LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“PEMBUATAN MEDIA KULTUR”

DISUSUN OLEH :

NAMA : NANANG BUDI SANTOSO

NIM : 115040201111134

KELOMPOK : SENIN, JAM 13.00

ASISTEN : KHOIRUN ENISSA

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan

tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik

perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman

seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut

dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat

pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya

sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi

menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan

adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif

tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan

kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan

jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik

seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro,

sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur

tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa,

ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga

menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman.

Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentuk garam-

garam anorganik. Pada umumnya biasa diberikan dalam komposisi

tertentu seperti komposisi media MS, WPM, B5, White, dan lain-lain

tergantung dari jenis tanaman yang akan dikulturkan. Vitamin yang

banyak digunakan adalah vitamin B12 (thiamin), Nicotinic Acid,

vitamin B6 (pyridoxine), dan vitamin E atau C yang digunakan

sebagai antioksidan. Asam amino dipakai sebagai sumber N organik,

yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutanin, alanin, dan

threonin.

Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat penting dalam pembutan

media kultur jaringan. Zat pengatur tumbuh adalah suatu

persenyawaan organik yang dalam jumlah sedikit (1 mM) dapat

merangsang, menghambat atau mengubah pola pertumbuhan dan

perkembangan tanaman.Dalam kultur jaringan ZPT penting:

sitokinin (Kinetin, BA, Zeatin, 2iP, Thidiazuron), auksin (IAA,

NAA, IBA, 2.4-D, 2.4.5-T, Dicamba, Picloram). Kedua ZPT ini

mempunyai fungsi masing-masing yang berbeda, sitokinin

mempengaruhi pembelahan sel serta pembentukan organ seperti

pucuk dan pembentukan embrio somatik. Auksin dipakai untuk

menginduksi pembentukkan sel dan akar. Kombinasi antara auksin

dan sitokinin berfungsi untuk menginduksi pertumbuhan kalus.

Selain auksin dan sitokinin digunakan juga giberelin(menginduksi

pemanjangan tunas dan perkecambahan embrio, dan menghambat

pengakaran) dan retardan (untuk menghambat pertumbuhan tunas)

seperti pachlobutrazol.

Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media

sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawa

organik yang sering ditambahkan adalah air kelapa, ekstrak ragi,

ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber energi

ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber

karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanaman umumnya),

glukosa, fruktosa, dam maltosa. Penambahan arang aktif berfungsi

untuk mengarbsorbsi senyawa-senyawa fenolik dan untuk

merangsang pertumbuhan akar.

Selain ditambahkan oleh senyawa-senyawa tersebut, media

yang baik harus selalu berada dalam PH yang optimal yaitu 5,5-5,8.

selain itu, harus dibuat dalam tempat yang steril. Autoclave sering

dipakai untuk sterilisasi dalam pembuatan media kultur jaringan.

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum bioteknologi bab “pembuatan media

kultur”, adalah :

Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang jenis-

jenis media pada kultur jaringan dan aplikasi

kegunaannya

Makasiswa dapat mengerti dan memahami tentang

komposisi dan fungsi unsure dalam media MS

(Murashige dan Skog)

Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang

teknik-teknik aseptik dalam pembuatan media

Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang

perhitungan larutan stok

1.3 Manfaat

Manfaat dari praktikum bioteknologi bab “pembuatan media

kultur”, adalah :

1. Mahasiswa dapat membuat sendiri larutan stok untuk

pembuatan media kultur jaringan sebagai pengembangan

tanaman

2. Dapat mengerti dan memahami tentang materi-materi

mengenai pembuatan media kultur dan cara aplikasinya

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jenis-Jenis Media Pada Kultur Jaringan dan Aplikasi

Kegunaannya

Jenis-jenis media pada kulur jaringan ada bebebrapa macam,

antara lain :

1. Media Knop

Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan

kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media

dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur

akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine,

thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dalam Dodds and Roberts, 1983).

2. Media White

Media white dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan

kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur

makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang

dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media

untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan

normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K

+

yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi

masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum

digunakan sekarang.

3. Media Knudson dan media Vacin and Went,

Media Knudson dan media Vacin and Went, media ini

dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam

di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya

mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan

penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3

-, sangat baik

untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan

NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.

Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K

+ dengan

kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman

artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1

mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka

mengambil kesimpulan, bahwa NH4+ sangat menunjang

pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, 1956 dalam Gunawan

1988).

4. Media Murashige & Skoog (media MS)

Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan

perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam

anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur

jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk

NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali

lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali

lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi

dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM,

sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya

dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS

dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah

umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media

MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada

tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan

media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media:

Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari

komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM

ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2PO4

yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan

senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan

oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan

wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam

Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan

1998) dalam penelitian kultur anther.

Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973

dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce

dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3

-, dan

menambah konsentrasi Ca2+ nya.

Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan

menurunkan konsentrasi NO3-, K

+, Ca

2+, Mg

2+ dan SO4

2- untuk

keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi

pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair.

Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan

besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn

dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung

unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan,

maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton

et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak

penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan

tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk

mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan

supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang

tetap.

5. Media Gamborg B5 (media B5)

Media Gamborg B5 (media B5) pertama kali dikembangkan

untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium

lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5

dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik

sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman..

Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain.

Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini

menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi

yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai.

Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+

antara 1-4 mM, sedangkan

Mg2+

antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).

6. Media Schenk & Hildebrant (media SH)

Media Schenk & Hildebrant (media SH) merupakan media

yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan

dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam

komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media

Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+

, Mg2+

, dan PO4-3

yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan

jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan

bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat

baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk

pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap

jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas

penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.

7. Media WPM (Woody Plant Medium)

Media WPM (Woody Plant Medium) yang dikembangkan

oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan

konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media

diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli

lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media

WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman

hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. Pada umumnya media

kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan.

Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung

hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam

teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar.

Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama

penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam

kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya.

(Suryowinoto, M. 1991)

2.2 Komposisi dan Fungsi Unsur Dalam Media MS (Murashige

dan Skogg)

Dalam media MS (Murashige dan Skogg), terddiri dari

beberapa macam unsur yang terkandung di dalamnya, antara lain,

makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi.

Jenis-jenis yang termasuk unsur makro adalah nitrogen (N),

fosfor (P), kalium (K), sulfur (S), kalsium (Ca), dan magnesium

(Mg). Unsur NPK tersedia. Sedangkan unsur S, Ca, dan Mg boleh

ada dan boleh tidak, tetapi baik apabila unsur-unsur tersebut juga

tersedia. Unsur-unsur yang termasuk di dalam unsur mikro adalah

klor (Cl), mangan (Mn), besi (Fe), tembaga (Cu), seng (Zn), bor (B),

dan molibdenum (Mo).

Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk

NH4NO3, KNO3, CaCl2, 2H2O, MGSO4.7H2O, dan KH2PO4.

Sedangkan unsur-unsur mikro biasa diberikan dalam bentuk

MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, NaMoO4.2H2O,

CuSO4.5H2O, dan CaCl2.6H2O.

Kegunaan tiap-tiap unsur tersebut adalah sebagai berikut:

a. Unsur Nitrogen (N)

Kegunaan Nitrogen bagi tanaman adalah untuk

menyuburkan tanaman, pembentukan hijau daun, dan

pertumbuhan vegetatif tanaman sebab unsur N dapat

membentuk protein, lemak, dan berbagai persenyawaan

organik yang lain.

b. Unsur Fosfor (P)

Unsur P terutama dibutuhkan tanaman untuk

pembentukan karbohidrat. Maka, unsur P dibutuhkan secara

besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih, pembungaan,

pemasakan buah dan biji.

c. Unsur Kalium (K)

Unsur K berfungsi untuk memperkuat tubuh

tanaman, karena dapat menguatkan serabut-serabut akar

sehingga daun, bunga, dan buah tidak mudah gugur. Di

samping itu, unsur K juga berfungsi memperlancar

metabolisme dan mempengaruhi penyerapan makanan.

d. Unsur Sulfur (S)

Unsur S merupakan unsur yang penting untuk

pembentukan beberapa jenis protein, seperti asam amino dan

vitamin B1. Unsur S juga berperan dalam pembentukan

bintil-bintil akar, membantu pembentukan anakan sehingga

pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.

e. Unsur Kalsium (Ca)

Unsur Ca terdapat pada batang dan daun tanaman

yang berfungsi merangsang pembentukan bulu-bulu akar,

mengeraskan batang dan merasang pembentukan biji karena

unsur Ca bersama Mg akan memproduksi cadangan

makanan.

f. Unsur Magnesium (Mg)

Dengan menambahkan unsur Mg maka kandungan

fosfat dalam tanaman meningkat. Kegunaan fosfat sebagai

bahan mentah untuk pembentukan sejumlah protein, maka

pertumbuhan daun menjadi hijau sempurna dan terbentuk

karbohidart, lemak serta minyak.

g. Unsur Besi (Fe)

Pemberian unsur Fe juga berfungsi sebagai

penyangga yang sangat penting untuk menyangga kestabilan

pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan

tanaman, pernafasan dan pembentukan hijau daun.

h. Unsur Sukrosa

Sukrosa sering ditambahkan pada medium kultur

jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk

induksi kalus. Sukrosa dengan konsentrasi 2%-5%

merupakan sumber karbon. Penggunaaan sukrosa di atas

kadar 3% menyebabkan terjadinya penebalan dinding sel.

Pengaruh rangsangan dari gula terhadap pertumbuhan

ditentukan juga oleh cara sterilisasinya. Penggunaan autoklaf

untuk sterilisasi dapat memberikan pengaruh baik atau buruk

terhadap pertumbuhan, tergantung dari gula yang digunakan

dalam medium tersebut.

i. Unsur Glukosa dan Fruktosa

Glukosa dan Fruktosa dapat digunakan untuk

mengganti sukrosa karena dapat merangsang pertumbuhan

beberapa jaringan. Peemilihan gula dan konsentrasi yang

akan digunakan tergantung dari jaringan tumbuhan yang

akan di kulturkan dan tujuan yang ingin dicapai.

j. Unsur Mio-inositol

Penambahan mio-inositol pada medium bertujuan

untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah

jaringan. Bila mio-inositol diberikan bersama dengan auksin,

kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan

jaringan kalus.

k. Unsur Vitamin

Vitamin yang sering digunakan dalam media kultur

jaringan antara lain Tiamin, Piridoksin, dan asam nikotonat.

Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel

pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim daalam

reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan

memindahkan energi. Asam nikotinat penting dalam reaksi-

reaksi enzimatik, sebagai prekursor dari beberapa alkaloid.

Pemberian vitamin C bertujuan untuk mencegah terjadinya

pencoklatan pada permukaan irisan jaringan. Vitamin yang

sering ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah

niasin, glisin, piridoksin HCl, tiamin HCl, mio-inositol, asam

folat, sianokobalamin, riboflavin, iotin, kolin klorida,

kalsium pentetonat, piridoksin fosfat, nikotinamida.

l. Unsur Asam-asam Amino

Asam amino berperan penting untuk pertumbuhan

dan diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap

tanaman berbeda-beda. Asparagin dan glutamin berperan

dalam metabolisme asam amino, karena dapat menjadi

pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-asam

amino baru dalam jaringan.

m. Unsur Zat Pengtur Tumbuh (ZPT)

Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa

organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat

mendukung, menghambat dan dapat merubah proses

fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman

terdiri dari lima kelompok, yaitu auksin, giberelin, sitokinin,

etilen dan inhibitor dengan ciri khas serta pengaruh yang

berlebihan terhadap proses fisiologis.

Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai

komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi.

Tanpa penambahan ZPT dalam medium, pertumbuahn sangat

terhambat bahkan tidak tumbuh sama sekali. Pembentukan

kalus dan organ-organ ditentukan oleh penggunaan yang

tepat dari ZPT tersebut.

n. Sitokinin

sitokinin berperan dalam pembelahan sel tanaman

terutama mempengaruhi metabolisme asam nukleat dan

sintesis protein. Protein berpengaruh terhadap pembelahan

sel tanaman.

o. Auksin

auksin berperan dalam proses merubah sifat osmotik

dari vakuola dan berpengalaman terhadap perpanjangan sel

tanaman sedangkan sitokinin berpengaruh pada pembelahan

sel dan diferensiasi sel. Pemanjangan sel ke arah vertikal

yang diikuti dengan pembesaran sel akan meningkatkan

bobot basah tanaman. Peningkatan bobot basah tanaman

terutama disebabkan meningkatnya pengambilan air oleh sel

tanaman. Air serta zat pengatur jumbuh dan nutrisi yang

terkandung dalam air kelapa masuk ke dalam sel dan dinding

sel mengembang, dengan makin besarnya sel yang terbentuk

akan berpengaruh terhadap berat basah tunas tanaman.

(Sriyanti, 1994)

2.3 Teknik-teknik Aseptik Dalam Pembuatan Media

Teknik aseptik adalah teknik pemindahan mikroba dengan

menggunakan alat-alat yang steril serta aturan laboratorium tertentu

agar tidak terjadi kontaminasi di dalam kultur tersebut.

Teknik aseptik adalah langkah-langkah yang diambil agar

dalam percobaan di laboratorium sehingga diperoleh hasil yang

akurat. Contoh dengan menghindarkan percobaan dari

mikroorganisme yang dapat mengkontaminasi produk sehingga

terjadi perubahan yang tidak diingainkan. Teknik aseptik juga

berfungsi untuk melindungi diri dari infeksi dan pencemaran

lingkungan.

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua

organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi

basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat

tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang

berkisar antara 110-1210C. Sterilisasi yang umum dilakukan dapat

berupa:

Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar

gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa

kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai

akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas,

dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan

temperatur 170o – 180

oC dan waktu yang digunakan adalah 2

jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan

disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan

yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan

mengalami perubahan, misalnya adalah dengan

saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain

adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang

lewat (dalam hal ini adalah mikroba).

(Anonymous a, 2012)

Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode

sterilisasi dengan uap air dibawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa,

perlatan laboratorium, plastik penutup, peralatan gelas, penyaring,

air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan autoklaf. Hampir

semua mikroba mati bial terkena uap yang sangat panas dari autoklaf

selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu

121ºC dan tekanan 15 Psi selama 15-20 menit (Torres, 1989).

Etil alcohol (70-90%) sangat berguna untuk mengusap

permukaan tempat pelaksanaan, membilas tangan, dan mencelupkan

peralatan dengan atau tanpa pembakaran. Alcohol mudah terbakar,

sehingga harus sangat hati-hati saat menggunakannya diatas api.

Kalsium atau Natrium hipoklorit digunakan sebagai sterilisasi

peralatan dan sebagai desinfektan bagi jaringan tanaman tanpa

melukainya (Afriastini, 2004).

Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan

untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan

adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi

ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital

(terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap

dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan

air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf

sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas

dari api.

Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan

pengaturan panas secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan.

Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif

murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan

problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih

cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi

dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila

pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat

dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah

bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan

media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan

total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang

ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.

Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan

kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah.

Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi, serta

waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai,

temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan

dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable, panas

ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal

ini harus diatur secara manual.

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas

dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C,

tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square

inci) atau 1 atm.Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan

jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara

20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.

Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :

1. Penguraian gula.

2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.

3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.

4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

( Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996 : 169)

Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya

mempergunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan

ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada laboratorium

komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.

Bagian-bagian autoklaf :

1. Panci luar.

2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat

saluran uap.

3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.

4. Katup pengeluaran uap.

5. Pengunci atau klem.

Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan

wadah yang mempunyai volume antara 300 – 500 ml. Isi wadah

tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta

kencangkan dengan karet gelang.

Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya

dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan

isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi

sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada

tekanan 15 psi. atau 1 atm.

Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan

yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada

temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu

antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume

media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil

berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi

dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan

waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter

memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan

52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest

dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai,

autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila

tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan

meluap (bubbled up).

Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan,

sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang

mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang

bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin

disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang

dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain :

GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan

sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang

sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan

selama 4 jam pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan dapat

langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama,

maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan

alumunium foil.

(Anonymous B, 2012)

2.4 Rumus Perhitungan Larutan Stok

Larutan stok adalah larutan berisi satu ataul e b i h

k o m p o n e n m ed i a y a n g ko n s e n t r a s i n y a l eb i h b es a r

d a r i ko n s e n t r a s i ko m p o n e n tersebut dalam formulasi media

akan dibuat.

Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat

menggunakan rumus :

V1 x M1 = V2 x M2

Dimana:

V1 = volume yang akan dibuat

M1 = banyaknya kebutuhan senyawa dalam media MS

V2 = volume larutan stok yang akan diambil

M2 = banyaknya senyawa dalam larutan stok

(Hemawan dan Na”em, 2006)

BAB III METODOLOGI

3.1 Alat, Bahan dan Fungsi

Alat :

1. 14 botol kultur : berfungsi sebagai tempat media kultur

2. 2 pak karet gelang : berfungsi untuk penutup atau tali

penutup plastik dan alumunium

3. Plastik tahan tanas (untuk 8 botol, dengan ukuran pxl; 12 x

13 cm) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan a)

4. Gelas ukur : untuk mengukur cairan yang di butuhkan

5. Mikro pipet : untuk mengambil larutan stok dengan ukuran

terkecil mikro meter

6. Beaker glass : untuk tempat pembuatan larutan stok

7. pH universal (indikator pH) : untuk mengukur pH larutan

8. sitter : megaduk larutan

9. microwave : untuk memasak larutan hingga larutan

mengental

10. alumanium foil (unutk 6 botol, dengan ukuran pxl; 24 x 15,

kertas di lipat/rangkap) : sebagai penutup botol kultur

(perlakuan b)

11. autoclave : sterilisasi botol kultur sebelum di masukkan ke

ruangan pengamatan

12. Timbangan analitik : untuk menimbang berat bahan yang

diperlukan

13. Oven : sterilisasi kering botol kultur

bahan :

Aquades : 50 ml (bahan tambahan pada

larutan stok)

Makro : 30 ml

Mikro A : 3 ml

Mikro B : 0,3 ml

FeEDTA : 3 ml

Vitamin : 0,3 ml

CaCl2 : 3 ml

Fungsi : Sebagai bahan pembuatan

larutan stok

Sukrosa : untuk 300 ml. Larutan media

digunakan 9 gram gula. (untuk

membuat larutan menjadi

tercampur rata)

Agar-agar : unutk 300 ml. Larutan media

digunakan 2,1 gram agar-agar

(untuk mengentalkan larutan)

3.2 Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir)

Bilas gelas dengan menggunakan aquades

Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok : Makro : 30 ml

Mikro A : 3 ml

Mikro B : 0,3 ml

Fe EDTA : 3 ml

Vitamin : 0,3 ml CaCl2 : 3 ml

Tambahkan aquades hingga volume

mencapai 300 ml

Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)

Masukkan sukrosa (gula) dan agar-agar

Sukrosa : 9 gram

Agar-agar : 2,1 gram

Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi

Mikrowave selama 7 menit

3.3 Analisa Perlakuan

Pertama, breaker glas di bilas dahulu dengan menggunakan

aquades, bertujuan untuk menghilangkan dan membersihkan gelas

breaker. Isi breaker glas dengan larutan aquades kurang lebih 50 ml.

Setelah itu, tambahkan unsur-unsur larutan yang sudah di stok, yaitu

: makro (30 ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3 ml), Fe EDTA (3 ml),

Vitamin (0,3 ml) dan CaCl2 (3 ml). Setelah semua larutan selesai

ditambahkan, tambahkan lagi aquades hingga volume mencapai 300

ml. Stirer (aduk) larutan dan ukut pH larutan menggunakan indikator

pH hingga mencapai pH sekitar 5 – 6. Masukkan sukrosa (9 gram)

dan agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan untuk melarutkan larutan

dan mengentalkan larutan. Stirer kembali sampai larutan berwarna

putih bening. Setelah selesai, tutup breaker glas dengan plastik wrap

dan masukkan ke dalam microwave selama 7 menit setelah selesai,

masukkan larutan ke dalam botol kultur dengan 8 botol di tutup

plastik, dan 6 botol ditutup alumunium. Masukkan ke autoclave

untuk sterilisasi akhir, dan amati selama 2 minggu, apakah terjadi

kontaminasi atau tidak.

Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml :

8 botol dengan tutup plastik

6 botol dengan tutup alumunium

Autoclave

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil (tabel perbandingan perlakuan)

a. Tabel media kultur dengan penutup plastik

No Hari

Pengamatan Ke-

Botol

Ke-

Jenis

Kontaminan

Keteranga

n

1 Hari ke-2 (17

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

7

8

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

2 Hari ke 4 (19

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

7

8

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

3 Hari ke 6 (22

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

7

8

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

4 Hari ke 8 (24

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

7

8

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

5 Hari ke 10 *(25

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

7

8

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

6 Hari ke 12 (29

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

7

8

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

*Seharusnya tanggal 26 Oktober 2012, karena libur, jadi pengamatan

dimajukan 1 hari pada tanggal 25 Oktober 2012

b. Tabel media kultur dengan penutup Aluminium Foil

N

o

Hari Pengamatan

Ke-

Botol

Ke-

Jenis

Kontaminan

Keteranga

n

1 Hari ke-2 (17

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

2 Hari ke 4 (19

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

3 Hari ke 6 (22

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

4 Hari ke 8 (24

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

6 Tidak ada yang

masih

putih dan

sudah

mengental

5 Hari ke 10 *(25

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

6 Hari ke 12 (29

Oktober 2012)

1

2

3

4

5

6

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak ada

Tidak

terjadi

kontamina

n dengan

warna

yang

masih

putih dan

sudah

mengental

*Seharusnya tanggal 26 Oktober 2012, karena libur, jadi pengamatan

dimajukan 1 hari pada tanggal 25 Oktober 2012

4.2 Pembahsan

Dari data hasil praktikum yang telah didapatkan, diketahui

bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan dapat dikatakan

berhasil. Hal ini diketahui dari pengamatan yang telah dilaksanakan

selama 2 minggu pengamatan (dengan selang waktu 2 hari sekali),

yaitu warna dari larutan yang berada di dalam botol kultur tutup

plastik maupun tutup alumunium berwarna putih dan sudah

mengental.

Pada botol kultur dengan tutup plastik, dilakukan percobaan

sebanyak 8 botol. Pada pengamatan pertama, 8 botol tersebut tidak

menunjukkan gejala-gejala terkontaminasi. Hal ini berlanjut ke

pengamatan-pengamatan selanjutnya, dengan selang waktu 2

minggu, 8 botol kultur masih menunjukkan hasil yang baik dan tidak

terkontaminasi.

Pada botol dengan tutup alumunium pun, menunjukkan hasil

yang sama dengan botol yang di tutup dengan plastik. Pada

praktikum, di lakukan percobaan dengan 6 botol yang di tutup

dengan menggunakan alumunium. Selang jangka waktu 2 minggu

setelah praktikum, botol kultur tersebut tidak terkontaminasi, dengan

ciri-ciri larutan tetap berwarna putih dan sudah mengental.

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Jenis-jenis media pada kulur jaringan ada bebebrapa macam,

antara lain : Media Knop (wortel), Media Knudson dan

media Vacin and Went (anggrek), Media White (bunga

matahari), Media Murashige & Skoog (media MS), Media

Gamborg B5, Media Schenk & Hildebrant (media SH),

Media WPM (Woody Plant Medium)

Dalam media MS (Murashige dan Skogg), terddiri dari

beberapa macam unsur yang terkandung di dalamnya, antara

lain, makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi.

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua

organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda.

Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan

apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila

dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-1210C.

Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

◦ Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar

gelombang pendek yang dapat dilakukan selama

senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah

atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi).

Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang

panas” (oven dengan temperatur 170o – 180

oC dan waktu

yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk

peralatan gelas).

◦ Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan

disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

◦ Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa

bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi

akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan

saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan

lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel

yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).

Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat

menggunakan rumus : V1 x M1 = V2 x M2

Dari data hasil praktikum yang telah didapatkan, diketahui

bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan dapat

dikatakan berhasil. Hal ini diketahui dari pengamatan yang

telah dilaksanakan selama 2 minggu pengamatan (dengan

selang waktu 2 hari sekali), yaitu warna dari larutan yang

berada di dalam botol kultur tutup plastik maupun tutup

alumunium berwarna putih dan sudah mengental.

5.2 Saran

Asisten : tolong kalau menerangkan materi, lebih

pelan saja, selain itu, no koment

Praktikum : bahan laporan tolong lebih di persingkat.

DAFTAR PUSTAKA

Suryowinoto, M. 1991. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya.

Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta

Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius.

Yogyakarta.

Anonymous a, 2012. Teknik Sterilisasi

http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20ST

ERILISASI/IV2%20Sterilisasi %20Alat.html. Diakses

Tanggal 16 Oktober 2012

Torres, K.C. 1989. Tissue Culture techniques for

Horticultural Crops. Von Hostrand Reinheld. New York.

Afriastini, F. 2004. Perbanyakan Vegetatif : Kultur Jaringan.

http://www.wikipedia.id.org/ teknik/veg. Diakses 15

Desember 2007

Kyte, Lydiane & John Kleyn. 1996. Plants from Test Tubes.

USA: Timber Press

Anonymous b, 2012. Teknik Sterilisasi.

http://www.iptek.net.id/ind/?ch=isti&id=211. Diakses

Tanggal 16 Oktober 2012

Herawan, T dan M. Na’iem. 2006. Pengaruh Jenis Media

dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran

pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.).

Jurnal Agrosains 19(2) : 103-109.

LAMPIRAN

Dokumentasi hari ke-2 (17 Oktober 2012)

Plastik Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi Tidak terjadi kontaminasi

Dokumentasi hari ke-4 (19 Oktober 2012)

Plastik Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi Tidak terjadi kontaminasi

Dokumentasi hari ke-6 (22 Oktober 2012)

Plastik Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi Tidak terjadi kontaminasi

Dokumentasi hari ke-8 (24 Oktober 2012)

Plastik Alumunium

Dokumentasi hari ke-10 (25 Oktober 2012)

Plastik Alumunium

Dokumentasi hari ke-12 (29 Oktober 2012)

Plastik Alumunium

Tidak terjadi kontaminasi Tidak terjadi kontaminasi