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Les échantillons biologiques sont de taille variée
L'infiniment petit
1 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15
homme fourmi cellule moléculeprotéine
atome noyau de l'atome
Les outils d'observation
L'œil microscope rayonnement synchrotronrayons X
collisionneur de particulesCERN
Pus on veut voir petit, plus l'instrument est grand
Système à étudiere.g. solution aqueuse,
cristal
‘Sonde’e.g. faisceau de lumière
Signaux ‘émis’ parle système sous l’effet
de la ‘sonde’e.g. Transmission
Diffusion à ‘grands’ angles
Contiennent de l’informationsur les caractéristiques du
système
Principe :Soumettre le système à une excitation
et étudier ses réactions
Rayons IR : Spectro Infra rouge
Champ radiofréquence+ champ magnétique : RMN
Ionisation +champs E et B : spectro de masse
Lumière polarise: dichroïsme circulaire
Rayons X : diffraction XNeutrons, électrons
La lumière: onde électromagnétique
une oscillation couplée du champ électrique et du champ magnétique qui se propage
Le champs électrique E et le champs magnétique H sont perpendiculaires
Dans le vide la lumière se propage à la vitesse C= 300 000 km/s
Une onde est caractérisée par sa fréquence (période T=1/ )
L’énergieE=hh cste de Plank: 6.62 10-34 js)
Sa longueur d’onde=C.T=C/
L’amplitude et la direction (polarisation) du champs électrique
Absorption de la lumière
La matière n'absorbe la lumière que si la lumière a une énergie égale à une transition électronique.
Ei
EF
hEF-EI
E
Ei
EF
Cette transition est très rapide 10-15s
h
EI EF
hEF-EI
Extraction des électrons des couches électroniques de l'atome
Cela demande une grande énergie rayons X
Absorption des rayons X
L'absorption des rayons X est proportionnelle au nombre d'électron. Plus la longueur d'onde est petite, moins les rayons X sont absorbés (loin des seuils).C'est pour cella que les rayons X sont "transparent"
les éléments sont lourds (Z) sont plus absorbésEx Os (Ca, P), Pb
Les tissus (C,O,N) sont transparents
A=k Z3 3
En dehors des seuils
Application radiographie
L'absorption: la loi de Berr-Lambert
L'absorption de la lumière est dépendante de: -la longueur d'onde (transition électronique)- de la nature chromophore -la concentration (ou densité), C-la longueur du chemin optique parcouru dx
Io It
.C.L ε(λ)-IoeIt
Cste.C.L)()ln(
.C.dx)(I
dI
.C.dx.I ε(λ)- dI
I
L
La perte d'intensité pour un petit élément d'épaisseur dx
.C.L ε(λ)-IoeIt L'intensité transmise décroit de façon exponentiel en fonction de la largeur de la cuve et de la concentration. C'est la loi de Beer-Lambert
On intègre sur l'épaisseur L
On note le rapport .C.L ε(λ)-eIo
It la transmitance (souvent exprimée en %)
La Densité optique (D.O) ou l'aborsbance A est
.C.L ε(λ))It
Ilog()log( 0 TDOA
Plus la densité optique est forte plus la solution absorbe
Si une solution absorbe une couleur (longueur d'onde), la solution apparaitra avec sa couleur complémentaire.
Un solution qui absorbe le bleu apparaitra orange te vice versa
La couleur
Le spectrophotomètre UV-Visible
C'est un des appareil les plus utilisé en laboratoire
principe
Source polychromatique.Lampe à incandescence visible
Lampe à Xénon (UV)
MonochromateurPermet de
sélectionner la longueur d'onde
Cuve de référence
IO
Tampon +
échantillon
It
Le monochromateur est constitué soit d'un prisme soit d'un réseau
Le prisme permet de disperser la lumière selon sa longueur d'onde
La cuve est souvent standard avec une largeur de 1 cmLe coefficient d'extinction molaire []=mol-1. cm-1
Avec un réseau
On trouve des cuves de différent volume de 50l à 1ml.Elle peuvent être en plastique, en verre et en quartz.
Il faut utiliser les cuves en quartz pour les mesure dans l'UV
A la fin on représente A=log(IO/It) en fonction de la longueur d'onde
Ou bien l'absorption à une longueur d'onde (en fonction du temps)
Ex absorption à 340 nm pour suivre la formation du NADHA
t
- Méthode simple- Précise- sensible- Nécessite peu de matériel (50 l)- Non destructive
Spectrophotomètre Avantages:
L'absorption dans l'UV-Visible
l'absorption UV-Visible implique de transition de niveau électronique de valence
La liaisons chimique implique le partage d'électron à des niveaux énergétique plus bas
E=h
liaison
Ex H2
H
1S 1S
H
H2
liante
anti liante
Ex He21 liaison liante
1 liaison antiliantePas de liaison
Effectivement la gaz rare ne font pas liaisons
Les autres orbitales de valence
Orbital
Ex O2
8 électrons liants4 électrons antiliants=>2 liaisons(reste 2 doublets non liant sur chaque atome)
C'est à cause des électrons non appariés que le dioxygène est si réactif.Combustion, oxydation des aliments, respiration,…
2S
Px Py Pz
2S
Px Py Pz
x
n
Orbital Doublet non liant
n n n
O OS
n
n
nn
simplification
Résumé des transitions possible dans les couches de valence
La plupart du temps ces transitions seront responsables de l'absorption de la lumière dans la gamme de l'ultraviolet.
C'est la raison pour laquelle les UV sont capables de casser les liaisons chimiques, de former des radicaux libre
En biologie on s'intéresse principalement au transition * (Intense et UV-visible)
En pratique on s'intéresse à la gamme 200nm-800nm
Les systèmes conjugués
Lorsque les orbitales sont alignées, les électrons peuvent se déplacer d'une orbitale à l'autre. Les électrons sont délocalisés.
Ex benzene
Dans ce cas, il y a un effet stabilisateurs. L'énergie des orbitales baisse et le gape avec l'orbitale * non liante diminue. Plus le système est conjugué plus cette effet est marqué
d
d Plus le système est conjugué plus la longueur d'onde d'absorption sera grande.Grâce à cette propriété les chromophores peuvent absorber jusqu'au visible
d
d
Les indicateurs colorés de pH.
Les indicateurs colorés sont des systèmes conjugués qui absorbent dans le visible.Le changement de pH change la conjugaisons du système. Les longueurs d'onde absorbées ne sont plus les même, le système change de couleurs
Ex phénolphtaléine
Devient rose déprotonés à pH basique (>10)
certains pigments de fleurs: anthocyanidines
On retrouve ces pigments dans les fraise, le raisin, les mures,…
Ex de chromophore biologique
La liaison peptidique
C C
O
N
C
H
C C
O-
N
C
H
Absorption UV à 190nm
C C.
O.
N
C
H
C C.
O-
.N
C
Transition *
Certains acides aminés
Trp, Phe, tyr sont des systèmes conjuguès
L'absorption UV à 280 nM permet aussi de suivre les protéines (qui sont transparentes à l'œil) par exemple lors d'une purification
L'absorption UV à 280 nM permet de déterminer la concentration de protéine. L'absorption est proportionnel à la concentration
Loi de Beer Lambert : A= l CIl faut connaître son coefficient d'extinction molaire (expérimentale ou théorique à partir de la séquence).
Les bases d'ADN ou d'ARN
Adénine Guanine Thymine cytosine
A cause de leurs systèmes de conjugaisons, ces bases absorbe dans l'UV.L'ADN et L'ARN absorbe à 260nm (280 nM pour les protéine)
L'absorption UV à 260 nM permet aussi de suivre les l'ADN ou l'ARN
Dimère de thymine
Sous l'effet deradiations non-ionisantes (UV solaires ...), la thymine (tout comme la cytosine) peut former un dimère covalent. Un dimère consiste en deux bases adjacentes qui, sur le même brin d'ADN, font une double liaison. Une double liaison covalente empêche l'ADN polymérase d'effectuer la réplication de la cellule. Généralement la mort cellulaire ou le cancer s'en suivent lorsque non réparées par les enzymes. Le Xeroderma pigmentosum est notamment causée par ce dérèglement génétique. Cette liaison atypique entre les bases est réparé par le système NER (nucleotide excision repair).
Certain cofacteurs
Le carotène
Le système est fortement conjugué, le carotène absorbe le bleu. Par conséquent il apparait orange.
Astaxanthine
La crustacyanine est une protéine qu'on retrouve dans la carapace des crustacés.2 monomères type tonneaux (Lipocaline). Elle fixe astaxanthine qui est responsable de la coloration des homards
La protéine fixe un pigment l'astaxanthineQui est très conjugué. il absorbe le bleu d’où la couleur rouge
Quand on chauffe le homard, il change de couleur
C'est à cause de la dénaturation de la crustacyanine.
Dans la protéine native, le pigment est courbé.L'environnent du pigment lié (liaisons hydrogène) sera différent du pigment libre.Il absorbe le rouge d’où la couleur bleu
Dans la protéine dénaturé, le pigment retrouvera une géométrie et un environnement similaire au pigment libre.Il absorbera dans le bleu, d’où la couleur rouge1GKA
Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) est un coenzyme d'oxydoréduction
Le NAD est capable de fixer 2 électron et un proton, soit un ion hydrure H-
En fixant l'électron et le proton la résonance du cycle. On change donc les longueur d'absorption
En suivant l'absorbance à 340 nm, on pourra suivre l'évolution de la réaction enzymatique. Formation de NADH (réduction) ou disparition de NAD+ (Oxydation)
1 monomère d'alcool déshydrogénase.On voit le cofacteur fixe par le sandwich triple avec la topologie "Rossman fold"
Dans le foie cette enzyme catalyse l'oxydation de l'alcool en aldéhyde
CH3CH2
OH
CH3CH
O
+ NAD+ + NADH + H+
Le jeunes filles expriment moins d'alcool dehydrogenase que les jeunes hommes et sont par conséquent plus sensible à l'alcool
Les asiatiques ont une d'alcool dehydrogenase moins performante que les européen et sont par conséquent plus sensible à l'alcool
1HSO
CH3CH2
OH
CH3CH
O
+ NAD+ + NADH + H+
L'absorbation à 340 nm permet de suivre la réaction au cours du temps, cinétique enzymatique
Phase préstationnaire
[P]
Phase stationnaire
Effet du produit
équilibre
t
Vitesse initiale
Autres cofacteurs
NADP
Les cofacteurs flaviniques (FAD, FMN) dérivés de la vitamine B2 (riboflavine)
jaune rouge Sans couleurs
Coenzymes quinoniques
Ex ubiquinone (coenzyme Q10)
Production d'énergie dans la mitochondrieEt lutte contre le stress oxydant
Les cycles porphyrines: hème et chlorophylle
ChlorophylleHème
Le cycle porphyrine est très délocalisé, il absorbe donc dans le visible.La nature du métal ou son etat d'oxydation change les propriété d'absorbation.Sang oxygéné rouge, sang hypoxique bleu
Structure ?
Changement de couleur par clivage
La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse du para-nitrophénolphosphate :
Hydrolysé, ce substrat devient jaune et absorbe à 405 nM.
1ALK
Architecture sandwich triple ()2 Zn, 1 Mg
Cette propriété est très utilisé en biologie (ELISA)
La couleur par la diffusion Rayleigh
On peut avoir de la couleur sans pigment (sans absorption).
Le ciel est bleu est pourtant il n'y a pas de pigment bleu
Diffusion de RayleighDiffusion de mie
micro onde saut d'un niveau de rotation
Infrarouge saut d'un niveau de vibration
Visiblesaut d'un niveau électronique dans une orbitale moléculaire délocalisée
Ultraviolet prochesaut d'un niveau électronique dans un orbitale moléculaire , ou formation d'un radical libre si liaison
Rayon X
Extraction des électrons des couches électroniques de l'atome.
Les métaux de transitions
Radio X
Fluo BET, cristaux
