LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI2105)

PCR

Tanggal Praktikum : 18 November 2013

Tanggal Pengumpulan : 2 Desember 2013

Disusun oleh :

Anisah Firda Rachmani

10612016

Kelompok 12

Asisten :

Luthfi Mu’awan

106110

PROGRAM STUDI BIOLOGI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

1.2 Tujuan

1. Menentukan cara penggunaan mikropipet untuk pengambilan larutan encer

dan pekat.

2. Menentukan nilai akurasi dan presisi mikropipet.

3. Menentukan kelayakan mikropipet berdasarkan analisis nilai akurasi dan

presisi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Prinsip Kerja Mikropipet

Mikropipet merupakan alat yang memungkinkan pengukuran volume

secara akurat dalam satuan µl. Mikropipet sangat peka, mahal, dan penting

terutama dalam pengerjaan DNA. Alat ini menggunakan pengisapan yang bisa

mengatur berapa volume yang ingin diambil. Prinsip awal pembuatan mikropipet

ditemukan oleh Warren Gilson dan Henry Lardy, Professor bidang biochemistry

di University of Wisconsin-Madison. Pada awalnya, mereka membuat sebuah

mesin untuk mengukur berapa volume oksigen yang dibutuhkan saat pertumbuhan

suatu sel. Alat ini bekerja dengan menggerakkan piston untuk menjaga tekanan

udara konstan saat oksigen digunakan. Tiga hal terpenting yang diperhatikan saat

itu adalah, ukuran kecil piston, akurasi pengukuran dan pengaturan (University of

Wisconsin, 2013).

Ide awal pengukuran mikropipet adalah saat piston digerakkan, maka dia

akan mengeluarkan udara dan selanjutnya menarik cairan masuk saat piston

digerakkan kearah berlawanan. Maka, mikropipet berawal dari sebuah alat yang

dibuat untuk mengukur perubahan kecil jumlah udara menjadi alat yang

digunakan untuk memindahkan cairan dalam skala yang sangat kecil. Sekarang

mikropipet sangat melekat dengan bidang ilmu bioteknologi dan menjadi ikon

dari biologi molekular (University of Wisconsin. 2013).

2.2 Jenis-jenis Mikropipet

Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup

kecil, biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet,

misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable

volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur

volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya

mikropipet 5 µl. dalam penggunaannya, mikropipet memerlukan tip.

Mikropipet berdasarkan volumenya terdiri atas tiga jenis yang umum

digunakan yaitu P20, P200, dan P1000. Setiap ukuran yang berbeda dirancang

untuk mengukur cairan dalam rentang volume yang berbeda. Mikropipet P20

dapat mengukur volume dalam kisaran 0,02 dan 0,7 ons (0,5 dan 20 mililiter)

sedangkan P200 dapat mengukur volume antara 0,7 dan 6,8 ons (20 dan 200

mililiter). P1000 Mikropipet adalah Mikropipet yang tersedia lebih besar dan

biasanya digunakan untuk mengukur cairan dengan volume di kisaran antara 3,4

dan 33,8 ons (100 mililiter dan 1.000) (Clare, 2012).

Tabel 2.1 Renang volume beserta tip yang digunakan

Size

Micropipette

Rentang Volume Warna Tip Kenaikan terkecil

P20 1-20μl Kuning 0.02

P200 20-200μl Kuning 0.2

P1000 100-1000μl Biru 2

Menurut Cabrillo (2012) Bagian yang paling sulit dari menggunakan

micropipette adalah pengaturan volume dengan benar. Pada setiap micropipette

terdapat 3 tempat penyetelan nomor. Namun, angka tersebut mewakili volume

yang berbeda untuk P1000, P200, dan P20:

Tabel 2.2 Volume pada tiap jenis mikropipet

Nomor P20 P200 P1000

1st X,000μl X00μl X0μl

2nd X00μl X0μl Xμl

3rd X0μl Xμl 0.Xμl

Cara pembacaan volume untuk jenis-jenis mikropipet yang berbeda dapat

dilihat pada gambar dan penjelasan berikut:

Gambar 2.1 Penunjuk volume mikropipet (Wadsworth, 2011)

Pada mikropipet jenis P1000, digit paling atas menunjukkan angka ribuan,

bagian tengah menunjukkan angka ratusan, dan bagian bawah menunjukkan

angka puluhan. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut

menunjukkan nilai 220 µl. Pada mikropipet jenis P200, digit paling atas

menunjukkan angka ratusan, bagian tengah menunjukkan angka puluhan, dan

bagian bawah menunjukkan angka satuan. Oleh karena itu, pengaturan volume

pada gambar tersebut menunjukkan nilai 22 µl. Pada mikropipet jenis P20, digit

paling atas menunjukkan angka puluhan, bagian tengah menunjukkan angka

satuan, dan bagian bawah menunjukkan angka desimal. Oleh karena itu,

pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 2,2 µl (Wadsworth,

2011).

2.3 Bagian-bagian pada Mikropipet dan Macam Tips

Mikropipet digunakan dalam diagnostik molekuler untuk memindahkan

cairan yang bervolume kecil secara akurat dan presisi. Penggunaan mikropipet

dengan benar sangat penting dalam memastikan volume cairan yang akan

dipindahkan tersebut akurat dan mencegah terjadinya kerusakan pada bagian-

bagian tertentu dari mikropipet. Oleh karena itu, mengetahui bagian-bagian dari

mikropipet dan memahami fungsinya merupakan suatu hal yang sangat penting

(Rhodes, 2012).

Adapun bagian-bagian dari mikropipet dapat dilihat pada gambar berikut:

Gambar 2.1 Bagian-bagian mikropipet Eppendorf (Netheler dan Hinz, 2011)

Tombol pengatur pada bagian atas mikropipet merupakan tombol yang

berfungsi untuk memasukkan atau mengeluarkan cairan yang akan dipindahkan.

Terdapat dua macam stop pada tombol pengatur volume ini. Stop pertama

digunakan untuk memasukkan volume dari cairan yang diharapkan, sedangkan

stop kedua digunakan saat mengeluarkan seluruh cairan yang sudah berada di

dalam tips (Dean et. al., 2003). Warna dari tombol tersebut menunjukkan jenis

mikropipet yang digunakan. Terdapat tiga jenis mikropipet yang biasa digunakan,

yaitu P20, P200, dan P1000. Warna putih menunjukkan jenis P20 yang memiliki

jangkauan volume ukur 0,5-20 µl, warna kuning menunjukkan jenis P200 dengan

jangkauan volume 20-200 µl, dan warna biru menunjukkan jenis P1000 yang

memiliki jangkauan volume ukur 100-1000 µl (Wadsworth, 2011).

Cincin pengatur volume merupakan bagian yang dapat diputar untuk

mengatur volume yang diinginkan dalam pengambilan cairan yang akan

dipindahkan. Tombol untuk melepaskan tips digunakan dengan cara menekan

bagian tombol ini ketika sudah selesai menggunakan mikropipet dan akan

melepaskan tips yang sudah selesai digunakan. Bagian penunjuk angka volume

merupakan nilai volume yang diinginkan saat akan memindahkan cairan (Dean et.

al., 2003).

Cara pembacaan volume untuk jenis-jenis mikropipet yang berbeda dapat dilihat

pada gambar dan penjelasan berikut:

Gambar 2.2 Penunjuk volume mikropipet (Wadsworth, 2011)

Pada mikropipet jenis P1000, digit paling atas menunjukkan angka ribuan,

bagian tengah menunjukkan angka ratusan, dan bagian bawah menunjukkan

angka puluhan. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut

menunjukkan nilai 220 µl. Pada mikropipet jenis P200, digit paling atas

menunjukkan angka ratusan, bagian tengah menunjukkan angka puluhan, dan

bagian bawah menunjukkan angka satuan. Oleh karena itu, pengaturan volume

pada gambar tersebut menunjukkan nilai 22 µl. Pada mikropipet jenis P20, digit

paling atas menunjukkan angka puluhan, bagian tengah menunjukkan angka

satuan, dan bagian bawah menunjukkan angka desimal. Oleh karena itu,

pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 2,2 µl (Wadsworth,

2011).

2.4 Hal yang Diperhatikan pada Mikropipet

Agar penggunaan mikropipet optimal, ada beberapa hal yang harus

diperhatikan seperti :

1. Konsisten Speed dan kelancaran saat tekan dan lepaskan tombolnya

2. Konsisten tekanan pada plunger pada pertama

3. Konsisten dan cukup saat memasukkan tip ke dalam cairan

4. Posisi tip pada cairan “Posisinya Hampir Vertikal” dari pipet

5. Menghindari semua gelembung udara

Beberapa hal yang perlu dihindari agar mikropipet tidak rusak dan

mengakibatkan tidak akuratnya pengukuran sebagai berikut (Cosee West, 2007) :

1. Jangan mengatur volume yang akan diambil pada mikropipet

melebihi ukuran maksimalnya. Hal ini akan menyebabkan rusaknya

roda gigi pada mikropipet.

2. Jangan menggunakan pipet tanpa tips di ujungnya. Lupa

menggunakan tips akan merusak piston presisi yang mengukur

volume larutan.

3. Selama ada larutan dalam tips, mikropipet harus selalu berada pada

posisi tegak. Karena larutan bisa masuk ke dalam pipet dan merusak

perhitungan.

4. Ketika mengambil larutan, jangan melepas tombol penekan secara

tiba-tiba. Gunakan ibu jari untuk mengontrol kecepatan lepasnya

tombol penekan. Hal ini akan menyebabkan larutan masuk ke dalam

pipet dan merusak piston.

5. Sebelum memasukkan tips ke dalam larutan, tombol pipet harus

ditekan dan jangan menekan melebihi stop pertama karena akan

menyebabkan larutan yang diambil tidak akurat.

6. Ketika memasukkan larutan, jangan melepas tombol penekan secara

tiba-tiba tapi secara perlahan. Hal ini akan menyebabkan larutan

masuk ke dalam pipet atau volume yang masuk tidak akurat.

2.5 Akurasi dan Presisi

Pengukuran tingkat presisi dan akurasi dari data yang dihasilkan akan

memberikan informasi mengenai baik tidaknya hasil pengukuran dari suatu

parameter kuantitas. Nilai akurasi menunjukkan kedekatan dari nilai hasil

pengukuran dengan nilai sebenarnya. Syarat menentukan tingkat akurasi adalah

diketahuinya nilai sebenarnya dari parameter yang diukur dan kemudian dapat

diketahui seberapa besar tingkat akurasinya. Nilai presisi menunjukkan tingkat

reliabilitas dari data yang diperoleh. Hal ini dapat dilihat dari standar deviasi (SD)

yang diperoleh dari pengukuran. Semakin kecil standar deviasi dan tingkat bias

(penyebaran) rendah, akan semakin baik pula nilai presisinya. Jika diinginkan

hasil pengukuran yang valid, maka perlu dilakukan pengulangan sebanyak n- kali.

Dari data tersebut dapat diperoleh ukuran harga nilai terukur yang merupakan

rata-rata dari hasil yang diperoleh dan standar deviasi (Tahir, 2008). 　 　 　 　

Perhitungan nilai akurasi (systematic error = E) dan nilai presisi (random

error = RSD atau CV(%)) dari parameter yang diukur adalah sebagai berikut

(Gilson, 2007) :

Gambar 2.2 Perhitungan akurasi Gambar 2.3 Perhitungan presis

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah,

Tabel 3.1 Alat dan bahan

Alat Bahan

Timbangan analitik

Akuades (berat jenis 1)

Tabung Eppendorf

Gliserol (Berat jenis 1,261)

TipsMicrotube

3.2 Cara Kerja

Sebelum melakukan pengerjaan, dilakukan uji kebocoran miikropipet.

Pertama, volume mikropipet diatur hingga mencapai volume maksimal. Lalu,

tips diisi dengan akuades. Mikropipet didiamkan pada posisi tegak selama 20

detik. Apabila terdapat air menetes, maka terdapat kebocoran. Pada

mikropipet yang memiliki volume maksimal ≤ 200 µl, ujung tips dicelupkan

kedalam air, dan apabila terdapat penurunan permukaan air maka terdapat

kebocoran.

Selanjutnya dilakukan uji akurasi dan presisi. Volume yang akan diambil

disesuaikan dengan mikropipet yang akan digunakan (p20, p200, atau p1000).

Selanjutnya tabung eppendorf ditimbang saat kosong dan sesudah diisi cairan

untuk mendapatkan berat cairan. Dalam konversi berat ke volume, nilai faktor

Z digunakan yang tertera pada tabel. Perbandingan rata-rata berat cairan hasil

perhitungan dengan yang diharapkan dibandingkan.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil dan Pengolahan Data Pengamatan

Berikut adalah data yang diperoleh berdasarkan percobaan penggunaan

mikropipet,

Tabel 4.1 Hasil percobaan

m Sebelum

m Sesudah

Volume Cairan

12.1.a 1.0135 mg1.066,7

mg 53,4 µl12.2.a 1.012 mg 1.060 mg 48,2 µl

12.3.a1.012,4

mg1.061,7

mg 49,5 µlVolume rata-rata

12.1.g1.010,8

mg1.099,4

mg 66,3 µl

12.2.g 1.011 mg1.092,8

mg 64,8 µl

12.3.g1.011,4

mg1.093,3

mg 64,9 µlVolume rata-rata 65,3 µl

Keterangan : a = Aquades

g = Gliserol

Akuades

∆m Aquades = msesudah – msebelum

∆m 12.1.a = 1.066,7 mg – 1.013,5 mg = 53,2 mg

∆m 12.2.a = 1.066 mg – 1.012 mg = 48 mg

∆m 12.3.a = 1.061,7 mg – 1.012,4 mg = 49.3 mg

V cairan = ∆m x Z Massa jenis

Keterangan :

Massa jenis air : 1 mg/ µl

Z = faktor koreksi = 1,0045

V 12.1.a = 53,2 x 1,0045 = 53,4 µl 1

V 12.2.a = 48 x 1,0045 = 48,2 µl 1

V 12.3.a = 49,3 x 1,0045 = 49,5 µl 1

E % = Vrata-rata – Vo x 100%Vo

E% = 50,3924167-50 x 100% = 0,78484 % 50

RSD = SD x 100% Vrata2

RSD = 2,718343545 x 100% = 5,39435 % 50,3924167

Gliserol

∆m Gliserol = msesudah – msebelum

∆m 12.1.g = 1.010,8 mg – 1.094,4 mg = 83,6 mg

∆m 12.2.g = 1.011 mg – 1.092,8 mg = 81,8 mg

∆m 12.3.g = 1.011,4 mg – 1.093,3 mg = 81,9mg

V cairan = ∆m Massa jenis

Keterangan :

Massa jenis gliserol : 1,261 mg/ µl

V 12.1.a = 53,2 = 66,3 µl 1,261

V 12.2.a = 48 = 64,8 µl 1,261

V 12.3.a = 49,3 = 64,9 µl 1,261

E % = Vrata-rata – Vo x 100%

Vo

E% = 65,371398 – 3 x 100% = 117,9 % 30

RSD = SD x 100% Vrata2

RSD = 0,802220318x 100% = 1,227 % 65,371398

4.2 Pembahasan

Dari hasil pengamatan, perhitungan error percentase pada akurasi

mikropipet didapatkan hasil pada akurasi akuades sebesar 0,78% atau 0,0078 µl

dan 117,9% atau 1,179 µl pada gliserol. Jika dilihat dari presentase, nilai eror dari

perhitungan gliserol sangat besar. Namun hasil yang didapat jika dibandingkan

dengan literatur masih dalam jangkauan yang dapat ditoleransi. Literatur yang

menyatakan systematic error maksimum yang masih dapat ditoleransi untuk P200

adalah ±1,6 µl. Pada perhitungan RSD, hasil yang didapat untuk akuades adalah

sebesar 5,39435 % dan untuk gliserol adalah sebesar 1,227%. Dari hasil terlihat

bahwa gliserol lebih presisi dibandingkan dengan akudes walaupun memiliki

akurasi yang lebih rendah dari akuades. Kedua nilai error presisi sama seperti

nilai error akurasi yaitu masih dalam jangkauan yang dapat ditoleransi (Gilson,

2007). Pada literatur, nilai maksimum error yang dapat ditoleransi pada “random

error” dengan mikropipet yang sama adalah ≤ 0,6 µl. Masih ditoleransinya error

pada presisi dan akurasi mengartikan bahwa mikropipet yang digunakan dalam

percobaan masih akurat dan presisi (Gilson ,2007).

Saat proses pengambilan zat, mikropipet harus selalu dalam keadaan

tegak karena larutan yang telah diambil dapat masuk ke dalam pipet dan merusak

piston yang terdapat dalam mikropipet. Dan jika piston atau alat lain didalam

mikropipet itu rusak, pengukuran volume akan menjadi tidak akurat (COSEE

West, 2007).

BAB V

KESIMPULAN

Kesimpulan dari percobaan ini adalah,

1. Perbedaan pengambilan cairan kental dengan encer adalah pada cairan encer

tombol ditekan hanya sampai stop satu, sedangkan pada cairan kental tombol

ditekan sampai stop dua.

2. Nilai akurasi dan presisi maksimal dari mikropipet P200 berdasarkan percobaan

untuk akuades adalah 0,78484 % dan 5,39435 %, dan untuk gliserol adalah

117,9 % dan 1,227 %.

3. Mikropipet yang digunakan masih tergolong akurat dan presisi karena hasil

masih berada pada jangkauan nilai maksimum akurasi dan presisi, yaitu ±1,6 µl

dan ≤ 0,6 µl.

DAFTAR PUSTAKA

Cabrillo. 2012.”WORKING WITH MICROPIPETS.http://www.cabrillo.edu/~

ytan/Bio1AF04/Lab7%20Micropipetting.pdf.Diakses pada tanggal 1

November 2013.

Clare. 2012. “Mastering the micropipette”. https://www2.bc.edu/clare-oconnor/

bcbc/courses/bi204_2014F/3-micropipettes_2013.pdf. diakses pada tanggal 1

November 2013.

COSEE West.2007.”Skill Building Activity 1: Manipulating Small Volumes-

Student Guide”.San Fransisco.

Dean, M., Fraga, D., Morgan, W., Tauer, T., dan L. Stroschine. 2003. “Instruction

in Basic Equipment Needed for Chemistry and Biology: Micropipette”.

http://www.public.coe.edu/ibench/pipet/parts.htm Diakses tanggal 3

November 2013.

Gilson SAS.2007.”Verification Procedure for Accuracy and Precision”.Standard

Operating Procedure for Pipettes.Perancis.

Netheler, H., dan Hans Hinz. 2011. “Eppendorf Research Plus: Micropipette”

http://www.eppendorf.com/int/index.php?

l=211&action=products&contentid=1&catalognode=67026&productpage=1

Diakses tanggal 2 November 2013.

Rhodes, Richard. 2012. “Laboratory 3: Micropipettes”.

http://www.austincc.edu/mlt/mdtech/MLAB2479Lab3UseOfMicropipettesSu

mmer2012.doc Diakses tanggal 30 Oktober 2013.

Tahir, Iqmal.2008. Paper Seri Manajemen Laboratorium. Penerbit UGM :

Yogyakarta.

University of Wisconsin. 2013. http;//www.biotech.wisc.edu/outreach/

pipettestory.html . Diakses tanggal 30 Oktober 2013 pukul 19.12 WIB.

Wadsworth, Gregory. 2011. “Use of Micropipette”.

http://faculty.buffalostate.edu/wadswogj/courses/BIO211%20Page/Resources/

micropipetting%20lab.pdf Diakses tanggal 30 Oktober 2013.