Konu5-DNA Izolasyonu (1)

8/12/2019 Konu5-DNA Izolasyonu (1)

1/47

DNAnn zolasyonuve Analizi


2/47

DNA

Genetik bilgiyi tayan ift sarmal molekldr. 5Clu eker, fosfat ve bazlar ieren

nkleotidlerden oluur.

Doadaki canllarn tmne yakn ksmndagenetik materyal DNAdr.


3/47

DNA hcre

ierisinde,*ekirdek,

*Mitokondri ve

*Kloroplastlardabulunmaktadr.


4/47

DNAnn zellikleri,

Negatif ykldr,

Suda znebilir,

Alkolde znmez.


5/47

DNA ZOLASYON YNTEMLERNDE BRBRNZLEYEN TEMEL AAMA

BULUNMAKTADIR:

1- Hcrenin paralanmas ile yksekmolekl arlkl DNAnn aa kmas,

2-Denatrasyon veya proteoliz ile DNA-

protein kompleksinin ayrlmas ve DNAnnznr duruma getirilmesi,

3-DNAnn basit enzimatik ve/veya kimyasal

yntemlerle proteinler, RNA ve diermakromolekllerden ayrlmas,***DNAnn analizi


6/47

Denatrasyon: ift zincirli DNA moleklyksek pH veya yksek scaklk etkisindebrakldnda sarmal yapsndaznmeler meydana gelir.

Renatrasyon:Koullar tekrar normalduruma getirildiinde iki iplik sarmalyapy oluturmak zere birleir.Yani

denatrasyon geri dnmldr.


7/47


8/47


9/47


10/47


11/47


12/47

*Enzimler(RNase) RNAy yok etmek iin,

*Enzimler (Proteases) DNA moleklne balolarak bulunan proteinleri yok etmek iin,

*zopropanol ve etanol: Nkleik asitlerinktrlmesinde,

*Amonyum slfat ve sodyum slfat:Proteinlerinktrlmesinde,

*Etil asetat, Toluen, SDS membran yapsn

bozmada,***zole edilen DNA +4Cda uzun sre

saklanabilir.


13/47

Kromozom DNAsnn izolasyonu*Bakterilerden kromozom (genom) DNAs

izolasyonu,*Mayalardan kromozom DNAs izolasyonu,

*Memelilerden kromozom DNAs izolasyonu,*Bitkilerden kromozom DNAs izolasyonuKromozom d DNAnn izolasyonu*Plazmid DNAs izolasyonu*Organel DNAs izolasyonu


14/47

Bakterilerden kromozom(genom) DNAsizolasyonu,

Organizma: E. coli, B. SubtilisYntem :1) LB(Luria Bertani) besiyerine tek koloniden ekim yaplr

ve 150 devir/dakika hzda, 37Cde bir gece bekletilir.2)Bakteri kltrnn 1.5 mlsi 10.000 rpm de 5 dakika

santrifj edilir.3)Spernatant atldktan sonra Tris EDTA (TE ph:8)

tamponu iinde zndrlr.4)zelti zerine Sodyum Dodesil Slfat (SDS) ve

proteinaz K eklenir ve 37Cde 1 saat bekletilir (buaamada hcreler paralanr).

5)zerine NaCI ile NaCI/CTAB (setil trimetil amonyumbromr) zeltileri eklenerek 65 Cde 10 dakikabekletilir.


15/47

6)Eit hacimde kloroform/izoamil alkol (CIA) eklenerek10.000 rpmde 5 dakika santrifjlenir.

7)Spernatant alnarak zerine fenol/kloroform/izoamilalkol eklenerek 10.000 rpmde 5 dakika santrifjlenir.

8)Spernatant ayr bir tpe alnarak izopropanol eklenir veDNA knceye alt-st edilerek kartrlr.

(Bu aamada DNAnn iplikikler eklinde keldiigzlenir)

9)DNA, 15.000 rpmde 10 dakika santrifjlenir.10)Pelletin zerine etanol eklenerek DNA ykanr ve alkol

geri boaltlr.

11)Tpn az ak durumda oda scaklnda (10-15 dak.)ya da 60 Cde birka dakika bekletilerek alkol tamamenuurulur.

12)kelti Tris-EDTA (pH:8) iinde yavaa vurularakzndrlr.


16/47

Mayalardan kromozom DNAsizolasyonu

Organizma:Schizosaccharomyces pombeveya Sacchromycescerevisiae

Yntem:1) Maya kltr uygun besiyerine ekilir ve 30Cde 180 devir/dakika hzda

24-30 saat remeye braklr.2) Kltrdeki hcreler 10.000 rpmde 5 santrifjlenir.3) kelti su iinde zndrldkten sonra tplere blnr ve 10.000

rpmde, 5 santrifjlenir.4) Spernatant atlr ve ok az kalan st sv ile pellet pipetlenir.5) zerine gerekli tampon(A) ,kloroform,fenol ve asitle ykanm cam

boncuk eklenir.6) Vorteksde 2 kartrldktan sonra TE buffer eklenir ve 14.000-15.000

rpmde 5 santrifjlenir.

7) Spernatant yeni bir tpe alnp etanol eklenir ve kartrlr.8) 15.000 rpmde 52 santrifjlendikten sonra RNase eklenir ve 30Cde 5bekletilir.

9) Daha sonra sodyum asetat ve saf etanol eklenerek -20 Cde 1-3 saatbekletilir.

10) 15.000 rpmde 10 santrifjlendikten sonra kelti TE veya distile suiinde zndrlr.

M lil d K DNA


17/47

Memelilerden Kromozom DNAsizolasyonu,

Materyal: Kan

Yntem1)Kan rnekleri phtlamay nleyen EDTA ieren zel tplere alnr.2)Uygun tampon eklendikten sonra 12.000 rpmde 1 santrifjlenir.3)Spernatant atldktan sonra tekrar ayn tampon eklenerek 12.000 rpmde

1daha santrifjlenir.4)kelti zerine sodyum asetat, SDS ve proteinaz K eklendikten sonra

55Cde 1 saat bekletilir.5)Sre sonunda fenol/kloroform/izomil alkol eklenir ve 30 sn vorteklendiktensonra 12.000 rpmde 2 santrifjlenir.

6)Spernatant yeni tpe alndktan sonra etanol eklenir ve -20 Cde 15bekletilir.

7)Daha sonra 12.000 rpmde 2 santrifjlenir ve spernatant atldktan sonra TEtamponu eklenir ve 55 Cde 10 bekletilir.

8)nce sodyum asetat daha sonra souk saf etanol eklenir ve 12.000 rpmde 1santrifjlenir.

9)Spernatant uzaklatrlr ve alkol ile muamele edildikten sonra 12.000rpmde 1 santrifjlenir.

10)Alkol dkldkten sonra vakumda 10 kadar kurutulur.11)zelti TE iinde zndkten sonra 55 Cde 1 gece braklr.


18/47

Bitkilerden Kromozom DNAsizolasyonu,

Materyal: Taze yaprak dokusu

Yntem:1)Materyalim miktarna gre 2- Mercaptaethanol / CTAB ve NaCI/CTAB

ektrasyon tamponlar su banyosunda 65Cye kadar stlr.2)Daha nce paralanarak toz haline getirilmi dokuya uygun miktarda

2Me/CTAB eklenerek 65 Cde 10-60 dak. tutulur.3)Eit hacimde kloroform /izoamil alkol (24:1) eklenerek 10.000 rpmde

5 , 4 Cde santrifjlenir.4)65 Cde stlm CTAB/NaCI zeltisi eklenir ve kartrlr.5)3. aama tekrarlanr.6)Tekrar CTAB ktrme tamponu eklenir ve eer kelti gzkr ise

bir sonraki aamaya geilir eer gzkmyor ise 65 Cde 30

beklenir.7)2700 rpmde 5 , 4 Cde santrifjleme yaplr.8)Spernatant atldktan sonra, kelti yksek tuz ierikli TE

tamponunda zndrlr.9)Daha sonra izopropanol eklenerek 10.000 rpmde 15 da 4 Cde

santrifjleme yaplr.

10)zelti etanol ile ykanr, TE iinde zndrlr ve +4de saklanr.


19/47


20/47


21/47


22/47


23/47

Kromozom d DNAnn izolasyonu

Kromozom d DNA olarak bakterilerde plazmidad verilen, sitoplazmada genom DNAsndanbamsz replikasyon yapabilen, ift zincirli,genellikle halkasal(ender olarak dorusal) olan

DNA moleklleri bulunmaktadr. karyotlarda ise nukleus DNAsndan bamszkaltm gsteren organel DNAlarna mitokondri(mtDNA) ve kloroplastlarda (ctDNA)rastlanmaktadr.

Mitokondri ve Kloroplast DNAs, ift zincirlihalkasal bir molekl olamakla birlikte boyutuorganizmalara gre deimektedir.


24/47

Plazmid DNAs zolasyonu

Plazmitlerinrekombinant DNAteknolojisialmalarnda

tayc DNA(vektr)olarak geni aptakullanlmas plazmidizolasyon

yntemleriningelimesine yolamtr.


25/47

1)E. colitad plazmitte bulunan antibiyotie diren geninin eidinegre, o antibiyotii ieren besiyerinde 15 devir/dakika hzda37Cde 1 gece boyunca retilir.

2)Bir gecelik kltrler, 7.000 devir/dakika da 10 santrifjlenir ve lizis

tamponunda sspansiyon haline getirilir.3)5 oda scaklnda bekletildikten sonra alkali SDS ile muamele edilirve yeniden 5 oda scaklnda tutularak hcrelerin paralanmas vegenomik DNAnn denaturasyonu salanr

4)4 Cde soutulmu potasyum asetatla muamele edilerek 5 buziinde bekletilir

5)13.000 rpmde santrifj edildikten spernatant ksmna kalan plazmidfraksiyonuna absol etanol eklenir.6)13.000 rpmde 20 Cde tekrar sabtrifj edilerek plazmid DNAs

ktrlr.7)TE tamponunda zdrldkten sonra RNase A eklenerek 37 Cde

1 saat bekletilir.

8)Daha sonra fenol/kloroform/izoamil alkol eklenir ve 13.000 rpmde 5oda scaklnda santrifjleme yaplr.9)Spernatant ayr bir tpe alnarak potasyum asetat eklenir ve -20

Cde 1 saat bekletilir.10)20.000 rpmde 20 4 Cde santrifjleme sonucu elde edilen kelti

uygun miktardaki TE iinde zlr.


26/47

Organel DNAs izolasyonu,

Organel DNAs izolasyonlarnda ennemli aama ncelikle organelinparalanmam ekilde ayrlmas

olduundan dolay,bu olay 2 aamadagerekletirilir.

***Organelin izolasyonu

***Organel DNAsnn izolasyonu


27/47

Mitokondriyal DNAnn izolasyonu Mitokondri zolasyonu

Materyal: Somatik hibritlerin eitli bitki dokular Yntem:1)Taze dokular (yaprak, iek vb.) buzda soutulmu uygun tampon

iinde paralanryada

Patates tuberi elektrikli meyve suyu skacandan geirilir ve eit

hacimde uygun tampon eklenir.2)Naylon bir membrandan filtre edildikten sonra byk hcreparalarnn uzaklatrlmas iin 500gde 10 dakika santrifj edilir.

3)Plastitlerin uzaklamas iin spernatant 2600 gde 15 da 2 kez vebir kez de 10 santrifj edilir.

4)Spernatant alnr ve mitokondrileri ktrmek iin 14.500 gde 15

santrifj edilir.5)Lizis olmu nkleus paralarn ieren st sv atlr, mitokondrileri

ieren kelti buzda soutulmu uygun tampon iinde zndrlr.***Mitokondri keltisi sv azotta dondurulduktan sonra -80C saklanr

yada dorudan DNA izolasyonu yaplabilir.


28/47

Mitokondri DNAs izolasyonu,1)Mitokondri keltisi lizis tampunu ierisinde

zndrldkten sonra Proteinaz K eklenerek37Cde 1 saat bekletilir.

2)Amonyum asetat ve TE ile doyurulmu

fenol/kloroform eklenerek 12.000rpmde 5santrifj edilir.3)Spernatant ksm ayr bir tpe alnarak absol

etanol alnarak eklenerek -20 Cde bir gece

bekletilir.4)18.000gde 20 santrifjlemeden sonra keltidistile su iinde zndrlr.


29/47

DNAnn Analizi

Nkleik asitlerin nanogram veya mikrogramdzeyindeki miktarlarnn belirlenmesindeabsorbsiyon temeline dayanan spektrofotometrik

yntemler kullanlr Ayrca nkleik asitlerin dorudan

grntlenmesinde zgn dizilerde kesim yapanrestriksiyon endonkleaz enzimlerinin etkisi

sonucu oluan farkl boyutlardaki DNAparalarnn saptanmasnda elektroforetikyntemler kullanlr.


30/47


31/47


32/47


33/47


34/47


35/47


36/47


37/47

Kk DNA fragmentleri iin yksek, byk DNA

fragmentleri iin dk agaroz konsantrasyonukullanlarak DNAnn jelde en uygun ekilde yrmesisalanr.

zole edilen DNA genomik DNA ise keskin bir bant

eklinde (aa ve yukar ksmna dalan az bir ekildedalan)grntlenirken,plazmid DNA snn genelde farkl biimi gzlenir(sebep,izolasyon srasndakrlmalardr).


38/47


39/47


40/47


41/47

DNAnn enzimatik kesimi

DNAnn enzimatik kesimi restriksiyonendonklezlarlayaplr.

DNAda zel nkleotid dizilerini tanyan veDNAnn her iki ipliini kesen enzimlerdir.

Kesim sonucunda kt veya yapkan ulu DNAfragmentleri oluur. Ayn DNA dizisini tanyp kesebilen farkl R.E.

vardr ve bunlar izoizomer olarak adlandrlrlar.

zellikle genom kitaplnn kurulmasnda veyaistenilen boyutta DNA fragmentlerini elde etmekamacyla kullanlr.


42/47


43/47

Star aktivitesi: R.Enin uygun olmayankoullarda zel kesim dizilerine benzerdizilerde kesim yapmalar sonucundaistenmeyen fragmentlerinin olumasdr.

Star aktivitesini arttran ve inhibe edenkoullar bulunmaktadr.


44/47


45/47


46/47


47/47

Documents

Konu5-DNA Izolasyonu (1)