UJI PIROGEN

I. Tujuan

Untuk mengetahui adanya pirogen hidup atau atau yang mempunyai daya

hidup di dalam suatu sediaan steril.

II. Prinsip

Uji LAL

Uji LAL merupakan pengujian untuk memperkirakan konsentrasi

endotoksin bakteri yang mungkin ada dalam contoh bahan. Pengujian ini

pada prinsipnya merupakan koagulasi protein yang ada dalam reagensia

LAL oleh endotoksin. Pengujian tersebut ialah dinyatakan positif apabila

terjadi pembentukan gel dan dinyatakan negatip bila tidak terjadi

pembentukan gel. Pembentukan gel akan terjadi apabila kandungan

endotoksin dalam contoh sediaan lebih besar daripada sensitivitas reagen

yang dinyatakan dalam Endotoksin Unit per ml (EU/ml) atau ng/ml

(Aulton, Michael, 2010).

III. Teori

Pirogen berasal dari kata pyro yang artinya keadaan yang

berhubungan dengan panas, dan kata gen yang artinya membentuk atau

menghasilkan. Pirogen adalah suatu produk mikroorganisme, terutama

dari bakteri gram negatif. Pirogen adalah senyawa dengan berat molekul

tinggi yang dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida yang diproduksi

oleh kira-kira 5-10% massa total bakteri. Pirogen ini merupakan senyawa

yang jika masuk ke dalam aliran darah akan mempengaruhi suhu tubuh

dan biasanya menghasilkan demam. Pengobatan demam yang disebabkan

oleh pirogen sangat sulit dan pada beberapa kasus dapat menyebabkan

kematian. Pirogen berasal dari kelompok senyawa yang luas, meliputi

endotoksin (LPS). Endotoksin adalah suatu molekul yang berasal dari

membran luar bakteri gram negatif. Organisme gram negatif membawa 3-

4 juta LPS pada permukaannya yang meliputi 75% permukaan membran

luar (Usman, 1988).

Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam

dan sering mencemari sediaan farmasi. Sampai saat ini, substansi

pirogenik yang diketahui paling aktif dan paling sering mencemari sediaan

farmasi adalah endoktoksin, selain itu masih banyak substansi pirogenik

lainnya seperti bakteri, fungi, DNA–RNA virus, protein, polipeptida dan

lain. Endotoksin merupakan suatu produk mikroorganisme terutama dari

bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa kompleks

lipopolysakarida yang pyrogenic, suatu protein dan suatu lipid yang inert.

Pada saat ini endoktoksin diketahui merupakan pirogen yang paling kuat,

namun kehadiran pirogen lain dalam suatu sediaan perlu diperhitungkan

karena manusia tidak hanya dipengaruhi endoktoksin saja tetapi juga

pirogen yang lain (Lucas, 2006).

Sifat-sifat pirogen adalah termostabil, sehingga hanya dapat

dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 650C selama 1 menit, 2500C

selama 15 menit atau 1800C selama 4 jam, larut dalam air sehingga tidak

bisa memakai penyaring bakteri, tidak dipengaruhi oleh bakterisida yang

biasa dan tidak menguap, destilasi biasa ada yang ikut bersama percikan

air serta berat molekul (BM) antara 15.000-4.000.000. Pirogen

dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu pirogen endogen dan pirogen

eksogen. Pirogen endogen yaitu faktor-faktor yang berasal dari dalam

tubuh kita sendiri sebagai reaksi kekebalan melawan kuman penyakit yang

masuk ke tubuh. Misalnya interleukin-1 (IL-1), interleukin-6(IL-6), alpha-

interferon, dan (TNF) tumor necrosis factor (Sudjadi, 2008).

Pirogen eksogen yaitu faktor eksternal tubuh yang menyebabkan

gangguan pada fungsi tubuh manusia. Misalnya bagian dari sel bakteri dan

virus. Selain itu, bisa juga berupa zat racun (toksin) yang dihasilkan oleh

bakteri atau virus tertentu. Jika suatu pirogen masuk ke tubuh, maka

pirogen menjadi suatu benda asing yang dapat menimbulkan respon imun

berupa demam. Demam yaitu suatu keadaan ketika temperatur tubuh di

atas batas normal yang dapat disebabkan oleh kelainan dalam otak sendiri

atau oleh bahan-bahan toksik yang mempengaruhi pusat pengaturan

temperatur. Penyebab-penyebab tersebut meliputi penyakit bakteri, tumor

otak, dan keadaan lingkungan yang dapat berakhir dengan serangan panas.

Pada manusia reaksi pyrogenic dimanifestasikan dengan demam dan

menggigil. Setelah di injeksikan sekitar 45-90 menit, kemudian terjadi

kenaikan suhu tubuh, diikuti dengan menggigil, sakit kepala dan malaise.

Dingin berlangsung 10 sampai 20 menit dan mencapai puncaknya pada

jam kedua atau ketiga. Biasanya efeknya dapat dikontrol dengan

pemberian obat antypiretic, tetapi dapat dibayangkan bahwa kenaikan suhu

pada pasien yang sakit dapat memiliki konsekuensi yang parah pada

penyakitnya. Ketika pirogen memang terjadi dalam produk parenteral,

mereka datang dari salah satu dari tiga sumber yaitu air yang digunakan

sebagai pelarut, wadah dengan larutan yang telah datang ke kontak selama

persiapan, pengemasan, penyimpanan, atau administrasi, atau bahan kimia

yang digunakan dalam persiapan dari larutan (James, 2008).

Metode LAL merupakan pengujian in-vitro, maka mulailah

perusahaan-perusahaan melihat kemungkinan untuk menggantikan uji

pirogenitas kelinci dengan metode LAL. Mulai saat itu muncullah

argumentasi-argumentasi sebagai akibat perbandingan antara uji kelinci

dan uji LAL. Sebagian menyatakan keuntungan-keuntungan menggunakan

uji LAL dan kerugian-kerugian uji kelinci. Dilain pihak ingin

mempertahankan kelinci dalam melakukan pengujian pirogenitas suatu

sediaan. Uji pirogenitas menggunakan kelinci pertama kali diperkenalkan

oleh Hort dan Penfold pada tahun 1911. Dalam percobaan mereka dengan

kelinci didapatkan hasil bahwa faktor terkait yang menyebabkan

peningkatan temperature pada kelinci yaitu setelah penginjeksian ekstrak

kultur bakteri, sedangkan dengan larutan steril bebas dari endotoksin tidak

menyebabkan efek samping terebut. Kelinci digunakan sebagai model uji

pirogen dikarenakan kelinci menghasilkan respons fisiologi yang serupa

dengan manusia terhadap pirogen. Griesman dan Hornick menunjukkan

bahwa kelinci dan manusia menghasilkan respon yang sama terhadap

kuantitas nanogram/kilogram dari pirogen. Untuk uji tersebut digunakan

kelinci dewasa sehat yang ditempatkan masing-masing satu kelinci dalam

satu kandang pada suhu 20-23 dan bebas dari gangguan yang

menimbulakan kegelisahan. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan

untuk uji pirogen, adaptasikan kelinci tidak lebih drai 7 hari dengan uji

pendahuluan yang me;iputi tahap pengujian yang tertera pada prosedur,

kecuali penyuntikan. Kelinci tidak boleh digunakan untukuji pirogen lebih

dari sekali dalam waktu 48 jam atau sebelum 2 minggu setelah digunakan

untuk uji pirogen bila menunjukkan kenaikan suhu maksimum 0, 60 atau

lebih, atau bila setelah digunakan untuk melakukan uji sediaan uji yang

mengandung pirogen (Donacki, 2004).

IV. Daftar Pustaka

Aulton, Michael. 2010. Pharmaceutical Practice. Oritic Livingston:

London, New York

Donacki, Nanci. 2004. Aseptic techniques used by Cell Culture specialists

in handling products from and/or mammalian cells. http://protocol-

online.org (Diakses pada 5 December 2015)

James, Daniel E. 2008. Nine Safe Practices for the Microbiology

Laboratory Carolina Biological Supply, Burlington, NC.John C. Schof

ield, B.V.Sc., M.R.C.V.S. Essentials for Animal Research: A Primer for

Research Personnel: Principles of Aseptic Technique.

http://www.unmc.edu/Education (Diakses pada 5 December 2015)

Lucas, S. 2006. Formulasi Steril. Yogyakarta : Penerbit Andi

Sudjadi, Harman. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit

Kanisius

Usman, Suwandi. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus

Amebocyt Lysate, Cermin Dunia Kedokteran No. 52