Az immunoassay elve

Kıszegi TamásPécsi Tudományegyetem

Laboratóriumi Medicina Intézet

Alapfogalmak - antigén

• Antigén: a szervezetben ellenanyagtermelést kiváltó anyag pl. vírus, baktérium, pollen, idegen egyedbıl származóellenanyag, fehérje, sejt, szövet, stb., de lehet saját molekula is (autoimmunitás)

• Epitóp: Az antigén azon része (molekula csoportja), amellyel az ellenanyaghoz kötıdik. Makromolekula antigének több epitóppal is rendelkezhetnek

Alapfogalmak - antigén

• Komplett – képes immunválaszt kiváltani (fehérjék, poliszaharidok, nukleinsavak)

• Haptén – kis molekula, nem immunogén csak hordozómolekulával együtt

Alapfogalmak - antitest

Antigén köt ı hely

Könny ő lánc

Nehéz lánc

Alapfogalmak - antitest

• Poliklonális, monovalens antitest

Alapfogalmak - antitest

• Monoklonális, monovalensantitest

Niels K. Jerne, GeorgesJ.F. Köhler és CésarMilstein, 1984

Antigén – antitest reakció

Antigén illeszkedése a hipervariábilis régióba

Affinitás: a köt ıdés erıssége egy adott epitóphoz

Aviditás: kötés er ıssége komplex antigén-antitest rendszerben (több epitópés poliklonális antitest van egyszerre jelen)

Antigén – antitest reakció• Specificitás: egyetlen epitóp

felismerése (monoklonális antitestek) vagy egyetlen molekulán több epitópfelismerése (poliklonális antitestek)

• Keresztreakció:

Az immunoassay fogalma

• Antigén – antitest reakción alapulóérzékeny és specifikus módszer, mellyel nagyon kis koncentrációban jelenlévı, antigén sajátságot mutató molekulák mennyisége meghatározható. A mérés során jelölı anyagot alkalmazunk, a módszer elnevezése a jelölés természetén alapul (RIA 1959, FIA, EIA, LIA, ECLIA, FPIA, stb.)

A szekvenciális elv

• Elsıdleges (primer) antitest alkalmazásapl. egér monoklonális

• A primer antitest ellen termelt másodlagos (szekunder) antitest jelölıvel

Jelölési lehet ıségek• Radioizotóp – I 123

• Kovalens fluoreszcens kötés – FITC • Kovalens lumineszcenciás jelölés –

akridinium észter, dioxetan, ruténium• Fluoreszcencia energia transzfer• Kovalens enzim jelölés – AP, HRP,

G6PD (színezék, fluoreszcens –lumineszcens jel az enzim aktivitás hatására jön létre)

• Antitestet vagy az antigént jelöljük

Fluoreszcencia energia transzfer

Energia transzfer

Molekuláriskölcsönhatások(antigén-antitest)

Fluoreszcencia polarizáció

Fényforrás Monokromátor

Polarizátor szőrı

Gerjesztı fény

Monokromátor

Fluoreszkáló minta

Emittált fény

Fotodetektor

Analizátor szőrı P = Ivv-F*Ivh

Ivv+F*Ivh

Fluoreszcencia polarizáció –molekuláris mozgásszabadság

Kisméret ő jelzett antigén- alacsony polarizáció

Nagyméret ő jelzettimmunkomplex- magas polarizáció

Immunoassay típusok

• Az antigén-antitest reakció szerint:Nem kompetitív módszerKompetitív módszer

• A meghatározás fizikai módja szerint:Szilárd fázisú (heterogén) assayHomogén assay

Nem kompetitív (szendvics) módszer

Antigén

Antigén

1. antitest

2. antitest + AP enzim

2. antitest + AP enzim

Kemilumineszcens szubsztrát

Kemilumineszcens szubsztrát

Szilárd fázisú assay

Jel – koncentráció összefüggés

Lineáris regressziós 4 (vagy 5) paramét eres illesztés illesztés

CL

Jel

LOG analyte

Kompetitív módszer

Szilárd fázisú assay

Mintában lév ı antigén Reagensben lév ı jelzett antigén

Jel – koncentráció összefüggés

Kompetitív assay kalibrációs görbéje4 paraméteres szigmoid görbe illesztésB=standardra mért jel, B0=zéró standardra mért jel

Kalibrációs típusok

• 6 pontos kalibráció (2 parallel mérés)

• Mester kalibráció: 2 pontos mérés (2 –4 parallel)

• Mind kompetitív, mind nem kompetitív módszerekre alkalmas

Mester kalibráció• Gyártó által adott lot számra meghatározott kalibrációs

görbe (mester görbe)• Ha szükséges, lineáris transzformáció (logit/log)• Fix meredekségnél 1 kalibrátor szükséges• Nem fix meredekségnél min. 2 kalibrátor szükséges • A saját mőszerre kapott egyenes meredekségét és

tengelymetszetét összehasonlítjuk a mester görbe adataival, ha szükséges a saját görbét a mester görbéhez illesztjük (eltoljuk).

• Megengedett eltérés (meredekség): 0,8 – 1,2 A tengelymetszetet is figyelembe kell venni

Példa a mester kalibrációraAz alapkészülék és a saját készülék kalibrációjának

egymáshoz való viszonyítása

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000

felhasználó készüléke (cps )

alap

kész

ülék

(cps

)

F

E

D

C

A,B

Meredekség =1,068 Tengelymetszet=3226,73

Kalibráció elfogadása

• Meredekség, tengelymetszet• Linearitás• Parallel mérések szórása• Legtöbb automata készülék

visszautasítja a nem elfogadhatókalibrációt

• Belsı kontroll és lehet ıleg független kontroll mérése is szükséges

Homogén módszerek

• Nincs szükség mosási lépésre és fázis szeparációra

• Mind kompetitív, mind telítési assaytípusra alkalmas

• Gyors

Homogén fluoreszcens energia transzferen alapuló immunoesszé

PCT

1st antibody

2nd antibody

Homogén fluoreszcens energia transzfer assay id ıfelbontású mérés

5/5

Fluoreszcens jel és a lecsengési idı függvénye:

FPIA gyógyszer monitorozás

Kompetitív módszer, a jelzett gyógyszer és a betegben lév ı gyógyszer vetélkedik az antitest kötésért

Kevés analit: gátolt rotáció, magas polarizáció

Sok analit: szabad rotáció, alacsony polarizáció

Szabad hormonok mérése

• Kompetitív módszer

• Fehérjéhez kötött hormon – szabad hormon megoszlása nem változhat (FT4, FT3)

• Linearitási tartományon túl hígítani nem szabad a mintát!

TRAK/TRAB mérése

Y

Y

YY

Y

Y

Humán rekombináns TSH receptor

Bovin TSH lumineszcens jelöl ıvel

TRAK (autoantitest)

TSH receptor- jelzett TSH komplex

Humán TSH receptor-TRAKautoantitest komplexY

Bevont cs ı kompetitív assay

TRAK/TRAB mérése –kalibrációs görbe

Interferenciák - preanalitika

• Lipemia• Icterus• Hemolízis• Gyógyszerek (heparin – szabad zsírsav)• Gyógyszerek – direkt interferencia• Fagyasztás – felolvasztás• Minta stabilitása (mintavétel)

Interferenciák - analitika• High dose hook effektus• Keresztreakciók• Heterofil, állat-specifikus, analit-specifikus

antitestek• Rheuma faktor • Specifikus autoantitestek (ATG)

Interferenciák - egyéb

• Mátrix hatások• Minta típus, alvadásgátlók• Hígító oldatok• Extrakciós módszerek• Kontroll minták mátrixa