KROMATOGRAFI KOLOMKromatografiadalah suatu teknik pemisahanmolekulberdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen berupa molekul yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerakakan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakandetektoratau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut(Anonim, 2012).Digunakan untuk memisahkan pigmen-pigmen yang terdapatpada tumbuhan.

Cara kerjanya :Campuran pigmen-pigmen dari tumbuhan dimasukkan padakolom gelas yang berisi alumina. Pelarut kemudian dialirkanuntuk membawa campuran melewati kolom. Pigmen-pigmenakan bergerak turun melewati kolom dengan kecepatan berbedatergantung kuat lemahnya absorpsi pigmen pada alumina.Pigmen yang terabsorp lemah akan melewati kolom lebih cepatdaripada pigmen yang terabsorp kuat. Pigmen-pigmen ini dapatdipisahkan dengan mengumpulkannya pada wadah yangberbeda ketika keluar dari kolom.

Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :a. Kromatografi fase normalKromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat polar, misalnyasilica gel,sedangkan fase geraknya bersifat non polar.b. Kromatografi fas terbalikKromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.Senyawa kurkumin dapat mengalami penurunan dengan lepasnya gugus OCH3dalam setiap penurunan. Kurkumin akan mengalami dua kali penurunan, dimana turunan pertamanya adalahdemetoksi kurkumindan turunan keduanya adalahbis-demetoksi kurkumin.Kurkumin akan terelusi paling akhir (berada paling bawah) karena sifatnya yang polar. Perlu diingat bahwa penurunan ini tak mungkin terjadi dengan hanya dengan melakukan kromatografi, tp ada perlakuan khususnya.Ketika senyawa kurkumin telah mengalami degradasi, akan menjadi senyawa demetoksi kurkumin (terdapat pada bagian tengah) yang lebih polar dari kurkumin. Karena telah kehilangan sebuah gugus OCH3.Senyawa ini merupakan turunan kedua dari senyawa kurkumin. Karena tidak lagi mengandung gugus OCH3, maka senyawa ini merupakan senyawa yang bersifat paling polar dari antara ketiga jenis senyawa kurkumin. Dengan begitu, senyawa ini akan terelusi terlebih dahulu (berada pada lapisan yang paling atas) karena fasa diam yang digunakan (silica gel) bersifat polar.Apabila kita menggunakan kromatografi lapis tipis, dapat diperoleh dengan adanya 3 titik titik pada pelat TLC. Hal ini menunjukkan adanya 3 komponen utama yang terkandung dalam senyawa kurkumin yang di-refluksi. Adapun 3 komponen utama tersebut adalah senyawa-senyawa kurkuminoid yaitu kurkumin (diferuloylmethane), demetoksikurkumin (hydroxycinnamoyl feruloylmethane) & bis-demetoksikurkumin (dihydroxydicinnamoyl methane).Setelah daerah dari nodayangterpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasiyangpaling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapistipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogramdanpada kondisi konstan merupakan besaran karakteristikdanreprodusibel. pada permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut sebagai fase gerak.b. Kromatografi Kolom.Kromatografi kolom digunakan untukdigunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa. Kolom yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri (dielusi) dengan fase gerak berupa pelarut.Sampel yang mengandung campuran senyawa dituangkan ke bagian atas dari kolom, kemudian dielusi dengan pelarut sebagai fase gerak. Setiap senyawa/komponen dalam campuran akan didorong oleh fase gerak dan sekaligus ditahan oleh fase diam. Kekuatan senyawa ditahan oleh fase diam akan berbeda dengan senyawa lainnya.Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi kolom adalah fase diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam), ukuran kolom (diamter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi.