1

I. TUJUAN

Tujuan dari praktikum adalah :

1. mempelajari teknik pewarnaan Gram pada bakterinis bakteri

2. Mengamati berbagai morfologi sel bakteri berdasarkan pengecatan Gram

3. Mengelompokkan jenis bakteri berdasarkan pengecatan Gram

II. DASAR TEORI

Mikroorganisme dipelajari di laboratorium untuk banyak tujuan. Salah satu

mikroorganisme yang dipelajari adalah bakteri. Dalam mengamati bakteri tidaklah mudah

karena bakteri berukuran sangat kecil dan transparan jika disuspensiskan dalam medium cair.

Bahkan walaupun dengan bantuan mikroskop pun, bakteri hidup tetap susah untuk dilihat

dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati

secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Untuk itulah,

dibutuhkan suatu metode khusus dalam mengamati dan mengidentifikasi suatu bakteri.

Metode tersebut adalah perwarnaan biologis dan prosedur perwarnaan dengan bantuan

mikroskop.

Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup.

Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat

pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai

mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan

butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-

hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan

ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).

Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai

mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur

pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :

1. Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.

2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.

3. Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

1

Terdapat beberapa teknik pewarnaan untuk visualisasi, diferensiasi, dan pemisahan

bakteri dalam hal karakteristik morfologis dan struktur seluler. Beberapa teknik pewarnaan

tersebut ialah:

1. Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan sederhana dilakukan untuk mengetahui ukuran, bentuk, dan tata letak sel.

Pewarnaan sederhana merupakan pemberian pewarnaan pada bakteri atau jasad renik dengan

menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan yang sudah

difiksasi. Lapisan tadi digenangi dengan larutan pewarna selama jangka waktu tertentu,

kemudian larutan itu dicuci dengan air dan kaca objeknya dikeringkan dengan kertas

pengisap. Biasanya sel-sel itu terwarnai secara merata. Akan tetapi, pada beberapa

organisme, terutama bilamana zat pewarna itu biru metilen, beberapa granula didalam sel

tampak terwarnai tampak lebih gelap dibanding bagian-bagian sel lainnya.

2. Pewarnaan Diferensial

Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau

bagian-bagian sel mikroba disebut pewarnaan diferensial. Dengan teknik ini biasanya

digunakan lebih dari satu larutan zat pewarna atau reagen pewarnaan. Contoh pewarnaan

diferensial antara lain: pewarnaan gram, pewarnaan giemsa, pewarnaan tahan asam,

pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagella.

3. Pewarnaan Negatif

Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan untuk menelaah morfologi dengan prosedur

dan reagen yang memiliki pengaruh yang sangat lemah terhadap mikroorganisme. Metode ini

bukan untuk mewarnai bakteri tetapi untuk mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.

Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Pewarnaan ini

ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti Spirochaeta.

Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini

olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia,

maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat

diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina

(Hadiotomo, 1990).

4. Pewarnaan Gram

Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling sering

digunakan adalah pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram pertama kali diuraikan dalam

suatu publikasi pada tahun 1884 oleh ahli bakteriologi Denmark, Cristian Gram. Beliau

mengembangkan teknik pewarnaan ini selagi mencari suatu metode untuk membedakan

antara Pneumokokus sp. dan bakteri Klebsiella pneumonia.

Pada pewarnaan gram, bakteri yang terwarnai dibagi menjadi dua kelompok, yaitu

bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang

tidak mempertahankan zat warna utama (Kristal Violet). Bakteri gram-positif akan tetap

mempertahankan zat warna utama (Kristal Violet) walau telah dicuci dengan larutan

dekolorisasi. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasi kedua tipe bakteri berdasarkan

perbedaan struktur dinding sel mereka.

Proses pewarnaan gram memerlukan 4 jenis reagen atau zat warna. Zat warna pertama

disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Zat

warna yang digunakan sebagai pewarna utama atau dasar adalah zat warna Kristal Violet

(Gram A). Zat warna kedua adalah zat warna pemekat (mordant). Fungsi dari zat warna ini

adalah untuk memekatkan warna utama pada dinding bakteri. Zat warna atau reagen yang

umum digunakan adalah larutan Yodium (Gram B).

Zat warna ketiga disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci atau

tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat

mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci. Bakteri dengan dinding sel yang tebal akan

mengalami dehidrasi sehingga pori-pori menciut dan menyebabkan zat warna utama tidak

dapat keluar. Sedangkan bila komponen dinding sel bakteri tersebut tipis, maka bakteri

tersebut tidak akan mengalami dehidrasi sehingga pori-porinya membukan dan menyebabkan

zat warna utama akan keluar dan mudah. Larutan yang digunkan sebagai dekolorisasi adalah

larutan Alkohol (Gram C).

Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila bakteri tersebut dapat mempertahankan

warna utama maka warna pembanding tidak dapat masuk ke pori-pori dinding sel dan warna

dinding bakteri tersebut akan berwarna seperti zat warna utama dan bila bakteri tersebut tidak

dapat memperthankan warna utama maka warna tandingan dapat masuk ke pori-pori dinding

sel dan memberi warna pada dinding selnya. Salah satu contoh larutan yang umum digunkan

sebagai zat warna tandingan adalah Safranin (Gram D).

Berikut di bawah ini adalah tabel langkah-langkah dalam prosedur serta hasil

pewarnaan gram pada setiap tahap:

Tabel 2.1 Langkah-langkah Prosedur Beserta Hasil Pewarnaan Gram

Larutan dan Urutan Penggunaannya

Reaksi dan Tampang BakteriGram positif Gram negative

Ungu Kristal/Kristal Violet (UK)

Sel berwarna ungu Sel berwaran ungu

Larutan Iodium (I)Kompleks UK-I terbentuk

didalam sel; sel tetap berwarna ungu

Kompleks UK-I terbentuk didalam sel; sel tetap

berwarna ungu

Alkohol

Dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut; daya rembes dinding sel dan membran menurun, UK-I tak dapat keluar dari sel; sel tetap

ungu

Lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori

mengembang; kompleks UK-I keluar dari sel; sel menjadi tak berwarna

SafraninSel tak terpengaruhi; sel tetap

unguSel menyerap zat pewarna

ini; sel menjadi merah

Menurut Hadiotomo (1990), bakteri Gram-Positif dan bakteri Gram-Negatif memiliki

karakteristik dan sifat yang berbeda. Perbedaan antara bakteri Gram-Positif dan Gram-

Negatif tersebut terlihat pada Tabel 2:

Tabel 2.2. Ciri-Ciri Bakteri Gram-Positif dan Bakteri Gram-Negatif

CIRIPERBEDAAN RELATIF

GRAM POSITIF GRAM NEGATIF

Struktur Dinding Sel Tebal (15-80 mm)

Berlapis tunggal (mono)

Tipis (10-15 mm)

Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-

4%)

Peptidoglikan sebagai ada

lapisan tunggal, komponen

utama merupakan lebih dari

50% berat kering sel bakteri

Asam tekoat

Kandungan lipid tinggi (11-

22%)

Peptidoglikan ada didalam

lapisan kaku sebelah

dalam,jumlahnya sedikit,

merupakan 10% berat kering

Tidak ada asam tekoat

Kerentanan terhadap

penisilin

Lebih rentan Kurang rentan

Pertumbuhan dihambat oleh

zat warna dasar (UK)

Pertumbuhan dihambat dengan

nyata

Pertumbuhan tidak begitu

dihambat

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada banyak

spesies

Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

Dengan metode pewarnaan gram, selain dapat mengelompokkan jenis bakteri menjadi

Gram-Positif dan Gram-Negatif, juga dapat melihat berbagai morfologi dari suatu bakteri.

Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk seperti elips, bola, batang (silindris) atau spiral

(heliks). Masing-masing ciri ini penting dalam mencirikan morfologi suatu spesies (Pelczar

dan Chan, 2010).

Walau bentuk bakteri sangat bervariasi, namun secara umum hanya dibagi menjadi tiga

tipe bentuk, yaitu:

1. Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola dan mempunyai

beberapa variasi sebagai berikut:

Mikrococcus, jika kecil dan tunggal. Contoh : Neisseria gonorrhoeae.

Diplococcus, jka berganda dua-dua. Contoh: Diplococcus pneumonia.

Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujur sangkar.

Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus.

Staphylococcus, jika bergerombol.

Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai.

2. Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan

mempunyai variasi sebagai berikut:

Monobacillus, hanya berbentuk satu batang tunggal. Contoh: Salmonella typhi.

Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua.

Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai. Contoh: Bacillus anthracis.

3. Spiral (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi

sebagai berikut:

Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran (bentuk

koma). Contoh: Vibrio cholera.

Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran. Contoh: Spirillum.

Spirochete, jika lengkung membentuk struktur yang fleksibel.

Bentuk tubuh/morfologi bakteri dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium, dan

usia. Walaupun secara morfologi berbeda-beda, bakteri tetap merupakan sel tunggal yang

dapat hidup mandiri bahkan saat terpisah dari koloninya. Berbagai bentuk dari bakteri dapat

dilihat pada Gambar 2.3:

Gambar2.3 Berbagai Morfologi Sel Bakteri (Sumber:ttp://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri)

Langkah awal sebelum melakukan proses pewarnaan adalah mempersiapkan spesimen

mikroba yang akan diwarnai. Adapun langkah-langkah utama dalam mempersiapkan

spesimen mikroba yang diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik ialah:

1. Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek.

2. Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, sehingga menyebabkan

organisme melekat pada kaca objek.

Aplikasi warna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau

reagen (pewarnaan diferensial)

III. ALAT DAN BAHAN

Alat:

1. Gelas obyek

2. Gelas penutup

3. Mikroskop

4. Loop inokulasi

5. Nampan pewarnaan

6. Bunsen

7. Tisu

8. Botol semprot

Bahan:

Biakan bakteri:

1. Escherichia coli

2. Pseudomonas aeruginosa

3. Staphylococcus aureus

4. Bacillus megaterium

5. Bakteri X1

6. Bakteri X2

Bahan kimia:

1. Alkohol

2. Minyak emersi

3. Aquades

4. Kristal violet (Gram A)

5. Yodium (Gram B)

6. Alkohol 95% (Gram C)

7. Safranin (Gram D)

IV. CARA KERJA

1. Bersihkan gelas obyek dan gelas penutup menggunakan alkohol.

2. Buatlah smear suspensi bakteri pada gelas obyek, kemudian dikeringanginkan lalu

fiksasi panas dengan melewatkan pada nyala api bunsen.

3. Tetesi smear bakteri dengan zat warna kristal violet (Gram A) selama 1 menit.

4. Cuci dengan aiir yang mengalir (dari botol semprot) secara perlahan diatas smear

bakteri.

5. Tambahkan yodium (Gram B), biarkan lagi selama 1 menit, lalu cuci lagi dengan air.

6. Dekolorisasi dengan etil alkohol 95% (Gram C) selama 30 detik, lalu cuci lagi dengan

air.

7. Tahap terakhir, tambahkan safranin (Gram D) selama 30 detik, cuci lagi dengan air lalu

keringkan.

8. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 X dengan terlebih dahulu gelas

penutup ditetesi minyak emersi.

9. Tentukan bentuk dan kelompokkan apakah tergolong bakteri Gram positif atau Gram

negatif.

V. Hasil Pengamatan

5.1 Tabel Hasil Pengamatan Data Kelas

Kel

Bacillus

megaterium

Staphylococcus

aureus

Escherichia

coli

Pseudomonas

aeruginosaBakteri X1 Bakteri X2

Bentuk Gram Bentuk Gram Bentuk Gram Bentuk Gram Bentuk Gram Bentuk Gram

1 Basil +Coccus

bergerombol- Kokoid - Basil - Coccus - Basil -

2 Basil +Coccus

bergerombol- Kokoid - Basil - Basil - Basil -

3 Basil +Coccus

bergerombol+ Kokoid - Basil + Basil - Basil -

4 Basil +Coccus

bergerombol+ Kokoid - Basil - Coccus - Basil -

Tabel 5.2 .Hasil pengamatan kelompok 2

Gambar Spesies Bakteri Bentuk Sel Gram

Bacillus megaterium Basil (batang) Positif

Staphylococcus aureus Coccus (bulat)

bergerombol

Negatif

Esherichia coliKokoid (batang

pendek)Negatif

Pseudomonas

aeruginosaBasil (batang) Negatif

Bakteri X1 Basil (batang) Negatif

Bakteri X2 Basil (batang) Negatif

VI. PEMBAHASAN

Proses visualisasi bakteri yang masih hidup tidaklah mudah, karena bakteri mempunyai

ukuran yang kecil, transparan dan umumnya tidak berwarna apabila disuspensikan dalam

medium cair.

Keberhasilan dalam proses pewarnaan Gram, dipengaruhi oleh beberapa faktor

diantaranya: ketebalan smear, fiksasi (apabila terlalu lama dapat merusak dinding sel bakteri),

lama pewarnaan, masa kadaluarsa zat warna, umur biakan (tidak boleh terlalu tua, umur

biakan ideal adalah 24 jam), dan proses pengeringan cukup dikering-aginkan tanpa perlu

diusap dengan kertas tisu, hal ini mengakibatkan hasil pewarnaan gram akan bercampur

dengan kotoran yang terdapat pada kertas tisu.

Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding

selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma

organisme Gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme Gram

negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif

memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan

bakteri Gram negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Pada pengamatan ini, bakteri

yang digunakan ialah E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus

megaterium, serta dua bakteri yang tidak disebutkan nama spesiesnya. Hasil pengamatan

dijelaskan dalam sub bab berikut:

1. Escherchia coli

Klasifikasi :

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gammaproteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherchia

Spesies : Escherchia coli (Wikipedia)

Hasil pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 X, Escherchia coli

dengan pewarnaan Gram termasuk dalam bakteri gram negatif, ditandai dengan sel yang

berwarna merah dengan bentuk batang pendek (kokoid), koloninya berbentuk rantai panjang.

Escherchia coli memiliki dinding sel dengan kandungan lipid yang tebal sehingga

ketika ditambahkan kristal violet (Gram A) sebagai pewarna utama maka dinding sel bakteri

Gram negatif akan menyerap zat warna tersebut dan sel berwarna biru keunguan. Setelah satu

menit dan dicuci dengan air lalu diberi yodium (Gram B) untuk mengikat zat warna utama,

kompkels UK-Y terbentuk di dalam sel, sehingga sel tetap berwarna biru keunguan. Tahap

ketiga ditetesi alkohol 95%, lipid pada dinding sel terekstraksi, pori-pori mengembang,

kompleks UK-Y keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna (terdekolorisasi). Selanjutnya

diberi safranin (Gram D) sebagai pewarna tandingan, sel menyerap zat pewarna ini dan

menjadi merah (Pelczar dan Chan, 2008).

2. Bacillus megaterium

Klasfikasi:

Kingdom : Bacteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus megaterium (Wikipedia)

Pewarnaan Gram pada Bacillus megaterium diawali dengan membuat suspensi bakteri

pada gelas objek. Suspensi diratakan (smear) pada gelas objek dengan loop inokulasi agar

koloni bakteri dapat menyebar rata dan tidak bertumpuk. Setelah itu, difiksasi panas di atas

api bunsen kurang lebih sampai suspensi kering (tidak boleh lama-lama). Fiksasi panas

bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur

bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna

(Tortora, 2002).

Kemudian smear bakteri ditambahkan zat warna Kristal Violet (Gram A) selama 1

menit dan setelah itu, dicuci dengan air mengalir (aquades dari botol semprot) secara

perlahan. Lalu ditambahkan Gram B (Larutan Yodium) sebagai larutan mordant selama 1

menit, selanjutnya didekolorisasi dengan Alkohol (Gram C) selama 30 detik dan tahap

terakhir adalah dengan menambahkan Safranin (Gram D) sebagai larutan tandingan selama

30 detik. Setiap pemberian larutan, smear bakteri dicuci dengan aquades yang mengalir dan

dikeringanginkan.

Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar zat warna yang diberikan dapat

hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan ( tidak diusap dengan kertas tisu)

bertujuan agar warna melekat pada dinding bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai

lagi, warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru dan tidak bercampur

dengan kotoran yang terdapat pada kertas tisu. Kemudian hasil pewarnaan diamati di bawah

mikroskop dengan perbesaran 1000 X agar dapat diamati bentuk dan warna sel bakteri. Pada

pengamatan di mikroskop dengan perbesaran 1000 X, terlihat Bacillus megaterium berbentuk

batang (basil) dan merupakan bakteri gram positif karena menunjukkan warna biru-

keunguan. Bacillus megaterium masuk ke dalam bakteri gram positif penghasil spora dan

memiliki sifat obligate aerob, yang berarti membutuhkan oksigen untuk hidup. Ukuran selnya

kurang lebih sebesar 2 x 4-5 µ.

Bacillus megaterium merupakan salah satu golongan Eubacteria terbesar yang

ditemukan di tanah. Koloni bakteri ini umumnya dijumpai dalam keadaan saling melekat satu

sama lain seperti rantai dimana sel-sel tersebut dapat melekat karena adanya polisakarida

yang terdapat pada dinding sel. Bacillus megaterium dapat bertahan di kondisi lingkungan

yang ekstrem seperti gurun pasir karena kemampuannya dalam membentuk endospora yang

melindunginya dari keadaan yang ekstrem.

Bakteri ini merupakan penghasil utama untuk vitamin B12 dan amidase penicillin yang

digunakan untuk membuat penisilin. Selain itu, Bacillus megaterium juga dapat memproduksi

enzim yang berfungsi untuk memodifikasi kortikosteroid (sintetik steroid) dan stabilitas yang

baik serta juga menghasilkan beberapa asam amino dehidrogenase. Penisilin merupakan

antibiotik alami yang dapat berfungsi untuk menekan pertumbuhan bakteri patogen seperti

bakteri Vibrio sp. Menurut Tag, et all (1976) Bacillus megaterium menghasilkan bakteriosin

berupa megacin.

3. Staphylococcus aureus

Klasifikasi :

Kingdom : Bacteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Cocci

Ordo : Bacillales

Famili : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus (Rosenbach 1884)

Pada saat pengamatan sel bakteri tampak berwarna ungu karena di dalam dinding sel

bakteri Staphylococcus aureus memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami

dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar.

Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Bakteri Staphylococcus aureus terwarnai

merah, ini tidak sesuai dengan literatur yang ada, seharusnya Staphylococcus aureus setelah

diwarnai dengan safranin bakteri memiliki warna yang sama dengan warna utama, yaitu

warna ungu, karena Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif. Kemungkinan

besar hal ini disebabkan karena terlalu lama dalam pemberian safranin.

Selanjutnya diamati bentuknya dengan menggunakan mikroskop. Dari uraian di atas,

dapat dilihat bahwa Staphylococcus aureus memiliki karakteristik mikroskopik bila diamati

dibawah mikroskop cahaya yaitu berbentuk kokus, biasanya bergerombol seperti anggur

dalam bentuk tidak teratur, berpasangan, maupun tunggal, tidak membentuk spora dan tidak

berkapsul.

4. Pseudomonas aerogenosa

Klasifikasi:

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Proteobacteria

Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa (Bergey, 1994)

Bakteri Pseudomonas aeruginosa setelah melalui proses pewarnaan gram, terlihat sel

terwarnai oleh warna merah. Hal ini dikarenakan, Genus Pseudomonas terdiri dari sejumlah

bakteri gram negatif, sehingga ketika diberi pewarna tandingan safranin, maka sel akan

terwarnai okeh pewarna tersebut dikarenakan lapisan dinding yang tipis, bakteri ini juga

merupakan bakteri aerob, bergerak dengan flagel, kalase postif, oksidase positif, bersifat

patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang

untuk memulai suatu infeksi, dan menyebabkan infeksi pada manusia dengan ketahanan

tubuh yang menurun.

Bakteri ini berbentuk batang, berukuran 0,6 x 2 μm, bergerak aktif dengan flagel

monotrika (flagel tunggal pada kutub), tidak berspora, tidak mempunyai selubung, dan

bersifat gram negatif (Jawetz, et al, 1996). Selain itu bakteri Pseudomonas aeruginosa

merupakan bakteri hirokarbonoklastik yang mampu mendegradasi berbagai jenis

hidrokarbon. Keberhasilan penggunaan bakteri Pseudomonas aeruginosa dalam upaya

bioremediasi lingkungan akibat pencemaran hidrokarbon membutuhkan pemhaman tentang

mekanisme interaksi antara bakteri Pseudomonas aeruginosa dengan senyawa hidrokarbon.

5. Bakteri X1

Kultur bakteri ini diambil pada media padat (agar miring) dengan penampakan pada

media berwarna putih. Setelah dilakukan pewarnaan gram dengan zat warna kristal violet,

larutan lugol atau yodium, alkohol, dan safranin dan dilakukan pengamatan dibawah

mikroskop (perbesaran 1000x) didapatkan penampakan struktur morfologi bakteri X1

berbentuk basil (batang) dan berwarna merah. Warna merah menunjukkan bahwa bakteri X1

termasuk kelompok gram negatif. Berdasarkan data kelas, hasil pengamatan kelompok 1 dan

4 mendapati struktur morfologi bakteri X1 berbentuk coccus (bulat) sedangkan kelompok 2

dan 3 berbentuk basil (batang). Hasil pengamatan keempat kelompok tersebut mendapati

bakteri X1 berwarna merah, hal ini menunjukkan bahwa bakteri X1 termasuk kelompok

bakteri gram negatif.

Dinding sel bakteri gram negatif mengandung rantai peptidoglikan yang tipis sehingga

pada saat diberi zat warna kristal violet (warna ungu) sebagai zat warna utama, sel akan

berwarna ungu, ketika diberi larutan lugol atau yodium (warna kuning), warna ungu pada sel

akan tetap dipertahankan karena larutan lugol atau yodium merupakan pengikat zat warna

utama yaitu kristal violet, setelah dilakukan dekolorisasi (penghilangan zat warna) dengan

alkohol 95%, sel akan mengalami dehidrasi, lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori

dinding sel mengembang dan sel tidak mampu mempertahankan zat warna kristal violet

(warna ungu) sehingga zat warna kristal violet tersebut keluar menuju lingkungan

ekstraseluler dan sel menjadi tidak berwarna dan saat diberi zat warna tandingan yaitu

safranin (warna merah), kondisi sel yang tidak mengandung zat warna menjadikan zat warna

safranin terkonsentrasi menuju dalam sel, sel akan menyerap zat warna safranin tersebut dan

hal ini menjadikan sel berwarna merah.

Bakteri batang dan coccus gram negatif aerobik diantaranya termasuk famili

Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae, Halobacteriaceae,

Acetobacteriaceae, Legionellaceae dan Neisseriaceae. Sedangkan bakteri batang gram negatif

fakultatif anaerobik diantaranya famili Enterobacteriacea termasuk didalamnya sub famili

Escherichia (Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella); famili Klebsiellae

(Klebsiella, Enterobacter, Hofnia, Serrotia); famili Proteae (Proteus); famili Yersiniae

(Yersinia); Erwineae (Erwinia).

6. Bakteri X2

Selain bakteri X1 yang tanpa diketahui nama spesiesnya, pada praktikum ini juga

terdapat satu bakteri tanpa diketahui nama spesiesnya diberi label X2, kultur bakteri diambil

dari media cair setelah dilakukan pewarnaan Gram, hasil yang diperoleh dari pengamatan

ialah pada masing-masing kelompok 1-4, spesimen biakan bakteri tersebut tergolong dalam

bakteri gram negatif setelah dilakukan pewarnaan gram, karena menampakan koloni sel yang

berwarna merah, dengan koloni berbentuk basil. Dari pengamatan yang dilakukan,

kemungkinan bakteri yang dimaksud ialah kelompok bakteri gram negatif, berbentuk basil,

dimana bisa jadi bakteri tersebut tergolong dalam bakteri dengan memfermentasi laktosa,

atau tidak memfermentasi laktosa, seperti yang dijelaskan dalam gambar di bawah ini.

Gambar 5.2 Bagan pengelompokan bakteri gram-negatif( Sumber: http://id.wikipedia.org/wiki/Berkas:Gram_-_algorithm.png )

Untuk menentukan spesies bakteri yang dimaksud tersebut (X2), maka tidak cukup dengan melakukan pewarnaan gram saja, namun membutuhkan uji selanjutnya, misalnya dengan uji biokimia.VII. KESIMPULAN

Dari hasil pengamatn dapat disimpulkan bahwa:

1. Keberhasilan dalam proses pewarnaan Gram, dipengaruhi oleh beberapa faktor

diantaranya: ketebalan smear, fiksasi (apabila terlalu lama dapat merusak dinding sel

bakteri), lama pewarnaan, masa kadaluarsa zat warna, umur biakan (tidak boleh terlalu

tua, umur biakan ideal adalah 24 jam), dan proses pengeringan cukup dikering-aginkan

tanpa perlu diusap dengan kertas tisu, hal ini mengakibatkan hasil pewarnaan gram akan

bercampur dengan kotoran yang terdapat pada kertas tisu.

2. Bacillus subtilis berbentuk batang (basil) dan merupakan bakteri gram positif karena

menunjukkan warna biru-keunguan, penghasil spora dan memiliki sifat obligate aerob,

yang berarti membutuhkan oksigen untuk hidup.

3. Escherichia coli dengan pewarnaan Gram termasuk dalam bakteri gram negatif,

ditandai dengan sel yang berwarna merah dengan bentuk batang pendek (kokoid),

koloninya berbentuk rantai panjang.

4. Pseudomonas sp. bersifat gram negatif, berbentuk batang, berukuran 0,6 x 2 μm,

bergerak aktif dengan flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub), tidak berspora,

tidak mempunyai selubung, dan

5. Staphylococcus aureus merupakan gram positif berbentuk kokus, biasanya bergerombol

seperti anggur dalam bentuk tidak teratur, berpasangan, maupun tunggal, tidak

membentuk spora dan tidak berkapsul.

6. Bakteri X1 berbentuk batang dan coccus gram negatif aerobik diantaranya termasuk

famili Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae,

Halobacteriaceae, Acetobacteriaceae, Legionellaceae dan Neisseriaceae. Sedangkan

bakteri batang gram negatif fakultatif anaerobik diantaranya famili Enterobacteriacea

termasuk didalamnya sub famili Escherichia (Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter,

Salmonella, Shigella); famili Klebsiellae (Klebsiella, Enterobacter, Hofnia, Serrotia);

famili Proteae (Proteus); famili Yersiniae (Yersinia); Erwineae (Erwinia).

7. Bakteri X2 kelompok bakteri gram negatif, berbentuk basil, dimana bisa jadi bakteri

tersebut tergolong dalam bakteri dengan memfermentasi laktosa, atau tidak

memfermentasi laktosa.

LAMPIRAN

Gambar Keterangan

Larutan untuk pewarnaan gram

:

1. Kristal violet

2. Lugol atau Iodin atau

Yodium

3. Alkohol

4. Safranin

Proses sterilisasi jarum

inokulum dengan nyala api

bunsen.

Pengambilan kultur murni

bakteri (Bacillus megaterium;

Staphylococcus aureus;

Escherichia coli; Pseudomonas

aeruginosa.; bakteri X1 dan X2)

menggunakan jarum inokulum.

Pembuatan smear suspensi bakteri :

Untuk media padat terlebih

dahulu obyek glass ditetesi

aquades sekitar 1-2 tetes

kemudian jarum inokulum

dioleskan secara rata.

Sedangkan untuk media cair

tanpa ada penambahan aquades

-

Dikeringanginkan kemudian dilakukan

fiksasi panas dengan melewatkan pada

nyala api bunsen

Penetesan 1 tetes zat warna kristal violet

(Gram A) selama 1 menit. Zat warna

kristal violet berwarna ungu.

Pencucian dengan aquades mengalir (dari

botol semprot) secara perlahan diatas

smear bakteri.

Penetesan 1 tetes zat warna lugol atau

yodium (Gram B) selama 1 menit. Zat

warna lugol berwarna kuning.

Pencucian dengan aquades mengalir (dari

botol semprot) secara perlahan diatas

smear bakteri.

Dekolorisasi dengan 1 tetes etil alkohol

95% (Gram C) selama 30 detik.

Pencucian kembali dengan aquades

mengalir (dari botol semprot) secara

perlahan diatas smear bakteri.

Penambahan safranin (Gram D) selama

30 detik.

Pencucian kembali dengan aquades

mengalir (dari botol semprot) secara

perlahan diatas smear bakteri.

Hasil smear dan pewarnaan bakteri pada

obyek glass ditutup dengan cover glass

kemudian ditetesi minyak emersi dan

diamati pada mikroskop pada perbesaran

1000x.

Hasil pengamatan Bacillus megaterium

Hasil pengamatan Staphylococcus aureus

Hasil pengamatan Escherichia coli

Hasil pengamatan Pseudomonas

aeruginosa

Hasil pengamatan bakteri X1

Hasil pengamatan bakteri X2

DAFTAR PUSTAKA

Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: Gramedia Pustaka

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Hadiotomo, Ratna Sri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT Gramedia.

Hardiningsih, Riani, Rostiati Nonta Refina Napitupulu, dan Titin Yulinery. 2006. Isolasi dan

Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas Vol 7

No.1.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia

Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan

Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan

Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Pelczar, Michael J dan E.C.S.Chan. 2010. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI Press.

Suriawiria, U. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.

Tagg, J.R., Dajani A.S. dan Wannamaker L.W. 1976. Bacteriocins of Gram Positive Bacteria. Bacteriology Review 40: 722-756.

Tjitrosomo. 1982. Dunia Mikroba. Jakarta; Bharata Karya.

Tortora, G. J., B. R. Funke, and C. L. Case. 2002. Microbiology; An Introduction. New York: Addison Wesley Longman.

Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta:

Erlangga.

Anonim.2010.Pseudomonasaeruginosa.http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/106/jtptunimus

dl-nisaakmala-5280-2-bab2.pdf. Diakses pada tanggal 16 Maret 2013.