Laboratórna diagnostika CLL: cytológia, prietoková cytometria · jú znaky CD21 (slabo), CD43 (slabo) a HLA-Dr. Znaky CD79b, CD10, CD103 a CD25 sú obyčajne negatívne (CD79b-,

166

Onkológia | 2014; 9(3) | www.solen.sk

Onkohematologické repetitórium

ÚvodChronická lymfocytová leukémia/lymfóm

z malých lymfocytov (CLL/SLL) je klonálna proli-ferácia malých B-lymfocytov s typickým fenoty-pom CD5+ a CD23+ v periférnej krvi (PK), kostnej dreni (KD), lymfatických uzlinách (LU), prípadne pečeni, slezine či ďalších orgánoch. Menšiu časť malígnych buniek potom tvoria prolymfocyty a paraimunoblasty. Termín SLL je používaný pre „aleukemickú“ formu CLL, primárne uzlinovú. V klasifikácii hematologických malignít WHO CLL sa považuje za malignitu vychádzajúcu výhradne z B buniek, zatiaľ čo jednotka T-CLL bola zrušená a pre svoj obligátne agresívny priebeh bola za- hrnutá do skupiny T-prolymfocytových leukémií (T-PLL). V PK pri CLL je spravidla lymfocytóza > 10 × 109/l, ak je však menšia, je diagnóza možná pri typickom morfologickom a imunofenotypo-vom obraze (1). V roku 1988 a 1996 boli pracov-nou skupinou pre CLL (National Cancer Institute-sponsored Working Group on chronic lymphocytic leukemia – NCI-SWG) publikované štandardné postupy na diagnostiku, staging a hodnotenie

liečebnej odpovede. Revidované odporúčania boli publikované v roku 2008 IWCLL – sponsored working group (International workshop on chronic lymphocytic leukemia) v periodiku (odbornom ča-sopise) Blood. Morfologické vyšetrenie PK a po-tvrdený charakteristický fenotyp pomocou prie-tokovej cytometrie je na postavenie diagnózy postačujúci. Vyšetrenie KD nie je na stanovenie diagnózy bezpodmienečne nutné, ale informuje nás o rozsahu infiltrácie, príčine cytopénie a po-máha zhodnotiť dreňovú rezervu (2, 3).

Diagnostika CLL Diagnóza CLL je založená na kritériách NCI-

SWG z roku 2008 uvedených v tabuľke 1. Zakladá sa na vyšetrení krvného obrazu s diferenciálnym rozpočtom, mikroskopickom zhodnotení ná-teru z periférnej krvi a prietokovej cytometrii periférnej krvi. Keďže malígny klon je možné jednoznačne identifikovať v PK, nie je na určenie diagnózy CLL nutné vyšetrenie kostnej drene (KD) či lymfatickej uzliny (LU). Vyšetrenie KD sa robí obyčajne na objasnenie etiológie anémie či

trombocytopénie, to znamená odlíšiť buď infil-tráciu KD pri CLL, autoimunitnú príčinu anémie a trombocytopénie, alebo útlm KD po liečbe. Aspirát aj biopsiu KD sa odporúča realizovať pred liečbou, pri hodnotení jej efektu a pri perzistu-júcich cytopéniách. Exstirpácia a histologické vyšetrenie LU je indikované vtedy, keď nie je diagnóza CLL jednoznačná (napríklad netypický imunofenotyp), alebo pri podozrení na trans-formáciu do inej lymfoproliferácie (Richterov syndróm) (2, 3, 4).

Klasické morfologické vyšetrenie PK sa po-važuje za „prvú líniu“ v rozpoznávaní správnej diagnózy. Cytologická diagnóza CLL sa často opiera o zistenie homogénnej populácie malých lymfocytov, na ktorých sa dokazuje charakteris-tický fenotyp (5).

Morfologické vyšetreniePri typickej CLL predstavujú lymfocyty mor-

fologicky homogénnu, monotónnu populáciu uniformných malých zrelých lymfocytov od veľ-kosti o niečo menšej než normálny malý lymfocyt,

Laboratórna diagnostika CLL: cytológia, prietoková cytometriaMUDr. Ľubica Váleková, PhD.1, MUDr. Juraj Chudej, PhD. 1, MUDr. Juraj Sokol1

1Klinika hematológie a transfuziológie JLF UK a UN Martin

B-chronická lymfocytová leukémia (CLL) je heterogénne ochorenie vychádzajúce z antigénne stimulovaného zrelého B-lymfocytu. Imuno-fenotyp je veľmi stabilný a dobre odlíšiteľný (CD19+, CD20+, CD22-/+, CD23+, CD5+), napriek tomu sa môže zmeniť, zvlášť pri transformácii ochorenia do agresívnejšej formy. V súčasnosti je predpokladom úspešnej starostlivosti o pacientov včasná a presná diagnostika, cielená liečba základného ochorenia a podporná terapia. Mimoriadne dôležité je laboratórne zázemie jednotlivých pracovísk. Morfologická diferen-ciácia CLL od iných malígnych lymfoproliferatívnych ochorení či od benígnych lymfoproliferatívnych porúch môže byť náročná. Dôležitým krokom pri riešení tohto problému je imunofenotypizácia pomocou prietokovej cytometrie. Prietoková cytometria je moderná laboratórna metóda, ktorá v posledných rokoch dosiahla výrazný technologický rozvoj a predstavuje dnes už bežnú a dôležitú súčasť klinickej praxe. Cieľom tohto článku je priblížiť okrem významu cytologického vyšetrenia, súčasné postavenie prietokovej cytometrie v diagnostike a di-ferenciálnej diagnostike CLL vrátane monitorovania minimálnej reziduálnej choroby a detekcie prognostických markerov.

Kľúčové slová: chronická lymfocytová leukémia, diagnóza, morfológia, imunofenotyp, CD38, ZAP-70, minimálna reziduálna choroba.

Laborathory diagnosis of CLL: cytology, flow cytometry

B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a heterogeneous disorder entity; it is characterized by the expansion of a mature, antigen-stimulated B-cell. Immunophenotype is very stable and well distinguishable (CD19+, CD20+, CD22-/+, CD23+, CD5+). However, changes can occur, especially during the transformation to more aggressive form of the disease. At present, early and accurate diagnosis, targeted treatment and supportive therapy seem to be a prerequisite for successful disease management. Laboratory equipment for departments is extremely important. Morphological differentiation of CLL from other malignant or benign lymphoproliferative disorders is difficult. Immunophenotyping by flow cytometry is the important step in this problem-solving. Flow cytometry is a modern laboratory method, which has recently achieved significant technological development and it is now common and important part of clinical practice. The aim of this article is to describe the importance of cytological examination, the current status of flow cytometry in the diagnosis and differential diagnosis of CLL, including the monitoring of minimal residual disease and the detection of prognostic markers.

Key words: chronic lymphocytic leukemia, diagnosis, morphology, immunophenotype, CD38, ZAP-70, minimal residual disease.

Onkológia (Bratisl.), 2014; roč. 9(3): 166–172

167

www.solen.sk | 2014; 9(3) | Onkológia


maximálne však dosahujú dvojnásobok veľkosti erytrocytu, guľatého alebo mierne oválneho tva-ru s ľahko excentricky uloženým jadrom, hutným, kondenzovaným chromatínom. Nukleoly nie sú vo svetelnom mikroskope zreteľné. Cytoplazma tvorí len úzky lem, ktorý je ľahko asymetrický, je slabo bazofilný, väčšinou agranulárny a len vzácne obsahuje inklúzie či vakuoly. Tieto ná-dorové lymfocyty sú veľmi fragilné. V nátere preto nachádzame veľké množstvo jadrových tieňov a rozpadajúcich sa buniek, ktoré sú v prípade CLL označované ako Gumprechtove tiene. Ide o arte-fakt vzniknutý mechanickým poškodením pri ro-bení náteru. Nález Gumprechtových tieňov nie je síce pre CLL patognomonický, avšak tento termín sa používa výhradne v súvislosti s CLL. Ak sú v ná-tere prítomné prolymfocyty, nemal by ich podiel presahovať 10 %. Ak dosiahne počet prolymfo-cytov 55 %, hovoríme už o B-prolymfocytovej leukémii (B-PLL), čo je ochorenie s agresívnejším správaním (1, 6).

Retikulocytóza, polychromázia a ďalšie prejavy hemolýzy svedčia o autoimunitnej hemolytickej anémii, ktorá je pri CLL relatívne častá, rovnako ako je možná aj autoimunitná trombocytopénia. Možná je aj trombocytopénia spôsobená hypersplenizmom (1).

Atypická CLL, nazývaná aj „zmiešano-bun-ková CLL“ (mixed cell type of CLL), má dva varian-ty. Prvý – CLL/PL (chronic lymphocytic leukemia/prolymphocytic leukemia) má typicky dimorfný obraz leukemickej populácie – malé lymfocyty a prolymfocyty, ktorých podiel z lymfoidných buniek PK je > 10 %, ale < 55 %. Druhý variant má leukemické lymfocyty veľmi polymorfné („pleo- morfný“ typ) – rôzne veľké lymfocyty s rôzne objemnou cytoplazmou, bez typickej mozai-kovitej kondenzácie chromatínu, s nepravidel-ným jadrom. Zastúpenie prolymfocytov je pri tomto variante nižšie ako pri predchádzajúcom. Prolymfocyty pri oboch variantoch sú morfolo-gicky ľahko odlišné od typickej B-PLL – väčšia variabilita veľkosti buniek aj objemu cytoplazmy, nukleolus môže byť menej nápadný. Môže byť prítomné aj malé percento väčších lymfoidných buniek s objemnou bazofilnejšou cytoplazmou, ba dokonca aj ojedinelé imunoblasty – blastové elementy s veľkými nukleolami a so silne bazo-filnou cytoplazmou. Atypické CLL majú sklon k agresívnejšiemu priebehu (1, 6, 7, 8, 9).

Aspirát KD býva hypercelulárny s infiltrá-ciou malými lymfocytmi rovnakými ako v PK. Ich zastúpenie je obyčajne > 30 % nukleárnych buniek (alebo > 50 % v prípade hyperplázie eryt-ropoézy). V prípade autoimunitnej deštrukcie erytrocytov či trombocytov býva hyperplázia

erytropoézy, respektíve megakaryopoézy (aj v prípade hypersplenismu) (1).

B-CLL sa môže časom transformovať do ag-resívnejšej formy ochorenia. Možná je tzv. pro-lymfocytoidná transformácia do obrazu B-PLL, keď prolymfocyty v PK tvoria > 55 % lymfoid-ných buniek. Ďalšia forma transformácie CLL je transformácia do difúzneho veľkobunkového lymfómu (DLBCL), predtým nazývaná Richterov syndróm (1, 7, 8, 9).

Morfologický obraz typickej, atypickej CLL a jej prolymfocytovej transformácie a transfor-mácie do DLBCL ukazuje obrázok 1.

Imunofenotypové vyšetreniePokrok v imunologickej fenotypizácii, mole-

kulárnej biológii a cytogenetike umožnil presnej-šiu klasifikáciu malígneho klonu, má prognostický význam v čase diagnózy a priamy vplyv na stra-tifikáciu liečby. Imunofenotypovým vyšetrením dokážeme odpovedať na otázky, či je nádor leu-kocytového pôvodu, či je leukocytová proliferácia malígna, o aký typ leukémie či lymfómu ide, či sú

prítomné znaky, ktoré pomôžu vybrať terapiu alebo určiť prognózu a aký efekt má liečba (moni-torovanie priebehu terapie a detekcia minimálnej reziduálnej choroby – MRD) (10, 11, 12, 13).

Prietoková cytometria (PC) je moderná diagnostická metóda, ktorá doplňuje štandardné morfologické vyšetrenie o údaje, ktoré sa týkajú informácií o bunkových líniách, o stupni diferen-ciácie a o klonovom pôvode buniek. Pomocou prietokovej cytometrie možno vyšetrovať aké-koľvek imunofluorescenčne označené bunkové suspenzie. Analyzuje prítomnosť a množstvo molekúl na bunkách, pričom bunkové suspenzie sa inkubujú s fluorescenčne označenou mo-noklonálnou protilátkou, bunky potom získajú fluorescenčný signál detegovaný prietokovým cytometrom. Súčasné prietokové cytometre umožňujú detegovať na každej bunke viac molekúl súčasne (10, 11, 13, 14, 15, 16). Keďže diagnóza CLL nie je jednoznačná, pokiaľ nie je dokázaný charakteristický fenotyp, musí byť použitý dostatočný panel monoklonových proti-látok na diagnostiku a na odlíšenie CLL od iných

Tabuľ ka 1. Diagnostické kritériá CLL

Diagnostické kritériá NCI-SWG 1996 IWCLL 2008

lymfocytóza v PK > 5 x 109/l > 5 x 109 /l

morfológia lymfocytov nešpecifikované – zrelého vzhľadumalé, zrelé s úzkym lemom cytoplazmy, s denzným jadrom, bez jadierok

atypické bunky (prolymfocyty) < 55 % alebo < 15 x 109/l < 55 %

trvanie lymfocytózy nevyžaduje sa > 3 mesiace

imunofenotyp

≥ 1 B znak (CD19, CD20, CD23) a pozitivita CD5 pri negativite ostatných T znakov monoklonová expresia κ a λ reťazca slabá expresia povrchového Ig

≥ 1 B znak (CD19, CD20, CD23) a pozitivita CD5 pri negativite ostatných T znakov monoklonová expresia κ a λ reťazca slabá expresia povrchového Ig

kostná dreň ≥ 30 % lymfocytóza ≥ 30 % lymfocytóza

Obrázok 1. Morfologický obraz CLL a jej transformácie

typická CLL, PK

prolymfocytová transformácia CLL, PK

typická CLL, KD

transformácia do DLBCL, (Richterov syndróm), KD

atypická forma CLL/PL, PK

168



B-lymfoproliferatívnych ochorení. Výber by mal obsahovať znaky pan B-buniek – CD19, CD20, CD22, CD24, CD79b a povrchový imunoglobulín (sIg), ďalej znaky pre diferenciálnu diagnostiku s ostatnými B-bunkovými chronickými lym-foproliferatívnymi ochoreniami – CD5, CD23 , CD10 , FMC-7 a CD11c, aj CD103, HLA-Dr, CD25. V roku 1994 profesorka Estella Matutes a jej spo-lupracovníci navrhli bodovací systém na zá- klade hodnotenia 5 parametrov: CD5, CD23, FMC7, intenzita povrchového imunoglobulínu (sIg) alebo kappa/lambda (κ/λ) ľahkých reťazcov na povrchu buniek a CD22/CD79b. B-CLL skóre sa pohybuje v rozmedzí 5 (typické prípady B-CLL) a 3 (menej typické prípady B-CLL). Výsledky 0 – 2 vylučujú diagnózu B-CLL (tabuľka 2). Nedávno skupina Euroflow navrhla väčší panel monoklo-nových protilátok v snahe dosiahnuť diagnózu a zlepšiť identifikáciu prekrývajúcich sa prípadov

(CD43, CD81, CD38, CD200, CD21). Použitie 8-fa-rebného prietokového cytometra umožňuje súčasné hodnotenie 8 až 12 znakov danej bun-kovej populácie (17, 18, 19, 20).

Diagnostika B-CLL je zvyčajne jednodu-chá, pretože populácia B-buniek vykazuje cha-rakteristický imunofenotyp (obrázok 2): slabá expresia povrchového imunoglobulínu (sIgM a/alebo sIgD) s klonálnou expresiou ľahkého reťazca κ alebo λ, nepravidelná expresia cyto-plazmatického imunoglobulínu (cIg), expresia B-bunkových antigénov, ako je CD19+, CD20 (slabá+), CD24+, CD79a (slabá+) s koexpresiou so znakom CD5+. Populácia je typicky CD23+, FMC7- a znak CD22 na povrchu patologických buniek je obyčajne negatívny (sCD22-). Niekedy sú bunky sCD22+, cCD22+. Znak CD11c býva obyčajne pozitívny (CD11c+/-), znak CD200 býva silno pozitívny (CD200+/silná), ďalej exprimu-

jú znaky CD21 (slabo), CD43 (slabo) a HLA-Dr. Znaky CD79b, CD10, CD103 a CD25 sú obyčajne negatívne (CD79b-, CD10-, CD103-. CD25-/+). Silná expresia znaku CD44 alebo sIg, expresia FMC-7, slabá expresia CD23, neprítomnosť CD11c môže znamenať horšiu prognózu. Znak CD20 je spravidla slabší ako CD19, na rozdiel od MCL (1, 4, 11, 13, 21). Do diagnostického panelu sú dnes zahrnuté aj znaky CD20 a CD52 s ohľadom na používanie monoklonových protilátok anti--CD20 (rituximab) a anti-CD52 (alemtuzumab) v liečebných režimoch pre CLL (25). Graf CD45/SSC identifikuje populáciu buniek s jasnou ex-presiou znaku CD45 a nízkym SSC a bunky CLL sa nachádzajú v oblasti lymfocytov (13).

Problémy vznikajú v prípade necharakteris-tického imunofenotypu, vrátane pacientov, ktorí majú skóre 3 (alebo dokonca 4) podľa Matutes. Problémy sú hlavne v tých prípadoch, keď chý-ba expresia znaku CD5 alebo CD23, alebo je silná expresia CD20 či CD22/CD79b (19, 20, 22). Pri morfologicky atypických formách B-CLL sa väčšinou zisťuje silná pozitivita CD20 a CD22, ľahkých a ťažkých reťazcov Ig, prípadne poziti-vita CD79b a FMC7. Dôkaz transformácie B-CLL pomocou PC býva ťažký. Pri prolymfocytovej transformácii si leukemické bunky väčšinou ponechávajú základný imunofenotyp (CD19+, CD5+, CD23+), mení sa ich intenzita expresie niektorých znakov v zmysle nárastu tak, ako to býva opisované pri atypických formách B-CLL – to je silná expresia CD20, CD22, CD79b, FCM7 a ľahkých a ťažkých reťazcov. Je nutné pripome-núť, že sa zväčšuje veľkosť buniek, čiže narastá parameter FSC. Richterov syndróm je možné PC analýzou dokázať, samozrejme, len v prípa-de postihnutia KD a PK v rámci tejto transfor-mácie. Potom vedľa malobunkovej populácie s typickým B-CLL fenotypom možno zachytiť v analyzovanej vzorke prítomnosť odlišnej veľ-kobunkovej frakcie s vysokým FSC, ktorá si však väčšinou ponecháva imunofenotyp CLL. Len niekedy je tu možné zachytiť odchýlky fenotypu, ktoré spočívajú v zosilnení expresie niektorých antigénov, ako je CD20, CD22, CD79b, FMC7 a ľahkých reťazcov, vymiznutí expresie CD23, prípadne i CD5 (7, 8, 17). Diagnosticky spoľahli-vejšie než PC je v takomto prípade histologické vyšetrenie suspektnej uzliny či KD (1).

Diferenciálna diagnostikaNález lymfocytózy a/alebo lymfadenopatie

a splenomegálie bez bližšieho určenia môže byť spojený s benígnymi, väčšinou infekčnými cho-robami (EBV, CMV, HIV, rubeola, varicela, infekčné hepatitídy, brucelóza, toxoplazmóza), ale môže

Tabuľ ka 2. Imunologické kritériá: skórovací systém B-CLL (Matutes et al., 1994)

znak prítomnosť – neprítomnosť znaku body

CD5 + 1

CD22/CD79a Slabo +/- 1

CD23 + 1

sIg Slabo + 1

FMC-7 - 1

Pacienti s B-CLL skóre 4 – 5 (87 % CLL) Pacienti s iným LPO skóre 0 - 1 (89 % iných B-bb. leukémií, 72 % lymfómov) (18)

Obrázok 2. PC analýza CLL: graf FSC/SSC a CD45/CD14 identifikuje populáciu buniek s jasnou expre-siou znaku CD45 a nízkym SSC, nachádzajúcu sa v oblasti lymfocytov. Expresia B-bunkových antigé-nov: CD19+, CD20 slabá+, CD24+, s koexpresia s CD5+, typicky CD23+, HLA-Dr+, FMC7-, CD10-, sCD22-, CD11c-/+, slabá expresia sIg s klonálnou reštrikciou ľahkého reťazca λ, nepravidelná expresia cIg

FSC (forward scatter) - predný svetelný rozptyl, miera veľkosti; SSC (side scatter) - bočný svetelný rozptyl, miera granularity, R6 – lymfocytový gate; R2 – monocytový gate; R3 – granulocytový gate

169



byť aj prejavom iného malígneho lymfoprolife-ratívneho ochorenia (LPO). Najdôležitejší marker na odlíšenie reaktívnej a malígnej lymfocytózy je dôkaz klonality populácie B-buniek: abnormálny pomer povrchových alebo cytoplazmatických imunoglobulínových ľahkých reťazcov (κ, λ) a dôkaz typického B-bunkového fenotypu. Pre diagnózu CLL je okrem fenotypu dôležitý aj počet B-buniek. V prípade zachytenia typického klonu CD5+/19+/23+ lymfocytov v množstve pod arbitrárnu hranicu 5 x 109/l a pri neprítom-nosti cytopénie, lymfadenopatie či splenome-gálie, ide o tzv. monoklonálnu lymfocytó-zu z B-lymfocytov (MBL), ktorá predstavuje premalígny stav analogický s monoklonálnou gamapatiou nejasného významu (MGUS). Iba časť týchto pacientov progreduje do CLL (pri-bližne 1 – 2 % ročne) (3, 4, 22). Frekvencia MBL v populácii sa pohybuje okolo 3 %, ale zdá sa významne vyššia (až 17 %) u príbuzných CLL pa-cientov. Toto, spolu s epidemiologickými údajmi, podporuje dedičný základ pre CLL. Jednotka SLL má identický imunofenotyp, hlavným rozdielom proti CLL je nesplnenie kritéria periférnej lym-focytózy. Spravidla prevažuje lymfadenopatia, preto väčšina dôkazov SLL je z histológie LU (4, 5, 8, 22). Tabuľky 3 a 4 prehľadne uvádza-jú najčastejšiu diferenciálnu diagnózu CLL (7, 8). Diferenciálne diagnosticky je potrebné od CLL odlíšiť hlavne B-PLL, leukemizovaný lym-fóm z plášťových buniek (MCL) (obrázok 3), lymfoplazmocytový lymfóm (LPL) (obrázok 4), leukémiu z vlasatých buniek (HCL) (obrázok 5), leukemizovaný folikulárny lymfóm (FL) (obrázok 6) a ďalšie indolentné lymfoproliferácie. B-PLL je agresívnejšie ochorenie charakterizované inou polohou patologických bunkových populácií na grafe FSC/SSC dané morfológiou, s expre-siou B-bunkových antigénov: CD19+, CD20+, CD24+, CD79a+, CD21+, s typicky CD5-, sCD22+, FMC7+, HLA-Dr+, silnejší sIg, znaky CD10-/+, CD25-/+, CD11c- (11, 13). Veľký dôraz je kladený hlavne na odlíšenie CLL od MCL, ktoré sa zjav-ne líšia, pokiaľ ide o prognózu. Kým CLL máva obyčajne indolentný priebeh s mediánom pre-žitia v rozmedzí od 95 do 293 mesiacov, MCL je obyčajne agresívne ochorenie s mediánom prežitia 36 až 60 mesiacov a býva často refrak-térne na konvenčnú liečbu. Diferenciácia týchto subjektov má dôležité prognostické a liečeb-né dôsledky. Dôkaz typického fenotypu CLL prietokovým cytometrom je relatívne dobrý spôsob odlíšenia CLL od MCL. Niektoré štúdie ukázali, že CLL môže však byť CD23-, FMC-7+, s jasnou expresiou CD20 aj sIg. Dokázať, či ide o atypický fenotyp CLL, alebo o MCL (obrázok 3),

môžeme jadrovou expresiou cyklínu D1 či dôka-zom translokácie t(11;14) a mRNA pre cyklín D1, alebo dôkazom cytogenetických abnormalít vyskytujúcich sa pri CLL. Početné štúdie ukazujú, že PC dôkaz CD23 a FMC-7 sú relatívne dobré na odlíšenie MCL a CLL. Často používané, ale menej spoľahlivé, sú aj intenzita expresie CD20 a sIg. Hodnotenie cyklínu D1 pomocou PC je problematické, nemá dostatočnú citlivosť a špe-cificitu v rozlišovaní MCL od CLL. Antigén CD5 je považovaný za dôležitý ukazovateľ odlíšenia MCL a CLL od iných low-grade B-bunkových lymfómov. Boli však dokázané rozdiely v expre-sii znaku CD5 u MCL, pričom jeho negatívna expresia CD5- pri MCL nie je mimoriadna, pre-to dôkaz cyklínu D1 a/alebo FISH analýza sú dôležité. Znak CD10 je ukazovateľom B-buniek zárodočných centier a je exprimovaný pri FL a DLBCL (8, 18, 20).

PrognózaCLL je ochorenie s veľmi heterogénnym prie-

behom. Kým u niektorých pacientov má indolent-ný charakter a neskracuje predpokladanú dĺžku života pacienta, u iných sa správa veľmi agresívne, rýchlo progreduje a prežitie pacienta od stano-venia diagnózy je 2 – 3 roky. Keďže väčšina pa-cientov sa diagnostikuje vo včasnom štádiu CLL, je snaha o predikciu ďalšieho vývoja ochorenia (9). Za klasické markery pre nepriaznivú prognózu B-CLL detegované PC sa považujú znaky CD38, CD49d a ZAP-70. Znak CD49d môže byť považo-vaný za silný prediktor celkového prežitia pri CLL. Väčšina štúdií uvažuje o zlej prognóze B-CLL pri aspoň 30 % pozitivite buniek pre CD49d (23). Hoci väčšina štúdií považuje 30 % pozitívnych buniek ako cut-off aj pre stanovenie pozitivity expresie znaku CD38, niektoré štúdie preukázali negatívnu prognózu u pacientov s expresiou CD38 na viac

Tabuľ ka 3. Diferenciálna diagnóza medzi CLL a inými B-bunkovými leukémiami

obraz CLL BPL HCL

morfológia

veľkosť bunky chromatín jadierko jadro cytoplazma

malá hutný nie/malé pravidelné úzka

stredná kondenzovaný nápadné pravidelné stredná

stredná/veľká retikulárny/špongiózny nie obličkovitý tvar bohatá s výbežkami

imunofenotyp

CLL skóre CD5 CD23 sIgM FMC7 CD79b cyklín D1

3 – 5 ++ ++ slabý -/+ slabý nie

0 – 2 -/+ -/+ silný ++ silný nie

0 - - silný ++ stredný áno (slabý)

Vysvetlivky: sIg: surface immunoglobulin (povrchový Ig)(-): negatívne alebo pozitívne v menej ako 10 % prípadov; (-/+): pozitívne pri 10 až 25 % prípadov; (+): pozitívne v 25 až 75 % prípadov, (++): pozitívne vo viac ako 75 % prípadov, BPL - B-prolymfocytová leukémia; HCL - leuké-mia z vlasatých buniek

Tabuľ ka 4. Diferenciálna diagnóza medzi CLL a inými B-bunkovými lymfómami

obraz CLL MCL SMZL FL

morfológia

veľkosť bunky chromatín jadierko jadro cytoplazma

malá hutný nie/malé pravidelné úzka

stredná škvrnitý nie/malé vrúbkované stredná

malá kondenzovaný nie pravidelné malá

veľmi malá kondenzovaný nie rozštiepené úzka

imunofenotyp

CLL skóre CD5 CD23 sIgM FMC7 CD79b cyclin D1

3 – 5 ++ ++ slabý -/+ slabý -

1 – 2 ++ -/+ silný ++ silný +

0 – 2 + -/+ silný ++ silný -

0 – 1 - -/+ silný ++ silný -

Vysvetlivky: MCL – mantle-cell lymphoma (lymfóm z plášťových buniek); SMZL/SLVL – splenic marginal-zone lymphoma with villous lymphocytes (splenický lymfóm z marginálnej zóny/ splenický lymfóm s výbežkovitými lymfocytmi); FL – folikulový lymfóm; SmIg – povrchový Ig(-): negatívne alebo pozitívne v menej ako 10 % prípadov; (-/+): pozitívne pri 10 až 25 % prípadov; (+): pozitívne v 25 až 75% prípadov, (++): pozitívne vo viac ako 75 % prípadov

170



než 20 % buniek alebo ešte menej. Za posledných 10 rokov bol antigén CD38 vyskytujúci sa na po-vrchu lymfocytov CLL predmetom extenzívneho výskumu, zdalo sa totiž, že jeho zvýšená expresia je spojená s prítomnosťou nemutovaného génu IgVH a bola snaha jednoduchou detekciou CD38 pomocou PC nahradiť stanovenie mutačného stavu. Bolo však zistené, že korelácia CD38+ s ne-mutovaným stavom IgVH nie je jednoznačná a aj miera expresie CD38 v priebehu trvania ochorenia kolíše. Aj napriek tomu, že antigén CD38 nena-hradil mutačný stav IgVH, je stále považovaný za nezávislý prognostický faktor (17, 24).

Zeta asociovaný proteín (ZAP-70) je tyrozín-kináza, prítomnosť ktorej bola dlho považovaná za špecifickú pre T-lymfocyty a NK bunky. Neskôr sa zistilo, že je v menšej miere exprimovaná i na rôznych vývojových štádiách B-lymfocytov a od-ráža stupeň bunkovej aktivácie. Pri štúdiu CLL bola opísaná expresia ZAP-70 aj v nádorových B-lymfocytoch a ich vyššia hladina bola asocio-vaná častejšie s nemutovaným IgVH a agresív-nejším priebehom ochorenia, pri mutovaných CLL bola expresia ZAP-70 uniformne nízka. Mieru expresie ZAP-70 na CLL bunkách stanovujeme PC analýzou z PK, pričom cut-off pre pozitivitu ZAP-70 je 20 %. Je málo údajov o jej stanovení na B-lymfocytoch KD a LU. PC umožňuje posúdiť prítomnosť ZAP-70 samostatne na CLL klone aj na T- a NK-bunkách (24, 25, 26, 17, 9). Na základe výsledkov dosiaľ publikovaných prác môžeme predpokladať, že miera expresie ZAP-70 sa javí na populácii leukemických buniek uniformná. Javí sa ako časovo stála a oproti čerstvo odobratým vzorkám sa významne nelíši pri použití zmraze-ných mononukleárnych buniek. Je odporučené skoré spracovanie vzorky v ten istý deň, optimál-ne do 6 – 8 hodín po odbere, prípadne skoro po rozmrazení (26). Napriek určitým problémom, predstavuje PC v súčasnom období najčastejšie používanú metódu stanovenia expresie ZAP-70. Jej výhodou je veľmi dobrá dostupnosť, relatívna jednoduchosť a časová nenáročnosť. Navyše nie sú potrebné separované B-lymfocyty a vý-sledok nie je ovplyvnený mierou kontaminácie T-lymfocytmi vo vzorke (T-lymfocyty sú identifi-kované špecifickými povrchovými protilátkami). Hlavnou a doteraz zásadnou nevýhodou je ab-sencia jednotne používanej, štandardizovanej metodiky, ktorej výsledky by boli vzájomne dobre porovnateľné. Ide hlavne o absenciu do-hody, ak ide o výber optimálnej anti-ZAP-70 protilátky, voľbu stratégie „gatingu“, pozitívnej a negatívnej kontroly a optimálny prah po-zitivity. ZAP-70 je lokalizovaný v cytoplazme, preto vyžaduje na detekciu permeabilizačné

Obrázok 3. PC analýza MCL: B-bunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky CD5+ a CD23- (odlíši od CLL), FMC-7+, CD11c-, sIg+, expresia κ ľahkého reťazca, CD25-, CD10-/+

R7 – lymfocytový gate; R8 – monocytový gate; R9 – granulocytový gate

Obrázok 4. PC analýza LPL: B-bunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky CD5- (odlíši od CLL), CD10-, výrazný cIg, expresia κ ľahkých reťazcov, CD23-, HLA-Dr+, CD11c-


171



techniky, ktoré môžu viesť k zníženiu intenzity farbenia. Všetky metódy narážajú na prekážku relatívne nízkej intenzity expresie ZAP-70 na CLL bunkách v porovnaní s T a NK bunkami (5, 6, 8). Expresia ZAP-70 a CD38 na CLL bunkách (ob-rázok 7) sa však môže v priebehu ochorenia významne meniť a pri oboch markeroch je istá diskonkordancia medzi ich pozitivitou a nemu-tovaným IgVH. Preto v súčasnosti, keď vyšetrenie mutačného stavu IgVH je dostupným a štan-dardizovaným vyšetrením, považujeme ZAP-70 a CD 38 za významné, ale skôr doplňujúce prognostické faktory pri určovaní prognózy kon-krétneho pacienta. Zatiaľ čo zmena z pozitivity do negativity bola zaznamenaná len u klinicky stabilných pacientov, pozitivizácia bola spoje-ná s progresiou ochorenia. Zaujímavou sa javí súvislosť pozitivizácie ZAP-70 s nemutovanými IgVH génmi, čo by mohlo byť v dôsledku klonál-neho vývoja opisovaného u týchto pacientov. Je preto vhodné znovu vyšetriť expresiu ZAP-70 u pôvodne ZAP-negatívneho pacienta v čase progresie ochorenia (25).

Minimálna reziduálna choroba (MRD)

Moderné liečebné protokoly vedú u vý-znamnej časti chorých k zníženiu leukemického klonu pod úroveň detekcie bežnými metódami, zvyškové leukemické elementy (MRD) môžu byť zistiteľné iba veľmi citlivými metódami. V litera-túre pribúda dôkazov o predĺžení prežitia bez progresie a celkového prežitia u pacientov, u kto-rých bola dosiahnutá negativita MRD. Sledovanie MRD pomocou viacfarebnej PC s citlivosťou až 10-5 je vhodné zvážiť u pacientov liečených in-tenzívnou liečbou. Na identifikáciu MRD pri CLL je odporučená minimálne štvorfarebná kombinácia monoklonových protilátok, najviac odporučené kombinácie na identifikáciu MRD sú CD22 slabá+/CD81 slabá+/CD19+/CD5+ a CD43 silná+/CD79b slabá+/CD19+/CD5+ (4, 27).

ZáverAj keď cytologické vyšetrenie zostáva pri

koreni každej diagnózy a môže byť dostatočné vo väčšine prípadov typickej CLL za prítomnosti Gumprechtových tieňov v krvnom nátere, na jednoznačné potvrdenie diagnózy CLL je potreb-né imunofenotypové vyšetrenie PK. Cytologické a imunofenotypové vyšetrenie poskytujú prísluš-né informácie, ak ide o diagnózu, priebeh ochore-nia, diferenciálnu diagnózu a prognózu. Klinická diagnóza musí byť výsledkom komplexného zhodnotenia celého diagnostického postupu a obyčajne si vyžaduje multidisciplinárny prístup.

Obrázok 5. PC analýza HCL: B-bunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky CD5- (odlíši od CLL), CD10- CD23-, HLA-Dr+, CD25+, sIg+, s expresiou κ ľahkých reťazcov, typicky: CD11c+, FMC7+, CD103+, CD123+ (odlíši od iných)


Obrázok 6. PC analýza FL: B-bunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky D10+ (výni-močne-), znaky CD5-, CD43- (odlíši od CLL a MCL), CD23-/+ (odlíši od CLL), sIg+ (všetky, najčastejšie IgM+) s reštrikciou ľahkých reťazcov. CD11c-, CD25-, HLA-Dr+

R8 – lymfocytový gate; R10 – monocytový gate; R11 – granulocytový gate; R7 – lymfómové bunky

Obrázok 7. Expresia znaku CD38 a ZAP-70 u pacienta s CLL

172



Literatúra

1. Kačírková P, Campr V. Hematoonkologický ATLAS krve a kost-ní dřeně. Praha: Grada, 2007.2. Mikušková E, Demitrovičová Ľ. Chronická lymfocytová leu-kémia – biológia, klinický obraz a prognóza (1. časť). Onkoló-gia. 2008;3(5):316–319.3. Hallek M. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the Internatio-nal Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (IWCLL) up-dating the National Cancer InstituteWorking Group (NCIWG) 1996 guidelines. Blood. 2008.4. Smolej L, Doubek M, Špaček M, Urbanová R, Obrtlíková P, Schwarz J, Lysák D, Pospíšilová Š, Jarošová M, Peková S, Kozák T. Doporučení pro diagnostiku a léčbu chronické lymfocytární leukemie (CLL). Transfuze Hematologie dnes. 2013;19(2):61–68.5. Kastenbaum HA, Khalbuss WE, Felgar RE, Stoller R, Monaco SE. The spectrum of coincident entities with small lympho-cytic lymphoma/chronic lymphocytic leukemia (SLL/CLL) diagnosed by cytology. CytoJournal. 2010;7:20.6. Dusse LMS, Silva TP, Freitas LG, Vieira LM, Sabino AP, Car-valho M. Gumprecht shadows: when to use this terminolo-gy? J. Bras. Patol. Med. Lab. 2013;49(5):320–323.7. Matutes E, Wotherspoon A, Catovsky D. Differential diag-nosis in chronic lymphocytic leukaemia. Best Practice & Rese-arch Clinical Haematology. 2007;20(3):367–384.8. Matutes E, Wotherspoon A, Catovsky D. Diagnostic issues in chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Best Practice & Rese-arch Clinical Haematology. 2010;23:3–20. 9. Panovská A, Doubek M. Chronická lymfocytární leukemie – diagnostika a léčba. Onkologie. 2013;7(3):117–120.10. Eckschlager T, et al. Průtoková cytometrie v klinické praxi. Praha: Grada, 1999. 169 s.

11. Marinov I. Průtoková cytometrie v klinické hematologii. 2. prepracované a rozšírené vydanie. Praha: Triton, 2008. 152 s.12. Stewart CC. Multiparameter flow cytometry. J Immuno-assay. 2000;21:255–272.13. Váleková Ľ. Princípy prietokovej cytometrie v diagnostike malígnych lymfómov. Lekárske listy. 2005;32:20–26.14. Riley RS, Idowu M. Principles and Applications of Flow Cy-tometry. Richmond; VA: Medical College of Virginia/VCU He-alth Systems Virginia Commonwealth University, 2003.14 p.15. Smithz HG, Rothe G. Durchflubzytometrie in der klinischen Zelldiagnostik. Stuttgart, New York: Schattauer, 1994. 199 p.16. Váleková Ľ, Vošková D, Fedorová J, Kubisz P. Význam prietokovocytometrických vyšetrení v hematológii. Lekár-ske listy. 1999;20:2–8.17. Craig1 FE, Foon KA. Flow cytometric immunophenoty-ping for hematologic neoplasms. Blood. 2008;111(8):3941–3967.18. Matutes E, Polliack A. Morphological and Immunophe-notypic features of Chronic lymphocytic leukemia. Rev Clin Exp Hematol. 2000;4(1):22–47.19. Afaf Abdel-Aziz Abdel-Ghafar, Manal Ahmed Shams El Din El Telbany, Hanan Mohamed Mahmoud, et al. Immunophe-notyping of chronic B-cell neoplasms: flow cytometry versus immunohistochemistry, Hematology reports. 2012;4(1):6–11.20. Béné MC, Nebe T, Bettelheim P, et al. Immunophenoty-ping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia. 2011;25(4):567–574.21. Spacek M, Obrtlikova P, Tměný M. Chronická lymfocy-tární leukémie [online]. Postgraduální medicína. 2013. Avai-lable from: <http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-me-dicina/chronicka-lymfocytarni-leukemie-470643>. Acces-sed June 6, 2013.

22. Rawstron AC, Shingles J, de Tute R, et al. Chronic lympho-cytic leukaemia (CLL) and CLL-type monoclonal B-cell lym-phocytosis (MBL) show differential expression of molecules involved in lymphoid tissue homing. Cytometry B Clin Cytom. 2010;78 Suppl 1:42–46.23. Bulian P, Shanafelt TD, Fegan Ch, et al. CD49d Is the Stron-gest Flow Cytometry–Based Predictor of Overall Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia. JCO. 2014;32(9):897–904.24. Kozák T. Chronická lymfocytární leukemie. Onkologie. 2008;2(3):156–162.25. Smolej L. ZAP-70 expression may changes significantly in patients during the course of chronic lymphocytic leuke-mia. Hematology. 2012;17(5):268–274.26. Smolej L, Saudková L, Špaček M, et al. ZAP-70 u chronic-ké B-lymfocytární leukémie: klinický význam a metódy de-tekce. Vnitř Lek. 2006;52(12):1194–1199.27. Böttcher S, Ritgen M, Fischer K, et al. Minimal Residual Di-sease Quantification Is an Independent Predictor of Progres-sion-Free and Overall Survival in Chronic Lymphocytic Leu-kemia: A Multivariate Analysis from the Randomized GCLLSG CLL8 Trial. J Clin Oncol. 2012;30(9): 980–988.

MUDr. Ľubica Váleková, PhD. Klinika Hematológie a transfuziológie JLF UK Univerzitná nemocnica Martin Kollárova 2, 036 59 Martin [email protected]

Documents

Laboratórna diagnostika CLL: cytológia, prietoková cytometria · jú znaky CD21 (slabo), CD43 (slabo) a HLA-Dr. Znaky CD79b, CD10, CD103 a CD25 sú obyčajne negatívne (CD79b-,