Adalah suatu teknik pemisahan atas dasar perbedaan sifat fisik dan kimiawi dari zat penyusun suatu campuran

Adanya tendensi molekul suatu zat untuk :

- larut dalam suatu cairan

- teradsorpsi pd butir zat padat yg halus dg

permukaan yg luas

- masuk ke fase uap atau menguap

JENIS KROMATOGRAFI

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi kolom :

Kromatografi adsorbsi Kromatografi partisi cair-cair Kromatografi pertukaran ion Kromatografi filtrasi gel

Kromatografi Gas Cairan

POLARITAS

Adanya pemisahan kutub muatan positif dan negatif dr suatu molekul sbg akibat terbentuknya konfigurasi tertentu dr atom-atom penyusunnya.

Dg dmkn molekul tsb dpt tertarik oleh molekul yg lain yg jg mempunyai polaritas.

Tingkat pemisahan dr muatan tsb menentukan derajat polaritasnya, dmkn jg daya tariknya.

Sifat polaritas, khususnya digunakan sbg petunjuk sifat zat pelarut, adsorben dan senyawa-senyawa yg dipisahkan (solute).

Air termasuk zat pelarut & mempunyai polaritas terbsr krn konfigurasi elektron dan geometri molekulnya dpt menghasilkan dipol permanen yang sangat kuat.

ADSORBEN & PELARUT

Dpt bersifat polar atau non polar Adsorben polar = silika & alumina, dpt

mengadsorp solut yg bersifat polar.Adsorben non polar = arang (charcoal)

POLARITAS RELATIF BERBAGAI ZAT PELARUT

Konstanta dielektrik Nama zat Pelarut

1,890

2,023

2,238

2,284

4,806

4,340

6,020

20,700

24,300

33,620

80,370

Petroleum eter, heksan, heptan

Sikloheksan

Karbon tetraklorida, Trikloroetilen, Toluen

Benzen, diklorometan,

Kloroform

Etil eter

Etil asetat

Asdeton, n-propanol

Etanol

Metanol

Air

ADSORBSI & PARTISI

Keduanya dipengaruhi oleh perbedaan polaritas solute yang dipisahkan

Polaritas mrpkn faktor yg

menentukan daya larut dan

terjadinya adsorbsi solute

NO KROMATOGRAFI ADSORBSI

KROMATOGRAFI

PARTISI

1 Sangat peka thd bntk stereometrik suatu senyawa.

Sangat trgantung pd daya larut (BM) senyawa dlm suatu pelarut.

2 Adsorben mempunyai polaritas konstan & pelarut dpt diatur polaritasnya sesuai kebutuhan

Kedua fasenya lbh sulit u/ diatur polaritasnya.

3 U/pemisahan dlm kuantitas lbh besar

Baik u/pemisahan solut yg sangat serupa sifatnya, bersft kualitatif.

4 U/ pemisahan senyawa kurang polar (hidrokarbon)

U/ pemisahan senyawa yang lebih polar (karbohidrat & protein)

ADSORBEN

Silika gel bersifat asam dan berfungsi untuk

memisahkan senyawa yang bersifat asam digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT).

Alumina bersifat basa dan berfungsi untuk

memisahkan senyawa yang bersifat basa. digunakan untuk kromatografi kolom

Mrpkn kromatografi adsorbsi dan adsorben bertindak sbg fase stasioner.

Dapat digunakan untuk memisahkan : ion-ion organik komplek senyawa organik dg anorganik senyawa organik alami dan sintetis

Pemisahan lebih sempurna, kepekaan tinggi dan dpt dilakukan dg cepat

Gambar KLT

ADSORBEN

Silika gel ( asam silikat ) Alumina ( aluminum oxyde ) Kieselguhr (diatomeous earth) Selulosa

Silika Gel G mengandung 13% Kalsium Sulfat sebagai zat

perekat biasanya mengandung ion logam (besi) dihilangkan dg

pelarut metanol : asam HCl pekat = 9 : 1

Silika Gel H digunakan untuk pemisahan yang spesifik,

terutama lipida netral. dpt memisahkan berbagai digliserida spt 1,2 digliserida

dari 1,3 digliserida; fosfatidil gliserol dari poligliserida fosfat.

Silika Gel PF senyawa organik yg terikat dpt berfluoresensi.

Mampu memisahkan bermacam senyawa terpen, alkaloid, steroid,alisiklik, alifatik dan aromatik

Tidak mengandung zat perekat Sifat sedikit alkalis Dapat digunakan dengan ataupun tanpa

aktivasi

untuk pemisahan senyawa polar.

PEMBUATAN PLAT

Untuk KLT Mikro Mis. Silika gel G = 35 gram adsorben dilarutkan

dalam 100 ml zat pelarut kloroform-metanol (2:1 v/v). Plat kaca dicelupkan dalam larutan tsb. Diuapkan selama 5-10 mnt u/ mencegah retak pd

lapisan adsorben atau terjadinya case hardening.

Untuk KLT Makro Suspensi adsorben silika gel H dicampur dg air

= 30 g / 60-70 ml air Plat berukuran 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, dan 20 x 20 cm. Keuntungannya : adsorben dapat melekat lebih baik,

dpt dibuat lebih tebal u/ kepentingan tertentu, dapat dilaksanakan pada tempat yg lebih luas

Kerugiannya : pembuatan lebih sukar & perlu aktivasi plat dg pemanasan 110oC selama 1 jam.

Cara pembuatan plat yg besar : plat kaca dicuci dg detergen, dibilas dg

aquades & dikeringkan. Suspensi adsorben yg telah dibuat dilapiskan

pd permukaan plat kaca menggunakan aplikator (Stahl Desaga).

Tebal lapisan antara 250 m – 2mm Plat yg sudah terlapis sebelum di aktifkan

harus didiamkan dulu pada suhu kamar selama + 30 menit.

MENETESKAN SAMPEL

Gunakan luas plat sesuai kebutuhan Buat garis dg jarak 8 – 10 mm (u/ plat mikro) dan 1,5 – 2,0

cm (u/ plat makro) dar dasar plat. Sampel dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah menguap

(ttk didihnya 50 – 100oC) Larutan sampel diteteskan pada plat menggunakan pipet

mikro atau syringe dan dibiarkan mengering sebelum tetesan berikutnya dikerjakan.

Jumlah sampel yang diteteskan dpt berkisar antara 5-100g dari larutan 0,1 %

Pengeringan tetesan sampel menggunakan gas N2 untuk

mencegah terjadinya kerusakan sampel karena oksidasi.

PENGEMBANGAN

Menggunakan wadah tertutup yg berisi senyawa pelarut.

Mencelupkan dasar plat yg telah ditetesi sampel dalam sistem pelarut.

Pemilihan sistem pelarut atas dasar like dissolves like, misalnya untuk memisahkan lipida digunakan sistem pelarut heksan : eter : asam asetat = 80 : 20 : 1

Pengembangan di akhiri bila ujung zat pelarut pada plat telah mencapai + ¾ tinggi adsorben (15 – 16 cm)

Pengeringan plat dg aliran gas N2

METODE PENGEMBANGAN

Pengembangan satu dimensi Berjalan 1 arah dg 1 macam sistem pelarut

Pengembangan dua dimensi Dikerjakan 2 arah Sampel di teteskan di pojok kanan bawah ( 2 cm

dari kanan & bawah) untuk plat 20 x 20 cm Setelah pengembangan I selesai, plat dikeringkan

dg gas N2

Setelah kering, plat dikembangkan lagi dg menggunakan sistem pelarut yang ke II dg memeutar plat 90o.

Pengembangan ganda Dikerjakan searah (1 dimensi) dan

dilaksanakan beberapa tahap (umumnya 2 tahap)

Sistem pelarut yg digunakan berbeda Masing-masing tahap pengembangan di akhiri

dg pengeringan sblm dilakukan pengembangan berikutnya.

Mis. Pemisahan lipida netral dan lipida polar . Pengembang I = kloroform : metanol : aquades = 60 : 25 : 4, dihentikan setelah permukaan pelarut mencapai 10 cm. Setelah pengeringan, dikembangkan lagi dg sistem pelarut Heksan : Eter = 4 : 1.

VISUALISASI DAN IDENTIFIKASI

Untuk melihat komponen penyusun yg sudah terpisah setelah proses pengembangan

Bersifat destruktif dan non destruktifo destruktif akan merusak sampel secara irreversible (u/

pengukuran kuanti & kualitatif)o nondestruktif baik u/KLT preparatif & pengukuran

kuantitatif Bersifat umum dan spesifik Identifikasi

o membandingkan posisi spot dg senyawa standaro visualisasi khusus (mis. Dg ninhidrin, senyawa yg

mengandung gugus amino akan menunjukkan spot kuning jingga)

Uap iodium Spot akan berwarna coklat dg dasar putih Tidak merusak komponen yg telah terpisah Dpt digunakan u/semua senyawa organik yg tidak

jenuh (dg ikatan rangkap) Sinar UV

memberikan fluoresensi pd plat yg mengandung unsur fosfor

sifatnya non destruktif Charring

penyemprotan plat dg lar H2SO4/K2Cr2O7 kmdn dipanaskan pd suhu 125oC

Zat organik akan mengalami oksidasi menjadi karbon yang berwarna hitam

Reagensia umum(terbatas u/ senyawa organik yg non volatil)

H2SO4 pekat senyawa organik akan mjd spot hitam

H2SO4 - Na2Cr2O7 senyawa organik akan mjd spot hitam

H2SO4 - K2Cr2O7 senyawa organik akan mjd spot hitam

H2SO4 – HNO3 senyawa organik akan mjd spot hitam

HClO4 senyawa organik akan mjd spot hitam

Iodium senyawa organik akan mjd spot coklat

Reagen Spesifik

Untuk mendeteksi secara kualitatif & mengenal adanya gugus tertentu dalam senyawa yg dipisahkan.

Reagensia ini bersifat destruktif

Anilin pthalat• Spot yg terdiri dari gula-gula reduksi akan

memberikan berbagai warna Anisaldehid dlm H2SO4 dan HOAc

• Senyawa ini untuk menunjukkan adanya karbohidrat.• Karbohidrat menunjukkan warna biru

Antimon triklorida dalam CHCl3• Senyawa ini mendeteksi adanya senyawa steroid,

steroid glikosida,lipida alifatik,dan vit A.• Zat tsb dg UV akan menunjukkan berbagai warna

tertentu Bromokresol jambon

• Untuk pengenalan ion-ion halogen kec. F & asam dikarboksilat

• Senyawa tsb akan menunjukkan warna kunin atau jingga

Bromokresol hijau• Pengenal asam karboksilat• Senyawa tersebut akan memberikan warna

kuning/jingga 2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DPNH)

• Pengenal aldehid dan keton yg akan membentuk warna kuning sampai kemerahan.

Reagensia Dragendorf• Pengenal berbagai alkaloid dan basa organik

(mberikan warna orange) Feri Klorida

• Senyawa fenol & menunjukkan berbagai warna.

Fluorescein-Br2• Pengenal senyawa organik tidak jenuh ( Dg UV

akan menunjukkan warna tertentu)8-Hidroksiquinolin-NH3

• Pengenal kation anorganik (dg UV akan terlihat berbagai warna)

Ninhidrin• Gugus amino akan berwarna biru.

Profil KLT fraksi aktif ekstrak daun pecut kuda (S. jamaicensis)

Fase gerak : CHCi3 : MeOH : EtOAc (9:3:5) ;

Fase diam = Silika Gel F254;

H fraksi heksan, C fraksi kloroform, E fraksi etil

Reagen fosfomolibdat u/ deteksi senyawa terpenoid dan warna yg dihasilkan adlh hijau kebiruan.

Reagen H2SO4 u/ deteksi senyawa terpenoid yg akn mnghslkn warna spot coklat, hijau, kuning, merah atau biru. Pd perlakuan H2SO4 50% kmdn dipanaskan suhu 100-110oC selama 5 mnt,mnghslkn spot coklat

JENIS KLTA. KLT Preparatif

Tebal adsorben 1 – 1,5 mm (makin tebal, pemisahannya makin sulit)

Pengeringan adsorben harus optimal u/mencegah case hardening dan retak.

2 ml sampel (50-250 mg) diaplikasikan dg cara menggariskan setebal 5-8 mm pada garis dasar (tidak smp merusak adsorben)

Cara visualisasi yg dipakai dg non destruktif, terutama dg UV, penyemprotan dg air atau uap iodium.

Komponen terpisah dikerok, diletakkan dlm corong dg kertas filter

Diekstrak dg pelarut yang polaritasnya sesuai.

B. KLT Kuantitatif, dilakukan pendekatan dg : Analisa langsung pada plat, dengan :

Charring secara standar, kmd digunakan densitometer untuk menentukan kuantitasnya

Pengukuran radioaktivitasnya, khususnya senyawa yg ditandai dg radioaktif

Dengan neutron activation analysis

Gravimetri : masing2 komponen diisolasi, diekstrak, diuapkan dan ditimbang.

Menganalisis elemen-elemen spesifik atau gugus fungsional dengan spektrofotometer.

C. KLT dengan argentasi U/ pemisahan senyawa yang mempunyai jumlah ikatan

rangkap yang berbeda & isomer cis dan trans dr asam lemak.

Plat adsorben mengandung AgNO3 : Mencelup plat KLT ke dalam larutan AgNO3 10-

12%,atau Menambahkan larutan AgNO3 dlm pembuatan larutan

adsorben Sistem pelarut campuran heksan eter dg proporsi yg

bervariasi tergantung jumlah ketidak jenuhan senyawanya u/ memisahkan monoenoat (ik. Rangkap 1) = 93 : 7 u/ dienoat (ik. Rangkap 2) = 83 : 17 u/ monoena, diena, triena, tetraena, pentaena,

heksaena dari metil esternya = 60 : 40.

Komponen lipida polar kacang tanah yg dipisahkan dg TLC dua dimensi

I. Kloroform : Metanol : 28% amonia = 65 : 25 : 5 (v/v)II. Kloroform : Aceton : Metanol : HAc : Air = 3 : 4 : 1 : 1 : 0,5 (v/v)X1, X2, X3, X4, tidak diketahui; PE = Fosfatidil etanolamin, PI =

Fosfatidil Inositol, PS = Fosfatidil Serin, LPE = Lisofosfatidil Etanolamin, LPC = Lisofosfatidil Kolin dan PA = Asam fosfatidat

Contoh hasil pengembangan ganda