La separazione di proteine si basa sulle loro proprietà fisiche:

Carica - Dato che molti aminoacidi sono carichi, noi possiamo utilizzare la carica netta di una proteina ad un particolare pH

Dimensione – (e.g. peso molecolare) Proteine hanno un range da pochi centinaia di Dalton fino a complessi sopra il milione

Polarità – Molti aminoacidi sono non polari e quindi alcune proteine sono molto idrofobiche

Specificità – Un interazione di una proteina per un ligando

Solubilità – Interazione proteina-solvente

Principali tecniche di separazione e purificazione di proteine

Precipitazione

Cromatografia di assorbimento

Cromatografia per gel filtrazione

Ultrafiltrazione

Elettroforesi su gel

Salting in

Salting out

Scambio ionico

Assorbimento su composti inorganici

Cromatografia per affinitàHIC Cromatografia per interazioni idrofobiche

SOLUBILITA’ DELLE PROTEINE

• La presenza di gruppi ionizzabili (acidi e basici) polari ed idrofobici presenti sulla superficie di una proteina determina la sua solubilità, che dipende anche:

1) dalla concentrazione dei sali disciolti nel mezzo;

2) dalla polarità del solvente;

3) dal pH;

4) dalla temperatura.

• Proteine diverse hanno, in determinate condizioni, valori di solubilità profondamente diversi: alcune precipitano, altre restano in soluzione

• Questa caratteristica viene utilizzata per la purificazione delle proteine.

• Ammonium sulfate precipitation: addition of saturated ammonium sulfate solution to a pH-stabilized protein mixture. Stop the addition before the precipitation of your protein. You have now to desalt, dialyze…..or hydrophobic interaction!

• Heat precipitation: warm the lysate under slow but efficient stirring. Many protein will precipitate. The working temperature should be studied scarifying a bit of protein. For highly stable proteins (e.g Taq polymerase) 65°C can be reached

• Batch cleaning: Addition of a medium which binds contaminants with opposite charge with respect to your protein.

Pre-purificationSometimes you need to pre-purify your protein in order to clean it before the first chromatographic step. Most used techniques are:

Solubilità di una proteina

zona idrofobiche

+

+

+

+

+

+

+ +

++

+

-

--

-

--

--

La distribuzione dei residui idrofilici e idrofobici alla superficie è il fattore che determina la solubilità nei vari solventi

La solubilità di una proteina nel solvente acquoso è il risultato di interazioni polari con il solvente, con gli ioni dei sali in soluzione e delle forze repulsive tra molecole cariche dello stesso segno

I c zi i 1

22

S/S’ = solubilità nella soluzione salina / solubilità in acqua pura della carbossi-emoglobina

Forza ionica = I

Ci = concentrazione molare della specie ionica i

Zi = carica ionica

L’effetto di ioni diversidipende da:

a) le dimensioni dello ioneb) l’idratazione dello ione

1. Effetti della concentrazione salina

Salting in

A bassa forza ionica le forze repulsive tra molecole di proteina,cariche dello stesso segno, sono insufficienti per tenere le molecole in soluzione

diminuzione di solubilità

precipitazione

Al punto isoelettrico (I.E.P.) le cariche positive bilanciano le cariche negative e la repulsione elettrostatica è annullata.Questo è un motivo ulteriore di

aggregazione e precipitazione

A bassa concentrazione salina la solubilità delle proteine usualmente incrementa leggermente

CARICA NETTA

CARICA NETTA

Ribonucleasi A

PUNTOISOELETTRICO

Salting in

pHI.E.P

forza ionica

solu

bil

ità

solu

bil

ità

pH = I.E.P.

pH < I.E.P.

--

--- --

---

++

++ ++

++

++

-- +--+

pH > I.E.P.

pH I.E.P.

pH < I.E.P.

Precipitazione: salting out

Una molecola proteica in soluzione ha delle zone idrofobiche che entrano in contatto con le molecole di acqua.Queste vengono forzate a disporsi in maniera ordinata attorno alle catene laterali dei residui.

+

+

+ +

+ +

++

+

-

-

--

O

H

H

O

H

H

O

H

HO

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

OH

H

In presenza di elevata concentrazione salina gli ioni dei sali vengono solvatati e l’acqua rimossa dalla superficie proteica.Le zone idrofobiche restano esposte e possono interagire e dar luogo a aggregati e precipitazione (salting out)

Salting outCaratteristiche dei sali usati per la precipitazione:devono provocare deidratazione di zone idrofobiche senza interagire con la proteinaSerie di Hofmeier per anioni:SO4

2-> CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4

->SCN-

Cationi:NH4

+>K+>Na+

Soluzione satura (NH4)2SO4 4M d=1.235 g/cm3

533 g/l soluzione 761 g sale + 1 l soluzione

Il salting out è funzione della proteina e del sale utilizzato. Inoltre all’aumentare del PM della proteina la quantità di sale richiesto per la precipitazione diminuisce

PregiEconomico e rapido

DifettiDifficoltà di risolubilizzazione della proteinaBassa efficienza

Precipitazione frazionataproteinaprecipitata%

% sat. di (NH4)2SO4

20

40

60

20 40 60 80 100

Tecniche di precipitazione:aggiunta di sale solidoaggiunta di soluzione satura

Le frazioni proteiche, via via che precipitano, vengono separate per centrifugazioneI precipitati vengono ridisciolti in soluzione tampone.L’eccesso di sale viene rimosso per dialisi

DialisiPermette di rimuovere soluti a basso PM (sali, ad es.)

Ultrafiltrazione

Permette di eliminare il solvente, concentrando il soluto ad alto PMPermette di rimuovere o cambiare i sali presenti nella soluzione

Effetto dei solventi organici

• I solventi organici miscibili con l’acqua, come l’acetone e l’etanolo, precipitano le proteine in quanto abbassano la costante dielettrica del solvente, riducendone il potere di dissolvere ioni come le proteine. L’acqua di solvatazione viene rimossa dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine e quindi le proteine precipitano in ordine crescente, a seconda del n° di gruppi carichi presenti sulla loro superficie mentre aumenta la concentrazione di solvente organico.

• Questo fenomeno può essere sfruttato come metodo di frazionamento, però richiede temperature vicino allo zero, o inferiori, per evitare l’effetto denaturante che i solventi organici hanno a temperature più alte.

• L’abbassamento della costante dielettrica aumenta l’effetto del SALTING OUT e quindi in alcuni casi può essere utile combinare le due tecniche di precipitazione.

• Alcuni solventi organici, come la N,N dimetilformamide (DMF) o il dimetilsulfossido (DMSO), per via del valore elevato della loro costante dielettrica, sono invece ottimi solventi delle proteine.

Cromatografia Le tecniche cromatografiche permettono la separazione di soluti in base alla loro diversa capacità di ripartirsi tra 2 fasi (generalmente una fase solida e una liquida). Ne conseguono diverse mobilità lungo una colonna delle particelle di soluto in presenza di un fluido che fluisce nella colonna.

Rf è la mobilità del soluto rispetto al flusso di liquido (solvente)

L’interazione tra soluto (nel caso specifico proteine) e il materiale che costituisce la colonna fa “ritardare” il passaggio del soluto rispetto al solvente.

Soluti con Rf diverso possono essere separati completamente se la colonna è sufficientemente lunga e la diffusione non troppo alta.

Cromatografia di adsorbimento

Scambio ionico

Assorbimento su composti inorganici

Cromatografia per affinità

Cromatografia per gel filtrazione

HIC Cromatografia per interazioni idrofobiche

Cromatografia di Adsorbimento

Caratteristiche del mezzo adsorbente:

L’adsorbente deve avere una struttura aperta in modo che le molecole proteiche possanopenetrare e raggiungere i siti di legame

L’adsorbente deve interagire con la proteina senza danneggiarla

Adsorbenti/supporti usati per le proteine:

Cellulosa, destrosio, agarosio e polimeri sinteticiPolimeri sintetici con leganti specifici (crom. per affinità)Sostanze inorganiche ( Ca10(PO4)6(OH)2)

Un adsorbente può essere definito come un solido che ha proprietà di tener legate molecole alla sua superficie

Supporto inerte (tipo cellulosa) con gruppi carichi non deve interagire fortemente con la proteina

Cromatografia per scambio ionicoLe molecole vengono separate sulla base della loro carica totale

Al supporto inerte sono legati gruppi carichi positivamente (scambio anionico) o negativamente (scambio cationico)

Le cariche sono bilanciate da contro-ioni come ioni metallici, ioni cloruro e ioni del tampone

Una molecola proteica può spiazzare il contro-ione e attaccarsi all’assorbente

Il legame delle molecole è reversibile e queste possono essere eluite con un gradiente salino o di pH

DEAE = Diethylaminoethyl

Scelta delle resine e loro capacità adsorbenti

I.E.P. proteina basico acido

Condizioni di lavoro pH < I.E.P. pH >I.E.P.

Carica della molecola + -Carica della resina - +Tipo di resina scambiatore di

cationiscambiatore di anioni

Capacità adsorbente degli scambiatori A parità di tipo di supporto dipende dalle dimensioni della molecola proteica. La capacità aumenta al diminuire del PM con una relazione lineare tra log PM e capacità.

Es: CM-cellulosa pH = 6 I = 0.01MPROTEINA PM Capacità (mg/ml)lisozima 14300 130creatina chinasi 82000 35aldolasi 160000 22piruvato chinasi 228000 12.5

Supporti e scambiatoriSupporti:cellulosa (microcristallina e non)granuli sferici di cellulosa (Sephacel)granuli sferici di destrano (Sephadex)agarosio (Sepharose)Scambiatori:DEAE = dietilamminoetil (-OC2H4N(C2H5)2) – carico fino a pH 9QAE = dietil (2-idrossipropil)amminoetil – carico fino a pH 12TEAE= trietilamminoetilCM = carbossimetil (-OCH2-COOH) – carico fino a pH 4SP = sulfoprofil – carico fino a pH 2

pH ed effetto DonnanIl pH nell’intorno dello scambiatore non è lo stesso di quello del tamponeapplicato perché la matrice adsorbente può respingere o attrarre protoni

Resine scambiatori di anioni

Resine scambiatori di cationi

Adsorbimento del campioneCondizioni di adsorbimento La miscela di proteine, per essere caricata sulla colonna, deve essere nello stesso tampone usato per equilibrare la colonna, in particolare deve essere alle stesse condizioni di pH e f. ionica.Per raggiungere queste condizioni si possono utilizzare tecniche di dialisi, ultrafiltrazione o gel filtrazione Concentrazione del campione

Dimensioni della colonna La concentrazione del campione e il suo volume determinano le dimensioni della colonna. La capacità dello scambiatore dipende dalle dimensioni delle molecole proteiche.

Una colonna larga e corta ha un flusso molto veloce, ma il flusso può non essere omogeneo attraverso tutta la sezione.

Una colonna lunga e sottile ha un flusso molto lento ma regolare lungo tutta la superficie.

Lunghezza colonna: 4-5 volte il diam.

Flusso 10-30 cm/h

Superficie: 5 cm2 flusso 50-150 ml/h

Eluizione della proteinaMetodi per eluire una proteina adsorbita: Variazione di pH in modo da indebolire le interazioni tra molecola proteica e gruppo carico (abbassare pH per scambiatore anionico, aumentare pH per scambiatore cationico)Inconvenienti del metodo: precipitazione proteina

Incremento di f. ionica per indebolire le interazioni elettrostatiche fra proteina e gruppo carico.Si usano sali tipo KCl o NaCl. Gli ioni spiazzano le proteine, occupano i gruppi carichi e permettono alla proteina di fluire lungo la colonna.

L’eluizione viene effettuata applicando un gradiente salino; le proteine di una miscela vengono eluite separatamente, sulla base della loro diversa forza di interazione con lo scambiatore.

Abs280

vol eluiz.

Applicazione del campione

Aggiustare pH e conducibilità dell’estratto proteico con piccole aggiunte di soluzione di Tris-HCl 0.2 M agli stessi valori di pH e conducibilità della colonna. Caricare l’estratto sulla colonna.

Adsorbimento su composti inorganici

-

-

--

Assenza di soluzione tampone In presenza di tampone

Adsorbenti: ossidi, idrossidi e fosfati. Un es.: idrossiapatite: Ca10(PO4)6(OH)2

Le molecole proteiche vengono adsorbite solo in superficie in un tampone fosfato 20mM e pH circa neutro. Capacità massima 0.1mg/cm3

Proteine cariche positivamente interagiscono con i gruppi PO4 3- e possono essere eluite da alta

concentrazione di ioni Ca2+

Proteine cariche negativamente interagiscono con gli ioni Ca2+ e possono essere eluite con altaconcentrazione di PO4

3-

Si applica per lo più su DNA perché riesce a separare in maniera selettiva da DNA a doppio filamentoda DNA a singolo filamento e RNA. (si eluisce il DNA con gradiente di tampone fosfato pH 7 che stacca prima il singolo filamento di DNA e poi il doppio filamento di DNA)

proteina

++ + +

+ + +

--

- --+ + ++ -

proteina

+++

- -

--

-++

Cromatografia per affinità

Si basa sulle proprietà di alcune proteine di legare in modo specifico, ma non covalente, un’altra molecola (coenzima, substrato, inibitore)

Il legante specifico viene attaccato ad un gruppo funzionale sulla superficie del materiale di supporto.

Il materiale di supporto deve essere un polimero poroso e idrofilo, in modo da permettere il libero accesso alle molecole ai siti di legame.Tipico polimero utilizzato: granuli sferici di agarosio.Il legante deve essere attaccato al supporto in modo da non alterare le interazioni con la proteina.Viene utilizzato un braccio spaziatore in modo da posizionare il legante lontano dal supporto e renderlo più accessibile alla proteina. Devono essere minime le interazioni aspecifiche di altre proteine con il leganteIl legante deve essere stabile alle condizioni utilizzate durante la cromatografia.

-CH2-CH2-CH2- agarosio

legante specificomolecola proteica

Eluizione

colonna colonna

GGGG

proteina legante il glucosio

Proteina eluita

aggiunta di glucosio (G)

GG

Eluizione: alta concentrazione di legante alta concentrazione salina (distrugge interazioni non idrofobiche)

Non possibile predire quale resina legherà una data proteina ma va determinato sperimentalmente

La miscela proteica è disciolta in alta forza ionica

•l'HIC viene svolta con un solvente acquoso e con variazioni di forza ionica per eluire la colonna. Le proteine tipicamente si legano nella forma nativa attraverso gruppi idrofobici presenti sulla loro superficie. Lo stato nativo viene mantenuto durante le condizioni di eluizione. •La cromatografia a fase inversa puo’ utilizzare un solvente idrofobico (tipicamente acetonitrile) e il legame di un ligando è una funzione della partizione di fase tra la natura idrofobica del solvente e i gruppi funzionali idrofobici della colonna. Le proteine in questi solventi sono tipicamente denaturate e si legano grazie alla natura idrofobica su di un'intera sequenza polipeptidica. Dal momento che la maggior parte dei gruppi idrofobici sono localizzati nel core delle proteine globulari, il legame è possibile grazie alla denaturazione della proteina. le proteine possono essere purificate usando la cromatografia a fase inversa, ma solitamente devono essere rinaturate per riottenere la funzionalità.