Laboratorios 1 Al 5 (1)

FACULTAD DE INGENIERÍA, PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL, LABORATORIOS DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

La Biotecnología es la ciencia llamada a solucionar muchos problemas de índole mundial en los campos de la medicina, la industria y el sector agropecuario. En países como Colombia, donde la inversión en investigación es muy precaria; los aportes e iniciativas de investigación y desarrollo en el área de la Biotecnología Alimentaria, indudablemente, contribuirán en brindar alternativas de soluciones a la gran ola de hambruna que tienen muchas poblaciones de este y otros países del mundo.

Dentro de las herramientas más valiosas y consistentes con que cuenta el Ingeniero Agroindustrial para suplir las necesidades de progreso científico, tecnológico y de Ingeniería, se encuentra la Interacción armónica de los diferentes aspectos de la Biotecnología Alimentaria; para ello es indispensable la formación de profesionales capaces de aplicar y desarrollar conceptos de ingeniería en los procesos biotecnológicos realizados en la industria de Alimentos.

El desarrollo de la biotecnología industrial en Colombia es evidente y se manifiesta en los diferentes renglones de la economía nacional. Entre las industrias de alimentos que generan o consumen productos biotecnológicos se encuentran: las cervecerías y malterías, productos lácteos fermentados, panificadoras, jugos y néctares, industrias vinícolas y licoreras, etc. La política nacional de ciencia y tecnología, en uno de sus programas orientados a fortalecer la competitividad del sector productivo y su inserción en el mercado mundial, reconoce que los adelantos científicos en biología molecular y biotecnología han tenido gran impacto en los sistemas de producción; y por ello es prioritario el fomento a las investigaciones y a la formación de nuevos profesionales en estas áreas.

Este manual de laboratorio, dirigido a estudiantes de Ingeniería de Agroindustrial y otras Ingenierías o áreas relacionadas con el sector de la industria agroalimentaria, fue diseñado con mucho esmero y dedicación para complementar y demostrar en el laboratorio los referentes teóricos discutidos previamente en el aula de clases. Surge, entonces como una herramienta pedagógica que fortalecerá el procesó de enseñanza-aprendizaje en el desarrollo de programas académicos relacionados con la Biotecnología Alimentaria.

BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRÁCTICAS MICROBIOLÓGICAS EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

Manual elaborado por la Universidad de Córdoba, programa de Ingeniería de Alimentos, agradeciendo a sus creadores Ingenieros Deivis Luján Rhenals y Jairo Salcedo Mendoza

Desde el primer momento en que el estudiante entra a un laboratorio donde se trabajen procesos biológicos microbianos, está expuesto a recibir cualquier clase de infección, dependiendo del microorganismo con el que entre en contacto, ya sea directamente o por contaminación cruzada. Para prevenir este tipo de riesgos, el estudiante debe cumplir con las normas de bioseguridad dentro y fuera del laboratorio. Las normas de bioseguridad son una recopilación de los procedimientos de laboratorio más esenciales que constituyen la base de técnicas microbiológicas y biotecnológicas apropiadas; éstas son fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse, en ningún momento, con equipos especializados; ya que estos no serán más que un complemento para facilitar el trabajo y en algunos casos para disminuir la exposición a sustancias peligrosas.

Las normas de seguridad que se deben cumplir en un laboratorio donde se trabaje con material microbiológico se clasifican en: De orden personal, de orden del laboratorio y de orden del trabajo microbiológico.

a) DE ORDEN PERSONAL:

Usar siempre la bata dentro del laboratorio; no se debe llevar puesta fuera del mismo. Las prendas contaminadas se deben esterilizar antes de lavarlas.

No se deben colocar los bolsos, prendas de vestir, paraguas, carteras, etc. en los mesones de trabajo. Debe existir un lugar destinado para ello.

Dentro del laboratorio no se permitirá al personal comer, beber, fumar ni aplicar cosméticos.

Se deberán lavar las manos al iniciar y al terminar el trabajo; como también, después de haber manipulado material contaminado y/o infeccioso.

No se deberá pasar la lengua por las etiquetas; los materiales no se colocarán en la boca

No se llevará calzado sin puntera o que no sea cerrado. No se debe hacer uso de pañuelos o bata de laboratorio para limpiar

objetos o instrumentos de trabajo. No se debe participar del trabajo si se tiene alguna herida,

quemadura o rasguño en las manos o antebrazos; estas deben ser tratadas inmediatamente.

Se debe comunicar inmediatamente cualquier sospecha de haber contraído alguna enfermedad como consecuencia del trabajo.

Cuando sea necesario, se deben proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos; se utilizaran gafas de seguridad, viseras o pantallas faciales.


No se deberá pipetear con la boca; se deben usar pipetas automáticas, pera de goma o auxiliar de pipeteo.

b) DE ORDEN DEL LABORATORIO:

Mantener cerradas las puertas del laboratorio; abrirlas sólo en caso de emergencia.

No permitir la entrada de niños a las zonas de trabajo No debe haber material que no tenga relación con el trabajo Debe haber un programa de lucha contra insectos y roedores Las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán al menos una

vez al día y en caso de derramamiento fortuito de sustancias potencialmente peligrosas.

No olvidar cerrar la válvula del gas al terminar cada jornada de trabajo.

La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de los locales en donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2.

c) DE ORDEN DEL TRABAJO MICROBIOLÓGICO

Estudiar, con anterioridad, las técnicas y protocolos de las prácticas y experimentos de laboratorio; esto evitará confusiones y dinamizará el trabajo.

Trabajar, siempre, de manera ordenada, tranquila, constante y metódica; evitando movimientos y gasto de energía innecesarios.

Llevar, siempre, un registro ordenado de los resultados y modificaciones. Esto evitará contratiempos desagradables por la pérdida de datos importantes.

El material de trabajo (Caldos de fermentación, cepas, medios, etc) deben ser tocados, únicamente, con instrumentos estériles; nunca con material contaminado y mucho menos con las manos.

Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo antes y después de cada jornada.

Cada vez que se derrame material infeccioso, se debe cubrir la zona con papel absorbente impregnado de desinfectante y dejarlo por un periodo de 15 minutos.

Las pipetas de vidrio, deben tener en su abertura superior un algodón que sirva como filtro para proteger a la muestra y al manipulador.

Colocar todo material contaminado, tales como: Porta objetos, laminillas, espátulas, pinzas, pipetas, etc. en recipientes adecuados con soluciones desinfectantes.

El resto de material contaminado se debe colocar en recipientes especiales para su posterior esterilización.

Al depositar líquidos, viértalos por las paredes.


Recuerde que siempre se debe adicionar ácidos al agua y nunca agua a los ácidos, porque ocasiona salpicaduras peligrosas.

No retire cultivos celulares del laboratorio sin previa autorización Las asas deben esterilizarse antes y después de usarse flameándolas

en la llama del mechero hasta ponerlas al rojo vivo en toda su extensión y luego dejarla enfriar por espacio de 20 segundos cerca de la llama.

Si se va a repicar de un cultivo a otro, termine por enfriar el asa en este último

Flamee la boca de tubos, balones, Erlenmeyers, etc. antes y después que introduzca asas o pipetas

Nunca hable, tosa, estornude o respire fuerte cuando abra un cultivo o esté sembrando

Trabaje lo más cerca posible al mechero.

RECUERDE SIEMPRE!

Las improvisaciones son el primer paso para un accidente En todo momento esté consciente de lo que hace En caso de un accidente, actúe rápidamente sin perder la calma Pregunte al profesor si no está seguro de lo que va a hacer Tenga mucho sentido común.

EXPERIMENTO Nº 1TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA

1. INTRODUCCIÓN:

El crecimiento microbiano se pude considerar como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo, lo cual, para los organismos unicelulares, conduce a un aumento del número de individuos en la población.

Se puede considerar el crecimiento al nivel de individuos dentro de una población (ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento). El crecimiento de las poblaciones celulares se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo intermitente y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes y el cultivo continuo.

Para determinar el número total de células de un cultivo, el método de elección es el recuento microscópico directo. Para células de levadura, puede emplearse un hemocitómetro. Es necesaria una ampliación de 100X a 400X para visualizar la cámara de recuento y las células en suspensión. Para células bacterianas se usa frecuentemente una


cámara de Petroof-Hauser o una de Neubauer y una ampliación de 1000X a causa del pequeño tamaño de las bacterias. El recuento microscópico directo tiene la ventaja de que permite observar directamente la morfología de las células estudiadas. Las morfologías aberrantes o atípicas podrían indicar unas condiciones subóptimas de crecimiento o la presencia de un genotipo o fenotipo alterados.

El método más usado para medir el crecimiento microbiano es secar volúmenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de células que sedimentan rápidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugación de muestras del cultivo en tubos de centrífuga prepesados. Para células bacterianas difíciles de concentrar por centrifugación, las muestras de cultivo se filtran a través de membranas hidrofílicas con un tamaño de poro de 0,2 m. Otro método muy utilizado es el de determinación de biomasa por densidad óptica. Se aprovecha la proporcionalidad de la densidad óptica a la masa celular, cuando no se tienen en el medio de fermentación otros sólidos en suspensión. Este método se basa en la Ley de Beer y Lamberty; en este caso, se asume que la absorción del rayo incidente es proporcional a la concentración de células presentes.

2. OBJETIVO:

Desarrollar la habilidad para medición la biomasa microbiana que interviene en los bioprocesos a través del conocimiento de las técnicas más utilizadas para este fin.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:

a) Materiales Cámaras de Neubauer Microscopios Estufa Desecador Balanza analítica (6 cifras decimales) Espectrofotómetro Centrífuga Pipetas graduadas Pipetas automáticas Auxiliar de pipeteo Beakers Erlenmeyers Tubos para centrífuga Pinzas


b) Reactivos Cultivo de Levadura Agua destilada Solución salina isotónica estéril (0,85%)

4. PROCEDIMIENT4.1. Preparación del cultivo madre:

Disolver aproximadamente 0,5 gr. de levadura seca comercial (Saccharomyces cerevisiae) en un erlenmeyer que contenga 200ml de agua destilada estéril.

4.2. Preparación de las soluciones problema:

En tubos de 20-25 ml, previamente secos en estufa, preparar 6 diluciones de levadura a partir del cultivo madre, así:

TUBO 1 2 3 4 5 6ml de agua 1

08 6 4 2 0

ml de cultivo

0 2 4 6 8 10

Cada dilución de levadura será medida con las siguientes técnicas: 4.3. Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en

cámara de Neubauer:

Agitar muy bien el cultivo de levadura. Tomar un volumen pequeño (0,1 – 0,3 mL) con la pipeta automática. Depositar una alícuota en la superficie pulida de la cámara de Neubauer cerca del extremo del cubreobjetos; la suspensión entrará en la cámara por capilaridad. Una cámara llenada adecuadamente contiene células sólo en el espacio contenido entre el cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que se deposite en los surcos.

Posteriormente se coloca en la platina de un microscopio compuesto y se enfoca el enrejado con los objetivos de menos aumento (4X y 40X). Para contar las levaduras se utiliza el cuadro central (Ver figura 1). El cuadro central está señalado con un círculo y contiene 25 cuadros, cada uno rodeado por un borde de tres líneas. Cada uno de los 25 cuadros a Manual elaborado por la Universidad de Córdoba, programa de Ingeniería de Alimentos, agradeciendo a sus creadores Ingenieros Deivis Luján Rhenals y Jairo Salcedo Mendoza

su vez contiene 16 cuadritos. Se debe ajustar la intensidad de la luz de modo que se hagan visibles tanto las líneas como las células. Se deben contar las células que se encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los cuatro de las esquinas y el del centro).

El cuadro central (marcado con el círculo) tiene un área de 1 mm2 y una profundidad de 0.1 mm.

Tenga en cuenta los Siguientes aspectos:

Para aquellas células que estén tocando las líneas de los bordes, sólo cuente aquellas que estén en dos de los cuatro bordes (superior e izquierdo); esto evitará que se repita el conteo.

Si cuenta más de 50 o menos de 20 células por cuadro, repita la toma de muestra o cambie la dilución que esté usando.

Limpie la cámara con agua destilada estéril y séquela con gasa o algodón después de cada lectura.

Figura 1. Cámara de Neubauer Manual elaborado por la Universidad de Córdoba, programa de Ingeniería de Alimentos, agradeciendo a sus creadores Ingenieros Deivis Luján Rhenals y Jairo Salcedo Mendoza

1 mm

1 mm

4.4. Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica:

Tomar 1 ml de cada muestra problema y preparar en tubos tapa – rosca una dilución de cada una de ellas de tal forma que la concentración final de solutos no sobrepase las 1000 ppm. (máxima concentración de sólidos leídas por el espectrofotómetro)

Agitar muy bien. Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm.

4.5. Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular:

Centrifugue los tubos, previamente pesados, que contienen las soluciones originales de levadura (volumen restante conocido) a 4000 rpm durante 15 minutos. Con ayuda de una pipeta evacue cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente someta a evaporación en estufa el agua restante a una temperatura de 90ºC durante 20 horas. Pese los tubos y vuelva a evaporar hasta que haya alcanzado un peso constante.

5. CÁLCULOS Y CONSULTAS:

Calcule y reporte la concentración de cada una de las diluciones problemas (células/ml, Absorbancia y gr de célula/L) .

Elabore una gráfica de No Células/ml vs Absorbancia. Calcule el valor de R2

Elabore una gráfica de gr de células/L vs Absorbancia. Calcule el valor de R2

Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana.

Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las técnicas utilizadas en el experimento.

¿Qué son los colorantes supravitales y para qué se usan.

EXPERIMENTO Nº 2DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO

DNS (Ácido 3,5 - dinitrosalicílico)


1. INTRODUCCIÓN:

Este método nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres (C=O) en los también llamados azúcares reductores. Esto involucra la oxidación del aldehído presente en el grupo funcional. Simultáneamente, en presencia de calor el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) se reduce a ácido 3-amino,5-nitrosalicílico bajo las condiciones alcalinas, desarrollándose un color amarillo café:

oxidacióngrupo aldehído grupo carboxilo

reducciónDNS ácido 3-amino,5-nitrosalicílico

Se adiciona sulfito (no necesario para la reacción del cambio de color) en el reactivo para absorber el oxígeno disuelto, ya que éste puede interferir con la oxidación de la glucosa.

En la reacción se muestra que una mol de azúcar reaccionará con una mol de DNS. Sin embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones, y la estequiometría de la reacción es mucho más complicada que lo previamente descrito. El tipo de reacción lateral depende de la naturaleza exacta del azúcar reductor. Diferentes azúcares reductores arrojan distintas intensidades de color ; así, se hace necesario calibrar para cada azúcar. Además de la oxidación de los grupos carbonilos en el azúcar, otras reacciones laterales como la descomposición de azúcar también compiten para la disponibilidad del ácido 3,5-dinitrosalicílico. Como consecuencia, la carboxymetil celulosa puede afectar la curva de calibración alterando la intensidad del color desarrollado.

Este es un método conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad es relativamente baja. Cuando los efectos de compuestos extraños no son conocidos, uno puede incluir efectivamente el llamado control interno para el desarrollo del color en muestras desconocidas; entonces, una cantidad conocida de azúcar se adiciona a esta muestra. El aumento en la absorbancia en el segundo desarrollo de color es equivalente a la cantidad incrementada de azúcar. Altas concentraciones de proteína interfieren en la determinación de los azúcares reductores. Otra de las ventajas de este método es que el color final desarrollado es estable hasta 24 horas, es sencillo y rápido.


2. OBJETIVO:

Aplicar una técnica sencilla, rápida y eficaz para determinar azúcares reductores en caldos y medios de fermentación que permitan conocer los rendimientos en sustrato y/o productos.


a) Materiales

Tubos de ensayo tapa rosca Pipetas de 1, 5 y 10 ml Pipeteador automático Auxiliar de pipeteo Matraz aforado de 1000 ml Frasco color ámbar Espectrofotómetro Vortex

b) Reactivos

Solución del ácido 3,5 dinitrosalicílico, 1% :

o DNS: 10 g o Fenol: 2 g o Sulfito de sodio anhidro: 0.5 g o Hidróxido de sodio: 10 g o Aforar a 1 litro con Agua destilada

Conservar refrigerado dentro del frasco color ámbar.

Solución estándar de glucosa :

Disolver 1 gr. de glucosa anhidra en 1000 ml de agua destilada, conservar en refrigeración hasta el momento de usarla.

4. PROCEDIMIENTO:


Establecer una escala estándar de 0 a 1000 ppm. Dentro de una serie de tubos de ensayo, previamente lavados y sumergidos en solución de ácido sulfúrico al 5% durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; y 1 ml de solución estándar y completar a 1 ml con agua destilada. Elabore la siguiente tabla al momento de registrar los datos:

Tubo ml. de s/n estándar

ml. de agua destilada

Concentración final (ppm)

Absorbancia (575 nm)

1 0.0 1.0 0 -2 0.2 0.8 200 -3 0.4 0.6 400 -4 0.6 0.4 600 -5 0.8 0.2 800 -6 1.0 0.0 1000 -

La determinación de azúcares reductores es efectuada sobre 1 ml de la muestra convenientemente diluida. La curva estándar y las muestras sufren las siguientes operaciones:

Adicionar 1 ml del reactivo DNS Agitar fuertemente en un vortex Poner a ebullición durante 5 minutos Enfriar rápidamente (baño de hielo) Adicionar 8 ml de agua destilada dentro de cada tubo Agitar fuertemente en un vortex Leer absorbancia a 575 nm.


Grafique la curva de calibración (Concentración vs Absorbancia) para la determinación de azúcares reductores con el método del DNS. Muestre todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R2.

Calcule la concentración en azúcares reductores (Glucosa) de la muestra problema.

Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares reductores y glucosa. ¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología?


ADVERTENCIA!

El reactivo DNS es altamente tóxico, cancerígeno y abortivo. Mucho cuidado al manipularlo. Usar siempre guantes de látex.

6. REFERENCIAS:

EXPERIMENTO Nº 3DETERMINACIÓN DE ETANOL POR EL MÉTODO DE WINNICK

1. INTRODUCCIÓN:

La determinación de la cantidad de etanol en los productos obtenidos a partir de la fermentación alcohólica es una de las principales preocupaciones del biotecnólogo; ya que éste es un análisis que requiere de una dotación adecuada de equipos de medición o, por otro lado, de una cantidad considerable de volumen de muestra, como en el caso del método de destilación.

El método de Winnick permite determinar bajas concentraciones de alcohol etílico a través de la acción oxidante de la solución 0.4 N de dicromato de potasio en ácido sulfúrico 10N, posterior valoración con Tiosulfato de sodio.

Se diluye la muestra de forma que la cantidad de dicromato utilizada sea suficiente para oxidar todo el etanol, formando acetaldehído; de otra


manera debe repetirse la prueba usando una mayor dilución de la muestra.

El exceso de dicromato se elimina con yoduro de potasio, el volumen de Tiosulfato de sodio gastado en titulación se emplea para determinar el porcentaje de etanol en la muestra teniendo en cuenta la respectiva dilución. Las reacciones que se manifiestan en el proceso son:

2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH6O 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3C2H4O2 + 11H2O

K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 7H2O + 6I

2Na2S2O3 + 2I Na2S4O6 + 2NaI

2. OBJETIVO:

Aplicar una técnica rápida y sencilla para la determinación de alcohol etílico en caldos de fermentación alcohólica que pueda ser usado en determinaciones de velocidad de reacción.


a) Materiales:

Microburetas Soporte universal Erlenmeyers de 50 ml Balones aforados de 250 y 500 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Balanza Beakers Varillas de agitación

b) Reactivos:

Ácido Sulfúrico 10 N Dicromato de potasio 0.4N en H2SO4 10N Solución de Yoduro de potasio 3N (KI) Solución reactivo de almidón soluble Tiosulfato de sodio 0.1 N+


4. PROCEDIMIENTO:

a) Preparación de Reactivos:

ÁCIDO SULFÚRICO 10N:

Disolver 138.9 ml de H2SO4 (densidad 1,84 gr/ml y 96% de pureza) con agua destilada hasta aforar a 500 ml.

ADVERTENCIA ! : Se presenta una reacción altamente exotérmica; por lo que se debe adicionar lentamente el ácido al agua (nunca lo contrario). Hacer esto con el balón sumergido en baño de agua con hielo. Al enfriarse la solución, se produce una contracción de volumen que se debe corregir adicionando más agua destilada hasta alcanzar el volumen final.

DICROMATO DE POTASIO 0.4 N EN H2SO4 10 N:

Pesar 19.614 gr. de Dicromato de potasio previamente seco a 100ºC durante 4-6 horas y disolverlo en el H2SO4 10 N hasta completar un volumen de 1000ml.

SOLUCIÓN DE YODURO DE POTASIO 3 N:

Disolver 49.8 gr. De yoduro de potasio (KI) en suficiente agua destilada y aforar en un balón de 100 ml.

SOLUCIÓN REACTIVO DE ALMIDÓN SOLUBLE:

Pesar 1 gr. de almidón soluble. Verter lentamente con agitación constante en 200 ml de agua destilada hirviente. Hervir hasta obtener un líquido ligero y translúcido. Dejar decantar y usar únicamente el líquido sobrenadante.

En un recipiente limpio y bien tapado, esta solución puede durar hasta dos meses. El reactivo es propenso a contaminarse con hongos.

TIOSULFATO DE SODIO 0.1 N:

Preparar a partir de un stock comercial para 1 L de solución.

b) Determinación:


Realizar una curva patrón en tubos de ensayo con tapa que contengan 5 ml. de las siguientes concentraciones: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14% de etanol. A éstas diluciones y a la muestra se someten al siguiente proceso:

Realizar una dilución 1:9 (muestra: agua) para cada tubo.

Adicionar exactamente 1 ml de solución de Dicromato de potasio 0.4 N en H2SO4 10 N dentro de un erlenmeyer pequeño (20-50 ml).

Adicionar 2 ml de la solución a estudiar

Dejar en reposo durante 5 minutos

Transcurrido el tiempo, adicionar 1 ml de solución de yoduro de potasio 3N y mezclar.

Adicionar 2 gotas de solución de reactivo de almidón soluble.

Titular con solución volumétrica de Tiosulfato de sodio 0.1 N con agitación cuidadosa hasta obtener un cambio nítido hacia un color azul marino.

Restar el volumen de Tiosulfato gastado por el blanco al momento de construir la curva de calibración.


Grafique la curva de calibración para las diluciones de alcohol realizadas. Calcule el valor R2 y muestre la ecuación que explique la curva.

Calcule el porcentaje de alcohol de la muestra problema utilizando la curva de calibración.

Consulte otros métodos para determinar alcohol etílico. Explique las ventajas y desventajas para su uso

EXPERIMENTO Nº 4EVALUACIÓN DE CULTIVOS LÁCTICOS

1. INTRODUCCIÓN:


Las Bacterias lácticas tienen la capacidad de fermentar la lactosa contenida en la leche a ácido láctico, como es el caso de Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Esta capacidad bacteriana puede ser explotada industrialmente para obtener productos como el Yogurt y el Kumis. El Yogurt es un producto obtenido por la simbiosis entre el Lactobacillus bulgaricus y Streptococos thermophylus; los cuales se pueden obtener de la leche desnatada concentrada por evaporación.

Una de las etapas más importantes del proceso de obtención del producto fermentado es el cultivo, ya que aporta a la leche las bacterias acidolácticas responsables del proceso de acidificación. Este cultivo consta exclusivamente de especies termofílicas; que para el caso del yogurt son : L. bulgáricus y St. Thermophylus. El cultivo no debe contener especies no termofílicas. La producción de cada una de las especies varía a lo largo del proceso; al comienzo es de 1:1 a 2:5. Durante la incubación se favorece el desarrollo de St. Thermophylus hasta el punto de alcanzar una proporción de 5:1 que se equilibra nuevamente al final del proceso. Por otra parte, el L. bulgaricus proporciona el aroma característico del yogurt.

2. OBJETIVO:

Conocer y evaluar la fabricación de cultivos lácticos utilizados en la industria del yogurt a través de un seguimiento en el comportamiento de la acidez, el pH, relación cocos/bacilos y rendimientos (YP/S , YX/S) a intervalos regulares de tiempo.


a) Materiales:

Balanza Frascos tapa rosca de 250 ml Erlenmeyer de 500 ml Pipetas de 5 y 10 ml Pipetas de 1 ml Tubos de ensayo pHmetro Bureta Baño María


Cámara de Neubauer

b) Reactivos:

NaOH 0,1 N Fenolftaleina 2% Azul de metileno Leche descremada en polvo Cultivo Láctico de Yogurt Agua destilada estéril

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. Preparación del Cultivo.

En 3 frascos con tapa rosca reconstituir 200 ml de leche en polvo descremada (8%, 12%, y 16%)

Pasteurizar en baño maría a 80ºC por 30 minutos.

Los gramos de leche en polvo se calculan con la siguiente ecuación:

Volumen total x % deseado

gr de Leche = ----------------------------------------- 100 - % de Humedad Leche P.

Volumen de agua = Volumen deseado - gr de leche en polvo

Enfriar a 43 ºC.

Inocular cada concentración con 3% de cultivo de yogurt. ¡AGITAR BIEN!

Incubar a 43 ºC por 3 horas. ¡ NO AGITAR!

Refrigerar a 4 ºC por 2 horas. ¡ NO AGITAR!

4.2. Actividad Del Cultivo Madre:

Medir el pH cada 30 minutos con ayuda de un pHmetro.


Medir la acidez cada 30 minutos tomando 9 ml del cultivo, adicionar 2 gotas de fenolftaleina al 2%. Titular con NaOH 0,1 N hasta que persista el color rosa pálido por 30 segundos. Expresar la acidez en porcentaje de ácido láctico:

ml NaOH gastado x 0,1N x meq-gr Ácido láctico% Ácido Láctico = --------------------------------------------------------------- x 100 ml muestra

4.3. Relación Cocos – Bacilos:

Realizar conteo en cámara de Neubauer cada 60 minutos y observar la relación coco - bacilo en cada intervalo de tiempo. (Incluir una gota de azul de metileno en la dilución para colorear las bacterias)

4.4. Rendimientos ( YX/S, YP/S) :

Realizar los balances de masa respectivos y encontrar los rendimiento de Sustrato en biomasa (YX/S) y sustrato en producto (YP/S), considerando que para una concentración de 12,5 % de sólidos existen 4,7% de lactosa.


Grafique el incremento de sólidos Vs acidez. Grafique el incremento de sólidos Vs pH Grafique el incremento celular de cada bacteria en función del tiempo Calcule los respectivos rendimientos para cada intervalo de tiempo y

muestre los rendimientos globales de la fermentación. Compare resultados.

¿Qué problema representa el hecho de encontrar levaduras, en alto porcentaje, en productos como el yogurt?

¿Qué efecto tiene en el pH y la acidez en el aumento de sólidos dentro de un cultivo láctico?

6. REFERENCIAS:


EXPERIMENTO Nº. 3EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE VINO DE FRUTAS

1. INTRODUCCIÓN:

La historia de la fermentación se remonta más allá de nuestros conocimientos. El hombre, tal como lo conocemos; es decir, el hombre que trabaja y lucha, aparece en la escena con una jarra de vino. Su realidad vinícola se aproxima más a nuestra experiencia de vida con la expansión de la dominación griega, iniciada 1000 años a. C., fue entonces cuando el vino llegó por primera vez a los países en los que se sentaría su verdadero hogar: Italia y Francia. Los últimos noventa años han presenciado la revolución industrial de los licores y, sobre todo, en los últimos 25 años el fundamento científico de la elaboración de los licores ha clasificado la situación de tal modo que técnicas que antes parecían imposibles hoy son fáciles de realizar.

Los microorganismos que intervienen en la fermentación del vino son principalmente levaduras del género Saccharomyces, y dentro de este género, la especie que ha sido tradicionalmente utilizada es S. Cerevisiae. Var. Ellipsoideus La fabricación del vino más que ciencia es un arte. Aunque la uva es la fruta comúnmente más usada, también pueden usarse muchas otras frutas como los melocotones, ciruelas, manzanas y duraznos para la fabricación de vinos. Los procedimientos de fabricación del vino de uva casero son bastante sencillos. Simplemente se inocula el jugo de la uva con un cultivo iniciador de levaduras adquirido en un supermercado. La fermentación primaria tarda aproximadamente una semana; durante ese tiempo la mayoría del azúcar originalmente presente en el jugo se convierte en etanol por acción de las células de levadura, al mismo tiempo se produce dióxido de carbono. El exceso de células de levadura son posteriormente removidas del mosto de uva junto con otros


sedimentos, y una fermentación secundaria más lenta permite desarrollar el sabor final del vino. Puede adicionarse azúcar (sacarosa o glucosa) para lograr alcanzar el porcentaje de alcohol deseado o para modificar el sabor del vino. El tipo de vino puede ser clasificado según el color del vino. Otra clasificación está basada en el contenido de azúcar presente en el producto final, como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Clasificación de vinos según el contenido de azúcar.TIPO DE VINO GRAVEDAD ESPECÍFICA CONT. DE AZÚCAR (%P/P)

Vino Seco 1.085 – 1.100 21 – 25Vino semi dulce

1.120 – 1.140 29 – 33

Vino Dulce 1.140 – 1.160 33 - 37

2. OBJETIVO:

Evaluar el efecto del contenido de azúcar (Fructosa) en el proceso de la fermentación del vino de frutas.


a) Materiales:

Fermentador estéril de 1 L. (Erlenmeyer) Manguera estéril Gasa estéril Cinta de enmascarar y bisturí Rollo de papel aluminio Beaker de 500 ml Colador Mortero grande Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml. Baño maría Tubos de ensayo estériles

b. Reactivos:

4 Kg. de Uvas o corozo, manzana, mango, piña, maracuyá Fructosa Levadura para vino (Saccharomyces cerevisiae) Azufre en polvo o Metabisulfito de sodio Agua destilad


4. PROCEDIMIENTO:

Seleccionar las uvas alto grado de madurez (12 – 15 ºBrix) y sanidad. Lavar la uva con abundante agua. Quitar manualmente las pepas de la fruta. Macerar manualmente (Usar guantes) en un recipiente grande para sacar el jugo de la uva (mosto).

Curar el fermentador, previamente limpio y estéril, con sulfuroso. Pesar 1 gr. de Azufre y cubrirlo con un pedazo de algodón alrededor de una varilla delgada. Quemar el azufre y flamear en el interior del fermentador con los gases sulfurosos para evitar la posterior contaminación del vino. Evitar un exceso de sulfuroso en el fermentador que pueda alterar las características organolépticas. En su defecto, se puede usar Metabisulfito de sodio al 1,5% para el curado del fermentador esparciendo esta solución por toda la superficie del recipiente.

Verter el mosto de uva en el fermentador, adicionar agua en relación 2:1 (Mosto : Agua). Adicionar la cantidad de fructosa correspondiente a cada ensayo y agitar. (Ver tabla).

Sacar la muestra inicial y determinar: Azúcares reductores, %Alcohol, pH y Acidez.

Ensayo Conc. de Fructosa adicionada (gr/L)

1 502 1003 200

Pasteurizar el mosto en baño maría a 65ºC durante 20 minutos. Agitar suavemente 2 o 3 veces para distribuir el calor.

Enfriar en baño de hielo hasta temperatura ambiente (28 – 30ºC) Inocular el mosto con un preinóculo de Levadura S. Cerevisiae para

vino (2%). . Adicionar al fermentador y agite hasta disolver. Tapar el fermentador con la gasa estéril (Bien ajustada) y conectar la

manguera como se muestra en la figura. Permitir que se realice la fermentación primaria por un periodo de 8

días. Luego de los 8 días, realizar un frotis del velo de crecimiento y

colorear con azul de lactofenol, observe la morfología; realice una siembra en agar malta; incube durante 5 días a temperatura ambiente y anote los resultados obtenidos.

realizar un trasciego del mosto (separar el vino del sedimento acumulado en el fondo del fermentador, evitar la agitación) a otro fermentador en las mismas condiciones de esterilidad y curado.


Ajustar nuevamente todos los accesorios y continuar con la fermentación secundaria por un periodo de 8 días más. Realizar otro Frotis para observar la morfología microbiana.

MONTAJE DEL FERMENTADOR PARA LA PRODUCCIÓN DE VINO

TAPÓN O GASA MANGUERA ESTERIL

MOSTO AGUA DESTILADA

FERMENTADOR

Al cabo de los 8 días, realizar otro trasciego y finalmente dejar fermentar por 2 semanas más.

Filtrar el vino obtenido, lo más higiénicamente posible con ayuda de un papel filtro y utilizando una bomba de vacío.

Pasteurizar a 65ºC por 20 minutos. Posterior enfriamiento a 4ºC. Degustar el vino y anotar sus características sensoriales. Envasar el restante en botellas de vidrio oscuro y permitir su

envejecimiento. Determinar en cada trasciego: Azúcares reductores, porcentaje

de alcohol etílico, pH y acidez expresada en ácido láctico.

NOTA: Todo material que entre en contacto con el caldo de fermentación debe estar previamente estéril para evitar una contaminación. Utilice siempre el mechero para sacar las muestras.


A través de un gráfico de barras analice los resultados obtenidos entre la concentración de azúcar adicionada Vs. Porcentaje de alcohol obtenido.

A través de un gráfico de barras analice los resultados obtenidos entre la concentración de Azúcares reductores Vs. %Alcohol.


Calcule los rendimientos de sustrato en producto (Yp/s) puntuales y globales de cada ensayo. Analice los resultados.

Realice los balances de masa de cada proceso y calcule los rendimientos de cada uno. Incluya costos - beneficios.

¿Cómo evitar la contaminación por bacterias acéticas en la producción industrial de vino?

¿Cuáles son los principales defectos físicos de los vinos? ¿Qué análisis organolépticos le haría a un vino? ¿Qué diferencia existe entre un vino espumoso y un vino tradicional? ¿Qué exigen las normas ICONTEC para la calidad de los vinos?

6. REFERENCIAS:


Documents

Laboratorios 1 Al 5 (1)