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francesca-grilli
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L’energia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck:L’energia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck:
E = h E = h
Campo magnetico
Campo elettrico
Direzionedi
propagazione
lunghezza d’ondalunghezza d’onda
a
aaampiezza d’ondaampiezza d’onda
PROPRIETA’ DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHEPROPRIETA’ DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE
: frequenza d’onda
tempo
ampiezza
spazio
ampiezza
4 Hz
1 s
tempo
ampiezza
spazio
ampiezza
2 Hz
1 s
E’ importante ricordare che frequenza e lunghezza d’onda non si possono confrontare sullo stesso grafico
Lunghezza d’onda, frequenza e velocità di una qualsiasi onda elettromagnetica sono correlate dalla relazione
c
Passando dall’aria al vetro, la velocità di propagazione diminuisce a causa dell’indice di rifrazione; pertanto, rimanendo costante la frequenza (dipendente solo dalla sorgente
luminosa), diminuisce anche la lunghezza d’onda.
Variazione di con l’indice di rifrazione del mezzo
ampiezza
distanza
aria ariavetro
= 6,0 x 1014 Hz = 500 nm
= 6,0 x 1014 Hz = 500 nm
= 6,0 x 1014 Hz = 350 nm
Onderadio
Microonde
IR lontano
IR medio
IR vicinoVisibile
UV vicinoUV lontano
Raggi X
Frequenza,Energia
Frequenza,Energia
1-1000 m1-1000 m
0,1-100 cm0,1-100 cm
50-1000 50-1000 mm
2,5-50 2,5-50 mm
0,75-2,5 0,75-2,5 mm
400-750 nm400-750 nm200-400 nm200-400 nm10-200 nm10-200 nm
1010-2-2- 100 Å- 100 Å
REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICOREGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO
1 Å = 10 1 Å = 10 -10-10 m m
1 nm = 10 1 nm = 10 -9-9 m m
1 1 m = 10 m = 10 -6 -6 mm
REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICOREGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO
Principali applicazioni delle diverse onde
INTERAZIONI TRA MOLECOLE ED ENERGIA RADIANTEINTERAZIONI TRA MOLECOLE ED ENERGIA RADIANTE
E0
E1
E2
v0
v1
v2
r0r1r2
UV-VIS
IR
E
SCHEMA DEI LIVELLI ELETTRONICI, VIBRAZIONALI E ROTAZIONALI DI UNA MOLECOLA
EE00 , E , E11 , E , E22 : livelli elettronici : livelli elettronici
vv00 , v , v11 , v , v22 : livelli vibrazionali : livelli vibrazionali
rr00 , r , r11 , r , r22 : livelli rotazionali : livelli rotazionali
L’energia assorbita viene cedutaL’energia assorbita viene ceduta per per diseccitazione termicadiseccitazione termica o, più o, più
raramente,raramente, radiativa radiativa(fluorescenza(fluorescenza o o fosforescenza)fosforescenza)
SPETTROFOTOMETRIA UV E VISIBILESPETTROFOTOMETRIA UV E VISIBILE
SoluzioneSoluzionecampionecampione
I0 (P0) I (P)
Potere radiante (P):Potere radiante (P): energia che attraversa un’area energia che attraversa un’area unitaria in un secondo (J/sec)unitaria in un secondo (J/sec)
Intensità (I):Intensità (I): potere radiante per unità di angolo potere radiante per unità di angolo solido (steradiante) della sorgentesolido (steradiante) della sorgente
TRASMITTANZATRASMITTANZA
IIII00
T =T =
0 ≤ T ≤ 1 0% ≤ T ≤ 100%
ASSORBANZAASSORBANZA
TT
11A = - log T = log = logA = - log T = log = log II
II00
0 ≤ A ≤ ∞numerinumeriadimensionaliadimensionali
numerinumeriadimensionaliadimensionali
radianter
r
steradiante
Spettro di assorbimento della clorofilla
max
Spettro di assorbimento: diagramma ottenuto misurando l’assorbanza in funzione di
max max : :
lunghezza d’onda a cuilunghezza d’onda a cuicorrisponde un massimocorrisponde un massimo
di assorbimentodi assorbimento
LEGGE DI LAMBERT-BEERLEGGE DI LAMBERT-BEER
II00 II
dndn
II00 IIII’’
cammino otticocammino ottico
bb
Valida per radiazioni monocromaticheValida per radiazioni monocromatiche
- dI’ = KI’dn
dI’ = - KdnI’
ln I = - KNI0
dI’I’
= - K dn∫0
N
∫I0
I
ponendo N = K’bc (c: conc. soluzione)
ln I = - (K · K’)bc = - a’bcI0
I = e-a’bc
I0
T = e-a’bc
passando ai log e ponendo a = a’log e
log T = -abc T = 10-abc
Poiché A = - log T
A = - log 10-abc = abc
A = abcA = abc
N° totalemolecole
Per b Per b == c c == 1 1
A A == a ab cb c
AA1%1%1 cm1 cm
: in F. U. : in F. U. estinzione specificaestinzione specifica di soluzioni 1% p/v e cammino ottico 1 cm di soluzioni 1% p/v e cammino ottico 1 cm
A A == a ( a (assorbivitàassorbività, costante per , costante per costante) costante)
coefficiente di estinzionecoefficiente di estinzione (o (o assorbanza specificaassorbanza specifica))se se bb espresso in cm e espresso in cm e cc in g/L in g/L
coefficiente di estinzione molarecoefficiente di estinzione molare (o (o assorbanza specifica molareassorbanza specifica molare))se se bb espresso in cm e espresso in cm e cc in mol/L in mol/L a a ==
A = abcA = abc
concentrazioneconcentrazione
AA
Deviazioni dalla legge di Lambert-BeerDeviazioni dalla legge di Lambert-Beer
a) a) deviazioni fisichedeviazioni fisiche
- a concentrazioni elevate il soluto può formare dimeri, polimeri o aggregati con il solvente - a concentrazioni elevate il soluto può formare dimeri, polimeri o aggregati con il solvente generando deviazioni positive o negativegenerando deviazioni positive o negative
concentrazioneconcentrazione
AA
- a concentrazioni elevate cambia anche l’indice di rifrazione della soluzione e quindi la - a concentrazioni elevate cambia anche l’indice di rifrazione della soluzione e quindi la della della radiazione che l’attraversa; di conseguenza, l’assorbanza di soluzioni di diversa concentrazione radiazione che l’attraversa; di conseguenza, l’assorbanza di soluzioni di diversa concentrazione viene misurata, di fatto, a viene misurata, di fatto, a diverse con scostamento dalla linearità diverse con scostamento dalla linearità
b) b) deviazioni strumentalideviazioni strumentali
Dipendono essenzialmente dalla monocromaticità della radiazione incidente: Dipendono essenzialmente dalla monocromaticità della radiazione incidente: le deviazioni dalla linearità sono tanto più grandi quanto maggiore è la le deviazioni dalla linearità sono tanto più grandi quanto maggiore è la banda passantebanda passante
Banda passanteBanda passante: : intervallo di radiazioni isolateintervallo di radiazioni isolatedallo strumento e convogliate dallo strumento e convogliate
sulla soluzione in esamesulla soluzione in esame
Skoog, West, Holler, Crouch
c) c) deviazioni chimichedeviazioni chimiche
Più apparenti che reali, sono dovute di solito ad alterazioni dell’equilibrio chimico Più apparenti che reali, sono dovute di solito ad alterazioni dell’equilibrio chimico tra due specietra due specie
maxmax: 372 nm: 372 nm maxmax: 450 nm: 450 nm
Cr2O7 2- + H2OCrO4
2- + 2H+EsempioEsempio:
Se a 372 nm e pH Se a 372 nm e pH == 1, 1,Assorbanza (CrOAssorbanza (CrO44 2-2-) ) == x x
Se a 450 nm e pH Se a 450 nm e pH == 1, 1,Assorbanza (CrAssorbanza (Cr22OO7 7
2-2-) ) == y y
Diluendo successivamente Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10:nel rapporto 1 a 10:
Diluendo successivamente Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10:nel rapporto 1 a 10:
Assorbanza (CrOAssorbanza (CrO44 2-2-) ) > > 1 1 xx
1010
Assorbanza (CrAssorbanza (Cr22OO7 7 2-2-) ) < < 1 1 yy
1010
ANALISI QUANTITATIVAANALISI QUANTITATIVA
Viene effettuata Viene effettuata quasi semprequasi sempre in corrispondenza della in corrispondenza della maxmax in modo che: in modo che:
- aumenti l’intervallo di linearità della legge di Lambert-Beer (- aumenti l’intervallo di linearità della legge di Lambert-Beer (vedi primavedi prima))
- aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti- aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti
A = abcA = abc
Sensibilità = Sensibilità = dAdA = ab = abdCdC
La sensibilità è cioè La sensibilità è cioè al cammino ottico al cammino ottico bb e al coefficiente di estinzione e al coefficiente di estinzione aa
ANALISI IN ASSORBIMENTOANALISI IN ASSORBIMENTO
a) a) Metodo di confrontoMetodo di confronto
Il confronto con soluzioni standard a differente concentrazione è visivo Il confronto con soluzioni standard a differente concentrazione è visivo e limitato alle soluzioni coloratee limitato alle soluzioni colorate
AA11 AA22 AA33 AA44AAxx
Mantenendo il cammino ottico costante, se AMantenendo il cammino ottico costante, se Axx = A = A11ccxx = c = c11
AAxx = A = A11
E’ possibile anche usare una sola soluzione standard E’ possibile anche usare una sola soluzione standard e variare i cammini ottici fino a quando:e variare i cammini ottici fino a quando:
AAxx = A = A11 a ba bxx c cxx == a b a b11 c c11ccxx == b b1 1 cc11
bbxx
b) b) Metodo direttoMetodo diretto
AAx x == a b c a b cxx
Conoscendo il coefficiente di estinzione Conoscendo il coefficiente di estinzione aa (tabulato o calcolato) ed il cammino ottico (tabulato o calcolato) ed il cammino ottico bb, , è possibile risalire alla concentrazione è possibile risalire alla concentrazione ccxx
Questo metodo implica una linearità tra assorbanza e concentrazione Questo metodo implica una linearità tra assorbanza e concentrazione che andrebbe preliminarmente verificatache andrebbe preliminarmente verificata
Conc.Conc.
AA
c) c) Metodo retta di taraturaMetodo retta di taratura
A1
c1
A2
c2
A3
c3
Ax
cx
d) d) Metodo delle aggiunteMetodo delle aggiunte (per matrici complesse) (per matrici complesse)
- aggiunta singola (di analita puro)- aggiunta singola (di analita puro)
xx x x ++ a a
AA
mgmg
xx x x ++ a a00
aa
AA11
00
AAxx
AA
mgmgaa
AA11
2a2a
AA22
3a3a
AA33
xx
00
AAxx
- aggiunte multiple- aggiunte multiple
xx xx ++ aa xx ++ 2a2a xx ++ 3a3a
Spettri in derivata:Spettri in derivata: Ottenuti tracciando la derivata della funzione A / Ottenuti tracciando la derivata della funzione A /
Nella pratica non si va oltre la derivata quarta perché aumenta troppo il Nella pratica non si va oltre la derivata quarta perché aumenta troppo il rumore di fondorumore di fondo
Derivata 1Derivata 1aa
Derivata 2Derivata 2aa
AASpettro UV-VisSpettro UV-Vis
Gli spettri in derivata consentono una migliore Gli spettri in derivata consentono una migliore risoluzionerisoluzione di bande sovrapposte di bande sovrappostenegli spettri normalinegli spettri normali
AA
Spettro UV-VisSpettro UV-Vis
Analita 1Analita 1
Analita 2Analita 2
Derivata 2Derivata 2aa
Analita 2Analita 2
Analita 1Analita 1
AA
AA
ADDITIVITA’ DELLE ASSORBANZEADDITIVITA’ DELLE ASSORBANZE
x
y
x + y
AAtottot = = A Ai i = = a aii b c b cii
Nel caso di due sostanze:Nel caso di due sostanze:
11 AA11 = A = A11x x + + AA1 1
yy = a = a11x x b cb cxx + a + a11
y y b cb cyy
22 AA22 = A = A22x x + + AA2 2
yy = a = a22x x b cb cxx + a + a22
y y b cb cyy
2211
A
Punto isosbestico:Punto isosbestico: punto di intersezione degli spettri di assorbimento di specie in equilibriopunto di intersezione degli spettri di assorbimento di specie in equilibrio
Es.: HA H+ + A-
pH: 3.0pH: 3.0
pH: 4.0pH: 4.0
pH: 5.0pH: 5.0
pH: 6.0pH: 6.0
pH: 7.0pH: 7.0
AAisis == aaisis b [HA] b [HA] ++ aaisis b [A b [A- - ]] = = aaisis b ( [HA] b ( [HA] ++ [A[A- - ])]) = = aaisis b c b ctottot
Operazioni di taraturaOperazioni di taratura
TRASMITTANZATRASMITTANZA
ASSORBANZAASSORBANZA
0%0%
corpo opacocorpo opaco
100%100%
biancobianco
campionecampioneanaliticoanalitico
azzeramentoazzeramento
operazione dioperazione di
biancobianco
soluzione identica al soluzione identica al campione analitico,campione analitico,
ma priva dell’analitama priva dell’analita
Limiti di trasparenza (Limiti di trasparenza (cut offcut off))di alcuni solventi: di alcuni solventi:
Acqua 180 -195 nm Metanolo 200 -210 nmAcqua 180 -195 nm Metanolo 200 -210 nm Cloroformio 250 -260 nm Benzene 280 -290 nmCloroformio 250 -260 nm Benzene 280 -290 nm
Errore fotometricoErrore fotometrico
Valori ottimali di trasmittanza: 20 - 60%Valori ottimali di trasmittanza: 20 - 60% Assorbanza: 0.2 - 0.7Assorbanza: 0.2 - 0.7
00 2020 4040 6060 8080 100100
± 1.0± 1.0
± 2.0± 2.0
± 3.0± 3.0
± 5.0± 5.0
± 4.0± 4.0
Trasmittanza %Trasmittanza %
Errore %Errore %relativorelativo
Combinazione lineare di orbitali atomici a formare orbitali molecolari (LCAO)Combinazione lineare di orbitali atomici a formare orbitali molecolari (LCAO)
EENNEERRGGIIAA
Assorbimento molecolare di una radiazioneAssorbimento molecolare di una radiazione
Per una molecola:Per una molecola:
EEtottot = E = E nuclearenucleare + E + E elettronicaelettronica + E + E vibrazionalevibrazionale + E + E rotazionalerotazionale + E + E traslazionaletraslazionale
Assorbimento radiazioni dell’UV e del visibile Assorbimento radiazioni dell’UV e del visibile transizioni elettronichetransizioni elettroniche
Orbitale molecolareOrbitale molecolareantileganteantilegante
OrbitaleOrbitale
atomicoatomico
OrbitaleOrbitale
atomicoatomico
Orbitale molecolareOrbitale molecolarelegantelegante
Diagramma dei livelli energetici degli orbitali molecolariDiagramma dei livelli energetici degli orbitali molecolari
EENNEERRGGIIAA
nn non legantenon legante
**
antilegantiantileganti}
legantileganti}
Scarso interesse analitico: Scarso interesse analitico: assorbimenti nell’UV lontanoassorbimenti nell’UV lontano
Es. di Es. di maxmax per per **CHCH44: 125 nm ; C: 125 nm ; C22HH55: 135 nm: 135 nm
Es. di Es. di maxmax per n per n **HH22O: 167 nm ; CHO: 167 nm ; CH33OH: 185 nmOH: 185 nm
Limitato interesse analitico; assorbimento nell’UV vicino, ma con bassi valori di Limitato interesse analitico; assorbimento nell’UV vicino, ma con bassi valori di assorbività (assorbività ( ≤ 10 ≤ 1022, , transizioni proibitetransizioni proibite dalle cosiddette regole di selezione quanto- dalle cosiddette regole di selezione quanto-meccaniche)meccaniche) EsempioEsempio: acetone, : acetone, maxmax (esano) 279 nm, (esano) 279 nm, ~ 20 ~ 20
Transizioni elettroniche Transizioni elettroniche **Collocazione variabile:Collocazione variabile: ~ 160-230 nm (sistemi~ 160-230 nm (sistemiisolati, isolati, transizioni E o etilenichetransizioni E o etileniche) ) ~ 250-280 nm (anelli benzenici, ~ 250-280 nm (anelli benzenici, transizioni B o benzenoiditransizioni B o benzenoidi) ) ~ 220-750 nm (sistemi aromatici e/o coniugati, ~ 220-750 nm (sistemi aromatici e/o coniugati, transizioni K o di coniugazionetransizioni K o di coniugazione))
max (cloroformio): 466, 497 nm
-carotene
Transizioni elettroniche n Transizioni elettroniche n ** (R o radicaliche come quelle n n *)*)
{
{E0
E1
Possibili transizioni tra due livelli Possibili transizioni tra due livelli elettronici con sottolivelli elettronici con sottolivelli vibrazionali e rotazionalivibrazionali e rotazionali
VaporeVaporeVaporeVapore
SoluzioneSoluzionedi esanodi esano
SoluzioneSoluzionedi esanodi esano
SoluzioneSoluzioneacquosaacquosa
SoluzioneSoluzioneacquosaacquosa
Lunghezza d’onda, Lunghezza d’onda, nmnmLunghezza d’onda, Lunghezza d’onda, nmnm
Ass
orb
anza
Ass
orb
anza
Ass
orb
anza
Ass
orb
anza
[Skoog-West-Holler][Skoog-West-Holler]
Spettro di assorbimento Spettro di assorbimento della 1,2,4,5-tetrazina in della 1,2,4,5-tetrazina in
tre diverse condizionitre diverse condizioni
Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche sono legati più debolmente
e sono perciò più facilmente eccitabili
CROMOFORI Gruppi funzionali insaturi le cui transizioni elettroniche danno luogo ad assorbimento nel visibile e nel vicino UV
Cromofori più comuni:
C C C C C N C O C S
N N N O Sistemi aromatici in genere
Ogni cromoforo ha di massimo assorbimento (max) e coefficienti di estinzione caratteristici che variano però in funzione del
solvente e della struttura molecolare complessiva
Cromoforo Transizione max
C = O * 180 9000
n * 200 --
n * 280 20
Possibilitransizioni
per uncarbonile
Fattori che influenzano il valore di
- Probabilità della transizione elettronica > 104 probabilità elevata < 103 probabilità bassa
- Variazione del momento dipolare legato alla transizioneL’assorbimento è tanto più intenso quanto maggiore la separazione di carica nello stato eccitato
- Natura del solvente
- Tipo di sostituentiInfluenzano sia la probabilità di transizione che la variazione del momento dipolare
Effetto ipercromico: aumento del valore di Effetto ipocromico: diminuzione del valore di
Effetto ipsocromico (blue shift): opposto al precedente e causato dal solventeo da interruzione della coniugazione con un gruppo cromoforo o auxocromico
Fattori che influenzano il valore di max
Effetto batocromico (red shift): spostamento della max verso valori più alti (frequenza ed energia più basse)
Possibili cause
-solvente: importante la polarità
coniugazione con altri cromofori
-sostituenti iperconiugazione
coniugazione con auxocromi
Auxocromi: gruppi funzionali saturi con doppietti elettronici di non legame; la coniugazione con un cromoforo comporta generalmente un aumento sia di max che di
Effetti sulla transizione * dell’iperconiugazione e della coniugazione con auxocromi
cromoforo lmax eCH2 = CH2 162 10.000
CH2 = CH – CH3 168 10.000
CH3 – CH = CH – CH3 177 11.000
CH3 – CH = C – (CH3)2 187 12.000
(CH3)2 – C = C – (CH3)2 196 12.400
Cl – CH = CH – Cl 193 11.000
Cromofori multipliSe non coniugati: sono additivi- max costante
CH3CH2CH2CH=CH2 max= 184 max = ~10,000
CH2=CHCH2CH2CH=CH2 max=185 max = ~20,000
Se coniugati:- effetto batocromico- effetto ipercromico
H2C=CH-CH=CH2 max=217 max = ~21,000
energia
N° doppi legami
-carotene(: 100.000)
450 nm
Etilene: 10.000)
162 nm
Butadiene( 21.000)
217 nm
Esatriene ( 25.000)
258 nm
Distribuzione degli orbitali in dieni coniugati
Sistemi aromatici Si possono considerare sistemi polienici coniugati; sono caratteristici sia il comportamento chimico che spettroscopico
max: 184 nm ( = 60.000) e 204 nm ( = 7.900) (bande etileniche E1 e E2)
max: 256 nm ( = 200) (banda benzenoide B a struttura fine)
Solo la prima (E1) non è “proibita” ed è infatti la più intensa benzene
Effetto del pH sull’assorbimento È legato alla presenza di gruppi funzionali ionizzabili
Esempi:
Assorbimento nei composti inorganici
Transizioni elettroniche nei metalli di transizione (orbitali d)
Caso classico: ioni complessi a struttura ottaedrica
Co(NH3)62+ Co(H2O)6
2+
Teoria del campo cristallino
Energia
Orbitali d
(nessun legante)
0
Di solito 0 è piccolo per cui la transizione avviene per assorbimento
nella regione del visibile(soluzioni colorate)
(complesso ottaedrico)Orbitali d
Transizioni per trasferimento di carica
- Transizione intramolecolare: tipica dei composti di coordinazione, ma anche di ioni quali MnO4
-, CrO42-….; di solito consiste nel trasferimento di un elettrone dal
legante al metallo
Esempio 1: FeSCN2+
Fe3+ -------- -SCN Fe2+ -------- SCN.h
Più raramente è lo ione metallico a cedere un elettrone al legante
Esempio 2: ferroina:
h
- Transizione intermolecolare: tipico esempio è quello del complesso I2-benzene in cui un elettrone oscilla tra la nuvola del benzene ed un orbitale vuoto di I2
Un altro esempio classico è quello del complesso I2-amido in cui un elettrone oscilla tra la la molecola di I2e quella di amido che l’avvolge a spirale
+ I2
SoluzioneMarrone scuro
Amido + I2Soluzione
blu
h
h
COLORIMETRIA E SPETTROFOTOMETRIA UV
La colorimetria è limitata alla regione del visibile ed utilizza colorimetri fotoelettrici
La spettrofotometria UV è più affidabile, più versatile ed utilizza spettrofotometri
Caratteristiche principali:- campo di indagine esteso dal vicino UV (~ 200 nm) al vicino IR (~ 1000 nm)- condizioni di quasi monocromaticità delle radiazioni utilizzate- continuità con cui può essere variata la lunghezza d’onda della radiazione
Componenti di colorimetri fotoelettrici e spettrofotometri
Selezionatore di lunghezza d’onda
Sorgenteradiante
Cella Rivelatore
Sorgenti radianti
Emettono radiazioni policromatiche contenenti cioè le lunghezze d’onda della regione richiesta
Le sorgenti possono essere continue (a) o a righe (b)
Skoog, West, Holler, Crouch
(nm)
3400 K
2200 K
2600 K
3000 KIntensità relativa
Emissione luminosa diun corpo incandescente
Regione del visibile- lampade a filamento di tungsteno (bulbo in vetro)• temperatura di esercizio ~ 3000 K• intervallo utile di ~ 2200 ÷ ~ 350 nm
- lampade a tungsteno/alogeno (bulbo in quarzo)• temperatura di esercizio ~ 3500 K• intervallo utile di ~ 2500 ÷ ~ 240 nm• vita media doppia rispetto alla precedente
Wsublimato + I2 WI2 (gas)
W + I2
filamento caldo
si rideposita sul filamento
Regione dell’UV- lampade a scarica elettrica in vapori di deuterio (bulbo in quarzo)• intervallo utile di ~ 380 ÷ ~ 160 nm• meccanismo di emissione legato all’eccitazione di D2:
ED2* = ED’ + ED’’ + h
ED’ e ED’’ : energie cinetiche dei due atomi di deuterio
ED’ + ED’’ può variare in modo continuo tra 0 e ED2*, quindi anche h può farlo: il risultato è uno spettro di emissione continuo
D2 D2* D’ + D” + h
Scarica elettrica
Fotonedi luce
- lampade a scarica elettrica in vapori di mercurio (bulbo in quarzo)• spettro di emissione a righe (UV e visibile)• usi analitici particolari soprattutto nella regione dell’UV
Gli spettrofotometri hanno quindi al loro interno due diverse lampade, una per il visibile e l’altra per l’UV opportunamente intercambiate. Nei modelli più recenti
un’unica lampada allo xenon copre tutto lo spettro (~ 200 ÷ ~ 1100 nm)
Selezionatori di lunghezze d’ondaHanno la funzione di scomporre la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche. Sono di due tipi: filtri e monocromatori.
La caratteristica principale, in entrambi i casi, è l’ampiezza della banda passante:intervallo di radiazioni che emerge dal selezionatore con un’energia almeno pari al 50% di quella della radiazione nominale
Lunghezza d’onda
lunghezza d’onda nominale
Skoog, West, Holler, Crouch
FiltriUsati nei colorimetri fotoelettrici
Filtri di assorbimento:• ampiezza di banda 30 ÷ 250 nm• trasmittanza 5 ÷ 30%• uso nel visibile (vetro)
Filtri a interferenza:• ampiezza di banda 5 ÷ 20 nm• trasmittanza 50 ÷ 60%• uso nel visibile e UV• costo più elevato
MonocromatoriConsentono di selezionare con continuità le radiazioni di qualsiasi lunghezza d’onda
Monocromatore a prisma
Quando una radiazione luminosa attraversa la superficie di separazione di due mezzi trasparenti, il raggio rifratto si piega verso la normale alla superficie se il secondo mezzo
è più denso del primo. L’angolo di rifrazione r è funzione della della radiazione.
n1 : indice di rifrazione dell’arian2 : indice di rifrazione del prismai : angolo di incidenzar : angolo di rifrazione
Schema ottico di un monocromatore a prisma
fenditura diingresso
lente collimatrice
prisma
lentefocalizzatrice
fenditura diuscita
1
2
Ssorgente
50
Scomposizione spettrale operata da tre diversi tipi di monocromatori
N.B. : nel visibile, il prisma di vetro è preferibile a quello di quarzo (maggiore dispersione)!
assorbimento
400 500 600 700200 nm
prisma divetro
200 nm 300 350 400 500 700
prisma diquarzo
400200 nm 300 500 600 700
monocromatorea reticolo
Sorgenteradiante
Sorgenteradiante
Sorgenteradiante
Immagine di una fenditura di larghezza variabile su uno schermo illuminato con luce monocromatica
Fenomeno della diffrazione
Interferenza costruttiva e distruttiva di una radiazione monocromatica
intensità
tempo
Onde in concordanza di fase Onde in opposizione di fase
A
A
2A
m
Monocromatori a reticolo di diffrazioneSono di due tipi: reticoli di trasmissione e reticoli di riflessione
Reticoli di trasmissioneCostituiti da sottilissime fenditure (600 ÷ 2000/mm) incise su una superficie rivestita di alluminio. Ampiezza delle fenditure e distanza sono dello stesso ordine di grandezza delle radiazioni incidenti.
Comportamento delle radiazioniin un reticolo di trasmissione
a
m = passo del reticoloa = m sen
Le radiazioni si sommano solo se:m sen
(K = 0, 1, 2, 3…..)
http://www.youtube.com/watch?v=9UkkKM1IkKg&feature=related
Diffrazione di luce policromatica
Sorgenteradiante
frangia di ordine zero:luce biancaSpettro del 1° ordine
Ovviamente nello spettro del 1° ordine, come di quelli successivi, sono da includere anche le radiazioni appartenenti a regioni diverse dal visibile!
Dispersione di luce bianca attraverso un reticolo di trasmissione
Gli spettri dei vari ordini sono tutti lineari in funzione della lunghezza d’onda,cioè la dispersione è costante in tutte le zone dello spettro!
Cozzi, Protti, Ruaro
Reticoli di riflessioneCostituiti da una serie di solchi (100 ÷ 2000/mm) tracciati sopra una superficie riflettente, piana o concava.
I reticoli più comuni sono quelli a gradini:
In questo caso, sono i raggi riflessi a dar luogo ai fenomeni di interferenza costruttiva o
distruttiva del tutto simili a quelli ottenuti con i reticoli di trasmissione
Esempio di diffrazione osservabile guardando con luce radente un comune compact disc!
Cellette di assorbimento (cuvette)Hanno la funzione di contenere la soluzione in esame e quella del riferimento
Hanno volume variabile e spessore (cammino ottico) che può variare da pochi mm ad alcuni cm (di solito 1 cm)
Cuvette in vetro o materiale plastico (polistirene, metacrilato)
visibile
Cuvette in quarzoUV, visibile
RivelatoriSono trasduttori che convertono l’energia radiante in corrente elettrica misurabile con
un galvanometro. La corrente elettrica che si genera è direttamente proporzionaleall’intensità della radiazione luminosa.
Relazione di Einstein per l’effetto fotoelettrico:
h = E0 + ½ mv2
energiafotone
potenziale ionizzazionedel metallo
Energia cinetica
dell’elettrone
Fototubi e fotomoltiplicatoriIl loro funzionamento si basa sull’effetto fotoelettrico
Fototubi
Il catodo è ricoperto da uno strato di materiale fotoemissivo (generalmente cesio)
Skoog, West, Holler, Crouch
Involucro di vetro o quarzo sotto
vuoto
Catodo
Anodo a filamento
Fascio di fotoni
elettroni
90 V
Amplificatoree misuratore
FotomoltiplicatoriSimili ai fototubi ma molto più sensibili. Si basano sul fenomeno dell’emissione secondaria.
Producono correnti 105 ÷ 107 volte più intense di quelle di un fototubo per cui possono essereusati solo per misure di bassi valori di intensità luminosa!
Skoog, West, Holler, Crouch
Griglia
Radiazione
Catodo fotoemissivo
Dinodi D1-D9
Numerosi elettroniper ogni fotone
Numerosi elettroniper ogni elettrone
Involucrodi quarzo
Anodo
Sezione trasversale
Dinodi
CatodoAnodo
90 V
900 V
Involucrodi quarzo
Amplificatore
Lettura
Rivelatori a serie di fotodiodi (DAD)
Fotodiodo: dispositivo costituito da una giunzione tra un semiconduttore di tipo p ed uno di tipo n
Semiconduttore: materiale la cui conducibilità elettrica è intermedia tra quella di un conduttore(metallo) e quella di un isolante
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Esempio: silicio cristallino
La conducibilità elettrica è legata all’eccitazione termica di un elettrone (di conduzione)che lascia una lacuna positiva anch’essa mobile come l’elettrone
Semiconduttore di tipo n: semiconduttore drogato con eccesso di elettroni di conduzione
Skoog, West, Holler, Crouch
Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del V gruppo (As)
Semiconduttore di tipo p: semiconduttore drogato con eccesso di lacune elettroniche
Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del III gruppo (Ga)
Skoog, West, Holler, Crouch
Schema di un fotodiodo al silicio
Giunzione pnContattometallico Buca
Elettrone
ConduttoreRegione p Regione n
Regione p Regione n
Polarizzazione diretta Polarizzazione inversa
Regione p Regione n
Strato dideplezione
Le condizioni di polarizzazione inversa sono quelle utilizzate nei rivelatori DAD
Schema ottico di uno spettrofotometro con rivelatore DAD
Acquisizione dello spettro in tempo reale! La sensibilità del DAD è intermedia tra quella di un fototubo e quella di un fotomoltiplicatore.
Skoog, West, Holler, Crouch
Sorgente
Otturatore
Specchio
Cella
Specchio
Reticolo di diffrazione
Fenditura
Serie difotodiodi
Schema ottico di spettrofotometro a raggio singolo
Sorgente hMonocromatore
Schermo
Cuvetta diriferimento
Cuvetta delcampione
Rivelatore
Amplificatore
Lettore
I0
Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nello spazio
Skoog, West, Holler, Crouch
Sorgente
Monocromatore
Schermo
Cuvetta diriferimento
I
I0
Cuvetta delcampione
Rivelatore 1
Rivelatore2
Amplificatoredifferenziale
Lettore
Beamsplitter
Specchio
h
Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nel tempo
Skoog, West, Holler, Crouch
Sorgente
hMonocromatore
Cuvetta diriferimento
Cuvetta delcampione
Specchio
Trasparente
Specchioa settori
Motore
Vista frontale
Specchio
Cuneoottico
Specchioa settori Rivelatore
Amplificatore
Lettore
I
I0
Titolazioni spettrofotometricheSi misura l’assorbanza di una soluzione ad una lunghezza d’onda opportuna dopo l’aggiunta di incrementi noti di titolante.
A A A
V V V
A + B C
A = C = 0B > 0
B = C = 0A > 0 A = B = 0
C > 00
Celletta per titolazioni spettrofotometriche
agitatore foro perburetta
finestre diquarzo
A
V
0
A A
V V
A = 0B > C > 0
C = 0A > B > 0
A = 0C > B > 0
Per ridurre l’effetto della diluizione, si impiegano soluzioni concentrate di titolante osi correggono i dati sperimentali:
Assorbanza corretta = Assorbanza osservata Volume totale Volume iniziale
Analisi quantitativa in assorbimento
La spettrofotometria di assorbimento nel visibile e nell’UV è una delle tecniche di piùampio utilizzo nell’analisi quantitativa strumentale.
Caratteristiche salienti:
• Ampia applicabilità
• Alta sensibilità (fino a 10-7 M)
• Selettività da moderata ad alta
• Buona accuratezza
• Facilità e convenienza
Saggi immunologici: si basano sull’uso di anticorpi specifici per l’analita (proteina)
SAGGIO IMMUNO-ENZIMATICO ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
L’enzima può trasformare, ad es., un reagente incolore in prodotto colorato (dosaggio colorimetrico) oppure un reagente non fluorescente in prodotto fluorescente (dosaggio fluorimetrico).La quantità di prodotto colorato o fluorescente ottenuto è proporzionale alla concentrazione di analita.
Esempio di applicazione della spettrofotometria in campo biologico
FLUORIMETRIAFLUORIMETRIAE’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza.E’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza.
Fluorescenza: processo nel quale gli atomi o le molecole, eccitate mediante assorbimento di radiazioni elettromagnetiche, rilassano allo stato fondamentale cedendo l’eccesso di
energia come fotoni.
L’emissione di radiazioni fluorescenti avviene a lunghezze
d’onda maggiori (frequenza
ed energia minori) rispetto alle radiazioni assorbite (spostamento
o shift di Stokes)
Skoog, West, Holler, Crouch
La fluorescenza è possibile solo in presenza di cromofori con particolare distribuzione dei livelli energetici (fluorofori). Le transizioni elettroniche coinvolte sono sempre le stesse:
* n *
Molti composti fluorescenti contengono anelli aromatici specie se condensati. La fluorescenza è inoltreparticolarmente favorita in molecole rigide. Ad esempio:
H
H
HH
Trans-stilbene(fluorescente)
Cis-stilbene(non fluorescente)
O
O
O
OHHO
O
O
OHHO
Fluoresceina(fluorescente)
Fenolftaleina(non fluorescente)
La fosforescenza è un fenomeno simile alla fluorescenza. Per capirne la differenza occorreprendere in considerazione gli stati di singoletto e tripletto:
Nello stato fondamentale le molecole sono generalmente nello stato di singoletto (spin elettronici appaiati). Nello stato eccitato possono assumere invece
sia lo stato di singoletto che di tripletto (coppia di spin elettronici spaiati).
Fluorescenza
singoletto eccitato singoletto fondamentale Transizione probabile e rapida (< 10-5 sec)
Fosforescenza
tripletto eccitato singoletto fondamentale Transizione poco probabile e più lenta (> 10-3 sec)
Skoog, West, Holler, Crouch
Analisi fluorimetrica
Spettri di eccitazione:
Eccitazione a variabile
Misurazione intensità di fluorescenzaa fissa (di solito max)
In teoria, spettri di assorbimento e di eccitazione dovrebbero coincidere
Spettri di emissione:
Eccitazione a fissa (di solito max)
Misurazione intensità di fluorescenzaa variabile
In genere, spettri di emissione e di eccitazione appaiono come immagini speculari l’uno dell’altro
Skoog, West, Holler, Crouch
Esempio: spettro di eccitazione (a) e spettro di emissione (b) dell’antracene in etanolo
antracene
statofondamentale
statoeccitato
statofondamentale
statoeccitato
Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza
E’ possibile dimostrare che:
If = S F I0 (1 – 10 –abc)
If = intensità radiazione fluorescente
I0 = intensità radiazione di eccitazione
a = coefficiente di estinzione alla di eccitazione
b = spessore della soluzione (cammino ottico)
c = concentrazione della soluzione
S = costante di proporzionalità (≤ 1) legata all’efficienza quantica del campione (rapportotra fotoni emessi e fotoni assorbiti)
F = costante di proporzionalità (≤ 1) legata alla resa strumentale (rapporto tra fotoni misurati e fotoni emessi)
Fattori che determinano la non linearità tra If e concentrazione:
• diminuzione di I0 nell’attraversamento della soluzione
• differente assorbimento della stessa radiazione fluorescente in funzione del cammino ottico percorso
Solo per soluzioni molto diluite si ha con buona approssimazione:
If = SFI0 abc If = K c
If = S F I0 (1 – 10 –abc)
concentrazione
SFI0If
Skoog, West, Holler, Crouch
Autospegnimento (self-quenching)Una molecola di analita assorbe energia da un’altra molecola di analita eccitata con trasferimento di energia non radiante che alla fine viene dissipata sotto forma di calore. Aumenta con la concentrazione.
AutoassorbimentoSi verifica quando la di emissione si sovrappone ad una banda di assorbimento. Aumenta anch’essacon la concentrazione.
Nell’analisi quantitativa occorre assicurarsi dell’assenza di quenching!
Processi di spegnimento (quenching)
Processi nei quali l’emissione da parte di una molecola eccitata diminuisce in intensità a causa deltrasferimento di energia ad un’altra molecola (spegnitore o quencher). Lo spegnitore eccitato può quindidissipare la sua energia attraverso altri processi.
Un esempio tipico di quencher è rappresentato da O2 :
M* + O2 M + O2*molecola allostato eccitato tripletto
fondamentale
singolettoeccitato
molecola allostato fondamentale
Fluorimetri e spettrofluorimetriLa differenza sta nel selezionatore di radiazioni elettromagnetiche: filtri per i fluorimetri,reticoli di diffrazione per gli spettrofluorimetri.
Sorgenti radiantiDevono produrre radiazioni di elevata energia (l’intensità di fluorescenza, come già visto, è funzione dell’intensità di eccitazione) concentrata nell’UV: lampade a vapori di Hg o lampade allo xenon.
Selezionatori di Sono normalmente due (filtri o reticoli), uno per il lato di eccitazione e l’altro per quellodi emissione.
RivelatoriE’ indispensabile l’impiego di fotomoltiplicatori a causa dei bassi livelli di energia tipici dell’emissione fluorescente.
L’emissione fluorescente è prelevata di solito a 90° rispetto al raggio incidente. Vantaggi:• rivelazione della sola radiazione di fluorescenza (e non eventualmente di quella di eccitazione)• maggiore intensità di fluorescenza emessa dai primi strati della soluzione del campione
Schema ottico di uno spettrofluorimetro
Skoog, West, Holler, Crouch
Applicazioni della fluorimetriaPur se di uso meno esteso rispetto alla spettrofotometria, la fluorimetria può essere applicata a numerosi composti sia organici che inorganici. Per questi ultimi si ricorre ad agenti complessanti come ad esempio:
Skoog, West, Holler, Crouch
Vantaggi dell’analisi fluorimetrica:
• selettività potenzialmente superiore alla spettrofotometria
• sensibilità superiore alla spettrofotometria ottenuta aumentando la potenza I0 delle radiazioni di eccitazione (limite di rivelabilità 10-8 - 10-9 M)
If = S F I0 (1 – 10 –abc) mentre A = abc = - log T = - log I0/I