Laporan PraktikumModul Sel Genetika BioMolekulerSALTING OUT,
SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPH, DAN ELEKTROFORESIS
Kelompok DK 15Dian Aris Priyanti [1406528144]Farah Vidiast
[1406577562]Maryam Ulfa [1406527772]Nadya Farhana [1406599310]Nurul
Falahiyyah Bahri [1406527955]Radityo Adi [1406571666]Stevanus
Samudra [1406566602]Skolastika Mitzy [1406599090]Yosilia Nursakina
[1406570026]
FAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS INDONESIAJAKARTA2014SALTING
OUT
I. Landasan TeoriSalting out adalah suatu cara pengendapan
protein dalam larutan yang memiliki kekuatan ionik sangat tinggi
dengan memanfaatkan pengurangan kelarutan pada molekul tertentu.
Untuk mengendapkan molekul secara selektif, dapat digunakan tipe
dan konsentrasi garam yang bermacam-macam. Meskipun salting out
memiliki kekurangan dalam ketepatan mengisolasi protein tertentu,
namun dalam kenyataanya salting out masih merupakan suatu cara yang
efektif untuk pengendapan molekul awal.Interaksi dari hidrofobik
dan hidrofilik dengan lingkungan seluler menyebabkan konformasi
(penyesuaian) pada biomolekul besar untuk terurai. Interaksi ini
menyebabkan pelipatan dimana kebanyakan grup fungsional hidrofobik
terlindungi dari lingkungan seluler polar sehingga tercapai
konformasi akhir. Semua bagian hidrofilik dari molekul tertinggal
untuk berinteraksi dengan air sementara bagian hidrofobik dari
molekul berkumpul bersama untuk mencapai konformasi ini. Salting
out terjadi karena penyeleksian yang dilakukan oleh asam amino pada
protein. Air diperintahkan oleh asam amino polar seperti lisin,
glutamate, dan tirosin untuk mengelilingi mereka sehingga mereka
tinggal terlarut. Molekul air akan mengelilingi kumpulan ion dan
protein pada pada lingkungan cair dengan kekuatan ionik tinggi.
Pengendapan dari zat yang dilarutkan seperti protein dan molekul
organic besar adalah hasilnya.
II. Alat dan Bahan1. Tabung Reaksi1. Kertas Saring1. Pipa
tetes1. Mikropipet 1. Corong1. Larutan amonium sulfat,
(NH4)2SO4jenuh1. Larutan NaCl 1%1. Larutan NaOH
III. Langkah Kerja1. Masukkan 7,28 gram (NH4)2SO4 ke dalam 25 ml
serum. Aduk hingga rata.1. Substrat tersebut kemudian disaring ke
dalam tabung reaksi menggunakan kertas saring yang sudah dilipat
empat dan dijadikan seperti corong1. Akan ada endapan dan filtrat
dari saringan pertama tersebut atau disebut juga sebagai
precipitate 50% dan filtrate 50%1. Lakukan uji biuret kepada
precipitate 50% dengan mencampurkan precipitate + 2 ml NaCl 1% + 2
ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung reaksi
yang kosong (tabung P1). Lihat hasilnya1. Lakukan Uji biuret kepada
filtrate 50% dengan mengambil 0,5 ml filtrate + 1.5 ml NaCL 1% + 2
ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung reaksi
kosong (tabung F1)1. Ambil filtrate saringan pertama, disaring ke
dalam tabung reaksi lain menggunakan kertas saring yang dilipat
empat dan dijadikan seperti corong1. Lakukan uji biuret kepada
precipitate 100% dengan mencampurkan precipitate + 2 ml NaCl 1% + 2
ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung reaksi
yang kosong (tabung P2). Lihat hasilnya1. Lakukan Uji biuret kepada
filtrate 100 % dengan mengambil 0,5 ml filtrate + 1.5 ml NaCL 1% +
2 ml NaOH + 3-5 drops CuSO4 secara berurutan ke dalam tabung reaksi
kosong (tabung F2). Lihat hasilnya
IV. Hasil KerjaP1 : tabung yang merupakan hasil dari uji biuret
pada precipitate 50%. Berwarna paling ungu karena mengandung
protein-protein besar yang tidak tersaringF1 : tabung yang
merupakan hasil dari uji biuret pada filtrate 50%. Berwarna lebih
muda dari P1 karena protein besar pada P1 tidak tersaring menjadi
F1P2 : merupakan hasil uji biuret dari precipitate 100 %. Pada
gambar terlihat memiliki warna yang sama dengan P1, dan lebih tua
dari warna F1. Merupakan hasil endapan protein-protein sedang dari
filtrate 50%F2 : merupakan hasil uji biuret pada filtrate 100%.
Berwarna sangat muda karena sudah tidak memiliki protein.
V. ReferensiCore [internet]. [place unknown].
[chemwiki.ucdavis.edu]; [date unknown] [cited 15 Februari 2015]
Available from:
https://www.health.ny.gov/professionals/ems/pdf/srgpslongbones.pdf
SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPH
I. Tujuan1. Memisahkan molekul protein berdasarkan
ukuran/beratnya.1. Memisahkan protein hemoglobin dengan vitamin B12
yang terkandung dalam darah dengan menggunakan kolom kromatografi
gel penyaring.
II. Landasan TeoriKromatografi adalah teknik yang digunakan
untuk memisahkan molekul yang bercampur dalam suatu larutan. Pada
teknik ini, molekul yang bercampur tersebut akan terpisah ke dalam
dua fasa yaitu fasa stasioner dan fasa mobil (disebut juga eluen).
Fasa stasioner adalah molekul yang dapat bergerak sedangkan fasa
stasioner adalah molekul yang diam/tidak dapat bergerak. Proses
pergerakan molekul akibat dari eluen disebut sebagai elusi.Teknik
pemisahan molekul dengan metode kromatografi pada umumnya
menggunakan kolom yang berisi matriks tertentu yang dipadatkan.
Matriks di dalam kolom tersebut berperan sebagai fasa stasioner.
Matriks pada kolom tersebut dibuat sedemikian rupa sehingga dapat
menyeleksi molekul yang melewatinya, berdasarkan kriteria tertentu,
misalnya kelarutan, berat, ukuran, dan lain sebagainya. Pemisahan
ini akan selesai ketika elusi telah berakhir. Dengan kata lain,
seluruh campuran molekul yang akan dipisahkan tersebut telah
semuanya keluar dari kolom penyaring. Dengan menggunakan elusi yang
sesuai, molekul-molekul tersebut akan keluar sesuai urutan dalam
kriteria yang ditentukan, misalnya mulain dari molekul yang berat
hingga yang ringan. Matriks yang digunakan dalam teknik ini berupa
gel yang berisi butiran-butiran mikroskopis dekstran yang
dipadatkan. Molekul yang memasuki matriks, dengan dibantu eluen,
akan terpisah berdasarkan ukuran molekul (mencerminkan berat
molekul). Molekul protein yang berukuran lebih kecil akan masuk ke
dalam pori-pori sehingga lajunya tertahan dan membutuhkan waktu
keluar lebih lama. Sementara itu, molekul protein dengan ukuran
yang lebih besar akan lolos dari pori-pori dan terus melaju di
sepanjang kolom. Dengan begitu, molekul dengan ukuran besar akan
keluar terlebih dahulu dibandingkan dengan molekul yang ukurannya
lebih kecil. Oleh karena itu, teknik ini biasa juga disebut dengan
size exclusion chromatography atau molecular sieve
chromatography.
III. Alat, Bahan, dan MetodeAlat:1. Tabung reaksi1. Sizing
column1. Pipet1. Mikropipet1. Spektrofotometri
Bahan:1. Campuran protein hemoglobin dan vitamin B121. Matriks
gel penyaring1. Dapar NaCl 0,1M + Azida1. Akuades
Gambar: Alat kerja praktikum
Langkah Kerja:1. Siapkan 15 tabung reaksi dengan dilabelkan 1-14
dan tabung terakhir dilabel sisa.1. Lakukan up and down pada tabung
berisikan campuran protein hemoglobin dan vitamin B12 hingga
campuran tersebut homogen.1. Buka penutup atas dan bawah kolom gel
penyaring. Tunggu hingga larutan dapar di atas permukaan gel
penyaring menetes keluar hingga habis.1. Beri 2 tetes campuran
protein dengan menggunakan pipet tetes ke atas permukaan gel
penyaring, kemudian tambahkan dua tetes dapar melalui diding kolom
gel penyaring. Tampung fraksi 3 tetes pada tabung pertama.1.
Pindahkan kolom gel penyaring ke tabung reaksi selanjutnya setelah
3 tetes.1. Setelah 15 tabung reaksi terisi oleh fraksi 3 tetes,
tutup kembali bagian bawah kolom gel penyaring. 1. Tambahkan
akuades sebanyak 1 ml dengan menggunakan mikropipet ke dalam tiap
tabung reaksi. Campurkan hingga menjadi homogen.1. Untuk
mendapatkan hasil yang akurat, ukur serapan pada masing-masing
tabung reaksi dengan menggunakan spektrofotometri.1. Catat hasil
yang diukur, kemudian tuangkan ke dalam bentuk tabel dan kurva
untuk dapat memperjelas kesimpulan.
IV. Hasil Pengamatan Dari tetesan sampel idapat hasil warna yang
berbeda dari 12 tabung yang digunakan. Masing-masing tabung
memiliki perubahan warna yang tidak begitu jauh. Dari hasil
percobaan didapatkan hasil berikut :
Setelah selesai, daya serap larutan tersebut pun kemudian diukur
pada spektrofotometer. Berikut ini adalah hasil percobaan yang
diberi label 1-14 dari kiri ke kanan beserta hasil
spektrofotometrinya.
Tabung1234567
WarnaTidakberwarnaTidak
berwarnaTidakberwarnaMerahGelapMerahGelapMerah
Merah
Intensitas(++)---++++++++++
Serapan()0.2460.0930.1110.6260.2580.2800.246
Tabung891011121314
WarnaMerahMerahMudaMerahMudaMerahMudaMerahMudaMerahMudaTidakBerwarna
Intensitas(++)++++++++++-
Serapan()0.2040.180Tabel Nilai Absorbansi
0.1500.1010.2070.2010.204
Dari hasil diatas maka dapat dibuat kurva dengan sumbu x adalah
nomor tabung dan sumbu y sebagai fraksi warna hasil pengukuran
spectrofothometer. Berikut adalah kurva yang diperoleh :
V. Analisis Percobaan kromatografi gel penyaring dilakukan untuk
memisahkan protein berdasarkan ukuran molekulnya. Pada percobaan
ini, protein yang digunakan adalah protein Hb dan B12 yang
dituangkan ke dalam agar pada sizing column. Protein Hb memiliki
ukuran molekul yang lebih besar dibandingkan B12. Agar-agar yang
diletakkan pada sizing column memiliki pori-pori tertentu yang
lebih besar dari ukuran molekul B12 tetapi lebih kecil dari ukuran
molekul Hb. Sehingga ketika protein campuran Hb dan B12 dituangkan
ke dalam sizing column, protein B12 akan masuk ke dalam pori-pori
agar , sedangkan protein Hb akan langsung turun ke bagian bawah
sizing column. Oleh karena itu, ketika tutup sizing column dibuka,
gel yang menetes pada tabung reaksi awal akan berwarna lebih merah
karena mengandung Hb dan gel-gel yang diteteskan pada tabung reaksi
berikutnya akan berwarna lebih muda dan transparan karena sudah
tidak mengandung Hb. Kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan
aquades sebanyak 1 mL agar larutan lebih terlihat.Pada grafik hasil
absorbansi terlihat adanya 2 puncak grafik yaitu pada tabung 4
dengan nilai absorbansi 0,626 yang menunjukkan nilai absorbansi
molekul Hb. Sedangkan puncak ke-2 terlihat pada tabung 6 yang
memiliki nilai absorbansi 0,280 menunjukkan nilai absorbansi
molekul B12. Sementara puncak grafik yang lain muncul akibat adanya
kontaminan pada larutan hasil kromatografi.
VI. KesimpulanKromatografi kolom adalah metode pemisahan protein
sesuai ukuran dan berat molekul. Molekul yang paling berat dan
berukurn lebih besar akan keluar lebih dulu dari kolom. Dalam
percobaan ini diketahui bahwa molekul-molekul hemoglobin adalah
molekul yang besar dan akan keluar lebih dulu dibanding molekul
dari vitamin B12. Pada grafik, pucak pertama menunjukkan nilai
absorbansi maksimum dari protein Hb sedangkan puncak kedua
merupakan nilai absorbansi maksimum protein B12.
ELEKTROFORESIS
1. PendahuluanElektroforesis merupakan teknik pemisahan
partikel, ion, atau koloid berdasarkan kemampuan berpindahnya
melalui medium konduktif(pelarut buffer) terhadap respon adanya
medan listrik. Selain itu, elektroforesis juga diartikan sebagai
migrasi partikel yang bermuatan akibat adanya arus listrik searah
(Direct Current). Larutan buffer pada proses elektroforesis
berfungsi sebagai konduktor dan menjadi jembatan konduksi antara
dua elektroda pada chamber elektroforesis, sehingga adanya aliran
medan listrik. Biasanya, elektroforesis dilakukan untuk memisahkan
segmen DNA.
1. Tujuan PercobaanTujuan dari elektroforesis adalah menentukan
muatan suatu partikel, dalam percobaan ini yaitu protein.
1. Landasan TeoriPrinsip kerja elektroforesis yaitu adanya
pergerakan partikel bermuatan positif ke kutub negatif dan partikel
bermuatan negatif ke kutub positif. Gerak partikel ini disebut
sebagai gerakan elektrokinetik. Hasil dari elektroforesis disebut
dengan elektroforegram yang menentukan kecepatan migrasi suatu
partikel.
1. Alat-Alat Praktikum1. Chamber elektroforesis1. Plate1. Filter
papers1. Power supply1. Alat pengepress dan tatakan cetak1.
Micropipet1. Pinset1. Membran selulosa asetat
1. Bahan Praktikum1. Serum1. BSA (Bovine Serum Albumine)1.
Precipitate 50% (P50) : Globulin1. Filtrate 50% (F50) : Albumin1.
Precipitate 100% : Albumin1. Filtrate 100% : No protein1. Buffer
Barbital1. Ponceau S stain1. Acetic Acid 5%
1. Cara Kerja1. Menyiapkan alat dan bahan1. Merendam membrane
selulosa di dalam buffer barbital selama 15 menit1. Menyiapkan
chamber elektroforesis dengan mengisinya menggunakan buffer
barbital1. Plate yang berlubang-lubang diisi dengan menggunakan
sampel ( Serum pertama, BSA kedua dan seterusnya) sebanyak 5
mikroliter masing-masing berurutan.1. Mengangkat membrane selulosa
asetat dengan menggunakan pinset lalu mengeringkannya dengan
melapisnya memakai filter papers ( seperti sandwich membran
diletakkan di tengah)1. Mengepress plate yang berisi sampel
sebanyak 6 lubang kesamping ( Serum, BSA, dan seterusnya) dengan
menggunakan alat cetakkan sebanyak 3 kali dorongan, lalu segera
mencetaknya pada membrane selulosa asetat yang sudah diletakkan
pada tatakan cetak dan tahan selama 10 detik1. Membran yang sudah
di cetak tersebut diletakkan pada bak elektroforesis yang telah
disediakan dengan posisi katoda pada membran diletakkan sejajar
pada sisi katoda bak elektroforesis1. Bak elektroforesis di tenagai
oleh power supply bertegangan 180 Volt dan dinyalakan selama 15
menit1. Setelah 15 menit membrane selulosa asetat di angkat dari
bak elektroforesis dan diletakkan pada wadah berisi larutan ponceau
merah lalu digerak-gerakkan selama 6 menit1. Setelah 6 menit
membrane selulosa asetat diletakkan ke wadah berisi larutan asam
asetat 5%1. Ulangi langkah 10 sekali lagi agar membrane selulosa
asetat benar-benar bersih dibilas1. Mengangkat membrane selulosa
dan diangin-anginkan.
1. AnalisisPada membrane selulosa asetat yang sudah diberi nomer
( 1 Serum, 2 BSA, 3 Presipitat Globulin 50%, 4 Filtrat Albumin 50%,
5 Filtrat Albumin 100%, Filtrat 100% No Protein ) tampak. Pada
tanda nomer 1 jejak elektroforesis (berwarna merah) Mengarah ke
atas dan kebawah dengan intensitas warna yang hampir sama besar.
Ini menandakan bahwa serum yang secara sama mengarah pada kutub
positif (atas membran) dan kutub negative ( bawah membrane) karena
serum tersebut terdiri dari Globulin dan Albumin. Pada nomer 2
(BSA) senyawa albumin pada sapi, memperlihatkan jejak
elektroforesis mengarah ke kutub positif. Pada jejak nomer 3
terlihat jejak elektroforesis mengarah ke kutub negatif. Jejak
elektroforesis nomer 4 dan 5 sama-sama mengarah ke kutub positif
(tebal) dengan ketebalan berbeda, sedangkan jejak elektroforesis
nomer 6 tidak memperlihatkan apa-apa.
1. KesimpulanJejak elektroforesis bernomer 2 yang berisi albumin
mengarah ke kutub positif. Suatu muatan yang mengarah ke kutub
positif pasti bermuatan negative ( gaya Tarik-menarik) dengan
demikian sampel yang memiliki albumin akan mengarah ke kutub
positif karena albumin sendiri bermuatan negatif. Sedangkan
Globulin mengarah ke kutub negatif karena bermuatan positif. Pada
sampel nomer 1 jejak elektroforesis mengarah ke kutub positif
maupun negatif, karena serum terdiri dari albumin yang mengarah
keatas (muatan negatif) dan Globulin mengarah ke bawah (muatan
positif). Jejak elektroforesis nomer 6 tidak menghasilkan apa-apa
karena tidak terdapat protein yang dapat dipisahkan.1. Referensi0.
Bagian Biokimia FKUI. Biokimia : Eksperimen Laboratorium. Isolasi
dan pemisahan protein. 1st ed. P 35-45. Widya Medika. 2001
1. Lampiran
Bak elektroforesis yang sudah berisi buffer barbital (tedapat
katoda, anoda)
Membran selulosa diletakkan pada tatakan cetakan. (Alat
pengepress di sebelah kanan)
Plate yang akan di beri sampel 1-6
