Kỹ thuật sắc ký Chromatography Technology Các kỹ thuật ... 6 Cac ky thuat phan tich chua… · Kỹ thuật sắc ký Chromatography Technology ... lớn nhất sẽ có

1

31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí1

Các kỹ thuật phân tích trong Côngnghệ Sinh học Thực phẩm


Kỹ thuật sắc kýChromatography Technology


Nguyên tắc của phương pháp sắc ký

Sự phân tách các chất tan dựa vào ái lực tương đối của: chất tan đốivới pha di động và chất tan đối với thể nền.Một chất tan có ái lực đối với pha di động lớn hơn so với ái lực vớithể nền sẽ có xu hướng di chuyển cùng pha so với pha di động.Trong một dung dịch có n chất tan, chất nào có ái lực với pha di độnglớn nhất sẽ có thời gian lưu nhỏ nhất, sẽ ra khỏi cột sắc khí sớmnhất.


Nguyên tắc của phương pháp sắc ký


Các phương pháp sắc ký

Sắc ký hấp thục (Adsorption chromatography)

Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange chromatography)

Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography)

Sắc ký ái lực (Affinity chromatography)

Sắc ký đảo pha (Reverse phase chromatography)

Sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography)


Kyõ thuaät saéc kyù• Mẫu (sample): cần được lọc trước khi chạy sắc ký.• Buffer: lọc nhằm loại bỏ tạp nhiễm trước khi sử dụng.• Pha động (mobile phase): Dung môi bơm từ reservoir

vào cột (column) sắc ký. Nhiều hơn một reserovoir, phađộng được bơm vào Mixer (máy trộn) trước khi vào cột.

• Pha tĩnh (stationary phase): Được giữ lại trong cột bởimôt miếng bông thủy tinh ở đáy cột.

• Các phân tử sinh học được tách ra tại cột sắc ký.• Trong HPLC, Guard column được sử dụng nhằm bảo vệ

cột sắc ký.• Detector: UV bước sóng 280 nm detect hầu hết protein• UV 205 – 220 detect cả những protein hay peptide ít cấu

tử có mạch vòng.

2


Saéc kyù loûng (liquid chromatography)


Thành phần cơ bản• Partition coefficient:

Cs: nồng độ mẫu trong pha tĩnh (Stationary phase)Cm: nồng độ mẫu trong pha động (Mobile phase)

31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí9 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí10

Saéc kyù loûng


Thông số trong sắc ký lỏng• Retention time (tR): thời gian phân tử sinh học ra

khỏi cột sắc ký tính từ lúc nạp mẫu.• retention volume(VR):

• Rf


Thông số trong sắc ký lỏng

• Resolution (R): Thông số dùng đánh giá mức độtách các phân tử sinh học trong mẫu.

• W: độ rộng của đáy beat.

3


Pha tĩnh (stationary phase)


Tách rửa khỏi cột (elution)

• Mobile phase: đường chấm, có pH, lực liên kết ion, tínhphân cực thay đổi theo dãy. Giảm hệ số K.

• Mỗi phân tử sinh học trong mẫu có khả năng ái lựcriêng đối với pha tĩnh.


Open column chromatography(low performance liquid chromatography)

• Sử dụng áp suất khí quyển, độ phân tách thấp• Đường kính của các hạt trong pha tĩnh tương đối lớn.• Cột sử dụng các vật liệu rẻ tiền. Vd: plastic.-Độ phân tách thấp.


Sắc ký lỏng hiệu năng cao(High performance liquid chromatography

– HPLC)• Phase ñoäng ñöôïc bôm vaøo heä thoâng vôùi toác ñoä doøng

chaûy cao (high flow rate) bôûi aùp suaát cao (55 Mpa).• Ñöôøng kính caùc haït trong pha tónh nhoû, chöùa loã nhoû li

ti giuùp caùc phaân töû sinh hoïc ñi vaøo, vaø ñaëc bieät chòuñöôïc aùp suaát cao (caùc haït phaûi raén hôn caùc haït ñöôïcduøng trong open column chromatography)• Vieäc taùch röûa toát khi toác ñoä pha ñoäng oån ñònh.• Trong HPLC, pha ñoäng thöôøng laø hoãn hôõp cuûa hai

thanh phaàn hoaëc nhieàu hôn -> mixer.• Ñöôøng oáng vaø coät saéc kyù ñöôïc laøm baèng theùp khoâng

ró.• Dung moâi phaûi ñöôïc khöû khí vaø loïc tröôùc khi söû duïng.


Sơ đồ hệ thống HPLC


Sắc ký lọc gel (gel filtration)

• Size exclusion chromatography hay gel filtration• Phân tử sinh học được giữ trong pha dung môi

suốt quá trình sắc ký.• Tách lọc các phân tử sinh học dựa trên kích

thước và hình dáng.

4



• Protein nhỏ vào các hạt beadvà được giữ lại.

• Cột thủy tinh• Các hạt gel polysaccharide.

• Các protein lớn bị lọai rakhỏi hạt và ra khỏi cột sắc kýtrước protein nhỏ hơn.



• Pha tĩnh gồm các hạt gelchứa nhiều khoảngkhông nhỏ (xốp).

• Protein càng nhỏ, càngdễ vào hạt gel và đượcgiữ lâu hơn.

• Protein tách rửa khỏi cộttheo thứ tự khối lượngphân tử giảm dần.



• Ứng dụng:• Xác định khối lượng phân tử• Loại bỏ các phân tử có kích thước nhỏ không

cần thiết. Vd: Loại bỏ muối khỏi dung dịchprotein trước khi thực hiện sắc ký trao đổi ion.

• Tinh sạch protein


Sắc ký hấp phụ• Trong sắc ký hấp phụ, chất tan

và pha động cùng tranh nhau vịtrí gắn trên pha tĩnh.

• Pha tĩnh có cấu trúc mở giúpprotein dễ dàng thâm nhập vào

các hạt tiến về vị trí gắn kết(binding site)

• Tùy vào kiểu liên kết giữaprotein và pha tĩnh:

– Sắc ký trao đổi ion– Sắc ký ái lực– Sắc ký kỵ nước– Sắc ký ngược pha


Saéc kyù trao ñoåi ion

5


• Protein thay thế counterionNa+, Cl− gắn vào pha tĩnhbằng lực hút tĩnh điện.

• Khi đó Na+, Cl- được gọi làIon exchange group hayion Exchanger.

• Sự gắn kết hoàn toàn->trung hòa điện

Saéc kyù trao ñoåi ion


Điện tích trên protein thay đổi theopH môi trường

• Điện tích protein do điện tích các mạch nhánh (R sidechain)cấu tử ở môi trường pH nhất định quyết định.

• Tại pH acid, hầu hết Protein tích điện dương vàngược lại.



Các nhóm tích điện


Ion exchanger

• Có 2 loại ion exchanger:

• Cation exchanger: có khảnăng gắn kết ion dương

• Anion exchanger: có khảnăng gắn kết ion âm

• Mạch nhánh tích điệngắn vào: cellulose,Agarose, dextran, haysilica (HPLC)

6


Moät soá ion exchanger thoâng duïng


Tách rửa

• Gradient nồng độ NaCl và KCl được dùng để táchrửa protein ra khỏi cột sắc ký. (Cũng có thể dùnggradient pH của buffer)


Sắc ký kỵ nước (hydrophobic chro.)

• Non – polar side chain: Ala,• Val, leu, Ile, Trp, Met, Phe,

Pro. Thường tâp trung tại lõiprotein.

• Có thể tìm thấy trên bề mặtprotein các protein khácnhau có tính kỵ nước bềmặt khác nhau.

• cơ sở của sắc ký kỵnước.



Các loại ligand

7


Tách rửa

• Protein được nạp vào cột sắc ký chứa nhóm octylvà phenyl với sự hiện diện 2M (NH4)2SO4.

• Tách rửa: dùng gradient nồng độ giảm dần (2M – 0)(NH4)2SO4


Normal phase chromatography

• Pha tĩnh: phân cực.• Pha động: gradient nông

độ dung moi phân cựctăng dần.

• Protein phân cực hơn sẽra khỏi cột sau và ngượclại.


Sắc ký ngược pha


Sắc ký ngược phase (reverssephase chro.)

• Pha tĩnh: các nhánh hydrocarbon (C-4, C-8, C-18) được gắn lên pha tĩnh.

• Mẫu được cho vào dung môi phân cựcnhư: nước, methanol, acetronitrile…hoặchỗn hợp.

• Proteins sẽ gắn vào pha tĩnh theo tươngtác kỵ nước theo các mức độ khạc nhau.

• Tách rửa: sử dung gradient nồng độ tăngdần acetonitrile và gradient nồng độ nướcgiảm dần -> sự tăng dần của tính kỵ nướctrong pha động


Sắc ký ái lực (affinity chro.)

• Enzyme nhận biết vàgắn với cơ chất là mộtdạng ái lực.

• -> lý thuyết xây dựngsắc ký ái lực.

• Pha tĩnh: Affinityligand được cố trênpha tĩnh.


Sắc ký ái lực (affinity chro.)

8



Một số ví dụ sắc ký ái lực

• Antigen ligand -----antibody• Protein A được cố định trên pha tĩnh.• IgG (immunoglobulin)sẽ gắn với protein A tại

vùng Fc: nồng độ muối cao, Ph cao.• Tách rửa: pH 2-4; IgG 1; IgG 2a; IgG 2b… được

phân tách ra khỏi cột dựa vào sự khác nhau củavùng Fc.


Qui trình ELISA

Modified from Specter, S. C., R. L. Hodinka and S. A. Young. Clinical Virology Manual, Third Edition . ASM Press, 2000. 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí48 © Hank Morgan/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.

Figure 5.20: HIV ELISA test.

9


Mẫu xét nghiệm

E

E

30 phút, T thường

Cơ chất

Ngư

ngph

ảnứn

g.Đ

ọckế

tquả

Cộng hợp

Ủ ở 37 °C

RỬA

RỬA

Ủ ở 37 °C

Kỹ thuật ELISA gián tiếp

Phaûn öùng maøu tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä khaùng theå


30 phút/ 37 °C

Mẫu XN

KN gắn trêngiếng

+RỬA3X

RỬA5X

cơ chât

30 phút/ 37 °C 30phút/ To phòng

Ngưngphảnứng.Đọckếtquả450nm

E

Cộng hợp

+

Kỹ thuật ELISA SANDWICH

Phaûn öùng maøu tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä khaùng theå


Mẫu xét nghiệm

E

E

30 phút, T thường

Cơ chất

Ngư

ngph

ảnứn

g.Đ

ọckế

tquả

Cộng hợp

Ủ ở 37 °C

RỬA

Kỹ thuật ELISA cạnh tranh

Phaûn öùng maøu tyû leä nghịch vôùi noàng ñoä khaùng theå


Y

Y

KN & KT Mẫu XN

Bước 1: Ủ 60 phút/ 37 °C

+RỬA3X

RỬA5X cơ chât

Bước 2 : 30 phút/ To phòng 30phút/ To phòng

Cộng hợp

+

Y E

E

?

Kỹ thuật ELISA phát hiện đồng thờiKháng nguyên và Kháng thể


Tách chiết nucleic acid- định tính và định lượng cơ bản

1. Các phương pháp tách chiết nucleic acid Phương pháp tách chiết DNA

Phương pháp tách chiết RNA toàn phần vàmRNA Ly tâm Phương pháp sắc ký

2. Các phương pháp định tính và định lượng thônucleic acid Phương pháp đo bằng quang phổ kế Phương pháp điện di


Tách chiết DNA

Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạpnhiễm, mà quan trọng nhất là protein.

Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau củacác phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai phakhông hòa tan (phenol, chloroform/nước).

Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng tháinguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ họchay hóa học.

Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độthấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase vàRNase).

Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trongmột thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm chophép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản vàkhi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn.

10


Tách chiết DNA

• Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân• Bước 2: loại protein• Bước 3: thu hồi nucleic acid


Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗnhợp chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màngnhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy cácprotein liên kết với DNA.– Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và

các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng.– Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không

ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn. Loại protein: lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để biến

tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein bị biếntính không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khili tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và phaphenol:chloroform. Thu hồi nucleic acid trong pha nước.

Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc đểbảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thểhòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa trongethanol hoặc isopropanol. Sau đó li tâm để thu nhận lại nucleicacid. Cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muốihoặc các dấu vết của isopropanol.

Tách chiết DNA


Ly tâm phân đoạn (a)và phân đoạn vùng(b) phân tách cáctrình tự trong hỗnhợp dựa trên khốilượng của chúng.Thời gian và lực lytâm được xác địnhcho từng nhóm phầntử. Dung dịch ly tâmcó tỷ trọng thấp hơncác phần tử cần phântách.

Tách chiết DNA


Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân táchcác phần tử trong hỗn hợp dựa trên tỷtrọng của chúng. Thời gian và lực ly tâm làchung cho các nhóm phần tử. Dung dịchly tâm có tỷ trọng với giá trị đi từ thấp đếncao hơn tỷ trọng của các phần tử cầnphân tách.

Ly tâm trên gradient liên tục CsCl: trongquá trình ly tâm, dung dịch CsCl sẽ tựđộng hình thành một gradient đẳng tỉtrọng với tỉ trọng tăng dần từ miệng ốngxuống đáy ống. Dưới tác động của lực lytâm, các nucleic acid di chuyển trong ốngvà đến vị trí có tỉ trọng bằng với tỉ trọngcủa chính nó sẽ ngừng lại và hình thànhmột lớp cố định trong ống. Lớp này đượcthu nhận lại sau ly tâm.

Tách chiết DNA


Phương pháp sắc ký

• Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligodT-cellulose, dùng để tinh sạch mRNA.

• Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các nucleicacid và nucleotic tự do sau quá trình tạo mẫu dò(probe) đánh dấu.

• Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi nhữnglượng rất nhỏ DNA.

• Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải rấtcao, được dùng trong tinh sạch cácoligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách cácđoạn DNA.


2. Các phương pháp định tính vàđịnh lượng thô nucleic acid

• Điện di:- Gel agarose- Gel polyacrylamide

• Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Opticaldensity)

11


Phương pháp điện di• Mục tiêu: Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm

lượng Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng, …)• Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic

acid: tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của mộtđiện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điệntrường.Tính linh động của phân tử khi di chuyển trong điệntrường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độcác chất cấu thành gel.

• Kiểu điện di: Agarose, polyacrylamide, điện di trongtrường xung(PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis)


Điện di - Electrophoresis

• Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…),bồn điện di, buffer, dung dịch điện di…

• Nạp mẫu• Chạy điện di• Nhuộm gel.


Điện di trên gel• Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…),

bồn điện di, buffer, dung dịch điện di…• Nạp mẫu• Chạy điện di• Nhuộm gel.


Chất nhộm gel - Stain


Điện di trên gel agarose

• Gel agarose là loại gel thông dụng nhất,thường dùng để phân tách những đoạncó kích thước 0,5-20 kb.

• Điện di theo phương nằm ngang• Độ phân giải thay đổi khi nồng độ

agarose hay loại agarose thay đổi.• Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhuộm

ethidium bromide. Chất này có khả nănggắn xen vào giữa các base của nucleicacid và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tửngoại.

• Ứng dụng: phát hiện 1 trình tự DNA,phân tích hỗn hợp các trình tự DNA(Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu


Điện di biến tính(Denaturing electrophoresis)

• SDS polyacrylamide gelelectrophoresis (SDSPAGE):

• Gel: polyacrylamide• SDS: Mạch 12 cacbon kỵ

nước và một đầu hiếunước.

• -> che phủ phần kỵ nướctrên protein -> protein tíchđiện âm (-).

12


Điện di trên gel polyacrylamide• Được dùng để tách các đoạn có kích

thước nhỏ, dưới 1000 cặp base.• Điện di theo phương thẳng đứng• Độ phân giải cao, phân biệt được những

trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide.• Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ

tự ghi, xanh methylene, ethidium bromide,protein – xanh Coomassie, nhuộm nitratebạc.

• Ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotictổng hợp, xác định trình tự DNA, tách cáctrình tự DNA có kích thước gần bằngnhau, SDS-PAGE (phân tích protein)


Phương pháp định lượng bằngquang phổ kế

• Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acidcó trong mẫu.

• Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tửngoại ở bước sóng 260 nm của các base.

• Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫuđo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫudựa vào mối tương quan:Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ:

50μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi 40 μg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn

Định tính: độ sạch dựa trên tỉ số OD260/OD280, tính chấtcủa nucleic acid (mạch đôi/đơn) (280 nm là bước sóngở đó các protein có mức độ hấp thụ cao nhất.


Các phương pháp lai phân tử


Cơ sở của sự lai phân tử

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệtđộ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì hai mạch sẽtách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết H giữa haimạch.

Sau khi hai mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng đượclàm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp,chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này được gọi là sựlai phân tử.

Đặc điểm của sự lai phân tử: Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai

trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến

sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA haycác phân tử lai DNA-RNA


Các kiểu lai phân tử

• Lai trên pha lỏng• Lai trên pha rắn• Lai tại chỗ


Lai trong pha lỏng:Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là một dung

dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặpnhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trườngthấp hơn Tm. Phương pháp này được sử dụng để pháthiện các trình tự tương đồng (giữa các loài hay trongmột cá thể).

13


Lai trong pha rắn: Mộttrong hai trình tự cần laiđược cố định trên giáthể rắn (màng lai). Pháthiện phân tử lai thôngqua mẫu dò (probe) cóđánh dấu đồng vịphóng xạ.

Ba kĩ thuật lai trên pharắn thông dụng làSouthern blot, Northernblot, Dot blot.


Lai tại chỗ:Trình tự nucleic acid cần tìm không được tách chiết rakhỏi mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã đượcđánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiệnngay trên nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô.


Southern blot

• Nguyên tắc của Southern blot là màng lainitrocellulose có khả năng tiếp nhận DNA đã đượcbiết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiêncứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên1950 và 1960.

• Đầu thập niên 1970, sự ra đời của phương phápđiện di trên gel đã cho phép các đoạn DNA đượccắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựatrên cơ sở kích thước của chúng.

• Từ đó bước phát triển tiếp theo của phương pháplà chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên mànglai nitrocellulose.

• Phương pháp này được E. M. Southern mô tả tạiÐại học Edingburgh vào năm 1975.


Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:– Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.– Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.– Làm biến tính DNA ngay trên gel, DNA sợi kép sẽ được tách thành

DNA sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.– Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay

màng nylon). Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng hoạttính mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng một thiết bịthấm chân không. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫnđược giữ nguyên không thay đổi.

– Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA cóđánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNAtrên màng lai với mẫu dò. Ðể đánh dấu người ta thường sử dụngP32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học.

– Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nếu sử dụng mẫu dò đánhdấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi(autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thìdùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò phát quangsinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.

Southern blot


Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot


Northern blot• Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào

năm 1975, người ta đã dùng một phương pháp tương tự đểxác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot.

• Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:– RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng

điện di trên gel agarose.– RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các

phân tử RNA giữ nguyên vị trí như ở trên gel).– RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn

(hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với mộtenzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase)tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.

– Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tựghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫudò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất khôngmàu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩmmàu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được pháthiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.

14

31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí79Sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí80

Phương pháp PCR

• PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dâychuyền nhờ polymease) là một trong những phương phápđược sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học phântử. Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm1985; được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ởCold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giảithưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993.

• Nguyên tắc của phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạtđộng của DNA polymerase: cần sự hiện diện của những mồichuyên biệt để hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từmạch khuôn. Như vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệtbắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉtổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi.

• Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chínhxác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháphiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của mộtgen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.


Ba giai đoạn trong một chu kỳ củaphản ứng PCR

Giai đoạn biến tính(denaturation)Trong giai đoạn này phân tửDNA mẫu bị biến tính ở nhiệtđộ cao (thường là từ 94-950C,lớn hơn nhiệt độ nóng chảycủa phân tử) trong vòng 30giây đến 1 phút, tất cả các liênkết hydro giữa hai mạch củaphân tử bị bẻ gãy và tạo thànhcác DNA sợi đơn.

Giai đoạn kéo dài (elongation)Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất.Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuônđể tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấubởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéodài từ 30 giây đến nhiều phút.

Giai đoạn lai (hybridization)Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-700C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụngkhoảng từ 3-50C) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cầnđược khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút.


Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệtđộ trong một chu kỳ của phản ứng PCR


Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sựnhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứngPCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.


Các thành phần của phản ứng PCR1. Primer (mồi): Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến

phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cặp bổ sung với mộtđầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiềungược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược(reverse primer).

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tínhđặc trưng và hiệu quả của phản ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần đượctuân thủ một số nguyên tắc nhất định: dài khoảng 18-24 base; Tm của 2mồi gần nhau; thành phần nucleotic của các mồi cần bằng tránh cáccặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cầnkhuyếch đại; không hình thành primer dimer, không phải là trình tự lặplại.

2. DNA bản mẫu (DNA template): hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinhsạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từmẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin, …). PCR vẫn cho kết quả tốt với DNAthu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được bảo quảntốt.

3. Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Taq polymerase, hàm lượng quácao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quảnhân bản của enzyme. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từngphản ứng qua nhiều thử nghiệm.

15


4. dNTP: thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cần bằng làm tăngcác lỗi sao chép của polymerase; hàm lượng thường không đổi nhưngcó thể thay đổi tùy điều kiện thực tế.

5. Enzyme polymerase chịu nhiệtTag-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản

ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường. Tag-polymerase đượcnhà Vi sinh vật học Thomas Brock phát hiện ở Thermus aquaticus mộtloài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao. Enzyme chịu nhiệt nàygiúp giải quyết vấn đề của enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ.

Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khámphá và người ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịunhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR như Vent/DeepVent DNApolymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcusfuriosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UlTma DNApolymerase (Thermotoga maritima)...

6. Số lượng chu kỳ phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu,thông thường số lượng chu kỳ nhỏ hơn 40 cho một phản ứng PCR.Thời gian của từng chu kỳ phụ thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm.

7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng được nhu cầu thayđổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Những cải tiến máy luân nhiệtquan tâm đến microtiler plate 96 giếng, các block nhiệt riêng biệt trong 1máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR.

Các thành phần của phản ứng PCR


Các ứng dụng của phương pháp PCR

Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh họcphân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nôngnghiệp, …

Một số ứng dụng có tính tổng quát: Sản xuất mẫu dò: PCR giúp sản xuất nhanh một lượng lớn mẫu dò

đánh dấu khi thực hiện các phản ứng với cặp mồi chuyên biệt và cácnucleotide đánh dấu.

Khuyếch đại số lượng các RNA: sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR(kết hợp enzyme phiên mã ngược và Taq polymerase; hoặc sử dụngTth polymerase). RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA thông tintồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng phươngpháp cổ điển như Northern blot, …Kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuyếch đại các RNA ngay trên môvà tế bào.

Định lượng bằng phương pháp PCR: dùng để nghiên cứu các trình tựRNA hay DNA có số lượng bản sao rất thấp. Trình tự đích đượckhuyếch đại đồng thời với một trình tự chứng có nồng độ đã biết, sauphản ứng so sánh hàm lượng sản phẩm, và suy ra số lượng bản mẫuban đầu.


ThePolymerase

ChainReaction

(PCR)


SYBR Green l, principe


Nguyên tắc phát hiện huỳnh quang

SYBR Green I Sondes d‘hybridation Sondes TaqMan

Giai ñoaïn keùo daøi Giai ñoaïn annealing Giai ñoaïn keùo daøi 31/10/2011 8:58 SA Nguyễn Hữu Trí90

Molecular BeaconsNguyên tắc: Dùng mồi đặc hiệu với AND đích là mộtchuỗi oligonucleotic gắn chất huỳnh quang R ở một đầuvà đầu kia chất ức chế phát huỳnh quang Q. Khi mồi gắnvào chuỗi AND đích, R và Q tách xa nhau cho phát ra tinhiệu màu

16


Sondes TaqMan

reporter quencher


RealTime PCR

TaqMan Procedure


RealTime PCR

Courbe standard

Echantillon inconnu

Crossing Point (Cycles)

log (nombre de copie)n

log (

F2/F1)

n

log (

F2/F1)

cible


Yêu cầu lớn của tất cả các quá trình chế biến thực phẩm là cung cấpmột sản phẩm không chứa vi sinh vật nguy hiểm và các chất độc củavi sinh vật:

• Các tác nhân gây bệnh chính trong thực phẩm là Listeria,Salmonella và Campylobacter

• Các nội độc tố của vi khuẩn và các độc tố nấm là các chất độc chủyếu cần lưu tâm trong thực phẩm.

Một loạt các quy trình truyền thống, tốn thời gian thông thường đượcáp dụng để xác định , kiểm soát, làm giảm hay loại bỏ các chấtnhiễm.

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học sử dụng các hệthống phát hiện kháng thể và công nghệ mẫu dò DNA, RNA.

Chuẩn đoán nhanh


Những quy trình này rút ngắn thời gian hơn, thường rẻ hơn vàkhông cần đòi hỏi kĩ năng cao sẽ tạo nên một sự cải tiến lớnvề các tiêu chuẩn an toàn trong việc cung cấp thực phẩm.

Gần đây việc sử dụng các immunoassay trong công nghiệp thựcphẩm mới phát triển nhưng nhanh chóng trở thành một công cụphân tích được công nhận.

Kĩ thuật ELISA (kĩ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme)làm trên một cái đĩa 96 giếng –là một dạng được sử dụng rộngrãi nhất bởi các nhà khoa học thực phẩm.

Kĩ thuật ELISA giúp tiết kiệm thời gian, nhân lực vượt trội các kĩthuật thông thường

Chuẩn đoán nhanh


Ví dụ :

• 1/Việc phát hiện Salmonella trong thực phẩm là mộtquy trình rất phức tạp và tốn đến 5 ngày nếu sử dụngcác quy trình tăng sinh truyền thống. Bằng cách sửdụng các quy trình immunoassay thì sẽ rút ngắn thờigian còn một ngày.

• 2/ Các độc tố nấm và nấm mốc đòi hỏi nhiều giờ đểtách chiết, tinh sạch, cô đặc để xác định các chínhxác các hóa chất theo cách truyền thống. Tuy nhiên,việc sử dụng các cột ái lực chứa các kháng thể đặchiệu vời độc tố thì toàn bộ các quá trình tách chiết,định lượng có thể tiến hành trong 30 phút.

17


Chân thành cảm ơn

Documents

Kỹ thuật sắc ký Chromatography Technology Các kỹ thuật ... 6 Cac ky thuat phan tich chua… · Kỹ thuật sắc ký Chromatography Technology ... lớn nhất sẽ có