PRAKTIKUM IIIPENYIAPAN MEDIA DAN METODE STERILISASI

A. TUJUAN1. Melakukan pembuatan media dan mempersiapkan peralatan untuk kerja mikrobiologi2. Melakukan sterilisasi dengan autoklaf

B. DASAR TEORINutrisi merupakan substansi-substansi yang diperlukan untuk biosintesis dan pembentukan energi. Berdasarkan kebutuhannya, nutrisi dibedakan menjadi dua, yaitu makro elemen yang merupakan elemen yang diperlukan dalam jumlah sedikit. Makro elemen meliputi C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca, Fe. Mikro elemen meliputi Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu. Selain itu, dikenal pula accesory nutrients, contohnya vitamin, asam amino, purin dan pirimidin. Medium untuk pertumbuhan mikroba harus mengandung nutrisi dasar yaitu C, N, mineral (P, Mg, Ca, Na) dan vitamin. C dan N untuk pembentukan karbohidrat, lemak dan protein. Mineral diperlukan dalam jumlah kecil sebagai kation. Vitamin merupakan molekul organik kecil yang membuat seluruh atau sebagian kofaktor enzim dan hanya sejumlah kecil yang digunakan untuk pertumbuhan (Pratiwi, 2008).Berdasarkan komposisinya, medium dapat digolongkan menjadi medium sintetik dan medium kompleks. Untuk kegiatan rutin laboratorium, biasanya dapat digunakan medium kompleks yang mampu menyediakan nutrisi kompleks yang diperlukan mikrobia. Salah satu contoh medium kompleks adalah nutrien agar yang mengandung pepton dan beef extract. Pepton mengandung sedikit karbohidrat, vitamin, macam-macam asam amino dengan persentasi tergantung pada asal peptonnya. Beef extract merupakan ekstrak daging yang kaya nutrisi. Selain berfungsi untuk kultivasi mikrobia, media juga berfungsi untuk menyeleksi mikrobia tertentu dan melakukan pengukuran kuantitatif suatu antibiotik atau vitamin (Astuti, 2011).Berdasarkan struktur fisiknya, media dapat dikelompokkan menjadi medium cair, padat dan setengah padat. Medium cair di antaranya adalah kaldu nutrisi, kaldu sitrat, kaldu glukosa, susu lakmus. Media tersebut digunakan untuk penyebaran sejumlah besar mikroorganisme, studi fermentasi dan berbagai tes. Medium padat dibuat dengan menambahkan agen pemerkuat seperti agar-agar, gelatin atau gel silika pada medium cairan. Agar darah, agar nutrisi dan agar saboutaud adalah contoh. Contoh media padat yang digunakan untuk pengembangbiakan koloni bakteri dan jamur. Media semi padat berada di antara media cair dan media padat. Media semi solid juga memiliki agen pemerkuat, namun tidak sebanyak media padat sehingga teksturnya lebih seperti selai. Media ini digunkan dalam menentukan apakah bakteri tertentu motil atau tidak (Benson, 2011).Media yang paling populer dan banak digunakan di laboratorium mikrobiologi adalah agen pemerkuat agar. Agar adalah polisakarida kompleks yang berasal dari ganggang merah. Sangat sedikit mikroorganisme yang dapat mengurai agar sehingga agar tetap dalam bentuk padat. Media agar-agar biasanya ditempatkan dalam tabung reaksi atau cawan petri. Tabung reaksi dibiarkan miring untuk memperkuat sudut-sudut media padat sudut kemiringan tertentu. Hal tersebut dapat meningkatkan luas permukaan pertumbuhan mikroorganisme (Betsy, 2005).Proses sterilisasi diperlukan untuk menghilangkan mikrobia pada bahan dan alat yan akan digunakan dalam kerja mikrobiologi, juga dalam pembuatan media. Sterilisasi merupakan suatu proses penghilangan semua mikroorganisme hidup. Desinfeksi merupakan suatu proses di mana hanya mikroorganisme tidak berspora dihilangkan. Agen yang menyebabkan desinfeksi disebut disinfektan. Aseptis merupakan prosedur pencegahan masuknya agen penginfeksi ke jaringan steril untuk mencegah terjadinya infeksi. Antiseptik adalah agen kimia yang data secara aman diaplikasikan pada bagian eksternal tubuh manusia untuk mencegah atau menghancurkan bakteri vegetatif (Benson, 2001).Ada beberapa metode sterilisasi. Pemilihan metode tergantung pada apa yang akan disterilisasi dan sifat bahan yang akan disterilisasi.1. Metode Sterilisasi FisikMerupakan metode yang dilakukan dengan cara panas, baik panas kering maupun panas basah, radiasi dan filtrasi. Metode panas kering dan panas basah digunakan untuk bahan-bahan yang tahan panas. Metode panas kering (160C-180C) untuk bahan-bahan yang tidak tahan kelembapan. Metode panas basah (115C-134C) untuk bahan yang tahan kelembapan. Metode filtrasi digunakan untuk bahan-bahan yang tidak tahan panas.

2. Metode Sterilisasi KhemisMetode sterilisasi kimia dilakukan dengan menggunakan bahan-bahan kimia yaitu dengan cara fumigasi (pengasapan) dengan ethylene oxide dan gas formaldehid atau dengan penggunaan liquid desinfektan dengan aldehid, hipoklorit, fenolik, alkohol (Pratiwi, 2008).

C. ALAT DAN BAHAN1. Alat Tabung reaksi Labu Erlenmeyer Beker glass Pipet tetes Gelas ukur pH meter autoklaf2. Bahan Agar Berbagai macam media

D. CARA KERJA1. Penyiapan Alat-alatAlat-alat yang akan digunakan untuk kerja disiapkanTabung reaksi, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas kassa dan aluminium foil. Piring petri, pinset, blue tip, yellow tip dibungkus dengan kertas koran.Alat-alat tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121C selama 30 menitDikeringkan dalam oven

2. Pembuatan MediaDitimbang masing-masing medium sesuai kebutuhan dan ketentuan yang tertera pada tabel mediumDilarutkan medium tersebut dalam sebagian akuadespH medium diatur sesuai dengan yang dikehendaki dengan menambah HCl atau NaOHsetelah pH sesuai, sisa aquadest ditambahkan dan dicampur homogen, kemudian dibagi-bagi dalam wadah yang sesuaiwadah medium ditutup dengan kapas berbalut kassa kemudian aluminium foilsterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121C selama 15 menituntuk membuat medium padat ditambahkan agar sebanyak 1.5%-2% (b/v) sebelum sterilisasi dilakukanmedium yang tidak langsung digunakan, simpan dalam refrigeratoruntuk membuat medium yang miring, segera setelah sterilisasi selesai, medium dimiringkan dengan kemiringan yang sesuai dan dibiarkan memadatE. HASIL PENGAMATAN Untuk media nutrient agar, NA dimasukka dalam Erlenmeyer, dipanaskan sambil dihomogenkan dengan magnetic stirrer selama 15 menit, dibagi ke dalam Erlenmeyer di add 100mL, ditutup dengan kaoas berbalut kassa kemudian aluminium foil. NA nantinya akan berwarna orange dan memadat. Untuk media PDA, PDA dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, dipanaskan sambil dihomogenkan dengan magnetic stirrer sekana 20 menit, dibagi ke dalam 3 erlenmeyer, ditutup dengan kapas berbalut kassa kemudian aliminium foil. PDA nantinya berwarna kuning muda dan memadat.Cara menggunakan autoklaf:1. Sebelum melakukan sterilisasi, cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.2. Peralatan dan bahan yang akan disterilisasi dimasukkan.3. Autoklaf ditutup rapat lalu dikencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman tidak dikencangkan terlebih dahulu.4. Dinyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu maksimal 15 menit pada suhu 121C.5. Ditunggu sampai air mendidih hingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup dan ditunggu sampai selesai. Perhitungan waktu 15 menit dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka ditunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkunan (jarum pada pressure gauge menunjuk angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan isi autoklaf dikeluarkan.

F. PEMBAHASANPercobaan ini bertujuan untuk melakukan pembuatan media dan mempersiapkan peralatan untuk kerja mikrobiologi, serta melakukan sterilisasi dengan autoklaf.Pertama-tama, praktikan mengamati cara pembuatan media. Media yang dibuat ada dua macam. Yang pertama adalah nutrient agar dan yang kedua adakah potato dextrose agar. Potato dextrose agar memiliki formula: potato extract 4.0, dextrose 20.0, dan agar 15.0.Cara membuatnya adalah: serbuk media dimasukkan ke dalam Erlenmeyer lalu ditambahkan akuadest, lalu dihomogenkan sambil dipanaskan agar serbuk media cepat melarut dan tersuspensi sempurna dengan magnetic stirrer. Suspensi lalu dibagi-bagi ke dalam Erlenmeyer lain, masing-masing 100 mL. Erlenmeyer lalu ditutup dengan