquido cefalorraquídeo; crecimiento en agarchocolate con 5% de CO2 pero no en agar sangre de carnero*

Diplococos gramnegativos, oxidasa positivos, crecimiento en agarchocolate y agar sangre de carnero*

Bacilos gramnegativos, oxidasa negativos, no fermentadores delactosa, crecimiento abundante en agar chocolate o agar sangrede carnero*




Bacilos gramnegativos, oxidasa positivo, aroma típico de uvasConcord, morfología típica de las colonias (brillo metálico,verde/rojizo/negro, mucoide)*

Cocos grampositivos en agrupamientos; catalasa positivos; colo-nias cremosas opacas amarillentas en agar sangre de carnero(coloración acentuada en agar chocolate)*

Cocos grampositivos en pares o cadenas cortas; catalasa negativosu ocasionalmente positivos débiles; no β-hemolíticos en agarsangre de carnero*

Cocos grampositivos en pares o cadenas cortas; catalasa negativos;usualmente una zona estrecha de β-hemólisis *

Cocos grampositivos en pares o cadenas cortas; catalasa negativos;α-hemolíticos en agar sangre de carnero; colonias típicamentemucosas o en forma de “damero”*

Cocos grampositivos en pares o cadenas; catalasa negativos; β-hemolíticos en agar sangre de carnero con una zona ancha dehemólisis; colonias usualmente secas y pequeñas en relación conla hemólisis*

Bacilos gramnegativos pequeños; oxidasa positivos; agar poceado,colonias con apariencia de “sombrero mexicano” o “gota derocío” en agar sangre de carnero, olor a lejía

PROTOCOLO DE PRUEBAS ABREVIADO

Sin pruebas adicionales

PYR negativa

MUG positiva

Prueba rápida para síntesis de porfi-rinas negativa

Prueba rápida de esterasa de butiratoo DNAsa positiva

Indol positiva

Indol negativa; sensible a ampicilina

Indol negativa; resistente a ampicili-na; maltosa negativa; ornitina posi-tiva

Indol negativa; resistente a ampicili-na; maltosa positiva; ornitina nega-tiva


Coagulasa en portaobjetos y/o coa-gulasa de 4 horas en tubo positivas

PYR positiva

Prueba rápida de hidrólisis de hipu-rato positiva; prueba de la manchaCAMP positiva; o aglutinación delátex con anticuerpos específicospositiva

Mancha de bilis o solubilidad debilis en tubo positiva;Pneumoslide® positivo; reacciónde hinchazón capsular positiva; oaglutinación de látex con antisue-ros específicos positiva

PYR positiva o aglutinación de látexcon antisueros específicos positiva


IDENTIFICACIÓN

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli

Haemophilus influenzae (no puede diferenciarsede Haemophilus hemolyticus, un patógenohumano poco común)

Moraxella catarrhalis

Proteus vulgaris

Proteus mirabilis

Proteus mirabilis

Proteus penneri

Pseudomonas aeruginosa (los aislamientos pococomunes de Aeromonas pueden ser similarespero dan positiva la prueba de la mancha deindol)

Staphylococcus aureus (Staphylococcus coagula-sa positivas); rara vez otros estafilococos pue-den ser positivos en una u otra prueba de lacoagulasa

Especies de Enterococcus; el fracaso del creci-miento adecuado en las pruebas de sensibilidadsugiere que el asilamiento puede ser de otrogénero

Streptococcus agalactiae (grupo B); los entero-cocos β-hemolíticos puede ser hipurato positi-vos, pero también son PYR positivos

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes (grupo A); cepas ocasio-nales de enterococos β-hemolíticos tienen dife-rente morfología de colonias y presentan aglu-tinación negativa

Eikenella corrodens

(Continúa)



Cuadro 1-15 Identificación abreviada de las bacterias y los hongos (cont.)

SITUACIÓN

Bacilos regulares o cocobacilos gramnegativos con grandes colonias (> 1mm) en agar sangre anaerobio y un tamaño similar en agares LKV yBBE; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2*

Bacilos gramnegativos fusiformes, delgados, puntiformes; colonias demiga de pan u opalescentes en agar sangre anaerobio; sin crecimiento enagar BEE; sin crecimiento en agar chocolate 5% CO2*

Bacilos gramnegativos; colonias pequeñas (< 1 mm) en agar sangre anae-robio y agar BEE luego de al menos 48 horas de incubación; sin creci-miento en agar chocolate en 5% CO2; punto negro en el centro de lacolonia por producción de H2S*

Bacilos gramnegativos cocobacilares pequeños; colonias negras (o confluorescencia rojo ladrillo bajo luz UV de longitud de onda larga) enagar LKV; colonias pequeñas translúcidas u opacas en agar BAP anaero-bio; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2*

Bacilos gramnegativos cocobacilares pequeños; colonias pequeñas translú-cidas u opacas en agar BAP anaerobio con fluorescencia rojo ladrillobajo luz UV de longitud de onda larga; sin crecimiento en agar chocola-te en 5% CO2*

Bacilos gramnegativos delgados; colonias planas, transparentes que produ-cen hoyos en el agar BAP anaerobio; sin crecimiento en agar LKV; sincrecimiento en agar chocolate incubado en 5% CO2; catalasa negativos;ureasa positivos*

Diplococos gramnegativos diminutos; colonias pequeñas (< 1 mm) detransparentes a opacas en agar BAP anaerobio con fluorescencia rojabajo luz UV de longitud de onda larga; sin crecimiento en agar BBE; sincrecimiento en agar chocolate en 5% CO2*

Bacterias grampositivas o gramvariables, grandes, en forma de vagón, deextremos romos; colonias grandes (> 2 mm) irregulares con una zonadoble de β-hemólisis en BAP anaerobio; sin crecimiento en agares LKV o BBE; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2; catalasanegativas*

Bacilos grampositivos delgados con hinchazón, esporas subterminales;crecimiento liso abundante en agar BAP anaerobio; sin crecimiento enagares LKV o BBE; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2; cata-lasa negativos; mancha de indol negativa*

Bacilos gramnegativos delgados con esporas subterminales; crecimientoequivalente en agar BAP anaerobio y en agar chocolate en 5% CO2;catalasa negativos

Bacilos grampositivos pleomórficos corineformes; colonias pequeñas (1 a2 mm) opacas blanco esmalte en agar BAP anaerobio; catalasa positi-vos; mancha de indol positiva*

Levaduras en brotación*

Levaduras en brotación esféricas; a menudo colonias mucosas*

PROTOCOLO DE PRUEBAS ABREVIADO

No son esenciales las pruebas adiciona-les; puede usarse como evidencia adi-cional el patrón de discos (resistenciaa penicilina, resistencia a kanamicina;sensibilidad a rifampicina)

Mancha de indol positiva

Catalasa fuertemente positiva

Sin necesidad de pruebas adicionales

Mancha de indol positiva







Prueba de germinación en tubo positivaen < 3 horas; o proyecciones micelia-les desde las colonias en medio quecontiene sangre en menos de 48 horasde incubación

Prueba rápida de fenol oxidasas positiva

IDENTIFICACIÓN

Grupo Bacteroides fragilis

Fusobacterium nucleatum

Bilophila wadsworthia

Especies de Prevotella; Preveotellaintermedia si la mancha de indol espositiva

Especies de Porphyromonas

Bacteroides ureolyticus

Especies de Veillonella

Clostridium perfringens

Clostridium septicum

Clostridium tertium

Propionilbacterium acnes

Candida albicans

Cryptococcus neoformans (los cripto-coccos puede excluirse de las colo-nias con prueba rápida de ureasanegativa)

* A partir de las recomendaciones consenso de la referencia80.


igual atención a las dos categorías, es muy probable que sehayan malgastado muchos recursos en muestras de significadodudoso y que las muestras más importantes sean subestimadas.

La función de cada microbiólogo es tomar las decisiones dellaboratorio, de acuerdo con el entorno local. Una primera con-sideración es evitar informar resultados que puedan interpretar-se de manera errónea. Un informe de “flora mixta; interpreta-ción dificultosa” es probable que estimule la recolección de otramuestra (con la esperanza de que sea mejor) o el tratamiento delpaciente sobre la base de los patógenos que probablemente seanla causa de la infección particular. Ponerle el nombre a unmicroorganismo aislado que de hecho es flora colonizante ocontaminante le da al microorganismo mayor relevancia de laque merece. El agregado de los resultados del antibiogramacomplica aún más la situación. Se puede utilizar una analogíacon el béisbol para ilustrar los errores más comunes:

1. Muestra enviada en hisopos: primer golpe (strike one).2. Ausencia de neutrófilos polimorfonucleares o no se solicitó

un frotis para tinción de Gram: segundo golpe (strike two).3. Presencia de flora mixta: tercer golpe (strike three).4. Usted está fuera de juego (out).

La pregunta que surge es: “¿Qué es flora bacteriana mixta?”.Para tomar la decisión, que debe hacerse en forma individualpara cada muestra, son esenciales el sentido común y una sóli-da base en los principios del diagnóstico microbiológico. Porejemplo, Streptococcus pyogenes es un patógeno importante,más allá de cuántas otras especies estén presentes; en cualquiercolonia β-hemolítica debe evaluarse la presencia de antígenode estreptococos del grupo A. Como una guía, Schreckenbergery Miller propusieron la “Regla de tres”.67,103 Sugirieron que sedeben evaluar uno o dos patógenos potenciales, incluso en pre-


Cuadro 1-16 Algunas estrategias sugeridas para optimizar las identificaciones en el laboratorio

CATEGORÍA

Muestras repetidas de un sitio no estéril dentro de un período definido

Flora mixta de un sitio no estéril, especialmente si es remitido en unhisopo; mínima inflamación o sin disponibilidad de frotis teñidos conGram

Flora mixta de un sitio no estéril, especialmente si es remitido en unhisopo; presencia de inflamación moderada a severa

Flora mixta de un sitio no estéril, especialmente si es remitido en unhisopo; presencia de inflamación moderada a severa; presencia de unúnico patógeno potencial predominante

Aislamiento de levaduras de cultivos mixtos con bacterias a partir de unsitio no estéril o potencialmente contaminado, como una herida olíquido peritoneal

Flora mixta a partir de muestras de orina del chorro medio de la mic-ción obtenida en condiciones adecuadas de higiene o de un catéterpermanente

Flora mixta con un único patógeno predominante a partir de muestrasde orina del chorro medio de la micción obtenida en condiciones ade-cuadas de higiene o de un catéter permanente

Presencia de flora vaginal mixta

Flora mixta a partir de un catéter intravascular

Aislamiento de bacterias que se asemejan a Haemophilus influenzae oMoraxella catarrhalis a partir de esputos expectorados

CRITERIO PROPUESTO*

Referir en las muestras siguientes la evaluación previa; si las muestras siguien-tes se inocularon en el medio y se observaron diferencias sustanciales con lamuestra original, consultar con el médico acerca de las acciones futuras

Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa

Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa, adjuntar un comentariopara consultar dentro de los 10 días por el procesamiento ulterior

Informar la identificación de un patógeno predominante y la presencia de floramixta; realizar el antibiograma sobre el patógeno predominante o adjuntarun comentario sobre consultar con el laboratorio acerca de las pruebas desensibilidad

Informar la presencia de levaduras; considerar adjuntar un comentario acercade consultar con el laboratorio por procesamiento ulterior

Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa, adjuntar un comentariosugiriendo 1) repita la recolección con un catéter que sea extraíble, si seencuentra clínicamente indicado y el paciente no tiene un catéter permanenteo 2) notifique al laboratorio si el paciente tiene un catéter permanente ynecesita terapia antimicrobiana

Evalué el patógeno predominante, adjunte un comentario que indique la pre-sencia de flora mixta

Informe sólo la presencia o ausencia de los patógenos vaginales documentadosque se encuentran mejor documentados por el cultivo; p. ej., Listeriamonocytogenes, Streptococcus agalactiae (en mujeres en edad fértil),Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus (si se sospecha un síndromede shock tóxico) y levaduras. Rara vez se indican las pruebas de sensibilidad

Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa, adjuntar un comentarioacerca de consultar con el laboratorio por el procesamiento ulterior

Proceder con la identificación e informar el resultado sólo si se encuentra unorganismo en una tinción de Gram concomitante asociada con neutrófilospolimorfonucleares

* Es un buen criterio preservar las muestras cuya evaluación no se ha completado durante al menos 24 horas. Preservar las placas de agar cuya evaluación no se ha completado du-rante un período. Siete días es un lapso conveniente para preservar las placas, dado que todas las placas de un día pueden almacenarse juntas y descartarlas una semana después.


sencia de flora comensal, pero no se deben evaluar tres o máspatógenos potenciales.

La guía de la “Regla de tres” es una ayuda, pero se debe uti-lizar un criterio lógico. Por ejemplo, la regla no debe aplicarseen forma automática a una muestra de tejido de biopsia, líqui-dos de aspirado o pus. En el aparato urinario, una mezcla detres o más microorganismos de cualquier variedad sugiere con-taminación con flora vaginal o perineal; aun cuando un pató-geno potencial sea parte de la mezcla y no predomine, es difí-cil confiar en que el análisis proporcionará información válida.A veces, la relación cuantitativa de los microorganismos en lamezcla puede proporcionar un indicio. Si uno o probablemen-te dos microorganismos predominan claramente, es razonableevaluarlos e informar además la presencia de flora mixta.

Cabe destacar que cuando un microbiólogo examina unaplaca de agar y determina que hay una mezcla de tipos de bac-terias, en realidad está observando una mezcla de tipos de colo-nias bacterianas (diferentes morfologías de colonias). Estascolonias visualmente diferentes suelen representar distintasespecies (o incluso géneros), pero también pueden representarvariantes fenotípicas de microorganismos con un solo genoti-po. La única manera de estar seguro de que se aislaron múlti-ples especies de bacterias es identificarlas a todas, y porsupuesto, para ese momento ya se habrá completado el trabajo.En la práctica, debemos aplicar nuestro criterio para decidir silas colonias son lo suficientemente diferentes como para que sejustifique la caracterización del crecimiento como una mezclao reconocer que a veces es posible equivocarse.

Un enfoque sensato en estas situaciones es ofrecerle al médi-co la oportunidad de solicitar que se evalúen los aislamientos oiniciar un diálogo preventivo a través de un informe verbal tele-fónico o de una comunicación escrita en el cuaderno de regis-tro del laboratorio. Un modo sencillo es conservar las placas

sobre las cuales se solicitó una consulta o las que contienenflora mixta. Si cada día las placas se separan, se encintan (conuna cinta adhesiva) y se guardan durante siete días, las mues-tras vencidas pueden descartarse con facilidad. Si surge unadiscusión y se continúa con la evaluación de esa muestra, elmicrobiólogo tendrá una posición más segura si conservó lamuestra que si la descartó.

Las técnicas y la interpretación de los procedimientos ante-riores se tratarán con más detalles en los capítulos siguientes.En la era de los costos restringidos, es imperativo que losmicrobiólogos apliquen sus habilidades de observación y la uti-lización de algunas características seleccionadas para identifi-car las especies bacterianas en forma presuntiva cuando seaposible. El desarrollo de este “sexto sentido” microbiológicopuede ser también útil para verificar los resultados obtenidos apartir de equipos de diagnóstico comerciales o de dispositivosautomáticos. En ocasiones, los números de biotipo que infor-man estos sistemas están en desacuerdo con las característicasde las colonias, la morfología en la tinción de Gram o las prue-bas bioquímicas de manchas. Se debe realizar un estudio con-tinuo para evitar los informes erróneos.

Fase posanalítica

INFORME DE LOS RESULTADOSLos informes con los resultados de los cultivos microbioló-

gicos se deben emitir en cuanto la información útil esté dispo-nible. Cada director de laboratorio debe establecer los resulta-dos que deben considerarse “urgentes” o “valores de alerta”.Asimismo, algunos resultados pueden considerarse “importan-tes”, pero no necesariamente “urgentes”. En el cuadro 1-17 seenumeran algunos resultados “urgentes” e “importantes” típi-cos. La confección de este tipo de listas varía mucho, de acuer-


Cuadro 1-17 Lista sugerida de informes “urgentes” o “importantes”*

INFORMES “URGENTES”

Hemocultivos positivos

Cultivos de líquido cefalorraquídeo positivos

Frotis positivos para bacilos ácido-alcohol resistentes


Especies de Plasmodium, especialmente P. falciparum

Streptococcus pyogenes a partir de sitio normalmente estéril o de origen genital

Streptococcus agalactiae a partir de un sitio genitalde una mujer embarazada de término

Virus del herpes simple a partir de un sitio genital deuna mujer embarazada de término

INFORMES “IMPORTANTES”

Tejidos y líquidos positivos que no sean sangre ni líqui-do cefalorraquídeo

Patógenos fecales

Otros parásitos positivos que no sean las especies dePlasmodium

Patógenos de transmisión sexual

Streptococcus agalactiae si se aísla a través del protoco-lo de cultivo de preparto

Streptococcus pyogenes a partir de un cultivo faríngeo

Patógenos virales positivos

Hongos dimorfos positivos

Antígenos positivos o pruebas de ácidos nucleicos reali-zadas directamente sobre muestras clínicas

* Esta lista es un modelo de sugerencia y debe ser modificada de acuerdo con las condiciones locales.


do con factores como la capacidad de los sistemas de informa-ción de la institución y la relación que se establece entre los mé-dicos y el laboratorio. Además de las categorías definidas, elmédico puede tener la oportunidad de solicitar un resultadosobre algún cultivo en forma telefónica en el momento en quese solicitó el examen.

Los resultados “urgentes” siempre se deben informar porteléfono a la persona que asiste al paciente. Los resultados“importantes” pueden informarse por teléfono, fax, ordenadoro papel. La principal consideración es que todas las partescomprendan las reglas. Si todos los resultados del laboratorioestán disponibles de manera inmediata y conveniente para losusuarios de los servicios del laboratorio, los médicos van aencontrar mucho más ventajoso obtener todos los resultados,excepto los urgentes, en forma electrónica. Siempre que uninforme pueda ser visto por personal no autorizado, debe ase-gurarse la confidencialidad de los datos del paciente; por ejem-plo, enviar los faxes sólo a los aparatos de recepción seguros.Es de buena práctica tener un protocolo para los informes tele-fónicos donde se especifique quién puede recibirlos en caso deque la persona que asiste al enfermo no se encuentre disponi-ble; este protocolo debe ser aceptable para el médico y para elpersonal del laboratorio.

Como política del laboratorio se deben realizar informespuntuales preliminares y provisionales. Por ejemplo, los infor-mes preliminares sobre los cultivos negativos deben emitirsedentro de las 48 horas. El momento de emisión del informe ini-cial para otros tipos de agentes variará de acuerdo con la velo-cidad de crecimiento; por ejemplo, en forma semanal para lasmicobacterias, dos veces la primera semana y luego semanal-mente para los hongos. Un informe provisional de un “cultivonegativo” puede ser de ayuda, ya que el médico puede desearevaluar nuevamente el caso mientras está pendiente el informefinal. Los informes finales deben emitirse lo antes posible; parala mayoría de los cultivos bacterianos, 48 horas es un plazorazonable.

INTERACCIÓN CON LOS EPIDEMIÓLOGOSLos microbiólogos desempeñan un papel importante en el

resguardo de la salud de los pacientes y, en general, de la saludpública.38,89 Ciertos agentes infecciosos deben informarse porley a las autoridades de salud pública; la lista varía según elestado y debe estar disponible en el laboratorio. El informedebe ser escrito o, cada vez más, enviarse por vía electrónica.Dentro de una institución se debe estimular una relaciónsimilar con los epidemiólogos del hospital (o del sistema deatención de salud). Los epidemiólogos deben revisar ciertosresultados de laboratorio en forma regular. Además, los micro-biólogos deben permanecer alertas frente a los patrones pococomunes de aislamiento que merecen una mención al epide-miólogo para que los considere para una investigación poste-rior. A veces, la caracterización molecular de un aislamientopuede aumentar la calidad de las investigaciones epidemiológi-cas. Las pruebas adicionales deben hacerse localmente o en unlaboratorio de referencia, según la capacidad profesional decada lugar.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS El director es responsable de la comunicación con los médi-

cos acerca de ciertos parámetros importantes sobre el funcio-namiento del laboratorio (recuadro 1-12). En condiciones ópti-mas, esta comunicación debería tenerse con los médicos en

forma individual o con grupos de médicos (p. ej., grupos porespecialidad), si los sistemas locales de información lo permi-ten. La herramienta final de control de calidad para los médi-cos es recibir una ficha de registro que detalla la solicitud deestudios y los resultados de sus pacientes (p. ej., la frecuenciay la tasa de análisis positivos) en comparación con la de otrosmédicos. Se desalienta el diseño de este tipo de informes por-que es difícil asegurar que los profesionales que se comparanatiendan a grupos de pacientes que son verdaderamente equi-valentes. Los estudios sobre el tiempo de respuesta global deun laboratorio (turnaround time, TAT) son más problemáticosen microbiología que en otras áreas del laboratorio a causa delas demoras inherentes a la generación de los resultados micro-biológicos. Ciertos análisis, como el examen directo de mues-tras clínicas, se prestan para evaluar el tiempo de respuesta glo-bal. Se deben suministrar en forma anual los resúmenes de losresultados del antibiograma.

CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REGISTROSSe deben seguir las guías locales y nacionales para el alma-

cenamiento de las solicitudes y de los informes. Éstas difierensegún el tipo de muestra y la situación clínica.

Los líquidos corporales estériles o los tejidos deben mante-nerse a temperatura ambiente o en heladera hasta que el culti-vo se haya evaluado por completo; el líquido cefalorraquídeodebe conservarse a temperatura ambiente debido a la labilidadque presenta Neisseria meningitidis a 4 °C. De manera ideal, eltejido debe ser congelado a –70 °C para su futura utilización,aunque esto puede ser dificultoso para muchos laboratorios. Amenudo, no es necesario volver al congelador. Sin embargo, enocasiones, los análisis siguientes (p. ej., luego de la revisiónhistológica del tejido) pueden sugerir la necesidad de detectarmicobacterias, virus u hongos luego de una solicitud inicialsólo de cultivo bacteriano. En esas situaciones, el tejido conge-lado representa un recurso invalorable con el cual se puedeobtener un diagnóstico etiológico específico y se pueden reali-zar los ensayos de sensibilidad apropiados.

Los aislamientos de los hemocultivos deben mantenersedurante al menos 30 días. De manera ideal, todos los cultivospositivos deben retenerse durante un período (p. ej., 7 días)para permitir su evaluación posterior; por ejemplo, su tipifica-ción molecular, o la realización de otras pruebas de sensibili-dad, si la clínica del paciente lo indica. Una vez más el man-tenimiento a –70 °C de aislamientos importantes o poco co-


Recuadro 1-12 Parámetros del desempeño del laboratorioy de los resultados clínicos

Actividad

Hemocultivos

Examen directo demuestras clínicas

Antibiograma

Parámetros

Frecuencia y tasa de aislamiento de “organismode la piel”/“contaminantes”

Frecuencia y tasa de envíos de cultivos únicosFrecuencia y tasa de aislamiento de patógenos

potencialesAnálisis del tiempo de respuesta global de un

laboratorio Resumen del porcentaje de sensibilidad de pató-

genos bacterianos de importancia


munes es un lujo, pero es muy útil. Si los aislamientos se con-servan, se deberá realizar una cuidadosa y rigurosa limpiezade los cultivos para mantener espacio para el almacenamientode los futuros aislamientos. Se describieron diversos métodospara el almacenamiento de los aislamientos microbianos.95

Nosotros encontramos que un método simple y eficaz de pre-servar aun los aislamientos de bacterias con requerimientosnutricionales especiales y de levaduras, es el simple hecho decolocar en un frasco ampolla estéril un bloque de agar cortadoa partir de una placa, que contiene colonias intactas en susuperficie. Los hongos pueden mantenerse como “cultivosacuosos” a temperatura ambiente. Los virus deben congelarsea –70 °C.

Aspectos administrativos del laboratorio de microbiología

El objetivo de este libro se centra en la ciencia de la micro-biología aplicada al diagnóstico y el tratamiento de las enfer-medades infecciosas. Sin embargo, en la práctica es imposibleseparar los asuntos de la microbiología de la ciencia. Una delas virtudes de los laboratorios microbiológicos es la sofistica-ción de los sistemas de soporte para la implementación de losprocesos científicos. Los laboratorios de investigación tienenmucho que aprender sobre el mantenimiento planificado y los

rigurosos controles de calidad de los laboratorios de diagnósti-co. Se guiará al lector por una extensa exploración sobre la teo-ría y la práctica de la gestión de laboratorio.37

Regulación estatal

En los Estados Unidos, el gobierno participa en casi todoslos aspectos de evaluación del laboratorio. A pesar de que algu-nas cuestiones se relacionan directamente con conjuntos dereglamentaciones específicas, todos los aspectos de la gestiónde laboratorio derivan, de una u otra forma, de leyes estatales.En muchos casos, los líderes de la industria de los laboratoriosprivados y académicos establecieron el marco de trabajo y defi-nieron los estándares, que luego fueron adoptados por el esta-do y aplicados a todos los laboratorios. En el recuadro 1-13 seenumeran las agencias federales y las agencias no guberna-mentales involucradas en las reglamentaciones médicas y delos laboratorios.

La autoridad que regula el alcance del laboratorio clínicoderiva de la Clinical Laboratory Improvement Act of 1967(CLIA ’67, Ley de mejoramiento del laboratorio clínico del año1967). Esta legislación autoriza la reglamentación de los labo-ratorios clínicos comerciales y de los hospitales. Durante vein-te años los laboratorios de otras instituciones estuvieron exen-tos. Las reformas de la Clinical Laboratory Improvement

Aspectos administrativos del laboratorio de microbiología 45

Recuadro 1-13 Entidades relacionadas con la práctica médica y de laboratorio

Entidad

Center for Medicare and MedicaidServices (CMS)

Centers for Disease Control andPrevention (CDC)

National Institute of OccupationalHealth and Safety (NIOSH); unadivisión de los CDC

Occupational Health and SafetyAdministration (OSHA)

Food and Drug Administration(FDA)

Veterans Affairs Department

International Air TransportAssociation (IATA)

Clinical and Laboratory StandardsInstitute (CLSI) (antes, NationalCommittee for Clinical LaboratoryStandards [NCCLS])

American Medical Association(AMA)

Joint Commission for theAccreditation of HealthcareOrganizations (JCAHO)

Área de responsabilidad

Establece las reglas para la acreditación, licencia e inspección de los laboratorios; fijalas tasas de reembolso para los servicios Medicare

Participan en la categorización de la complejidad de las pruebas; proporcionan lasrecomendaciones sobre diversos temas, como las técnicas de laboratorio y la prepa-ración para el bioterrorismo

Responsable de las reglamentaciones sobre protección de peligros químicos y bioló-gicos

Responsable de las reglamentaciones sobre la seguridad en los lugares de trabajo

Responsable de la aprobación de los medicamentos y de los dispositivos médicos; laFDA quita obstáculos para los dispositivos médicos pero no los “aprueba”

Responsable de la salud y el bienestar de los veteranos, incluida la red nacional dehospitales y clínicas

Organización internacional de transportistas aéreos; involucrada en la promulgaciónde las reglas para el envío seguro de los agentes infecciosos por vía aérea

Organización voluntaria académica, industrial y gubernamental; su objetivo es mejo-rar el desempeño de los laboratorios; aunque es una organización consejera, susrecomendaciones a menudo se vuelve estándares de la práctica del laboratorio

La mayor organización de médicos de los Estados Unidos; es responsable del desa-rrollo de los códigos de las pruebas de laboratorio y de los procedimientos médi-cos, que sirven de base para los reembolsos

Inspecciona y acredita a los hospitales y laboratorios hospitalarios, las agencias decuidado de salud domiciliario, los centros de salud para la atención de las enferme-dades crónicas y otros


Amendments of 1988 (CLIA ’88, Ley de mejoramiento del labo-ratorio clínico de 1988) extendieron el mandato para incluir a los laboratorios estatales, de salud pública y los laboratoriosde los consultorios médicos que realizan análisis para enferme-dades humanas. Los análisis con fines de investigación (losresultados no se aplican a la atención del paciente) y de medici-na veterinaria no se encuentran bajo el alcance estatal.

En la reglamentación de la CLIA ’88 se establecieron variascategorías de análisis (cuadro 1-18); además, existen muchasotras reglamentaciones, según la categoría en la cual se ubiqueel análisis. Los Centers for Disease Control and Prevention(CDC) tienen a su cargo la tarea de asignar cada análisis a unacategoría compleja. Un grupo de consejeros formado por indi-viduos del estado, la industria, grupos médicos, laboratoriosclínicos y de salud pública y consumidores aconseja al estadosobre estas decisiones (Clinical Laboratory ImprovementAdvisory Committee [CLIAC, Comité consejero sobre el mejo-ramiento del laboratorio clínico]).

En las reglamentaciones se delinean las especificacionesdetalladas sobre la calificación del personal, los ensayos deaptitud (proficiency) y el control de calidad para todos los labo-ratorios no exentos que realizan análisis.

Han surgido numerosos consecuencias de las reglamentacio-nes de la CLIA ’88.

1. La mayoría de los médicos han dejado de realizar todos losanálisis excepto los más básicos porque las reglamentacio-nes imponen requerimientos considerados demasiado ago-biantes.

2. Existe una presión constante por parte de los grupos médi-cos (que no son patólogos) para que las reglamentacionessean más flexibles y permitan la realización de análisis máscomplejos sin controles estrictos.

3. Los fabricantes se esfuerzan para que sus instrumentos yproductos se ubiquen en la categoría de las pruebas de exen-ción, de modo que puedan comercializarlos directamentecon los médicos como simples pruebas sin los rigurososrequerimientos de control y documentación.

Acreditación e inspección del laboratorio. La reglamentación de laCLIA ’88 otorga las licencias a los laboratorios luego de la ins-pección realizada por inspectores estatales o por otras organiza-ciones que hayan sido “acreditadas” por los CMS porque cuen-tan con los estándares equivalentes, o aún más estrictos. La JointCommission for the Accreditation of Healthcare Organizations(JCAHO) y el College of American Pathologists (CAP) son dosorganizaciones muy utilizadas por los laboratorios clínicos parala acreditación y la inspección. En todos los casos, el laboratoriodebe evaluarse en forma bienal. Los laboratorios que utilizan laJCAHO, se encuentran casi siempre en hospitales y su inspec-ción se realiza al mismo tiempo que la del hospital. En este caso,los inspectores son “profesionales”, por lo general con una pre-paración médica o de enfermería en lugar de tener un entrena-miento específico en laboratorio clínico. El CAP fue la primeraorganización que evaluó a los laboratorios antes de la participa-ción del estado en este proceso. Al principio, la acreditación eravoluntaria y se veía como una forma de educación para la mejo-ra del propio laboratorio. Su filosofía se basa en la evaluaciónpor pares. Cada laboratorio que se inspecciona debe suministrarun equipo para inspeccionar a su vez a otro laboratorio similar.Por lo tanto, los inspectores son profesionales de laboratorio y“voluntarios”.

Cada organización que inspecciona a los laboratorios tieneun conjunto de estándares para evaluar, los cuales deben serenviados a los Centers for Medicare & Medicaid Services(CMS) para su aprobación. En algunos estados se debe realizar,


Cuadro 1-18 Categorías de la complejidad de las pruebas de laboratorio según CLIA ’88

CATEGORÍA

Complejidad alta

Complejidadmoderada

Microscopia realizada poroperadores

Pruebas de exención

DESCRIPCIÓN

Pruebas que requierenla mayor habilidadanalítica y criterio

Pruebas que requierenhabilidad analítica ycriterio pero en unnivel menor

El examen microscópi-co realizado por cier-tos grupos de médicos

Pruebas simples que noes probable que ten-gan consecuenciasadversas si se realizande manera incorrecta

ENSAYOS DE APTITUD (PROFICIENCY)

Se requiere

Se requiere

Se requiere si corresponde

No se requiere

REQUERIMIENTOS DEL PERSONAL

Los más estrictos;requiere el equivalen-te a un título de espe-cialista

Menos estricto; requie-re entrenamiento quese puede realizar a lavez que trabaja

Se deben definir losgrupos de operado-res; no se puededelegar en otromiembro del personal

Ninguno

CONTROL DE CALIDAD

Se requiere

Se requiere

Se requiere sicorresponde

Se deben seguirlas instruccio-nes del fabri-cante

COMENTARIOS

Las pruebas de alta y moderadacomplejidad no se consideranen su conjunto pruebas deexención

Existe una fórmula complejapara categorizar las pruebas enniveles de complejidad

Esta es una subcategoría de laspruebas de moderada comple-jidad

A la mayoría de los trabajadoresde los laboratorios les llevamucho tiempo comprenderpara qué vale la pena realizaruna prueba si una respuestaincorrecta no causa ningúndaño

Para obtener información más detallada, diríjase al sitio de los Centers for Medicare & Medicaid Services (CMS): hhttp://www.cms.hhs.gov/clia/appendc.asp


además, la acreditación ante una agencia estatal si el laborato-rio tiene relaciones comerciales con ese estado. Ensayos de aptitud (proficiency).. Una parte fundamental de laacreditación continua es la participación en los ensayos de apti-tud. Se envían muestras desconocidas a los laboratorios parti-cipantes en forma periódica. El laboratorio las evalúa y envíalos resultados a la agencia de acreditación, luego de lo cualestos resultados son evaluados y se le otorga una calificación.Una vez más, el CAP inició este protocolo muchos años antesque la CLIA ’67. Hoy, las reglas son establecidas por el estado,aunque existe cierta libertad para trabajar dentro de ellas. Losmejores programas proporcionan una experiencia de capacita-ción como parte de los ejercicios. El Clinical and LaboratoryStandards Institute (CLSI) ofrece una guía para mejorar el fun-cionamiento del laboratorio a través de los ensayos de aptitud.78

Si no se cuenta con una fuente externa de ensayos de aptitudpara un analito, se debe crear en el laboratorio otro método quepermita determinar su desempeño. Existen diversos métodos,entre ellos el intercambio de muestras entre laboratorios y laelaboración de un panel de muestras problemas dentro delmismo laboratorio.81

En la CLIA ’88 se codificaron algunas reglas aparentementeobvias: el protocolo para los ensayos de aptitud debe ser lo másparecido posible al que se utiliza para las muestras clínicas(incluida la participación del mismo personal que realiza elensayo) y el personal del laboratorio no puede comparar losresultados antes de enviar las respuestas; en otros palabras, setoman precauciones para evitar el falseamiento de datos.Calificación del personal. En la reglamentación de la CLIA ’88para los laboratorios que realizan análisis reglamentados seproporcionan especificaciones detalladas para el personal detodos los niveles del laboratorio.Manuales de procedimientos. A pesar de que no existen prescrip-ciones rígidas para la preparación de las políticas y los proce-dimientos escritos, se deben seguir ciertos principios genera-les.82 Se deben establecer y seguir claramente las políticas. Losprocedimientos deben incluir los principios del análisis y lasreferencias, así como las instrucciones para su realización. Losmanuales deben estar disponibles para todos los trabajadoresque necesiten consultarlos.Requerimientos de espacio. Las reglamentaciones no especificanen forma detallada los requerimientos de espacio. En cambio,indican que debe ser adecuado para realizar el trabajo en formasatisfactoria. Sin embargo, se describieron guías informalespara los laboratorios generales75 y para los laboratorios demicrobiología120 que pueden ser útiles cuando se construye unanueva instalación o para evaluar la adecuación de un laborato-rio ya instalado.Laboratorios de referencia o de derivación. Es un laboratorio pococomún que puede satisfacer todos los requerimientos de losmédicos. Algunas muestras deben enviarse a un laboratorioespecializado para su análisis posterior.76 La selección de uno omás laboratorios de referencia no debe hacerse en formacasual. Los candidatos posibles deben evaluarse en conjuntocon el personal médico adecuado. El precio no es el únicodeterminante o incluso el factor más importante. La seleccióndebe someterse a revaluaciones regulares.Confidencialidad del paciente. La Health Insurance Portabilityand Accountability Act of 1996 (HIPAA, Ley de portación yresponsabilidad del seguro de salud de 1996) proporciona unresguardo para la confidencialidad de la información y permi-te que los pacientes tengan acceso a sus registros médicos. Sinembargo, la reglamentación del CLIA ’88 para los laboratoriosreemplaza los requerimientos del HIPAA. Los resultados del

laboratorio pueden ser informados a individuos autorizados, lapersona que requirió el análisis o quien es responsable de la uti-lización de los resultados. En algunas jurisdicciones puedenaceptar pedidos de análisis directamente de los pacientes.

Gestión de riesgos

La mayoría de los centros de salud están actualmente invo-lucrados en la gestión de riesgos. De hecho, muchos hospitalesy clínicas han establecido oficinas formales para esa gestión,completamente financiadas y con personal para ayudar a redu-cir al mínimo las probabilidades de accidentes y de prácticas dealto riesgo que les puedan causar daño a los empleados y a lospacientes. A pesar de que el mayor ímpetu para esta prácticapuede estar dirigido hacia la reducción de los costosos pedidosde compensación de los trabajadores o a los procesos judicia-les de mala praxis, en un sentido más amplio, los esfuerzospuestos para la gestión de riesgos están destinados a garantizarun entorno de trabajo seguro y un ambiente en el cual lospacientes puedan recibir la última tecnología médica sin temora ser dañados.97

La persona a cargo de la gestión de riesgos, trabajando enconjunto con el comité de aseguramiento de la calidad, es asig-nada para investigar los casos en los cuales el tratamiento de lacalidad cae por debajo de los umbrales establecidos o las situa-ciones en las cuales los empleados o los pacientes puedan estarexpuestos a un riesgo indebido. Después de revisar los detallesde la situación con los representantes adecuados del departa-mento involucrado y de recabar los datos necesarios, la perso-na a cargo de la gestión de riesgos envía un informe conciso alcomité del aseguramiento de la calidad conjunto con las reco-mendaciones para las acciones correctivas. El diálogo entre lapersona a cargo de la gestión de riesgos y el director del comi-té continúa hasta que se concreta un plan de acción apropiado.Luego se controla que el departamento involucrado cumpla conlos planes de acción correctiva.

A pesar de que el mayor esfuerzo de la gestión de riesgosestá dirigido hacia la atención del paciente, el laboratorio clíni-co participa en verificar que todas las operaciones del labora-torio cumplan con el total de las prácticas y políticas de la ins-titución. Si los equipos o instrumentos se dañan debido a unincendio o a un accidente eléctrico, si el personal se lastima osi los trabajadores contraen infecciones serias en el laboratorio,el flujo de trabajo se puede desorganizar y, en consecuencia,los informes de laboratorio se retrasan. Por lo tanto, la gestiónde riesgos del laboratorio está relacionada principalmente conla implementación y el control de las prácticas seguras de labo-ratorio, dirigida más hacia los empleados que a los pacientes.La responsabilidad de un daño recae claramente sobre elempleador, aun cuando la negligencia que condujo a ese dañosea responsabilidad del trabajador.50 Por esta razón, las perso-nas que se ocupan de la gestión de riesgos insisten en llevar acabo cursos de educación orientados hacia la seguridad y enrevisar que todas las reglas y reglamentaciones pertinentes a laseguridad del laboratorio sean implementadas y seguidas.

El aspecto financiero es otra área importante a la cual las per-sonas que se ocupan de la gestión de riesgos le prestan cada vezmás atención. Existen reglamentaciones estrictas para los con-flictos de interés, las facturaciones fraudulentas y los incentivosilegales para los negocios (como las comisiones clandestinas).La facturación de los programas estatales (el seguro estatal deenfermedad, Medicare y el programa de asistencia estatal paraindividuos sin recursos, Medicaid) deben utilizar un conjunto decódigos de pruebas, denominados Códigos de Terminología



de Procedimientos Actuales (Current Procedural Terminology,CPT). Muchas otras aseguradoras también utilizan estos códi-gos. La American Medical Association (AMA), que ha sidodesignada por el Estado para esta tarea, revisa y publica anual-mente estos códigos. Cualquier persona u organización puedeparticipar en el ingreso de datos para la construcción de loscódigos, pero el comité operativo de la AMA se forma a partirde sus sociedades constitutivas. En el campo del laboratoriomédico éstos son del CAP y de la American Society for ClinicalPathology (ASCP).

Seguridad del laboratorio

A pesar de que la responsabilidad legal de proporcionar unambiente de trabajo seguro es de los directores de los hospita-les y laboratorios, los empleadores deben también compartir laresponsabilidad de adherirse a los estándares de seguridad deli-neados en el Manual de Seguridad del Laboratorio, de avisar alsupervisor acerca de cualquier peligro que pueda surgir duran-te las actividades laborales y buscar atención médica inmedia-ta ante cualquier accidente potencialmente relacionado con eltrabajo.50

Se debe designar a una persona en el laboratorio como res-ponsable de la seguridad, cuyos deberes son verificar que losestándares de seguridad y las guías se encuentren escritas ypublicadas, informar a los empleados acerca de esos estándaresa través de cursos programados en forma regular sobre seguri-dad del laboratorio y de reuniones informativas del servicio, eimplementar un sistema en el lugar para controlar el cumpli-miento. El responsable de seguridad trabajará de manera estre-cha con la persona a cargo de la gestión de riesgos para recon-ciliar y corregir cualquier brecha en las conductas o irregulari-dad que se descubra.

NORMAS Y REGLAMENTACIONES GENERALES DE SEGURIDADSe les advierte a los trabajadores del laboratorio que no se

expongan a riesgos innecesarios. El descuido, la negligencia ylas prácticas inseguras pueden dar como resultado serios acci-dentes, no sólo para el individuo sino también para otros com-pañeros de trabajo y para los pacientes. A continuación se deta-llan consideraciones generales que harán que el trabajo en ellaboratorio de microbiología presente menor riesgo.73 Cadadirector de laboratorio es responsable de asegurar que las polí-ticas y los procedimientos del laboratorio estén de acuerdo conlos requerimientos legales (federal, estatal y local) y los están-dares de la buena práctica del laboratorio.

1. Cada empleado deberá ser instruido acerca de la ubicación yel manejo de todo el equipamiento y las instalaciones deseguridad, como mantas para incendio, extintores, duchas ylavabo para lavado ocular. Cada uno de éstos debe ser fácil-mente accesible en el laboratorio.

2. El equipo de protección personal (guantes de cirugía, bata,etc.) debe usarse cuando corresponda. Las batas debenusarse (con los botones abrochados) en todo momentomientras se está en el laboratorio y deben quitarse cuando selo abandona. Para algunas manipulaciones que pudierangenerar aerosoles infecciosos con patógenos importantes,como Mycobacterium tuberculosis, deben utilizarse másca-ras personales adaptables.

3. Los hábitos y el aseo personal deben estar pautados de ante-mano. El cabello largo debe estar recogido para que no obs-taculice el trabajo con el equipamiento o los reactivos. Laaplicación de cosméticos en el área de trabajo está prohibi-

da. Las sandalias y el calzado del tipo abierto no ofrecen laprotección adecuada al pie y por lo tanto, no son aceptables.Está prohibido fumar en el laboratorio. Los dedos, los lápi-ces y otros implementos no deben introducirse en la boca.No deben permitirse bromas ni payasadas.

4. Las lentes de contacto, en especial las de tipo blando, absor-ben ciertos solventes y pueden ser un peligro si ocurren sal-picaduras o derrames. Se aconseja a los empleados que nolas utilicen en el laboratorio o que usen anteojos de seguri-dad cuando trabajan con materiales cáusticos o infecciosos.

5. No se permite comer ni guardar alimentos o bebidas en ellaboratorio o en frigoríficos que se utilizan para muestras omateriales de laboratorio. Se debe designar específicamenteun frigorífico para guardar comida y bebidas.

6. Está absolutamente prohibido pipetear con la boca cualquiermaterial. Se cuenta con numerosos sistemas de ayuda parahacerlo.

7. El personal del laboratorio que tenga infecciones en la piel,infección respiratoria aguda u otras enfermedades contagio-sas debe evitar el contacto con los pacientes.

8. Es importante que los trabajadores del laboratorio conozcanlas características de todos los materiales en uso y, por lotanto, puedan tomar las precauciones adecuadas durante suutilización y su descarte. Se requiere que los fabricantesproporcionen estos detalles en las hojas de informaciónsobre la seguridad del material. Estas hojas deben estaraccesibles para todos los miembros del laboratorio.

9. Se deben colocar las etiquetas y los signos apropiados entodas las muestras o instrumentos y en todas las áreas dellaboratorio donde sea necesario para mantener un ambientede trabajo seguro.

10. En el cuadro 1-19 se resumen los tipos y los niveles de des-contaminación. Es importante que coincida el tipo dedesinfección o esterilización con el peligro biológico.18,19,119

PRECAUCIONES HABITUALES DE SEGURIDADCentrifugación

1. Antes de centrifugar algo, verifique que los tubos, el frascoampolla o las botellas no se rompan. Reemplace en formaperiódica los cojinetes de goma que se encuentran en elfondo de las camisas portatubos y elimine los vidrios rotosque puedan haberse acumulado.

2. Asegúrese de que la centrífuga se encuentre correctamentebalanceada antes de usarla. Verifique los anillos portacami-sas y las camisas portatubos para estar seguro de que lospesos coinciden.

3. Espere que la centrífuga se detenga por completo antes deabrir la tapa para retirar las muestras. Utilice sólo el dispo-sitivo de freno para lograr que la rotación se detenga enforma más rápida y completa.

4. Si se rompe un tubo en la centrífuga, primero apague el ins-trumento, espere al menos 20 minutos antes de abrir la tapay luego de colocarse una máscara y guantes, limpie comple-tamente y desinfecte el interior de la centrífuga.

5. Cada centrífuga debe limpiarse totalmente con el desinfec-tante adecuado al final del día, como parte del programa demantenimiento de rutina. Se debe realizar el mantenimientopreventivo de todas las partes de la centrífuga bajo un cro-nograma regular apropiado.

6. Si se centrifuga material potencialmente infeccioso, la mues-tra debe colocarse en un contenedor cerrado (tubos de cen-trífuga con tapa).



Agujas y material de vidrio

1. Deseche todo el material de vidrio astillado y roto en conte-nedores adecuados.

2. Levante los vidrios rotos con un cepillo y una pala; no utili-ce las manos.

3. Los artículos de vidrio no deben desecharse en el lavabo osueltos en un cubo de basura donde se arrojan papeles. Losvidrios pueden producir cortes en los dedos y las manos delas personas que los retiran. Deben colocarse en un conte-nedor diseñado para objetos cortantes.

4. Las agujas y las lancetas (punzantes) utilizadas deben colo-carse en los contenedores apropiados para agujas usadaspara poder descartarlas en forma segura. Estos contenedoresde objetos punzantes se deben controlar y cambiar periódi-camente para evitar su llenado excesivo.

5. Evite, en lo posible, sacar las agujas de las jeringas o cam-biar las agujas de las jeringas. La práctica de cambiar laaguja antes de inocular la sangre obtenida por venopuncióndentro de los frascos de hemocultivo ha sido abandonada enla mayoría de los hospitales.

Seguridad eléctrica

1. Todo el personal debe conocer la ubicación de los interrup-tores maestros y de los tableros de interrupción de los cir-cuitos. No intente reparar ningún instrumento mientras estéenchufado.

2. No se deben utilizar los enchufes o cables que estén rotos,deshilachados o gastados.

3. Los tomacorrientes no deben estar sobrecargados. Nunca uti-lice enchufes múltiples.

4. Todo cable o equipo eléctrico que se enchufe debe tenercable y enchufe con descarga a tierra. Todas las descargaseléctricas, aun las que causan hormigueos pequeños, debeninvestigarse de inmediato.

5. Los alargues deben utilizarse sólo si cumplen con todas laspolíticas y los procedimientos del hospital.

Precauciones en el corredor

1. Abra las puertas hacia el corredor con precaución. Debetenerse cuidado con las puertas vaivén. Si hay una ventanaen la puerta, mire hacia afuera para estar seguro de que elcorredor está libre antes de abrir la puerta.

2. Mantenga la derecha al acercarse a la intersección del corre-dor y al utilizar las escaleras. Camine, nunca corra en losvestíbulos, habitaciones y los huecos de las escaleras. Losespejos ubicados de manera apropiada proporcionan imáge-nes del posible tráfico en los corredores que se cruzan.

3. Tenga cuidado con la eventual presencia de objetos peligro-sos en el vestíbulo, como camas, carros o mesas, y con losobjetos que se encuentran en el suelo, como sujetapapeles,cables eléctricos, baldosas flojas y líquidos derramados. Sedebe utilizar sólo un lado del corredor para el almacena-miento temporal de un equipo móvil.

Levantamiento de objetos

1. Las lesiones de la espalda se encuentran entre las causas másfrecuentes de enfermedad debilitante entre el personal. Evi-


Cuadro 1-19 Tipos de descontaminación, desinfección y esterilización*

NIVEL

1

2

3

4

CATEGORÍA EPA/FDA

Desinfectante hospitalario

Desinfectante hospitalariocon actividad tuberculocida

Esterilizante/ desinfectante dealto nivel

Esterilización

EJEMPLO

Compuestos de amoniocuaternario

Compuestos de amoniocuaternario con alco-hol; fenoles; iodófo-ros; productos quecontienen cloro

Glutaraldehído; peróxi-do de hidrógeno

Óxido de etilieno; autoclave

CATEGORÍA CDC

Desinfectante de bajonivel

Desinfectante de nivelintermedio

Desinfectante de altonivel

Esterilización

TIPO DE ORGANISMOS

Bacterias vegetativas

Virus envueltos o de tamañomediano

Hongos

Virus no envueltos o detamaño pequeño

Micobacterias

Esporas bacterianas

Todos los agentes

EJEMPLOS

Especies de Staphylococcus

Especies de PseudomonasVirus de la inmunodeficiencia

humanaVirus del herpes simpleVirus de las hepatitis B y CCoronavirus

Especies de AspergillusEspecies de Candida

EnterovirusRinovirus


Especies de Bacillus

* Los agentes a cada nivel son eficaces también contra los organismos que matan a los agentes de un nivel inferior. Los priones requieren una consideración aparte; consúltese lareferencia.99 Adaptado de las referencias 18,19.


te levantar objetos pesados cuando sea posible. Siempre con-siga ayuda.

2. Si debe levantar objetos sin la ayuda de otra persona, tomelas siguientes precauciones:a. Estar bien afirmado. Mantener una distancia entre los pies

de alrededor de 25 cm.b. Doblar las rodillas para tomar el objeto.c. Mantener el objeto cerca del cuerpo y sostenerlo en forma

firme.d. Mantener los brazos y la espalda tan estirados como sea

posible y levantar el objeto hacia arriba estirando laspiernas.

Manipulación de muestras y derrames

1. Las muestras deben recolectarse en recipientes seguros conun tipo de cierre adecuado para evitar los derrames y las fil-traciones. Se deben tratar todas las muestras como si fueranpeligrosas.

2. Se deben cubrir las cortaduras en las manos con vendajesadhesivos adecuados. Utilice guantes desechables si la acti-vidad involucra el contacto con sangre, suero, plasma uotros líquidos o tejidos.

3. Si un contenedor presenta evidencia de rotura, filtración omancha, colóquese guantes y transfiera la mayor cantidadde muestra posible a un segundo recipiente estéril. Tambiéntranscriba cualquier información pertinente del viejo reci-piente al nuevo.

4. Las prescripciones que están contaminadas con sangre debenrechazarse. Manipúlelas sólo con guantes si su procesa-miento es necesario en una emergencia. Notifique al solici-tante que este tipo de materiales contaminados representanun peligro para la salud.

5. Lávese exhaustivamente las manos con agua y jabón variasveces por día, sobre todo después de manipular muestrasantes de salir para tomar alguna colación.

6. Los derrames se deben manejar según la naturaleza del mate-rial involucrado.

Manipulación de desechos y materiales peligrosos

1. Deje aparte en el laboratorio ciertos lavabos para el descar-te de muestras de sangre y orina. No se debe permitir ellavado de las manos en estos lavabos.

2. Las bolsas para materiales biológicos peligrosos (así rotu-ladas) deben utilizarse para descartar todas las muestraspotencialmente contaminadas, tubos con sangre, recipien-tes de muestras, pipetas, puntas de pipetas, recipientes dereacción, tapones y otro material de este tipo. Se debe dejarsuficiente espacio en la parte superior de modo tal que labolsa pueda cerrarse fácilmente y asegurarla con una bandaelástica. Es una buena práctica la utilización de doble bolsapara los desechos peligrosos.

3. Descarte el material de vidrio y punzante en los recipientesde pared rígida apropiados. Cuando estos recipientes se lle-nan, deben sellarse con cinta y colocarse en las cajas paradesechos rotuladas para su descarte correcto.

4. Retire las bolsas para materiales biológicos peligrosos lle-nas a las áreas de desechos designadas, en forma tan fre-cuente como sea necesario durante el día para evitar su acu-mulación.

5. Sumerja el material de vidrio no desechable contaminado ensoluciones desinfectantes. Enjuague con abundante agua ypóngalo en el autoclave antes de utilizarlo nuevamente.

6. Al final del día o después de un derrame se deben desinfec-tar las superficies de trabajo con un producto eficaz contralos agentes que pueden contaminar el sitio. Todo equipa-miento que se retire del laboratorio debe primero ser des-contaminado. Además, las cabinas de flujo laminar deseguridad biológica deben descontaminarse (debe hacerlopreferentemente un técnico acreditado en el cuidado de esteequipamiento) antes de realizar el mantenimiento o de cam-biar los filtros.

AGENTES BIOLÓGICOSClasificación de los agentes biológicos. Los CDC y el NationalInstitute of Health clasificaron los organismos infecciosos den-tro de grupos de riesgo,99 que se resumen en el cuadro 1-20. Eldocumento se puede obtener en la oficina de impresiones delgobierno o en el sito de Internet: (http//www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl4/bmbl4toc.htm). Contención física de los peligros biológicos. Las barreras físicaspara las infecciones en el laboratorio pueden clasificarse enpersonales o institucionales. Las barreras personales son lahigiene personal (p. ej., instalaciones separadas para los ali-mentos o para el lavado de manos) y el equipo de protección (p.ej., protectores contra salpicaduras, gafas, guantes, camisolinesy máscaras). Las barreras institucionales son estructurales (p.ej., instalaciones separadas, puertas y cerraduras) y tecnológi-cas (p. ej., manipulación y filtración del aire). Las cabinas deseguridad biológica (CSB) son un componente crítico en laprotección de los trabajadores. Es importante tener en cuentaque las CSB y las campanas para el manejo de los productosquímicos son diferentes. Es posible construir una CSB quepueda utilizarse como campana para el manejo de los produc-tos químicos, pero sólo ciertos tipos de CSB se aplican a esteuso. Las campanas para manejo de productos químicos nodeben utilizarse para la manipulación de agentes infecciosos.

En el cuadro 1-21 se resume la clasificación de las CSB y selas esquematiza en las figuras 1-21 a 1-25. La mayoría de loslaboratorios clínicos utilizan CSB de tipo II para procesar lasmuestras y trabajar con los aislamientos, en especial los quepresentan peligro de generación de aerosoles. Hoy es pococomún que se utilicen las CSB de tipo I, y las de tipo III no sue-len utilizarse en los laboratorios de diagnóstico. En las cabinasde clase II o III el aire se dirige, de un modo laminar, a través dela superficie de trabajo desde la parte superior de la cabina yreduce la contaminación de las muestras con agentes que for-man aerosoles. Estos dispositivos se denominan cabinas deflujo laminar de seguridad biológica. El flujo laminar haciaabajo también protege el área de trabajo del aire no filtrado quees empujado a través de la apertura frontal en las cabinas declase II; el aire que ingresa frontalmente es dirigido por el flujolaminar hacia el sumidero ubicado debajo del área de trabajodonde éste se filtra antes de confluir con el flujo laminar que sedesplaza hacia abajo.

Un técnico acreditado debe validar la velocidad del flujo delaire en las CSB de clases I y II al menos una vez por año ocuando se realiza algún trabajo de reparación. Además, la cabi-na debe ser descontaminada por un técnico acreditado antes deefectuar cualquier manipulación que comprometa un área con-taminada (p. ej., cambio de los filtros, reemplazo o reparaciónde los motores o traslado de la cabina).

Con respecto a los riesgos habituales de infecciones en los la-boratorios de diagnóstico, y a pesar de que la mayoría de losagentes que se encuentran en un laboratorio clínico puedencausar enfermedades a los trabajadores del laboratorio, sólo un



número relativamente pequeño de ellos las producen. Miller ycols.66 describieron una experiencia de 25 años con infeccioneshumanas adquiridas en el laboratorio en el National AnimalDisease Center (NADC) en Ames, Iowa, una institución dondese realizan investigaciones sobre enfermedades comunes delganado y de las aves de corral. El nivel de riesgo para los tra-bajadores es probablemente algo mayor que el promedio de loslaboratorios clínicos. Entre 1960 y 1985 se informaron alNADC 128 exposiciones en laboratorios a organismos zoonó-ticos; esto derivó en 34 infecciones asociadas con el laborato-rio. La brucelosis representó el 47% de los casos; la leptospi-

rosis, el 27%, y las micobacteriosis, un 9%. Las especies deSalmonella y de Chlamydias, el virus de la enfermedad de New-castle (un patógeno no humano) y las especies de Trichophytonrepresentaron las otras infecciones adquiridas informadas alNADC.

Las 10 infecciones adquiridas con mayor frecuencia en ellaboratorio que surgen a partir de estudios acumulados son:1) brucelosis, 2) fiebre-Q, 3) fiebre tifoidea, 4) tularemia, 5)tuberculosis, 6) tifus, 7) hepatitis infecciosa, 8) encefalitisequina venezolana, 9) coccidioidomicosis y 10) psitaco-sis.90,91,92,118 Algunas de estas infecciones son difíciles de evi-


Cuadro 1-20 Clasificación de los agentes biológicos según el riesgo*

NIVEL DE BIOSEGURIDAD

(BSL)

1

2

3

4

CLASES DE AGENTES

No se sabe que causeenfermedad regular-mente en adultossanos

Se asocia con enferme-dades en seres humanos

Peligro = lesión percu-tánea, ingestión o exposición de mucosas

Agentes endógenos oexóticos con poten-cial transmisión enaerosol

La enfermedad puedetener consecuenciasserias o letales

Agentes peligrosos oexóticos que presen-tan alto riesgo deenfermedades queponen en riesgo lavida, infecciones delaboratorio que setransmiten por aerosol

O agentes relacionadoscon un riesgo detransmisión desconocida

PRÁCTICAS

Prácticas microbiológi-cas estándares

BSL-1 más:• Acceso limitado• Signos de adverten-

cia de peligro bioló-gico

• Precauciones conobjetos punzo-cortantes

• Manual de bioseguri-dad que defina ladescontaminación delos residuos y lasprácticas de vigilan-cia médica

Prácticas BSL-2 más:• Acceso controlado• Descontaminación

de todos los residuos• Descontaminación de

la indumentaria delaboratorio antes deir a la lavandería

• Muestra de suero inicial

Prácticas BSL-3 más:• Cambio de indumen-

taria al ingresar• Ducha al salir• Todos los materiales

se descontaminancuando salen dellugar

EJEMPLOS DE LOS AGENTES

EnterobacteriaceaeEspecies de CandidaComplejo

Mycobacteriumavium

Virus del herpes simple

Mycobacteriumtuberculosis

Francisella tulerensisVirus del Nilo occi-

dental

Arenavirus que pro-ducen fiebre hemo-rrágica (p. ej.Lassa, Junín,Machupo)

Filovirus que produ-cen fiebre hemorrá-gica (p. ej.Marburg, Ébola)

EQUIPO DE SEGURIDAD

(BARRERAS PRIMARIAS)

No se requieren

CSB de clase I o II u otros dis-positivos de contención físicautilizados para todas lasmanipulaciones de los agen-tes que causan salpicaduras oaerosoles de materialesinfecciosos

EPP: guardapolvos, guantes, yprotección de la cara cuandose lo requiera

CSB de clase I o II u otros dis-positivos de contención físicautilizados para todas lasmanipulaciones de los agen-tes que causan salpicaduras oaerosoles de materialesinfecciosos

EPP: guardapolvos, guantes, yprotección de la cara cuandose lo requiera

Todos los procedimientos sellevan a cabo en una CSB declase III o en CSB de clase Io II combinado con un tajepersonal de presión positiva,con abastecimiento de aireque cubre el cuerpo por completo

INSTALACIONES (BARRERAS

SECUNDARIAS)

Se requiere una mesadaabierta con lavabo superior

BSL-1 más:• Disponibilidad de un

autoclave

BSL-2 más:• Separación física de los

corredores de acceso• Puertas de acceso dobles

que se cierran solas• El aire expelido no se

recircula• Flujo de aire negativo

dentro del laboratorio

BSL-3 más:• Edificio separado o zona

aislada• Emplea sistemas de abas-

tecimiento y expulsión deaire y de vacío y descon-taminación

• Otros requerimientos enu-merados en la referencia99

BSL: nivel de bioseguridad; CSB: cabina de seguridad biológica; EPP: equipo de protección personal.* Nivel de seguridad de muchos agentes cuando se realizan manipulaciones en las cuales sería razonable esperar que se generen aerosoles o cuando se emplean grandes volúmenesde materiales. Para algunos agentes de nivel 2 se indica un nivel superior cuando se manipulan cultivos que se sabe que contienen al agente. Se utiliza una clasificación separadapara los agentes que infectan, en forma natural o experimental, a animales. Adaptado de la referencia99.


tar, aunque el objetivo debe ser siempre cero infecciones. Sinembargo, en algunas circunstancias no es difícil visualizar losmedios para evitar las infecciones, al menos en retrospectiva.Por ejemplo, un estudiante de auxiliar médico contrajo fiebretifoidea con complicaciones luego de trabajar con Salmonellatyphi como un microorganismo desconocido.44 Aún peor, el22% de los auxiliares de laboratorio presentaron gastroenteri-tis por Shigella sonnei. La tipificación de los aislamientosreveló que todas las cepas eran idénticas a una que se le habíadado a un estudiante como desconocida.64 Algunos agentesque no debieran encontrarse en un laboratorio clínico a vecespueden causar infecciones en los investigadores22,43,4 cuandose realizan manipulaciones que producen aerosoles sin la con-tención adecuada.

PRECAUCIONES UNIVERSALESIrónicamente, los trabajadores del laboratorio tiene un ries-

go mucho menor de infectarse que sus colegas médicos.Numerosas razones explican este fenómeno. Los pacientesestornudan y tosen; las placas de cultivo, no. A menos que enel laboratorio se realicen procedimientos que generen grandescantidades de aerosoles, el riesgo para los trabajadores es bas-tante bajo. Los médicos y los enfermeros utilizan con mayorfrecuencia objetos cortopunzantes, como instrumentos y agu-jas. En la medicina moderna los mayores riesgos infecciososson los patógenos transmitidos por la sangre. Una vez más, esirónico que los microbiólogos tengan menor riesgo que suscolegas de otras áreas del laboratorio, como química y hema-tología, donde diariamente se procesan numerosas muestrasde sangre. Las infecciones de laboratorio más importantes son

las producidas por el virus de la inmunodeficiencia humana(HIV), el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C. Enla mayoría de los hospitales, el virus de la hepatitis C es el másprevalente, debido a que se cuenta con una vacuna eficaz con-tra el virus de la hepatitis B y a que la incidencia de HIV en lapoblación general es baja. Es importante que se cuente conuna vacuna eficaz contra el virus de la hepatitis B, porque elriesgo de un trabajador no inmunizado de contraer esta infec-ción es mucho mayor que la de adquirir una infección por elvirus de la hepatitis C o el HIV.

Los CDC,14-17 el CLSI79 y los trabajadores de los laborato-rios8 han establecido recomendaciones para reducir al mínimolas infecciones transmitidas por vía sanguínea.

En el cuadro 1-22 se resumen los riesgos de contraer losprincipales patógenos transmitidos por esa vía.17

Como casi nunca es posible predecir quiénes son los indivi-duos que pueden ser fuente de riesgo, surgió el concepto deprecauciones universales. Esto significa que cada muestra seconsidera de riesgo. La especificación de que algunas muestrasson riesgosas incrementa la posibilidad de que se genere unafalsa sensación de seguridad.

Los CDC y el OSHA han establecido las siguientes precau-ciones universales:12

1. La sangre y los líquidos corporales de todos los pacientesdeben ser manipulados como materiales infecciosos. Todoslos pacientes deben presumirse como infectados por HIV ypor otros patógenos de transmisión sanguínea.

2. Todas las muestras de sangre y los líquidos corporales debencolocarse en un recipiente adecuado, con una tapa segurapara evitar el derrame durante el transporte.


Cuadro 1-21 Comparación de las cabinas de seguridad biológica

TIPO

Clase IFrente abierto

Clase IITipo A

Clase IITipo B1

Clase IITipo B2

Clase IITipo B3

Clase III

VELOCIDAD EN LA APERTURA

FRONTAL

24 (75)

24 (75)

330 (100)

330 (100)

330 (100)

ND

RADIONÚCLIDOS/QUÍMICOS TÓXICOS

No

No

Sí (bajos niveles/volati-lidad)

Sí

Sí

Sí

PATRÓN DEL FLUJO DE AIRE

Entrada frontal; parte posterior y arriba através de filtro de alta eficiencia (HEPA)(fig. 1-21)

70% de recirculación a través de filtroHEPA; expelido a través de filtro HEPA(fig. 1-22)

30% de recirculación a través de filtroHEPA; expelido por medio de filtro HEPAy conductos rígidos (fig. 1-23)

Sin recirculación; expelido total por mediode filtro HEPA y conductos rígidos (fig. 1-24)

El mismo que IIA, pero el aire expelido seelimina a través de un espacio de presiónnegativa y se lleva por conductos al exterior

Provisto de conexiones de entrada y expeli-do de aire a través de dos filtros HEPA(fig. 1-25)

NIVELES DE BIOSEGURIDAD

2, 3

2, 3

2, 3

2, 3

2, 3

3, 4

PROTECCIÓN DE PRODUCTOS

(MUESTRAS)

No

Sí

Sí

Sí

Sí

Sí

Tomado de la referencia99.


3. Todas las personas que procesan muestras de sangre y líqui-dos corporales (p. ej., quienes quitan las tapas de los tuboscon vacío) deben utilizar guantes y protección facial (más-cara, antiparras o gafas), si se espera que la sangre o loslíquidos corporales salpiquen.

4. Los trabajadores deben cambiarse los guantes y lavarse lasmanos cuando concluyen con el procesamiento de las mues-tras.

5. Los trabajadores nunca deben pipetear con la boca; debenutilizar dispositivos mecánicos.

6. La utilización de agujas y jeringas debe limitarse a las situa-ciones en las cuales no existe otra alternativa.

7. Las superficies de trabajo del laboratorio deben descontami-narse con las sustancias químicas germicidas apropiadasluego de un derrame de sangre u otros líquidos corporales ycuando se ha concluido con las tareas.

8. Los materiales de trabajo que se utilizan en las pruebas delaboratorio deben descontaminarse antes de ser reutilizadoso colocarse en bolsas para ser desechados de acuerdo conlas políticas institucionales.

9. Todas las personas deben lavarse las manos al finalizar lasactividades del laboratorio y quitarse la vestimenta de pro-tección antes de abandonar el lugar.

Las recomendaciones para el tratamiento de las exposicionesvarían según el agente; los CDC las revisan regularmente y las

modifican si es necesario. En general, el paciente del cual seobtuvo la muestra debe ser estudiado para determinar si existealgún riesgo, mientras que al trabajador accidentado se lo debeestudiar a lo largo del tiempo para establecer si se infectó. Enciertas situaciones es apropiada una inmunización posterior ala exposición o quimioterapia antiviral profiláctica. Cabe des-tacar que se debe prestar principal atención a la prevención, demodo que el problema de un accidente nunca se presente. Laprevención puede realizarse por medio de la inmunización delpersonal en riesgo y de la reducción de la exposición a los ele-mentos cortopunzantes (agujas, hojas de bisturí, vidrios rotos,etc.), que son las fuentes más comunes de accidentes.Limpieza de los derrames de materiales infecciosos. El protoco-lo recomendado para la limpieza de los materiales infeccio-sos es:79

1. Utilizar guantes (preferentemente guantes gruesos, resis-tentes a las pinchaduras), camisolines y máscaras.

2. Si existen fragmentos de vidrio u otros objetos, deben eli-minarse sin tocarlos en forma directa.

3. Utilizar protectores de calzado impermeables al agua si elderrame es grande.


Aire ambiente

Aire potencialmente contaminado

Aire filtrado a través de HEPA

Vista lateral

A

B

C

D

Figura 1-21 Diseño de una cabina de seguridad biológica de clase I. Estascabinas de presión negativa toman aire del ambiente hacia la cabina a una velo-cidad de 24 m/min (75 pies lineales por minuto) y eliminan el aire a través deun filtro HEPA hacia el ambiente o hacia el exterior por medio de un conduc-to. No protege la muestra de la contaminación con el material presente en elaire ambiente. Puede utilizarse para sustancias químicas tóxicas o radiológicassólo si ventilan hacia el exterior. Adaptada de la referencia99.

Aire ambiente

Aire potencialmente contaminado


Vista lateral

A

C

D

E

F

B

Figura 1-22 Diseño de una cabina de seguridad biológica de clase II A. Estascabinas toman aire del ambiente hacia la cabina a través de su abertura frontal(A), usualmente a una velocidad de 24 m/min (75 pies lineales por minuto).Luego éste circula por un compartimento (D) y a través de un filtro HEPA, unaparte del aire, por lo general el 70%, circula por el lugar de trabajo; el aireremanente se elimina a través de un filtro HEPA (C) hacia el ambiente. Si elaire remanente se elimina a través de un espacio de presión negativa hacia elexterior del edificio, la cabina se clasifica como de clase II B3. El trabajopuede verse a través de un visor de vidrio (B). Adaptada de la referencia99.



G

H

F

E

D

C

B

A

Vista lateral Vista frontal

Aire ambiente

Aire contaminado


Figura 1-23 Diseño de una cabina de seguridad biológica de clase II B1. Estas cabinas toman aire del ambiente hacia la cabina a través de su abertura frontal auna velocidad de 330 m/min (100 pies lineales por minuto). Luego circula (por lo general el 30%) a través de un sumidero (A) y por el compartimento (D), pasan-do a través de los filtros HEPA (B y E) antes de ser expelido (G), a través de un filtro HEPA (F), dentro de los conductos con presión negativa hacia el exterior.Debido a la mínima recirculación se pueden utilizar cantidades limitadas de sustancias químicas de bajo nivel y agentes biológicos. El trabajo puede verse a travésde un visor de vidrio (C). Adaptada de la referencia99.

G

E

D

C

B

A

Vista lateral Vista frontal

Aire ambiente

Aire potencialmentecontaminado


Figura 1-24 Diseño de una cabina de seguridad biológica de clase II B2. Estas cabinas toman aire del ambiente hacia la cabina a través de su abertura frontal (A)y el aire es llevado al compartimento (E) de la cabina antes de eliminarlo al exterior a través de un filtro HEPA (C) y un sistema de conductos con presión negati-va. En forma simultánea el aire del ambiente ingresa en la cabina a través de una segunda entrada (F) y un filtro HEPA (D), luego de lo cual el aire pasa hacia abajoa través del área de trabajo y luego se junta con la corriente del flujo de salida en el compartimento (E) de la cabina. El trabajo puede verse a través de un visor devidrio (B). Se pueden utilizar sustancias químicas tóxicas en esta cabina en la que no recircula el aire. Adaptada de la referencia99.


4. Cubrir el derrame con material absorbente y agregar undesinfectante concentrado. Luego de esperar 10 minutos,proceder a la limpieza.

5. Si se hubieran generado aerosoles, por ejemplo, de un tubode centrífuga roto, apagar la centrífuga, pero dejarla cerra-da al menos por 30 minutos para permitir que los aeroso-les se asienten.

6. Absorber la mayor cantidad del derrame con materialesdesechables antes de proceder a la desinfección.

7. Limpiar el sitio de derrame de todos los materiales visi-blemente contaminantes con una solución acuosa de deter-gente o con una solución de blanqueador al 10%.

8. Descontaminar el sitio con un desinfectante apropiado(véase cuadro 1-19).

9. Absorber el material desinfectante y enjuagar el sitio conagua. Finalmente, secar para evitar resbalarse.

10. Desechar todos los materiales en un recipiente para obje-tos biológicos peligrosos.

Si se derramó un agente que requiere medidas de bioseguri-dad de nivel 3 (BSL-3) fuera de la cabina de seguridad bioló-gica, evacuar el área durante al menos 60 minutos y notificar alas autoridades correspondientes.


E

D

CC

B

A

Vista lateralVista frontal

Aire ambiente

Aire potencialmentecontaminado


Figura 1-25 Diseño de una cabina de seguridad biológica de clase III. Esta cabina funciona como una caja con guantes totalmente cerrada con recirculación deaire. Los agentes peligrosos están contenidos dentro de la caja, de manera que el operador no está expuesto. El mismo efecto se puede lograr si se utiliza una cabinade clase II junto con un traje de seguridad biológica conectado a una fuente de aire para el operador, quien virtualmente queda dentro de la cabina. El aire ingresa através de una entrada y un filtro HEPA (D) antes de ser expelido a través de un filtro HEPA dentro de un sistema de conductos de presión negativa y al ambienteexterior. El operador manipula las muestras dentro de la caja a través de un enclavamiento (E). La desventaja de este diseño es la dificultad de realizar manipula-ciones finas con guantes gruesos de goma, pero los costosos sistemas de “traje espacial” para la protección del operador no son esenciales. Adaptada de la referen-cia99.

Cuadro 1-22 Riesgos de contraer ciertas infecciones virales transmitidas por vía sanguínea luego de la exposición a la sangre porpunción con una aguja*

VIRUS

Hepatitis B

Hepatitis C

HIV

ESTADO DEL PACIENTE FUENTE DE LA MUESTRA SANGUÍNEA

Positivo para HBsAg y HBeAg

Positivo para HBsAg y negativo para HBeAg

Seropositivo

Seropositivo

CONSECUENCIA

Hepatitis clínica

Hepatitis clínica

Seroconversión

Seroconversión

Seroconversión

RIESGO

22-31%

1-6%

23-37%

0-7%

0,3%

* El riesgo luego del contacto de la sangre con las mucosas no está bien definido, pero es menor que luego de la punción con una aguja.Datos tomados de la referencia17.


ENVÍO DE MUESTRAS Y DE AGENTES ETIOLÓGICOSTodas las muestras microbiológicas que deban transportarse

a través del correo de los Estados Unidos deben embalarse bajoestrictas reglamentaciones especificadas por el Departamentode Transporte (DOT) y la International Air Transport Associa-tion (IATA). Los organismos aislados (agentes etiológicos) queno sean de nivel de bioseguridad I (véase cuadro 1-20) y lasmuestras para diagnóstico, las cuales se espera razonablemen-te que contengan agentes etiológicos, deben embalarse y rotu-larse en forma apropiada.

Las muestras se deben preparar para que soporten choques ocambios de presión que puedan tener lugar durante la manipu-lación y ocasionar el derrame del contenido. Un recipiente conuna filtración no sólo predispone a la muestra a una posiblecontaminación, sino que puede también exponer a quienes lomanipulan y al personal de recepción a agentes patógenos. Enla figura 1-26 se ilustra el embalaje y el rótulo adecuados de losagentes etiológicos. El recipiente primario (tubo para el análi-sis, frasco ampolla) debe estar tapado con una tapa hermética yrodeado por suficiente material de embalaje para absorber loslíquidos en caso de que ocurra una filtración. A su vez, se lodebe colocar en un recipiente secundario hermético, preferen-temente de metal y con tapa de rosca. Los recipientes primarioy secundario se colocan luego en una caja externa de embalaje

de tableros de fibra, cartón corrugado o poliestireno. El hieloseco se considera material peligroso. Una caja de cartón paraenvío que contiene hielo seco como refrigerante de una mues-tra, debe rotularse “MUESTRA MÉDICA CONGELADACON HIELO SECO”. El embalaje debe hacerse de tal mane-ra que pueda escaparse el dióxido de carbono gaseoso para evi-tar la acumulación de presión que pueda ocasionar la rotura delrecipiente. El hielo seco debe ubicarse afuera del recipientesecundario junto con un material que amortigüe los golpes paraque el segundo recipiente no quede suelto dentro del recipien-te externo a medida que el hielo seco se sublima.

Además de la etiqueta con la dirección, el recipiente externodebe tener pegada una etiqueta que indique los agentes etioló-gicos/materiales biomédicos (con su logotipo en rojo contrafondo blanco) y también una advertencia para el transportador,como se muestra en la figura 1-27.

PELIGROS NO BIOLÓGICOSSustancias químicas

1. Debe realizarse un plan de higiene químico para el labora-torio.73 Se encuentran disponibles las guías para el trata-miento de los desechos del laboratorio.83


Recipienteprimario

que contiene el cultivo

Material de embalaje absorbente

Recipiente secundario

Registro de la muestra (HSM 3 203)

Recipiente de envío

Etiqueta EA

Etiqueta de dirección

Cinta resistente

al agua

Cultivo

Material de embalaje absorbente

SECCIÓN TRANSVERSAL DE UN EMBALAJE APROPIADO

Tapa

Tapa

Figura 1-26 Técnica adecuada para embalar materiales con peligro biológico.


2. Punto de inflamabilidad: las sustancias combustibles voláti-les liberan vapores sobre la superficie del líquido. El puntode inflamabilidad es la temperatura más baja posible a lacual se produce una suficiente concentración de vaporespara que se enciendan. Las sustancias volátiles se conocenen forma conjunta como inflamables. La clasificación basa-da en el punto de inflamabilidad y el punto de ebullición es:a. Inflamables

1) Clase IA: punto de inflamabilidad, < 22 °C; punto deebullición, < 38 °C

2) Clase IB: punto de inflamabilidad, < 22 °C; punto deebullición, > 38 °C

3) Clase IC: punto de inflamabilidad, > 21 °C; punto deebullición, < 38 °C

b. Combustibles1) Clase IIIA: punto de inflamabilidad, > 60 C y < 94 °C2) Clase IIIB: punto de inflamabilidad, > 94 °CEn el laboratorio de microbiología se pueden encontrar

diversos materiales combustibles, aunque no en las canti-dades que se utilizan en algunas otras áreas. Un peligroparticular es el dietil éter, que puede formar peróxidosexplosivos luego de su exposición al aire. El éter se utilizaen algunos procedimientos de concentración de parásitos.Hoy se dispone de otras alternativas a este procedimientopara evitar tal peligro. Si es necesario utilizar éter, debealmacenarse en la menor cantidad posible y de maneraadecuada.

3. Las sustancias químicas corrosivas se definen como agentesque tienen un pH < 2,1 o > 12,5 o que pueden corroer elacero (SAE1020) más de 0,6 cm por año a una temperaturade 54,4 °C. En el laboratorio, los corrosivos más comunesson los ácidos fuertes, como el ácido clorhídrico. Se debenutilizar transportadores de botellas que contienen ácidosconcentrados en cantidades mayores de 500 mL.

4. Las sustancias químicas incompatibles (identificadas de esemodo en las hojas de información sobre la seguridad delmaterial) no deben utilizarse o almacenarse juntas.

5. Las latas y cabinas de almacenamiento seguro deben ubicar-se lejos de las fuentes de calor, llama, chispas y salidas. Lasáreas de almacenamiento deben estar ventiladas en formaadecuada y ser de acceso limitado al personal.

6. Todos los recipientes deben estar claramente rotulados con:a. Contenidob. Advertencias de peligroc. Precauciones especialesd. Fecha de recibido/preparadoe. Fecha de apertura/puesta en usof. Fecha de vencimientog. Fabricante

7. En caso del derrame de una sustancia química líquida:83,73

a. Determinar la naturaleza del peligro, si es necesario con-sultar la hoja de información sobre la seguridad del mate-rial. Si el derrame es una emergencia evacuar el área. Siel material presenta peligro de encenderse, eliminar todaslas fuentes de ignición.

b. Notificar al personal apropiado y obtener más ayuda sifuera necesario. Identificar cualquier necesidad de dispo-sitivos de protección personal.

c. Confinar el derrame en un área lo más pequeña posible.d. Neutralizar los ácidos con carbonato disódico. Neutralizar

los álcalis con ácido bórico al 1%. Para grandes cantida-des de ácidos o bases enjuagar con abundante agua luegode la neutralización.

e. Limpiar cualquier área salpicada por el derrame.

f. Para derrames de líquidos inflamables y tóxicos, utilizarabsorbentes para reducir la presión de vapor y evitar laignición del líquido.

8. Desecho de las sustancias químicas:a. Utilizar guantes de goma, delantal de goma y gafas.b. Eliminar todos los objetos presentes en el lavabo desig-

nado para descarte. Dejar correr agua fría de modo queno salpique dentro del lavabo.

c. Verter lentamente el líquido lo más cerca como sea posi-ble del drenaje, sin salpicar. Sólo se pueden descartar enel drenaje del lavabo cantidades menores de 500 mL.

d. Luego de finalizar el descarte, dejar que continúe corrien-do agua limpia durante varios minutos.

e. Descartar los solventes orgánicos solubles en agua (meta-nol, acetona) como ya se describió. Para los líquidos orgá-nicos insolubles, sólo se pueden descartar de esta formacantidades menores de 100 mL. Para cantidades mayores,se debe consultar con la oficina de seguridad del hospitalo con la oficina de seguridad y salud ambiental local.

9. Peligros radiactivos: en el pasado, los laboratorios utiliza-ban sustancias radiactivas, en especial, para los inmunoa-nálisis. Estos procedimientos han sido reemplazados casipor completo por los enzimoinmunoanálisis. Si en el labo-ratorio se utiliza algún material radiactivo, se deben seguirlas reglamentaciones apropiadas de manera estricta. Casisiempre hay un oficial de seguridad institucional para losmateriales radiactivos, a menudo en el Departamento deRadiología.

10. Carcinógenos: se debe prestar especial atención a los temasde seguridad para este tipo de sustancias químicas que seha demostrado que tienen cierto potencial neoplásico, a


Disposiciones previas requeridas por el IATASe realizaron las reglamentaciones para mercancías peligrosas 1.3.3.1

Sustancia infecciosa, que afecta a seres humanos ( ), UN2814Cantidad neta: ( )

SUSTANCIA INFECCIOSAEN CASO DE DAÑO O FILTRACIÓN NOTIFÍQUESE

INMEDIATAMENTE A LAS AUTORIDADES

DE SALUD PÚBLICA

EN USA NOTIFÍQUESE

AL DIRECTOR DEL CDC

ATLANTA, GA

800/232-0124

6

Figura 1-27 Logotipo del agente etiológico y “aviso al transportador” quedebe colocarse en el exterior de cualquier paquete que contenga materialespeligrosos o infecciosos.


veces sólo en animales de laboratorio. En el laboratorio demicrobiología, el compuesto que más probablemente seencuentra en esta categoría es el formaldehído. La formali-na es una solución estabilizada comercial de formaldehído,utilizada como solución al 10% en buffer (4% formaldehí-do). El formaldehído es combustible y un carcinógenopotencial. Las reglamentaciones locales para el almacena-miento, uso y desecho del formaldehído difieren. El área detrabajo debe estar bien ventilada; se debe utilizar preferen-temente una campana de escape para sustancias químicas.El College of American Pathologists exige el control de losvapores de formaldehído en el área de trabajo; si se en-cuentran niveles aceptables, no se necesita repetir la prue-ba, a menos que cambien las condiciones.

11. Mercurio: el mercurio elemental es un importante peligropara la salud. En el laboratorio de microbiología se loencuentra en los termómetros y en algunos reactivos fija-dores para los frotis de parasitología. A pesar de que sólose hallan involucradas pequeñas cantidades, muchas insti-tuciones han elegido, de manera voluntaria o debido a leyeslocales, eliminarlo por completo.

Incendios

1. Cada empleado del hospital es responsable de evitar losincendios y de ayudar a reducir al mínimo los siniestros quelos ocasionan.

2. Mantener las áreas de trabajo libres de basura acumulada yde materiales inflamables. Los corredores, los pasillos y lasescaleras deben mantenerse sin obstrucciones que puedanimpedir la salida o agregar combustible a un incendio.

3. Conocer las fuentes de ignición, las llamas abiertas, los ele-mentos de calor y los generadores de chispas (motores, inte-rruptores de luz, fricción y estática). Más del 22% de losincendios de los hospitales son causados por instalacioneseléctricas defectuosas.

4. El personal debe estar instruido acerca de las diferencias y eluso de los extintores para las cuatro clases de incendios:

a. Clase A: incendios que involucran materiales combustiblesordinarios, como madera, papel, tela y plásticos; utilizarun extintor de agua a presión (tipo A).

b. Clase B: incendios que involucran líquidos inflamables,como alcohol, nafta, querosén y grasa; utilizar un extintorde dióxido de carbono (tipo B).

c. Clase C: incendios que involucran equipos eléctricos enlos cuales puede existir peligro de electrocutarse debido ala conductividad eléctrica; no utilizar nunca un extintor deagua; utilizar un extintor de sustancias químicas secas(tipo C).

d. Clase D: incendios que involucran metales combustiblescomo magnesio y potasio. Se requieren técnicas especia-les. Llamar de inmediato a la estación de bomberos local.

5. Las mantas para incendios se utilizan para sofocar la vesti-menta incendiada, envolviendo a la víctima con ellas. Si lavestimenta se incendia, deberá ser arrojada al piso y apisona-da para sofocar el fuego contra el piso. No corra en busca deuna manta; la corriente de aire sólo ventilará las llamas ydará como resultado un accidente más serio. De manerasimilar, una manta para incendios debe utilizarse con la víc-tima sobre el piso; envolver a la persona parada con unamanta sólo creará una chimenea para las llamas.

6. Cumpla con todas las reglamentaciones locales para losincendios. Participe en los simulacros periódicos que se rea-lizan en el hospital. Cada empleado debe conocer el proce-

dimiento del simulacro de incendio y la ruta de evacuaciónde su área del laboratorio.

Bioterrorismo

La probabilidad de que los terroristas utilicen agentes quí-micos, biológicos o radiactivos ha sido real durante muchosaños, pero adquirió un nuevo significado luego de: 1) la trage-dia en el World Trade Center y 2) el descubrimiento de cartasenviadas a través del servicio postal que contenían esporas deántrax. En la actualidad se requiere que todos los laboratorioslimiten ciertos agentes a un uso absolutamente esencial y quele proporcione al gobierno un inventario de ellos. Además, cadalaboratorio debe preparar un plan de contención para ocuparsedel bioterrorismo. Muy pocos laboratorios de diagnóstico tie-nen a mano alguno de estos agentes seleccionados (véaserecuadro 1-23). La responsabilidad principal de ocuparse de lamayoría de estos microorganismos recae sobre los laboratoriosde referencia, los laboratorios de salud pública y otros labora-torios del gobierno. El principal trabajo de un laboratorio diag-nóstico es reconocer la posibilidad de estar ante uno de estosagentes mencionados durante el procedimiento normal de ruti-na al realizar su tarea; luego se lo envía a una dependencia deapoyo designada y se notifica a las autoridades correspondien-tes. Si se sospecha terrorismo, la investigación tomará carácterdelictivo. En el cuadro 1-23 se resumen las categorías de losposibles agentes de bioterrorismo.13

En los Estados Unidos, el plan nacional de preparación parael terrorismo contempla una categorización de los laboratoriosen niveles múltiples con una responsabilidad gradual para eva-luar las posibles amenazas. La clasificación de los laboratoriosse detalla en el cuadro 1-24. Las cuatro categorías originales secompendiaron en tres.13

Aseguramiento de la calidad

El sello de los buenos laboratorios clínicos es prestar cons-tante atención a la calidad del trabajo. El aseguramiento de lacalidad es el amplio paraguas que cubre muchas actividades. Aveces, parece que los nombres de los programas cambian contanta frecuencia como los de las bacterias. Las denominacionesde mejoramiento de la calidad o mejoramiento total de la cali-dad han dado paso al aseguramiento de la calidad, pero entodos los casos el mensaje básico es que los microbiólogosdeben mirar constantemente lo que están haciendo y mejorarlos procesos. El control de la calidad es un procedimiento tra-dicional y se analizará por separado.

El aseguramiento de la calidad puede lograrse en formainterna o realizarse como parte de un programa externo. Seencuentran disponibles las guías nacionales de consenso.84,77

Debe comprender todas las fases del ciclo de diagnóstico.84

En la sección de acreditación del laboratorio se discutenmuchas de las características de un programa de aseguramien-to de la calidad, que incluye los programas de calidad como unaspecto crítico. Las actividades internas abarcan la documenta-ción del desempeño clínico de las ensayos (que deberá reali-zarse para cada prueba nueva que se introduzca en el laborato-rio) o la documentación de la utilización del laboratorio porparte de los médicos. Se debe documentar el desempeño delpersonal técnico en cada tarea de la que son responsables. Sedebe evaluar la equivalencia de las observaciones morfológicasentre los técnicos que realizan las mismas tareas. Se requiere laevaluación formal de las competencias de todo el personal querealiza las pruebas de laboratorio (incluidos los enfermeros y



los médicos) para todos los ensayos que no sean de exención.El examen puede ser de diferentes maneras: observación direc-ta, exámenes escritos o pruebas “de campo” utilizando mues-tras del laboratorio. Se han publicado las guías de consensonacional para implementar estos programas.86

La evaluación del desempeño del laboratorio se puede mejo-rar comparando el desempeño propio con el de los paresmediante un programa externo. El College of AmericanPathologists ofrece dos programas de este tipo.122,102 El pará-metro que se elige para la evaluación se denomina indicador.

El primer programa, llamado Q-Probes, consiste en estudiostransversales sobre un tema en particular, como la frecuenciaen la que un microorganismo propio de la piel se halla en loshemocultivos. Cada laboratorio participante envía sus resulta-dos del estudio que se han realizado de acuerdo con un proto-colo definido. Estos resultados se analizan con cuidado y seelabora un informe que se entrega a todos los laboratorios par-ticipantes.

Por el contrario, el programa de Q-tracks es el control reite-rado de un número limitado de indicadores definidos como úti-les para establecer el desempeño de un laboratorio. Por ejem-plo, el tiempo global de respuesta de un laboratorio para undeterminado analito puede analizarse a lo largo del tiempo. Porlo tanto, es posible graficar el desempeño en relación con suspares.

Como ya se dijo, un laboratorio puede también evaluar sudesempeño en comparación con el de sus pares a través de la

participación en los ensayos de aptitud.78,109 En un comienzo, elCollege of American Pathologists proporcionaba estos ensayoscomo una herramienta de educación para el mejoramiento deldesempeño de los laboratorios. Luego de la reglamentación delas dos leyes de CLIA, pasaron a ser una parte obligatoria parael funcionamiento del laboratorio.

Control de calidad

El control de calidad en un sentido estricto consiste en laevaluación continua y sistemática del trabajo para asegurar queel producto final se encuentra conforme a los límites de preci-sión y de exactitud tolerados previamente establecidos.3 Losdirectores y supervisores de los laboratorios actuales debendarse cuenta de que el control de calidad es sólo una faceta delamplio terreno del aseguramiento de la calidad. Los interesa-dos pueden acceder a los requerimientos del College of Ame-rican Pathologists para el control de calidad (y también para laseguridad y otros temas importantes dentro de la gestión de la-boratorios) obteniendo la Lista de Comprobación General deLaboratorios del sitio de Internet del College of AmericanPathologists (http//www.cap.org).

El control de calidad en microbiología es más un arte queuna ciencia; involucra elementos intangibles, como el sentidocomún, el buen criterio y la atención constante a los detalles.Los programas se deben organizar teniendo en cuenta objetivosbien definidos.


Cuadro 1-23 Clasificación de los agentes biológicos y químicos con potencial para terrorismo

CATEGORÍA DEL AGENTE

Categoría A

Categoría B

Categoría C

DESCRIPCIÓN DE LA CATEGORÍA

• Fácilmente diseminado o transmitido persona a persona• Causa alta mortalidad con potencialidad para un gran

impacto en la salud pública• Puede causar pánico público y alteración social Y• Requiere especial acción para la preparación de la salud

pública

• Moderadamente fácil de diseminar• Moderada morbilidad y baja mortalidad• Requieren un incremento en la vigilancia de enfermedades

Agentes emergentes con:• Disponibilidad• De fácil producción y diseminación• Potencial de alta morbilidad, mortalidad e impacto en la

salud pública

EJEMPLOS

• Viruela (virus de la viruela)• Bacillus antracis (carbunco)• Yersinia pestis (peste)• Toxina de Clostridium botulinum (botulismo)• Francisella tularensis (tularemia)• Filovirus (virus Marburg y virus Ébola)• Arenavirus causantes de fiebre hemorrágica

• Coxiella burnetii (fiebre Q)• Especies de Brucella (brucelosis)• Burkholderia mallei (muermo)• Alfavirus (p. ej., virus de la encefalomielitis del Este

y del Oeste)• Toxina ricina de Ricinus communis (semilla de ricino)• Toxina ε de Clostridium perfringens• Enterotoxina B de estafilococos• Especies de Salmonella• Shigella dysenteriae• Escherichia coli (O157:H7)• Vibrio cholerae• Cryptosporidium parvum

• Virus Nipha• Hantavirus• Virus de la fiebre hemorrágica transmitida por garrapatas • Virus de la encefalitis transmitida por garrapatas• Virus de la fiebre amarilla• Mycobacterium tuberculosis multirresistente

Adaptado de la referencia13.


COMPONENTES DE UN PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDADUn programa básico de control de calidad para microbiolo-

gía enumera varios elementos específicos que se deben consi-derar al implementar las diversas fases de un programa.Bartlett5 ideó y analizó diferentes niveles de actividades, quecomprenden desde las más básicas hasta las más avanzadas.Utilizando su esquema, un supervisor puede seleccionar elnivel de actividad que es apropiado para el personal y el volu-men de trabajo en un laboratorio determinado.

La comisión de acreditación e inspección de los laboratoriosdel College of American Pathologists (CAP) ha establecido losestándares para la acreditación de los laboratorios clínicos,entre ellos una lista de comprobación para la inspección de loslaboratorios de microbiología. Esta lista le brinda a los super-visores una valiosa guía para realizar la evaluación punto porpunto de las necesidades de control de calidad. Las reglamen-taciones estatales de la CLIA ’88 incluyen muchos de estosrequerimientos.

Las reglamentaciones están en constante revisión y puedenser modificadas. Por ejemplo, en enero de 2004, el CMS publi-có la modificación a las reglamentaciones sobre “control decalidad equivalente”. Esta modificación permite reducir la fre-cuencia de ciertas tareas de control de calidad luego de la vali-dación de un laboratorio que ha cumplido con un criterio defi-nido. Algunos de los cambios son más exigentes que los quesolicitan algunas calificadas agencias de acreditación, como elCAP; otros lo son menos. Por ley, las agencias calificadasdeben tener estándares que son al menos tan exigentes como elCMS, pero sus estándares pueden serlo aún más.

En un comienzo, se debe seleccionar un coordinador decontrol de calidad. Se deben establecer con claridad las obli-gaciones del coordinador y conferirle la autoridad apropiadapara que pueda tratar en forma eficiente los problemas cuandoéstos surjan. Es responsabilidad del coordinador establecer losestándares mínimos de control de calidad que el laboratoriodebe alcanzar y esquematizar los diversos pasos que se debenseguir para monitorizar y vigilar a diario todas las facetas delprograma.

El coordinador debe controlar que todas las actividades esténclaramente descritas en un manual de control de calidad, en elcual también se deben esquematizar:

1. Los detalles de todas las prácticas de control de calidad,como los procedimientos y los esquemas para controlar elfuncionamiento de los equipos.

2. El control de todos los medios y reactivos en cuanto a sureactividad, fecha de vencimiento y patrones de reacciónapropiados frente a los organismos de prueba.

3. Todos los resultados de los ensayos de aptitud.

Se deben diseñar los formularios adecuados para recolectarlos datos con un formato de columnas de números, gráficos odiagramas, de modo de poder detectar con rapidez cualquierelemento que esté fuera de los valores esperados. El coordina-dor debe revisar también todos los registros de control y verifi-car que todas las mediciones que se encuentran fuera de losvalores esperados y que las acciones correctivas resultantesestén claramente anotadas. A continuación, se realiza un breverepaso de los numerosos componentes de un programa de con-trol de calidad.

CONTROL DE LOS APARATOS DEL LABORATORIOEn todos los laboratorios de microbiología se debe esta-

blecer un programa de mantenimiento preventivo para ase-gurar el funcionamiento adecuado de los equipos eléctricos ymecánicos. Los aparatos deben revisarse a intervalos prees-tablecidos; se deben reemplazar ciertas partes de ellos luegode un tiempo de uso especificado, a pesar de que no parez-can gastadas. En el cuadro 1-25 se muestra una lista breve dealgunos aparatos, el procedimiento de control que se debellevar a cabo y la frecuencia y los límites de tolerancia. Sedeben asignar las tareas entre los miembros del personal dellaboratorio para asegurarse de que todas las inspecciones selleven a cabo y que se registren todos los datos de maneraexacta en cuadros o en el manual de mantenimiento. Es


Cuadro 1-24 Clasificación de los laboratorios involucrados en la investigación de terrorismo biológico o químico

NIVEL

A

B (antes B y C)

C (antes D)

DESCRIPCIÓN

• Detección temprana de la diseminación intencional de agentes bioló-gicos o químicos

• Procesamiento inicial de las muestras clínicas

• Capacidad central para el aislamiento y la caracterización de agentesde bioterrorismo seleccionados

• Presta servicios para reducir la sobrecarga de muestras de los labora-torios de un nivel mayor

• Capacidad avanzada para la identificación rápida de agentes selec-cionados, mediante técnicas de cultivo y moleculares

• Participa en el desarrollo de pruebas y en la evaluación

• Niveles más altos de contención y sofisticación• Capacidad para detectar agentes diseñados

EJEMPLOS

• Laboratorios de hospitales o de salud pública• Instalaciones con bajo nivel de bioseguridad

• Laboratorios de salud pública locales y estatales• Laboratorios estatales de alto nivel• Centros médicos académicos

• Grupo selecto de laboratorios estatales• Laboratorios académicos que operan en un alto nivel de

contención bajo contrato estatal

Adaptado de la referencia13.


importante detectar de inmediato las tendencias ascendenteso descendentes, para que se puedan tomar las acciones co-rrectivas antes de que se produzcan errores serios. Se debedeterminar y registrar en forma diaria con un termómetrocalibrado por la Bureau of Standards o con uno que se hayacontrolado con un termómetro calibrado, la temperatura delas estufas de incubación, refrigeradores, congeladores, ba-ños de agua termostatizados y los bloques de calentamiento(bloques térmicos). Se debe determinar también en formadiaria la concentración de CO2 en las estufas con atmósferade CO2. Se debe establecer la causa de cualquier lectura quese encuentre fuera del rango estipulado por el control de cali-dad y corregir de inmediato el defecto.

CONTROL DE LOS MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS E INSUMOSTodos los medios y reactivos se deben revisar frente a los

controles apropiados para establecer su correcta reactividad. Sereconoce que muchos de los medios comerciales modernos serealizan con un alto grado de calidad o confiabilidad. Se hancreado recomendaciones de consenso para las necesidadeslocales del control de calidad.74 Los pocos medios que puedentener problemas ocasionales (p. ej., agar chocolate, el mediopara Campylobacter jejuni y el agar de Thayer–Martin) debensometerse a pruebas de control en cada laboratorio. No existenecesidad de probar muchos otros medios si el fabricante pro-porciona la documentación que demuestra que se observó enellos una correcta reactividad.


Cuadro 1-25 Procedimientos de vigilancia del control de calidad del equipamiento microbiológico usados comúnmente

EQUIPAMIENTO

RefrigeradoresCongeladores

Estufas

Estufas (CO2)

Baños de agua termostatizados

Bloques de calentamiento (5 bloques térmicos)

Autoclaves

Medidores de pH

Jarras de anaerobiosis

Caja plástica anaerobia

Aparato rotatorio para serología

Centrífugas

Cabinas de seguridad

PROCEDIMIENTO

Registro de temperatura*Registro de temperatura*

Registro de temperatura*

Medición del contenido de CO2

Uso de un analizador de gases san-guíneos o un dispositivo Fyrite†



Prueba con tira de espora (Bacillusstearothermophilus)

Prueba con soluciones de calibra-ción de pH

Tira con indicador azul de metileno

Cultivo de Clostridium novyi tipo B

Solución con indicador azul demetileno

Medición de las revoluciones porminuto

Control de revoluciones con untacómetro

Medición de la velocidad del aire através de la apertura frontal ‡

CRONOGRAMA

Diario o continuoDiario o continuo

Diario o continuo

Diario o dos veces por día

Diario

Diario

Por lo menos semanalmente

Con cada uso

Con cada uso

Realizarlo periódicamente

Continuo o diario

Con cada uso

Mensualmente

Semestral o cuatrimestral

LÍMITES DE TOLERANCIA

2–8 ºC–8 a –20 ºC–60 a –75 ºC

35,5 ± 1 ºC

5–10%

36–38 ºC55–57 ºC

± 1 ºC del fijado

Sin crecimiento de esporas en los subcultivos indicaun ensayo estéril

± 0,1 unidades de pH del estándar que se usó

Un cambio de color de la tira de azul a blanco indicabaja tensión de O2

El crecimiento indica muy baja tensión de O2. Esto seutiliza sólo cuando se requiere un tensión de O2

extremadamente baja

Las soluciones permanecen incoloras si la tensión deO2 es baja

180 ± 10 RPM

Dentro del 5% del fijado en el dial indicador

50 ft de flujo de aire por minuto ± 5 ft/min

* Cada termómetro de monitorización debe ser calibrado contra un termómetro estándar.† Bacharach Instrument Co., Pittsburgh, PA.‡ Velometer Jr., Alnor Instrument Co, Chicago, IL.



Cuadro 1-26 Control de calidad de los medios utilizados con mayor frecuencia: organismos de control sugeridos y reacciones esperadas

MEDIO

Agar sangre

Agar bilis-esculina

Agar chocolate

Agar urea de Christensen

Agar citrato de Simmons

Agar cistina tripticasa (CTA) Dextrosa

Sacarosa

Maltosa

Lactosa

Lisina descarboxilasas

Arginina (dihidrolasa)

Ornitina

Desoxirribonucleasa (DNasa)

Agar eosina-azul de metileno

Agar entérico de Hektoen

Indol (de Kovac)

Agar hierro de Kligler

Agar-lisina-hierro

MICROORGANISMOS DE CONTROL

Streptococcus del grupo AS. pneumoniae

Especies de Enterococcusα-hemolíticosStreptococcus, no del grupo D

Haemophilus influenzaeNeisseria gonorrhoeae

Proteus mirabilisKlebsiella pneumoniaeEscherichia coli

K. pneumoniaeE. coli

N. gonorrhoeaeBranhamella catarrhalis

Escherichia coliN. gonorrhoeae

Especies de Salmonella, o N. meningitidisN. gonorrhoeae

N. lactamicusN. gonorrhoeae

K. pneumoniaeEnterobacter sakazakii

E. cloacaeProteus mirabilis

P. mirabilisK. pneumoniae

Serratia marcescensE. cloacae

E. coliK. pneumoniaeShigella flexneri

Salmonella typhimuriumS. flexneriE. coli

E. coliK. pneumoniae

E. coliShigella flexneriPseudomonas aeruginosaSalmonella typhimurium

S. typhimuriumShigella flexneriP. mirabilis

REACCIONES ESPERADAS

Crecimiento adecuado, β-hemólisisCrecimiento adecuado, α-hemólisis

Crecimiento adecuado, negroSin crecimiento; sin cambio de color del medio

Crecimiento adecuadoCrecimiento adecuado

Completamente rosa (positivo)Pico de flauta rosa (positivo parcial)Amarillo (negativo)

Crecimiento o color azul (positivo)Sin crecimiento, permanece verde (negativo)

Amarillo (positivo)Sin cambio de color (negativo)




Azulado (positivo)Amarillo (negativo)



Zona de clarificación (adicionar HCl 1 N)Sin zona de clarificación

Crecimiento adecuado, brillo verde metálicoCrecimiento adecuado, colonias violetas, sin brilloCrecimiento adecuado, colonias transparentes (lactosa negativo)

Colonias verdes con centros negrosColonias verdes transparentesCrecimiento levemente inhibido, colonias naranjas

Rojo (positivo)Sin color rojo (negativo)

Pico de flauta ácido/fondo ácidoPico de flauta alcalino/fondo ácidoPico de flauta alcalino/fondo alcalinoPico de flauta alcalino/fondo negro

Pico de flauta y fondo violeta, H2S +Pico de flauta violeta, fondo amarilloPico de flauta rojo, fondo amarillo

(Continúa)



Cuadro 1-26 Control de calidad de los medios utilizados con mayor frecuencia: organismos de control sugeridos y reacciones esperadas (cont.)

MEDIO

Agar de MacConkey

Malonato

Movilidad (agar semisólido)

Caldo o agar nitrato

Agar sangre feniletil alcohol

o-nitrofenol-β-galactopiranósido (ONPG)

Fenilalanina desaminasa

Agar Salmonella-Shigella (SS)

Voges-Proskauer

Agar xilosa-lisina-dextrosa (XLD)

MICROORGANISMOS DE CONTROL

E. coliP. mirabilisEspecies de Enterococcus

E. coliK. pneumoniae

P. mirabilisK. pneumoniae

E. coliAcinetobacter lwoffi

Especies de StreptococcusE. coli

Serratia marcescensSalmonella typhimurium

P. mirabilisE. coli

S. typhimuriumE. coli

K. pneumoniaeE. coli

Especies de SalmonellaE. coliEspecies de Shigella

REACCIONES ESPERADAS

Colonias rosadas (lactosa positivo)Colonias incoloras, sin dispersiónSin crecimiento

Sin crecimientoCrecimiento adecuado, azul (positivo)

Medio turbio (positivo)Sin bordes plumosos en la estría de siembra (negativo)

Rojo al agregar los reactivosSin color rojo (negativo)

Crecimiento adecuadoSin crecimiento

Amarillo (positivo)Incoloro (negativo)

Verde (adicionar 10% FeCl3)Sin color verde (negativo)

Colonias incoloras, centro negroSin crecimiento

Rojo (adicionar reactivos)Sin desarrollo (negativo)

Colonias rojas (lisina positivo)Colonias amarillas (azúcares positivo)Colonias transparentes (negativo)

* Tomado de Microbiology Checklist, Collage of American Pathologist, Revisado 14 de octubre de 2003.

Cuadro 1-27 Control de calidad de reactivos y medios seleccionados*

MEDIOS O REACTIVOS

Tinción de Gram

Otras tinciones no inmunológicas, no inmuno-fluorescentes

Tinciones fluorescentes

Sistemas de identificación de catalasa, coagu-lasa, oxidasa, bacitracina, optoquina ,ONPG, discos X o V o XV

Antisueros (Salmonella y Shigella)

β-lactamasa (otras diferentes de nitrocefina)

β-lactamasa (nitrocefina)

Sondas de ácidos nucleicos

Tinciones AFB

Antibiograma

FRECUENCIA

Cada nuevo lote de colorantes y al menos semanalmente

Cada día que se utiliza y cada nuevo lote, número de loteo envío

Cada vez que se utiliza

Cada nuevo lote, número de lote o envío

Cada nuevo lote, número de lote o envío cuando se prepa-ra o abre y una vez cada 6 meses en lo sucesivo

Cada día que se utiliza

Cada nuevo lote, número de lote o envío



Diariamente o semanalmente si cumple con el criterio(véase cap. 17)

CONTROLES

Organismos grampositivos y gramnegativos

Reactividad apropiada

Reactividad apropiada

Controles positivos y negativos






Organismos apropiados

* Tomado de Microbiology Checklist, Collage of American Pathologist, Revisado 14 de octubre de 2003.


En el cuadro 1-26 se listan los organismos sugeridos y losresultados aceptables para los medios de cultivo utilizados conmayor frecuencia en los laboratorios clínicos. En los laborato-rios se pueden mantener organismos de reserva para control decalidad a través del subcultivo de las cepas bacterianas que seaíslan como parte del trabajo de rutina. Como alternativa, ymás conveniente, se pueden comprar microorganismos dereserva en colecciones de cultivos, como ATCC (AmericanType Cultere Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville MD) opromotores comerciales. El fabricante o el laboratorio localdebe controlar en cada lote de medios de cultivo, su reactividadcorrecta y su capacidad como sustrato adecuado para el creci-miento bacteriano.

Los tubos de cultivo, las placas con medio y los reactivosdeben presentar una etiqueta que indique en forma clara el con-tenido y las fechas de preparación y de vencimiento. Se debehacer referencia a los tubos de cultivo, placas con medio yreactivos “codificados” de manera que aún el personal que nopertenece al laboratorio pueda interpretar el código. Se debendefinir en forma precisa las reglas de control de calidad que seaplican a los antibiogramas.

Cada lote de medio en tubos o en placas debe ser sometidoa un control de esterilidad, sobre todo aquellos a los cuales seles agregan componentes luego de su esterilización. El controlde esterilidad debe realizarse en forma visual y por subcultivo.Por ejemplo, ciertos medios selectivos pueden suprimir el cre-cimiento visible de ciertas bacterias; sin embargo, pueden apa-recer microorganismos viables en el subcultivo. El medio pre-parado también debe ser observado en cuanto a la presencia deotros signos de deterioro, como cambio de color, turbidez, evi-dencia de congelado/descongelado y estado de hidratación.

La frecuencia con la que se deben realizar las pruebas decontrol de calidad sobre los medios y los reactivos (incluidoslos reactivos para serología) está claramente definida por variasagencias de acreditación. En el cuadro 1-27 se muestran algu-nas de las reglas para el control de calidad de medios y reacti-vos. Las recomendaciones para el control de calidad no sonestáticas. Es importante seguir las recomendaciones actuales, almenos en parte, porque es probable que los cambios represen-ten menos trabajo en lugar de más trabajo.

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Documents

Koneman. Diagnóstico microbiológico 2008.pdf