Percobaan 4

KROMATOGRAFI KOLOM & KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Isolasi Kurkumin dari Kunyit (Curcuma longa L)

I. Tujuan

1. Melakukan dan menjelaskan teknik-teknik dasar kromatografi kolom

dan kromatografi lapis tipis

2. Menjelaskan Prinsip dasar kromatografi.

3. Melakukan isolasi campuran senyawa sampai pemurniannya secara

kromatografi kolom

II. Prinsip

Pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion berdasarkan kecepatan

migrasinya dengan fasa gerak dan fasa diam.

III. Teori dasar

Kromatografi adalah suatu metode yang digunakan ilmuwan untuk

memisahkan senyawa organik dan anorganik sehingga senyawa tersebut

dapat dianalisis dan dipelajari. Dengan menganalisis senyawa, seorang

ilmuwan dapat mengetahui apa yang membangun senyawa tersebut.

Kromatografi adalah suatu metode fisik yang baik sekali untuk mengamati

dan menyelidiki suatu campuran dan pelarutnya. Kata kromatografi berarti

“tulisan berwarna”, artinya suatu cara seorang kimiawan dapat menguji

campuran zat cair. Ketika mempelajari material zat warna dari tumbuhan,

seorang botanis Rusia menemukan kromatografi pada tahun 1903.

Namanya adalah M.S. Tswett. Kromatografi digunakan oleh berbagai

orang dan disiplin ilmu di dalam berbagai bidang. Sebagian orang

menggunakan kromatografi untuk mengetahui komponen apa saja yang

terdapat dalam suatu zat padat atau zat cair. Metode ini digunakan juga

untuk mengetahui zat-zat yang tak dikenal dalam suatu sampel. Polisi,

FBI, dan agen detektif lainnya menggunakan kromatografi ketika

mengusut suatu kasus criminal. Metode ini digunakan pula untuk menguji

keberadaan kokain dalam urin, alkohol dalam darah, PCB (polychlorinated

benzene) dalam ikan, dan kandungan timbale dalam system perairan.

Metode kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau

ion berdasarkan pada perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-

ion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Dua fasa ini bisa berwujud

padat-cair, cair-cair, atau gas-cair. Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak

mengalir pada suatu fasa diam. Zat terlarut yang memiliki afinitas terhadap

fasa gerak yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak,

sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil

akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian senyawa-

senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat perbedaan

migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam. Dalam semua metode

kromatografi terdapat fasa gerak dan fasa diam. Fasa diam adalah fasa

yang tidak bergerak, sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak

melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen senyawa yang

akan dipisahkan. Pada posisi yang berbeda-beda, senyawa-senyawa yang

berbeda akan tertahan dan terabsorbsi pada fasa diam, dan kemudian satu

demi satu senyawasenyawa ini akan terbawa kembali oleh fasa gerak yang

melaluinya. Dalam kromatografi kertas dan kromattografi lapis tipis, fasa

gerak adalah pelarut. Fasa diam pada kromatografi kertas adalah kertas

yang menyerap pelarut polar, sedangkan fasa diam pada kromatografi lapis

tipis adalah pelat yang dilapisi adsorben tertentu. Kedua jenis kromatografi

ini menggunakan aksi kapilaritas untuk menggerakkan pelarut melalui fasa

diam.

Keakuratan hasil pemisahan dengan metode kromatografi bergantung pada

beberapa faktor berikut:

Pemilihan adsorben sebagai fasa diam

Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai sebagai fasa

gerak

Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlah material

yang akan dipisahkan.

Laju elusi atau aliran fasa gerak.

Dengan pemilihan kondisi yang sesuai, hampir semua komponen

dalam campuran dapat dipisahkan. Dua pemilihan mendasar untuk

pemisahan secara kromatografi adalah pemilihan jenis adsorben dan

system pelarut. Pada umumnya, senyawa non polar melewati kolom lebih

cepat daripada senyawa polar, karena senyawa non polar memiliki afinitas

lebih kecil terhadap adsorben. Jika adsorben yang dipilih mengikat semua

molekul yang terlarut (baik polar maupun non polar) dengan kuat, maka

senyawa-senyawa tersebut tidak akan bergerak turun keluar dari kolom.

Sebaliknya, jika pelarut yang dipilih terlalu polar, semua zat terlarut (polar

maupun non polar) akan dengan mudah tercuci keluar kolom, tanpa

adanya pemisahan. Adsorben dan pelarut sebaiknya dipilih sedemikian

rupa sehingga kompetisi molekul-molekul terlarut di antara kedua fasa

terjadi dalam kesetimbangan. Koefisien partisi, k, yang mirip dengan

koefisien distribusi untuk ekstraksi, merupakan tetapan kesetimbangan

untuk distribusi molekul-molekuk atau ion terlarut di

antara fasa gerak dan fasa diam. Kesetimbangan ini lah yang dapat

memisahkan komponen-komponen dlam campurannya.

Fasa Diam

Silika gel, fasa diam yang paling umum digunakan sebagai fasa diam,

memiliki rumus empiris SiO2. Tetapi, pada permukaan partikel silika gel,

terdapat atom-atom oksigen yang terikat pada proton. Adanya gugus

hidroksil ini mengakibatkan permukaan silika gel sangat polar, sehingga

analit organik yang memiliki gugus fungsi polar akan terikat dengan kuat

pada permukaan partikel silika gel dan senyawa yang non polar hanya

berinteraksi lemah dengan silika gel. Molekul yang memiliki gugus fungsi

polar dapat terikat pada silika gel dalam dua cara: melalui ikatan hidrogen

dan melalui interaksi dipol-dipol. Pada gambar 1 diperlihatkan model

interaksi analit senyawa oraganik dengan silika gel.

Fasa diam lain yang juga biasa digunakan untuk kromatografi kolom dan

lapis tipis adalah alumina, yang memiliki rumus empiris Al2O3. Model

interaksi senyawa organik dengan alumina dapat dilihat pada gambar 2

berikut.

Fasa Gerak

Pada kromatografi yang menggunakan silika gel sebagai fasa diam, fasa

gerak yang digunakan adalah suatu pelarut organik atau campuran

beberapa pelarut organik. Ketika fasa gerak melalui permukaan silika gel,

fasa gerak ini membawa analit organikkmelalui partikel-partikel pada fasa

diam. Tetapi, molekul analit hanya bebas bergerak oleh adanya pelarut

apabila molekul tersebut tidak terikat pada permukaan silika gel.

Kemampuan suatu analit terikat pada permukaan silika gel dengan adanya

pelarut tertentu dapat dilihat sebagai penngabungan 2 interaksi yang saling

berkompetisi. Pertama, gugus polar dalam pelarut dapat berkompetisi

dengan analit untuk terikat pada permukaan silika gel. Dengan demikia,

jika pelarut yang sangat polar digunakan, pelarut akan berinteraksi kuat

dengan permukaan silika gel dan hanya menyisakan sedikit tempat bagi

analit untuk terikat pada silika gel. Akibatnya, analit akan bergerak cepat

melewati fasa diam dan keluar dari kolom tanpa pemisahan. Dengan cara

yang sama, gugus polar pada pelarut dapat berinteraksi kuat dengan gugus

polar dalam analit dan mencegah interaksi analit pada permukaan silika

gel. Pengaruh ini juga menyebabkan analit dengan cepat meninggalkan

fasa diam. Kepolaran suatu pelarut yang dapat digunakan untuk

kromatografi dapat dievaluasi dengan memperhatikan tetapan dielektrik

(ε) dan momen dipol (δ) pelarut. Semakin besar kedua tetapan tersebut,

semakin polar pelarut tesebut. Sebagai tambahan, kemampuan berikatan

hidrogen pelarut dengan fasa diam harus dipertimbangkan.

Semua jenis kromatografi melibatkan proses kesetimbangan molekul-

molekul yang dinamis dan cepat diantara 2 fasa (diam dan gerak).

Kesetimbangan di antara kedua fasa tersebut bergantung pada 3 faktor:

• Kepolaran dan ukuran molekul yang akan dipisahkan

• Kepolaran fasa diam

• Kepolaran fasa gerak

Isolasi Kurkumin dari Kunyit

Kunyit merupakan salah satu tumbuhan yang sudah sangat akrab dengan

masyarakat Indonesia. Rimpang (Rhizoma) dari tumbuhan ini biasa

digunakan sebagai bahan warna kuning dalam industri tekstil tradisional

serta digunakan sebagai bumbu masakan, di samping kegunaannya dalam

obat tradisional. Nama latin dari kunyit adalah Curcuma longa yang

termasuk dalam famili Zingeberaceae (temu-temuan). Komponen aktif dari

rimpang kunyit adalah kurkumin (E,E)-1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)-

1,6-heptadien-3,5-on) yang biasanya terdapat 1,5-2% dari berat rimpang

kunyit kering. Struktur senyawa ini ditentukan tahun 1910 oleh V. Lampe

dan merupakan diarilheptanoid yang pertama ditemukan. Kurkumin juga

dapat disintesis di laboratorium. Kurkumin dilaporkan memiliki sifat

antikanker dan antitumor. Analog kurkumin telah dilaporkan pula mampu

menghambat enzim HIV-1 integrase.

IV. Alat & bahan

Alat

Alat destilasi

Penyaring vakum

Gelas ukur

Gelas kimia

Neraca analitik

Termometer

Batang pengaduk

Plat kromatografi

lapis tipis

Pipet tetes

Pipa kapiler

Gelas kimia

Spektrum UV

Kertas saring

Kolom kromatografi

Bahan

Rimpang kunyit

kering

Diklorometana

Kapas

Silika gel

Eluen

Metanol

n-heksana

air

Kertas saring

Kolom kromatografi

V. Prosedur

20 g rimpang kunyit dikering dalam 50 mL diklorometana direfluks

selama 1 jam. Campuran kemudian segera disaring dengan saringan

vakum hingga diperoleh larutan kuning. Dilarutan lalu dipekatkan melalui

distilasi pada penangas air 50 oC. Residu kuning kemerahan yang

diperoleh kemudian dicampurkan dengan 20 mL n-heksana dan diaduk

secara merata. Campuran kemudian disaring lagi dengan penyaring

vakum. Padatan yang dihasilkan selanjutnya dianalisis dengan

Kromatografi lapis tipis (TLC) menggunakan eluen CH2Cl2 : MeOH =

97:3 yang akan menunjukkan 3 komponen utama. Kromatografi

menggunakan kromatografi kolom dibuat menggunakan 15 g silika gel

dan eluen CH2Cl2 : MeOH = 99 : 1 dengan tinggi kolom berkisar antara

15-20 cm. 0,3 g diekstrak kasar yang diperoleh dilarutkan dengan sesedikit

mungkin pelarut CH2Cl2 : MeOH = 99:1 dan kemudian diteteskan secara

perlahan pada bagian atas kolom (jangan merusak permukaan kolom).

Dilakukan elusi hingga komponen pertama habis. Monitoring dilakukan

dengan menggunakan TLC. Digabungan fraksi yang mengandung

komponen pertama ini kemudian dikeringkan. Diuji spektrum UV dan IR

dari senyawa murni yang berhasil diisolasi. Proses pemisahan dilakukan

pula dengan menggunakan KLT preparatif. Diekstrak kasar (0,1 g)

dilarutkan dengan sesedikit mungkin pelarut CH2Cl2 : MeOH = 99 : 1,

kemudian ditotolkan pada batas awal pelat KLT preparatif dengan

menggunakan pipa kapiler yang diameternya lebih besar dari pada pipa

kapiler untuk titik leleh. Setelah noda kering, dilakukan elusi dengan eluen

CH2Cl2 : MeOH = 97 : 3. Hasil elusi dilihat dibawah lampu UV, kemudian

pita komponen utamanya diberi tanda dengan ujung tumpul pipa kapiler.

Bagian pita yang dipilih kemudian dipisahkan dari komponen lainnya

dengan cara mengerok lapisan silika tersebut dan ditampung pada kertas.

Dipindahkan silika tersebut ke dalam gelas kimia, dilarutkan dengan

diklorometana, kemudian saring dan cuci dengan pelarut yang sama.

Filtrat kemudian diuapkan dengan rotary evaporator (atau distilasi biasa

dengan penagas air pada suhu 60oC). Dilakukan uji kemurnian fraksi

yang diperoleh dengan KLT (eluen CH2Cl2 : MeOH = 97 : 3).

Dibandingkan kemurniannya dengan fraksi hasil pemisahan secara

kromatografi kolom!

VI. Hasil & pembahasan

Hasil pengamatan

20 gram rumpang kunyit + 50 ml diklorometana direfluks 1 jam

menghasilkan padatan dan berwarna kuning kemerahan

Hasil refluks di saringan dengan vakum menghasilkan kurkumin

kuning kemerahan

Distilasi pada penangas air pada suhu 50°C menghasilkan kurkumin

kuning kemerahan murni + n-heksana menghasilkan kurkumin

memadat atau mengkristal.

kromatografi kolom, kapas + silikagel + estrak kurkumi + eluen

CH2CI2 : MeOH = 99 : 1 menghasilkan kolom terbentuk tiga fraksi

senyawa yang ditandai dengan warna yang berbeda. Dan atas ke

bawah berturut-turut adalah warna coklat kemerahan, oranye, dan

kuning.

kromatografi lapis tipis dengan eluen CH2CI2 : MeOH = 97 : 3 +

totolkan ekstrak kurkumin dengan pipa kapiler di atas silica.

Menghasilkan nilai Rf 0,9 cm.

Pembahasan

Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen

dan suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara dua fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam mungkin berupa padat atau cair

yang terikat pada bahan padat atau gel. Fase padat dapat terkemas dalam

kolom, tersebar sebagai suatu lapisan, atau terdistribusi sebagai lapisan

film. Fase gerak dapat berupa gas atau cair yang mengalir atau berpindah

dalam arah tertentu (Pure and Applied Chem, 37, 447, 1974). Analisis

dengan kromatografì dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif

maupun analisis kuantitatif. Berdasarkan mekanisme pemisahannya,

kromatografi dapat dibedakan menjadi:

Kromatografì adsorbsi

Kromatografi partisi

Kromatografì pasangan ion

Kromatografì penukar ion

Kromatografì eksklusi ukuran

Selain itu, kromatografi dapat dibedakan berrdasarkan media yang

digunakan, yaitu:

Kromatografi kertas

Kromatografi lapis tipis (KIT)

Kromatografì Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografì Gas

Kurkumin adalah komponen utama senyawa kurkuminoid hasil metabolit

sekunder yang banyak terdapat pada tanaman jenis kunyit dan temulawak

(suku Zingiberaceae). Senyawa kurkuminoid lainnya adalah bis-demetoksi

kurkumin dan demetoksi kurkumin. Dalam dunia farmasi, penggunaan

kurkumin sebagai senyawa bahan obat telah dilakukan secara luas,

diantaranya adalah sebagai antioksidan, antiinflamasi, antiinfeksi, dan

antiviral. Pada tingkat penelitian yang lebih lanjut, kurkumin diduga dapat

bermanfaat sebagai antitumor, bahkan dapat melakukan penghambatan

replikasi human immunodeficiency virus (HIV).

Kurkumin dapat ditemukan pada dua bentuk tautomer, yaitu bentuk keto

dan bentuk enol. Struktur keto Iebih stabil atau Iebih banyak ditemukan

pada fasa padat, sedangkan struktur enol Iebih dominan pada fasa cair atau

larutan.

Untuk mengisolasi kurkumin dari kunyit, serbuk kunyit dilarutkan dalam

diklorometana. Sebagai pelarut, digunakan diklorometana karena

merupakan pelarut non polar karena senyawa yang ada dalam kunyit

merupakan senyawa organik yang cenderung bersifat non polar. lnteraksi

antar molekul non polar ini akan melarutkan senyawa yang ada dalam

kunyit termasuk kurkumin pada pelarutnya. Campuran rumpang kunyit

dengan diklorometana selanjutnya direfluks selama satu jam. Proses ini

bertujuan untuk mengekstrak kurkumin yang ada pada kunyit. Pada saat

refluks suhunya 5 oC, suhu larutan sebaiknya tidak terlalu tinggi karena

proses ini berjalan relatif lambat. Jika suhu terlalu tinggi, ekstraksi tidak

berjalan dengan sempurna sehingga tidak semua kurkumin pada kunyit

dapat diekstrak. Setelah proses refluks selesai, campuran disaring dengan

penyaringan vakum dan larutan berwarna kuning hasil penyaringan

selanjutnya dipekatkan dengan melalukan distilasi pada penangas air pada

suhu 50°C. Distilasi ini bertujuan untuk menguapkan pelarut

(diklorometana) sehingga diperoleh kurkumin kuning kemerahan.

Kemudian ditambahkan dengan n-heksana yang bertujuan untuk

menjenuhkan campuran sehingga kurkumin memadat atau mengkristal.

Setelah didapat ekstrak kurkumin, lakukan kromatografi kolom.

Kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion

berdasarkan perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-ion

tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Fasa diam merupakan fasa yang

tidak bergerak, senyawa yang digunakan adalah silica gel. Fasa gerak

merupakan fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa

komponen-komponen yang akan dipisahkan, menggunakan suatu pelarut

organik atau campuran beberapa pelarut organik. Dalam kromatografi

kolom, kolom bagian dasar buret dibalut kapas yang telah diberi aseton

untuk menghilangkan gelembung udara. Aseton akan menyerap panas dari

buret danterjadi penurunan suhu sehingga gelembung naik ke permukaan.

Kemudian kolom disiapkan dengan silika gel sebagai fasa diam dan

CH2CI2 : MeOH = 99 : 1 sebagai fasa gerak. Dalam proses kromatografi

kolom adsorben silika gel harus terus basah karena, jika dibiarkan kering

kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan

zat tidak berjalan optimal. Selain itu, juga untuk memudahkan proses elusi

(larutan melewati kolom) dalam kolom. Karena digunakan silika gel yang

sangat polar, maka komponen yang bersifat lebih polar atau cenderung

polar akan berinteraksi dengan kuat, akibatnya akan tertahan lebih lama

pada fasa diam. Setelah dilakukan elusi, ada kolom terbentuk tiga fraksi

senyawa yang ditandai dengan warna yang berbeda. Dan atas ke bawah

berturut-turut adalah warna coklat kemerahan, oranye, dan kuning.

Komponen yang berwarna coklat kemerahan adalah demetoksi kurkumin.

Komponen oranye adalah bis-demetoksi kurkumin, dan komponen kuning

adalah kurkumin. Ditinjau dari segi kepolaran molekul, urutan dan yang

paling polar ke yang kurang polar adalah demetoksi kurkumin, kurkumin,

dan bis-demetoksi kurkumin. Akan tetapi, pada kolom kurkumin

menempati fraksi yang paling bawah, yang memiliki afinitas dengan silika

gel paling kecil. Hal ini terjadi karena adanya ikatan hidrogen antar

molekul kurkumin sehingga mengurangi kekuatan untuk berinteraksi dan

membentuk ikatan dengan silika gel.

Selain menggunakan kromatografi kolom, padatan yang dihasilkan

dianalisis juga dengan kromatografi lapis tipis dengan eluen CH2CI2 :

MeOH = 97 : 3 yang nonpolar dan fase diamnya merupakan silica yang

polar, kurkumin yang memiliki struktur simetris merupakan senyawa

nonpolar. Sehingga eluen menarik kurkumin yang di totolkan dengan pipa

kapiler di atas silica. Karena eluen yang non polar akan menarik kurkumin

yang nonpolar. Maka didapat nilai Rf adalah 0,9 cm.

VII. Kesimpulan

Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen

dan suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara dua fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam mungkin berupa padat atau cair

yang terikat pada bahan padat atau gel. Fase padat dapat terkemas dalam

kolom, tersebar sebagai suatu lapisan, atau terdistribusi sebagai lapisan

film. Fase gerak dapat berupa gas atau cair yang mengalir atau berpindah

dalam arah tertentu. Kurkumin adalah komponen utama senyawa

kurkuminoid hasil metabolit sekunder yang banyak terdapat pada tanaman

jenis kunyit dan temulawak (suku Zingiberaceae). Senyawa kurkuminoid

lainnya adalah bis-demetoksi kurkumin dan demetoksi kurkumin.

Kromatografi kolom, padatan yang dihasilkan dianalisis kromatografi lapis

tipis dengan eluen CH2CI2 : MeOH = 97 : 3 yang nonpolar dan fase

diamnya merupakan silica yang polar, kurkumin yang memiliki struktur

simetris merupakan senyawa nonpolar. Sehingga eluen menarik kurkumin

yang di totolkan dengan pipa kapiler di atas silica. Karena eluen yang non

polar akan menarik kurkumin yang nonpolar. Maka didapat nilai Rf adalah

0,9 cm.

VIII. Pustaka