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Programa detallado y resúmenes
Programa
MIERCOLES 19 DE NOVIEMBRE -Anfiteatro Estación Experimental INIA-Las Brujas, Ruta 48
Km. 10. Rincón del Colorado, Canelones
8:30. Registro de participantes
9:00. Bienvenida y presentación de jornadas. Ing. Agr. (MSc) Edgardo Disegna (Viticultura,
Estación Experimental INIA-Las Brujas) y Dr. Eduardo Dellacassa (Laboratorio de
Biotecnología de Aromas, Facultad de Química-UdelaR)
9:30. Genoma Tannat: polifenoles durante el desarrollo del grano de uva. MSc Cecilia Da
Silva y Dra. Carina Gaggero (Departamento Biología Molecular, IIBCE)…………………………pag. 1
9:50. El manejo del viñedo y su efecto en la sanidad de la uva. Lic. Virginia Ferrari
(Viticultura, Estación Experimental INIA-Las Brujas........……………………………………………….pag. 2
10:10. El balance del Tannat en el sur de Uruguay. Ing. Agr. Andres Coniberti (Viticultura,
Estación Experimental INIA-Las Brujas).………………………………………………………………………..pag. 3
10:35. Descanso para el café
11:05. Evaluación y selección de clones de Tannat. Ing. Agr. (MSc) Edgardo Disegna
(Viticultura, Estación Experimental INIA-Las Brujas)…….....………………………………………….pag. 4
11:40. Principios y práctica de la poda reducida. Dr. Alan Lakso y Dr. Terry Bates
(Horticultural Section, Plant Science, Cornell University, USA)…………………………………….pag. 6
12:30. Lunch y Degustación de vinos de Wines of Uruguay. Vinos Blancos
JUEVES 20 DE NOVIEMBRE -Salón Píriz McColl- Facultad de Química, Gral. Flores
2124 en el edificio del Instituto de Química.
14:00. Presentación de la jornada de Enología. Dr. Francisco Carrau (Sección Enología,
Facultad de Química-UdelaR)
14:20. Aplicaciones de un método rápido para la determinación de madurez aromática.
Dr. Eduardo Boido (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR)………………….……..pag. 7
14:40. ¿Saccharomyces o no-Saccharomyces? Biodiversidad para incrementar complejidad.
Dr. Francisco Carrau (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR)………….…………..pag. 8
15:00. Levaduras comerciales y demanda de nitrógeno. Dra. Laura Fariña (Sección Enología,
Facultad de Química-UdelaR)…………………………………………………………………………………….pag. 9
15:20. Control y huella microbiológica en los vinos. Dr. Albert Mas (Facultad de Enología,
Universidad Rovira i Virgili, Tarragona España)………………………….………………………………pag. 10
16:00. Descanso para el café
16:20. ¿Podemos evitar la pérdida de color con levaduras? Dra. Karina Medina (Sección
Enología, Facultad de Química-UdelaR)…………………………………………………………….………pag. 12
16:40. Aplicación de levadura Hanseniaspora vineae para vinificación en blanco y tinto.
MSc Valentina Martin (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR y Universidad Rovira i
Virgili, Tarragona)………………………………………………………………………………………………………pag. 13
17:00. Aquibrett: método simple para detectar Brettanomyces en bodega. MSc. Gabriel
Perez (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR)…………………………………….………pag. 14
17:20. "Novedades en la caracterización y trazabilidad de los taninos enológicos" y "Tioles
varietales provenientes de los taninos de la uva. Nuevas opciones enológicas"
Dr. Giorgio Nicolini y Dr. Roberto Larcher (Centro Trasferimento Tecnologico. Fondazione
Edmund Mach di Institute San Michele all'Adige San Michele all Adige, Italia……….pag 16- 17
18.00. Cierre del evento con degustación vinos WOU.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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Genoma Tannat: polifenoles durante el desarrollo del grano de uva.
MSc Cecilia Da Silva y Dra. Carina Gaggero
Departamento Biología Molecular, IIBCE
Hoy en día Tannat (Vitis vinifera cv. Tannat) es la variedad de uva vinífera más plantada en
Uruguay, constituyendo los viñedos más extensos del mundo. Posee el mayor contenido de
polifenoles y alto poder antioxidante, lo que otorga a sus vinos características particulares: color
intenso y gran estructura en boca. Por esto la industria vitivinícola uruguaya ha establecido una
estrategia para producir vinos finos Tannat utilizando tecnologías vitícolas y enológicas
avanzadas.
En nuestro primer estudio genético en Tannat (Gonzalez-Techera et al. 2004) investigamos
polimorfismos de microsatélites en diferentes clones de Tannat, y descubrimos que es altamente
homocigota. Históricamente, Tannat era la variedad dominante y casi exclusiva del suroeste de
Francia. Es posible que este aislamiento geográfico haya resultado en un proceso de auto-
fertilización natural que explicaría el alto grado de homocigosis observado. Característica innata
de Tannat que facilitó la secuenciación de su genoma.
Recientemente en colaboración con la Universidad de Verona publicamos el genoma de Tannat
en la prestigiosa revista The Plant Cell (Da Silva et al. 2013), siendo la tapa de la edición de
Diciembre del 2013. Aquí investigamos las bases genéticas de las principales características de
los vinos Tannat mediante la secuenciación del genoma del clon uruguayo UY11, utilizando la
tecnología Illumina. Por medio de la secuenciación de ARNs provenientes de uvas en etapas
anteriores al envero, encontramos 5.901 genes no identificados en vid y descubrimos 1.873
genes que Tannat no comparte con el genoma de Pinot Noir (primer y único genoma de vid
secuenciado junto a Tannat hasta el día de hoy). También mostramos que estos genes específicos
de Tannat contribuyen sustancialmente a la expresión general de las enzimas implicadas en la
biosíntesis de polifenoles, los cuales contribuyen a las características fenotípicas únicas de las
uvas Tannat. La caracterización del genoma del Tannat nos mostró que el genoma publicado de
Pinot Noir carece de muchos genes que son importantes para el fenotipo de cada variedad.
La siguiente etapa de nuestro proyecto es secuenciar ARNs provenientes de uvas en etapas de
crecimiento posteriores al envero, para así poder caracterizar genes específicos de Tannat que se
expresan en estas etapas más tardías de la maduración de la uva. Con estos resultados podremos
terminar de determinar los genes claves que diferencian a Tannat de las demás variedades.
Como objetivos futuro esta realizar este mismo estudio en diferentes zonas vitivinícolas del
Uruguay, para poder determinar el efecto que tiene el ambiente (suelto, clima, etc) en la
expresión de genes relacionados a la biosíntesis de polifenoles y por ende en la cálida de las
uvas y vinos Tannat. Con estos conocimientos podríamos predecir características de los vinos
Tannat según la región de plantación.
Conocer detalladamente el genoma y transcriptoma de nuestra variedad insignia nos otorga, en
un futuro no muy lejano, la posibilidad de realizar mejoramientos de esta vid guiados por
métodos modernos que no involucran transgénicos, como por ejemplo la edición genómica.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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El manejo del viñedo y su efecto en la sanidad de la uva
Virginia Ferrari*, Andrés Coniberti***, Eduardo Dellacassa**, Edgardo Disegna***
* Bqca. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas
** Dr. Laboratorio de Biotecnología de Aromas, Facultad de Química-UdelaR *** Ing. Agr. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas
El mercado mundial de vinos en los últimos años atraviesa por un proceso de cambio estructural
caracterizado por exigencias en la calidad e inocuidad de los productos, acompañado de fuertes
reglamentaciones que contemplan estos aspectos. Uruguay, como país productor de vinos, debe
adaptarse a estas exigencias y normativas; para diferenciarse en la oferta de productos,
apuntando a un mayor valor agregado y al acceso de nuevos nichos comerciales.
Bajo este punto de vista el vino, además de ser agradable a la vista y paladar de quién lo
consume, deberá ser inocuo. Esto implica que el mismo sea el resultado de procesos de
producción y control en todos los eslabones de la cadena productiva-industrial atendiendo a la
seguridad alimentaria, en particular a la calidad sanitaria de las uvas ya que de ellas depende la
inocuidad del vino.
En nuestras condiciones climáticas las principales enfermedades que afectan a las uvas son
provocadas por hongos. Como resultado de la infección de ciertas especies pueden aparecer
compuestos tóxicos en los vinos, principalmente fumonisinas y ocratoxina A (OTA), cuya
ingesta crónica puede causar daños a la salud humana.
Para obtener datos nacionales sobre estos aspectos, se realizó un estudio sobre la
biodiversidad de especies fúngicas durante las vendimias 2007-2008-2010 en 22 predios
comerciales de la variedad Tannat en la región sur del Uruguay. Como consecuencia de la
aplicación de un sistema HACCP se determinaron los riesgos existentes y los principales
factores que influyen en el estado sanitario de las uvas y la inocuidad de los vinos. Para ello se
analizaron las características climáticas, culturales y vegetativas de cada viñedo, y la
composición química de las uvas, mostos y vinos producidos.
Los resultados indicaron que la contaminación fúngica fue mayor en la temporada 2006/2007, y
si bien existe correlación con la ocurrencia de lluvias 30 días previos a la cosecha, esta no fue
estadísticamente significativa. Los géneros mayoritariamente encontrados fueron: Alternaria,
Fusarium, Penicillium, Botrytis, Aspergillus y Epicoccum; y en menor medida: Rhizopus,
Cladosporium y Trichoderma. Las cepas de Aspergillus y Botrytis fueron las que presentaron
mayor riesgo por los graves daños que causa su ataque. Los factores que mostraron mayor
incidencia sobre la presencia de estas especies, fueron la altura del plano de poda y la
compactación de la canopia.
Las correlaciones se comprobaron bajo condiciones experimentales en la Estación Experimental
W. F. Aldunate (INIA Las Brujas), y se confirmó que el microclima al que estuvieron expuestos
los racimos y el vigor de las plantas son factores determinantes en el grado de infestación y la
presencia de OTA en los vinos.
Si bien en ninguno de los vinos producidos se determinaron valores superiores al límite
reglamentario de 2g/l de OTA, la presencia constatada de cepas productoras y potencialmente
productoras en los viñedos y el cambio climático, predisponen a aumentar el riesgo. Por este
motivo la aplicación de prácticas de manejo en los viñedos son recomendables para reducir la
presencia y desarrollo de B. cinerea y Aspergillus spp., obteniendo uvas sanas, de calidad
enológica y vinos con bajo riesgo de contenido de OTA.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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El balance del Tannat en el sur de Uruguay
Andrés Coniberti, Edgardo Disegna*, * Virginia Ferrari** * Ing. Agr. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas ** Bqca. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas
Es reconocida por técnicos y productores la relevancia que tiene el alcanzar en el viñedo, un
adecuado equilibrio hoja/fruta cuando se pretende optimizar nuestra ecuación de
rendimiento/calidad. Aunque menos tomado en cuenta, un adecuado equilibrio hoja
expuesta/hoja total es igualmente relevante a la hora de conseguir maximizar la
productividad/calidad de un viñedo. Si bien es extensa la información producida en las últimas
décadas sobre esta temática, desde el punto de vista práctico el equilibrio del viñedo no es
posible definirlo en forma universal. Por esta razón este trabajo tuvo como objetivo producir
información que permita orientar a los viticultores locales a responderse algunas preguntas
simples: ¿Mi viñedo está equilibrado?¿Está mi viñedo en su potencial productivo?¿A qué nivel
de producción debo ajustar mi viñedo si pretendo maximizar su potencial de calidad?¿Cómo
logro equilibrar mi viñedo?
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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Clones de Tannat en Uruguay
Edgardo Disegna*, Andrés Coniberti,* Virginia Ferrari** * Ing. Agr. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas ** Bqca. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas
La industria vitivinícola uruguaya ha adoptado a la variedad Tannat para la producción de vinos
que la identifiquen a nivel mundial. Introducida al país a fines del siglo diecinueve, ha sido
acogida por gran parte del sector, ocupando en la actualidad casi el 25% de la superficie total de
viñedos. En un proceso de replantación primeramente con plantas de selección masal,
proseguido por la introducción al país de materiales certificados libres de virus seleccionados en
Francia, el clon 398 se consolidó como el más cultivado, sin la existencia previa de ensayos de
campo ni estudios de sus atributos cualitativos. Según estimaciones, este clon representaría más
del 50% de las plantaciones de Tannat del país. Existen escasos reportes bibliográficos sobre el
comportamiento de los clones de Tannat disponibles a nivel comercial. Al ser esta variedad
raramente cultivada a nivel mundial y estando circunscripta su plantación a una región de
Francia y al Uruguay, el comportamiento de Tannat y sus clones no ha sido estudiado en
profundidad en distintas situaciones productivas.
En este contexto se inicia un proyecto conjunto entre el Instituto Nacional de Investigación
Agropecuaria (INIA) y el Instituto Nacional de Vitivinicultura (INAVI), en el año 2002 que
incluye 2 líneas de investigación:
A) Estudio del comportamiento cualitativo y productivo de los principales clones comerciales
en las condiciones agro-climáticas del Uruguay. Se comienza un ensayo en la Estación
Experimental INIA Las Brujas en que se comparan los clones ENTAV-INRA: 398, 399, 472,
474, 475, 717, 794 y 944, injertados sobre SO4. Las evaluaciones fueron realizadas a partir de
que las plantas alcanzaron su estado adulto (primera cosecha comercial) durante el período
2005-2010.
B) Paralelamente, y con la recomendación del sector acerca de las ventajas comerciales que
podría significar el exportar vinos producidos con un clon uruguayo, INIA e INAVI comienzan
un programa de selección de plantas candidatas a cabeza de clon, en acuerdo a los protocolos
europeos, partiendo de antiguos viñedos (mayores a 50 años) existentes en distintas zonas del
país. El proceso de selección comienza a realizarse durante las temporadas 2002 – 2003.
Cumplida la etapa de preselección las plantas candidatas fueron analizadas por serología y por
indicadoras leñosas para las principales virosis. En paralelo y una vez extraído el ADN de las
plantas candidatas, se realizaron estudios moleculares a través de la técnica de AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) en el Laboratorio de Biotecnología de INIA Las Brujas, a los
efectos de evaluar la posible existencia de diferencias genéticas entre los individuos
seleccionados. Las primeras plantaciones a campo de los materiales preseleccionados se realizan
en el año 2006. Las evaluaciones abarcan el período 2009 – 2014.
Del estudio comparativo de clones comerciales de origen francés podemos concluir que en el
período en estudio, los clones 717 y 474 mostraron un excelente comportamiento, expresado por
su grado alcohólico, contenido de antocianos y atributos sensoriales de sus vinos. Estos clones
se manifiestan como más precoces y por su comportamiento y performance cualitativa deberían
ser considerados para plantaciones destinadas a la producción de vinos de alta gama en el país.
Si bien algunos clones mostraron diferencias estadísticamente significativas en productividad,
los rendimientos relativos entre el más (475, 398 y 399)y menos productivo 474 cuando las
plantas no fueron raleadas fue del orden del 10%.
En relación a la selección de clones uruguayos los avances logrados nos permiten concluir que:
a) de acuerdo a los análisis moleculares, muchos de los materiales en estudio podrían ser
considerados diferentes a los clones importados y comercialmente disponibles en el país. b)
Asimismo, se destacan por sus características productivas y cualitativas la potencialidad de al
menos 14 clones uruguayos (2, 18, 20, 21, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37). Cabe resaltar
que muchos de estos comparten altos niveles de producción de azúcares expresados como GAP
y color aún con altos rendimientos.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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En función de los objetivos comerciales deberían ser probados en comparación con los que
mostraron mejor performance dentro de los originarios de Francia (717 y 474) en distintos
predios del país.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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Alan Lakso
School of Integrative Plant Science Horticulture Section, Cornell University, College of
Agriculture and Life Sciences.
Cornell University College of Agriculture and Life Sciences
Research Focus
My area of research is integrative plant and crop physiology, primarily on fruit crops. I
investigate the individual physiological bases of specific processes such as the regulation of sink
activity in the grape berry, carbon partitioning as related to developmental stage, temperature,
water availability and light microclimate. I try, however, to also emphasize how these individual
processes are integrated in the whole plant and what the grower can do to influence such
processes to improve plant productivity, especially under field conditions. As indicated by our
increasing use of dynamic simulation modeling, I feel that we will need more and more
integrative physiology to understand plant responses to the environment and cultural treatments,
to improve our management and culture, and to attack increasingly complex problems such as
global climate change and environmental compatibility through IPM and sustainable
approaches. I have a new emphasis on application and integration of new micro-engineering,
remote sensing, information technologies to problems of agriculture
Outreach and Extension Focus
My approach to extension and outreach reflects my research on understanding the principles of
fruit crop behavior in relationship to the environment and cultural practices. I feel that for
complex issues such as growing fruit crops in NY, recipe approaches are dangerous as each year
presents new challenges that can only be handled by knowledge of a complex system and how it
behaves. I extend this approach and information at different levels and in different formats. For
fruit growers, the focus is on understanding the principles of crop behavior so they can adjust
appropriately each year or location. For school children the message is simpler but also focused
on how plants behave.
Teaching Focus
I teach an Advanced Viticulture Senior/Grad course and lead and co-teach a Grapevine Biology
junior/senior course. These are upper division classes so a primary learning outcome is the
ability to synthesize substantial amount of factual information about grapevines and their
culture to critically assess complex issues in grapevine physiology and culture. This requires
creative thinking and the use of multiple hypotheses or explanations to elucidate the many
complex interactions of plant, environment and culture. Examples are climate change, dealing
with site and plant variability, and regulation of growth and wine quality by water relations.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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Aplicaciones de un método rápido para la determinación de madurez aromática
E. Boido
1, L. Fariña
1, D. Cozzolino
2, F. Carrau
1, E. Dellacassa
1
1Sección Enología, Facultad de Química, UdelaR, Uruguay.
2The Australian Wine Research
Institute, Australia.
El aroma del vino depende de numerosos factores como son la variedad de uva, proceso de
vinificación y crianza, siendo los metabolitos secundarios de la uva los responsables del carácter
varietal de los vinos. Algunos de estos metabolitos, que se presentan glicosilados en las uvas,
pueden ser hidrolizados durante la vinificación produciendo compuestos aromáticos. Para uvas
no aromáticas como el Tannat, una importante fuente de aromas en el vino luego de la crianza
son los precursores glicosilados, siendo importantes para esta variedad los norisoprenoides. Por
lo tanto, el contenido de compuestos aromáticos glicosilados es un parámetro necesario para
poder clasificar la fruta según su calidad, así como además para determinar el momento óptimo
de cosecha dependiendo de la vinificación objetivo. Es por esto que resulta relevante disponer
de técnicas rápidas para su determinación, útiles para el enólogo, ya que los métodos
tradicionales utilizados para su análisis requieren de etapas de extracción, hidrólisis, y posterior
separación de los compuestos por cromatografía gaseosa, consumiendo tiempos importantes de
análisis.
La espectroscopía en infrarrojo cercano (NIR) es una técnica rápida, no destructiva, que
requiere cantidades y preparación mínima de la muestra. Su aplicación cuantitativa se basa en la
correlación entre la composición de la muestra y la absorción de luz en infrarrojo cercano,
permitiendo la calibración usando técnicas quimiométricas Los modelos lineales, como la
regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS), son los más utilizados. Sin embargo, los
modelos no lineales como las redes neuronales (RNs) presentan ventajas.
En este trabajo se utilizaron las técnicas de NIR-PLS y NIR-RNs para la cuantificación de
compuestos aromáticos glicosilados, particularmente norisoprenoides, en uvas Tannat. Para esto
se realizó la calibración de los espectros NIR con la concentración de los compuestos,
determinados por GC-MS, presentes en uvas en diferentes zonas y etapas de madurez. Los
resultados obtenidos demuestran que es posible utilizar estas técnicas rápidas para
cuantificación de norisoprenoides en uvas, presentando los mejores resultados la calibración
con RNs utilizando un modelo de perceptrón multicapa con dos capas ocultas y como método
de aprendizaje un algoritmo de gradiente descendiente.
Esta calibración obtenida es validada con muestras de uvas de tres cosechas, y es posible
utilizarla con equipos NIR para obtener en forma rápida la concentración de norisoprenoides en
uvas Tannat (error cuadrático medio 270 µg/L).
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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¿Saccharomyces o no-Saccharomyces? Biodiversidad para incrementar complejidad sensorial.
Facundo Giorello
1; Valentina
Martin
1, Laura Fariña
1, Eduardo Boido
1, Karina Medina
1, Eduardo
Dellacassa1.Luisa Berna
2; Pablo S. Aguilar
2; Carina Gaggero
3; Francisco Carrau
1
1Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, 11800, Montevideo, Uruguay.
2Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de Montevideo,
11400 Montevideo, Uruguay. 3Departamento de Biologia Molecular, Instituto de Investigaciones
Biológicas Clemente Estable (IIBCE), 11600 Montevideo, Uruguay.
Saccharomyces cerevisiae, la levadura ampliamente utilizada para la cerveza, el pan, la sidra y
la producción de vino, es la especie utilizada casi exclusivamente en estas industrias. Cada vez
con mayor frecuencia se considera el uso de nuevas cepas de levadura para la elaboración del
vino como una forma de mejorar la calidad y proporcionar variación, incluyendo diferencias
sutiles en los vinos finos. Por otra parte, las fermentaciones espontáneas se asocian con la
producción de mayor cuerpo del vino, aromas y sabores inusuales, textura cremosa y una mayor
complejidad. Por lo que es previsible que el trabajo de selección de diversidad en levaduras
nativas ofrezca oportunidades innovadoras para mejorar el aroma y sabor, incrementando la
diferenciación de los vinos en un mercado cada vez más competitivo. En este sentido, se
propone lo que llamamos: la estrategia de búsqueda de nuevos fenotipos del sabor en la flora
nativa proveniente de uvas. Metodológicamente la integración de conocimientos sobre análisis
sensorial y biodiversidad natural de cepas no-Saccharomyces abre la oportunidad de lograr
nuevas cepas de aplicación enológica a nivel industrial. Más de 800 cepas de no-Saccharomyces
se aislaron del medio ambiente de uvas y vinos de Uruguay en los últimos 5 años. De esta
colección en primera instancia se seleccionaron cepas de Hanseniaspora vineae y
Metschnikowia pulcherrima para estudiar estrategias de fermentaciones secuenciales con y sin
la presencia de una cepa de Saccharomyces comercial. Sobre la base de los parámetros de
elaboración del vino, la formación de compuestos volátiles y no volátiles discriminantes y el
análisis sensorial, fue posible definir un perfil metabólico y rasgos sensoriales específicos para
cada cepa. En general, la estrategia de co-fermentación con estas cepas ha proporcionado
aumentos significativos en glicerol y acetatos, con disminuciones relativas de alcoholes, ácidos
grasos, y aminas biógenas.
Con el fin de comprender la base genética de los fenotipos "aroma y gusto" se secuenciaron dos
cepas diferentes de H. vineae. A pesar de la gran cantidad de secuencias divergentes entre H.
vineae y S. cerevisiae industriales a nivel de vías metabólicas de fermentación, 68% de estos
genes se encontraron en H. vineae. Curiosamente, se discuten las grandes divergencias en los
genes relacionados con el metabolismo de compuestos aromáticos. Por ejemplo, el gen asociado
con la biosíntesis de los acetatos en Saccharomyces (ATF2) en H. vineae está presente pero con
un alto % de divergencia genética. Por otro lado, H. vineae presenta 4 genes nuevos para la
formación de estos esteres (AAT) lo que también puede explicar el incremento de estos
compuestos en vinos producidos con esta especie. Los genes implicados en la regulación de los
alcoholes superiores (ARO8 y ARO9) se presentaron en más de 3 copias en comparación con
copias únicas en S. cerevisiae. Estos genes también pueden tener un impacto clave en la
diferente calidad sensorial de vinos elaborados con esta especie y con cepas comerciales. Una
de estas cepas seleccionadas, H. vineae 025A, ha comenzado a ser producida a nivel industrial
por Lage y Cia en Uruguay, siendo la primer cepa comercial de esta especie en el mundo. En los
ensayos que se han realizado con esta cepa desde el 2008, se han obtenido vinos de alta calidad
ya a nivel comercial en blancos varietales como Chardonnay y Petit Manseng fermentados en
barricas, o variedades neutras como Ugni Blanc o Macabeo en tanque, resultando en vinos de
mucha más complejidad sensorial que con cepas de Saccharomyces comerciales.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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Sistema de clasificación de levaduras aptas para vinificación de acuerdo a su capacidad de administrar nitrógeno
L. Fariña
(1), M. Urruty
(1), E. Boido
(1), K. Medina
(1), E. Dellacassa
(2), F.
Carrau
(1)
(1) Sección Enología, Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Facultad de
Química, (2)
Cátedra de Farmacognosia y productos Naturales, Departamento de Química Organica, facultad de Química.
,
El aroma del vino es la sumatoria de un gran número de compuestos volátiles que provienen de
diversos orígenes. Entre estos se encuentran los denominados aromas fermentativos, que se
originan a partir del metabolismo secundario de Saccharomyces cerevisiae. Este metabolismo es
afectado por la cepa de levadura utilizada y por los distintos factores del medio en el cual se
desarrolla como temperatura, pH y nivel de nitrógeno asimilable (FAN). Este último factor
resulta determinante en la expresión metabólica de las levaduras y la producción de metabolitos
secundarios con impacto en el aroma final del vino. La adición de amonio se ha transformado en
una operación sistemática de muchos enólogos con el fin de evitar complicaciones debidas a la
falta de nitrógeno en el mosto que trae como consecuencia la formación de compuestos
aromáticos responsables de defectos y/o fermentaciones lentas. Por otro lado, esta adición
provoca la modificación del perfil de aminoácidos natural de la variedad de uva utilizada,
afectando la tipicidad aromática varietal. Además actualmente se trata de evitar la adición en
exceso de sales de amonio para prevenir el riesgo de producción de etilcarbamatos e histamina,
que pueden resultar nocivos para la salud del consumidor o aumentando los niveles de FAN
residual en el vino terminado lo que arriesga la estabilidad microbiológica posterior del vino en
la crianza en barricas o botellas.
De acuerdo con trabajos previos realizados por nuestro grupo se diseñó un modelo en el cual se
plantea la existencia de levaduras con distinta capacidad de administrar nitrógeno en base a los
compuestos volátiles generados en un medio de cultivo químicamente definido. Las cepas
“buenas administradoras de nitrógeno” (BAN) producen vinos con aromas agradables a bajas
concentraciones de nitrógeno debido a la mayor producción de esteres y ácidos grasos de
cadena media, mientras que las cepas “malas administradoras de nitrógeno” (MAN) producen
vinos con aromas poco agradables debido al aumento de la producción de aromas asociados a
los alcoholes superiores, los isoacidos y algunos compuestos azufrados.
En este trabajo se realizó una clasificación de cepas de levaduras comerciales y nativas (con
potencial uso industrial) de acuerdo a su capacidad de administrar nitrógeno utilizando como
referencias las cepas M522 (MAN) y la cepa KU1 (BAN). Las cepas estudiadas se fermentaron
en símil vino químicamente definido utilizando fermentadores y válvulas estandarizadas de
manera que el método de clasificación sea universal mediante la aplicación de un protocolo
definido. Las fermentaciones se realizaron a 20ºC y su avance se monitoreó mediante
desprendimiento de CO2. Una vez finalizada la fermentación para cada una de las cepas
estudiadas, se realizó la extracción en fase solida de componentes volátiles. Los extractos se
concentraron e inyectaron en un cromatógrafo con detector de masa (GC-MS). Se cuantificaron
33 compuestos volátiles que se agruparon en: alcoholes, esteres etílicos y acetatos, ácidos
grasos, isoácidos, lactonas y miscellaneos. Se realizó un análisis de componentes principales
logrando disminuir el número de variables a 2 componentes principales, de esta forma se obtuvo
la agrupación alrededor de las dos cepas del modelo M522 y la KU1 que permitió caracterizar
dos grupos de cepas (MAN y BAN). Se observó que la mayor diferencia entre las cepas de
referencia se encuentra en el componente principal 1 siendo los compuestos más significativos:
1-butanol, ácido butanoico, acetato de propilo, ácido hexanóico y ácido octanóico.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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Página 10
Control y huella microbiológica en vinos
Dr. Albert Mas Depto. Bioquímica y Biotecnología. Facultad de Enología. Universitat Rovira y Virgili.
Tarragona, España.
En los últimos años, las preferencias de los consumidores se han orientado hacia distintas
características regionales (vinos de terroir ), así como para los vinos elaborados mediante
procedimientos naturales y orgánicos. Estas tendencias se reflejan en el aumento en la
producción de vinos de agricultura ecológica o biodinámica, el aumento de la comercialización
de los vinos obtenidos sin adición de inóculos comerciales, el cambio en el mercado
internacional de vinos de mesa hacia vinos de calidad superior. Esto plantea una oportunidad
para que los países productores potencien los vinos que corresponden a terruños peculiares que
junto a antiguas tradiciones puedan producir nuevos vinos de calidad ultra-premium con
sistemas de producción “naturales”. El uso de levaduras Saccharomyces y no- Saccharomyces
indígenas puede ofrecer un gran potencial para abordar los aspectos críticos mencionados con
técnicas actuales de vinificación.
Las levaduras forman el núcleo de la elaboración del vino. Las levaduras llevan a término la
fermentación alcohólica, pero también tienen un papel destacado en la calidad del vino. La
actividad de diferentes especies de levaduras y/o cepas se refleja en diversos perfiles
organolépticos de los vinos lo que añade complejidad y riqueza organoléptica al vino.
Actualmente, los productores de todo el mundo utilizan inóculos comerciales de Saccharomyces
cerevisiae para asegurar una fermentación predecible, reproducible y controlada. Sin embargo,
el uso generalizado de cultivos iniciadores eliminan los efectos que la microbiota nativa podría
incorporar, resultando vinos con propiedades analíticas y sensoriales semejantes, privándolos
de la variabilidad, la complejidad y personalidad que definen la tipicidad de un vino. El uso de
levaduras autóctonas o indígenas es una herramienta para defender la tipicidad. Las levaduras
Saccharomyces asegurarían la fermentación y la evolución de las propiedades sensoriales típicas
de vino de una región determinada se complementaría con el uso de las levaduras No-
Saccharomyces. La alternativa que se está utilizando en la actualidad en algunos casos, la
ausencia de inóculos, implica grandes riesgos y, sobre todo un aspecto fundamental: la pérdida
del control por parte del enólogo. No es posible controlar la microbiota autóctona y, por lo tanto,
el vino final puede sufrir graves alteraciones que lo hagan poco aceptable para el mercado.
La adición de los iniciadores de fermentación industriales puede entrar en conflicto con las
necesidades de los vinos que se producen bajo las prácticas más naturales y orgánicos. Aunque
el establecimiento de normas específicas en la fase de elaboración del vino es todavía objeto de
debate, se espera que la producción de vino orgánico se someta a limitaciones específicas. En
este sentido, es muy probable que se deba indicar en las etiquetas menciones específicas (por
ejemplo, “obtenidos sin la adición de levadura comercial” o “producido con las levaduras
indígenas”), como se anticipó en la organización común del mercado del vino orgánico. El uso
de levaduras autóctonas es una de las prácticas que se observa con mayor interés por parte de
los organismos reguladores.
Cada vez más hay una necesidad de aislar levaduras indígenas enológicamente competentes
para ser utilizadas como inóculos para la producción de vinos convencionales o ecológicos, pero
para lograr este objetivo se requiere una evaluación enológica de los aislados naturales. El
concepto de explotar levaduras autóctonas no es nuevo. Hace ya muchos años que diferentes
productores de levaduras están desarrollando levaduras comerciales “de selección local” en un
intento de defender la autenticidad y tipicidad de los vinos. No obstante, en todos los casos se
han centrado en una única levadura de la especie de Saccharomyces cerevisiae. La propuesta
actual radica en la reproducción del ecosistema natural presente en la uva en los inóculos, con
una presencia notable de levaduras No-Saccharomyces que permitan el enriquecimiento
sensorial. Este concepto se ha propuesto en el proyecto europeo WildWine
(http://www.wildwine.eu/en/), actualmente en desarrollo en regiones de prestigio europeo como
Burdeos (Francia), Priorato (Eapaña), Piemonte (Italia) o Creta (Grecia) y algo similar en el
proyecto “la huella microbiológica chilena”. El objetivo del proyecto WildWine es dotar a las
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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Pequeñas y medianas empresas y las diferentes denominaciones de origen de instrumentos para
diversificar y ofrecer vinos innovadores de calidad superior para los mercados nacionales y
mundiales. Estos vinos están dirigidos también a la captación de nuevos consumidores,
mediante unos vinos controlados y en el que el factor del terroir esté especialmente destacado.
Según se declara en el proyecto el objetivo estratégico de WildWine es desarrollar mezclas de
levaduras originales y peculiares combinando Saccharomyces indígenas con levaduras no-
Saccharomyces para la producción de vinos de calidad premium con un fuerte carácter terroir.
Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.
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¿Podemos evitar la pérdida de color con levaduras?
Dra. Karina Medina Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
En el proceso de vinificación de vinos tintos, la optimización en la obtención de color
constituye un área clave en la elaboración de vinos tintos de calidad. En dicho proceso
intervienen una serie de variables, que van desde el viñedo hasta la bodega, donde la
fermentación alcohólica llevada a cabo por las levaduras puede afectar positivamente la
concentración de color. Durante la fermentación alcohólica, las levaduras transforman los
azúcares del mosto en etanol y anhídrido carbónico como principales compuestos, pero además
sintetizan o modifican una gran diversidad de compuestos polifenólicos de la uva, que a pesar
de estar en muy baja concentración, son los compuestos claves que determinan en buena medida
la calidad de un vino tinto.
Desde el punto de vista del color, las consecuencias de la interacción de las levaduras con el
mosto pueden ser tanto beneficiosas como perjudiciales para la calidad del vino.
Dentro de las consecuencias beneficiosas, se encuentra la producción de pigmentos derivados
de antocianos por parte de levaduras. Estos pigmentos son desde el punto de vista del color de
vital importancia en la elaboración de vinos tintos, debido a su estabilidad frente a la presencia
de SO2 y cambios de pH, y a su vez por manifestarse intensamente coloreados al pH del vino;
todas características que impactan en un mayor potencial de guarda.
Por otro lado, las interacciones perjudiciales y a la vez “inevitables” son la adsorción de
antocianos a nivel de la pared celular de las levaduras.
Considerando ambos fenómenos, y la posibilidad enológica de solo poder intervenir sobre el
primero de ellos, para evitar la pérdida de color por levaduras, en este trabajo se realizó la
caracterización y selección de cepas nativas provenientes de uvas de diferentes viñedos del
Uruguay.
Los resultados obtenidos demostraron que la formación de estos derivados de antocianos es
dependiente de la cepa, y pusieron de relevancia la contribución de algunas levaduras en la
preservación y/o aumento del color durante la vinificación, lo que constituye un importante
carácter de selectividad para cepas de vinos tintos.
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Aplicación de H. vineae para vinificación en blanco y tinto
M.Sc. Valentina Martín Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
En la actualidad la mayoría de las bodegas utilizan iniciadores comerciales de fermentación,
formulados en su mayoría por levaduras pertenecientes al género Saccharomyces, ya que
aseguran un correcto desarrollo del proceso de fermentación. Sin embargo, la gran biodiversidad
de levaduras nativas no se ve reflejada en la disponibilidad de levaduras comerciales. Es así que,
en la enología ocurre una situación paradójica: la biodiversidad de cepas de levaduras nativas
presentes en las uvas y en la bodega es muy grande, mientras que a nivel industrial existe una
muy limitada cantidad de cepas comerciales para su aplicación por el Enólogo. Por lo que
muchas veces se utilizan las mismas levaduras para fermentar distintos vinos en distintas
bodegas y regiones. Esto conlleva a una estandarización de los vinos y a una disminución de la
tipicidad transmitida por la aplicación de las distintas cepas.
Diversos autores se han dedicado a estudiar el aporte de las levaduras nativas, en su gran
mayoría No-Saccharomyces sobre las características organolépticas de los vinos, el aporte
mayormente está asociado a las reacciones enzimáticas que ocurren en el mosto durante las
etapas tempranas de la fermentación alcohólica, participando en la producción de compuestos
no volátiles como el glicerol, y otros volátiles como los esteres y ácidos grasos que aportan
atributos sensoriales beneficiosos al vino.
En este trabajo se muestran resultados en el estudio de levaduras de la especie Hanseniaspora
vineae, que en trabajos previos realizados por el grupo de la Sección Enología se constató que
aumentan la complejidad aromática y de boca de vinos blancos fermentados en barrica. Se
muestran los resultados obtenidos con uvas Chardonnay y Macabeo en blanco, y con uvas
Merlot y Tannat en tinto.
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“AquiBrett”: Medio selectivo y diferencial para la detección de contaminación
por Dekkera/Brettanomyces en jugos de uva y vinos.
Gabriel Pérez Giffoni.
Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
Brettanomyces en enología es asociada a defectos sensoriales en los vinos. Se trata de un tipo de
levaduras que preocupa a bodegueros de todo el mundo debido a que su eliminación es muy
difícil y su desarrollo impredecible, en consecuencia las pérdidas que ocasiona pueden llegar a
ser muy elevadas.
Es bien reconocido actualmente que las levaduras del genero Dekkera/Brettanomyces son las
responsables del defecto comúnmente conocido como aroma a etilfenol (descrito sensorialmente
como aroma a “establo”, “sudor de caballo”, “curita medicinal”). Este defecto se debe a la
habilidad de estas cepas de producir fenoles volátiles a partir de los ácidos fenólicos
normalmente presentes en los vinos, principalmente en tintos. Junto con el etilfenol y el
etilguaiacol, se producen ácido acético, esterasas (con fuerte impacto sobre los componentes de
aroma y color) y tetrahidropiridinas, resultando en vinos con pérdida del carácter varietal y
encubriendo las notas frutales de un buen vino. Descriptores aromáticos tales como vinagre,
acetona, medicina, plástico quemado, tempera, perro mojado, sudor de caballo, madera húmeda,
orín de ratón, etc, son algunos de los defectos que estas levaduras pueden causar en los vinos.
Dada la importancia y el prestigio que en los últimos años los vinos Uruguayos han sabido
ganar a nivel mundial, se ha planteado la necesidad de desarrollar métodos que permitan la
detección de estas levaduras en los inicios de la contaminación para prevenir la formación de
estos aromas defectuosos en el vino, determinar su origen y distribución ecológica.
Al tener estas cepas un desarrollo muy lento, su aislamiento e identificación es muy difícil al ser
superadas por otras levaduras que coexisten en el medio.
El principal objetivo fue entonces desarrollar un método rápido de diagnostico de la presencia
de la levadura Dekkera/Brettanomyces con potencial para su aplicación en bodegas. Esta
levadura, considerada uno de los contaminantes de vinos más difíciles de controlar en esta
industria, se sabe actualmente que quizás pueda cumplir un papel preponderante debido a su
gran resistencia a las condiciones de bajo pH y altos niveles de anhídrido sulfuroso.
La presencia de esta levadura en bodegas ha sido relevada en forma preliminar por la Sección
Enología de la Facultad de Química en diversas bodegas y regiones de Uruguay. Su presencia
fue detectada principalmente en barricas y botellas, particularmente en vinos Tannat. Esto puede
indicar que los vinos Tannat, dado su alto contenido en algunos ácidos fenólicos, son proclives a
esta contaminación lo que resulta en aromas desagradables cuando supera determinados
umbrales sensoriales. La formación de etilfenoles es la causa de la aparición de estos aromas
que encubren los aromas frutales típicos de la variedad, disminuyendo el frescor del vino y el
carácter varietal.
El medio de cultivo desarrollado por nuestro equipo, permite especialmente la detección de
levaduras del género Dekkera/Brettanomyces, en vinos y mostos. Su actividad se basa en una
fórmula que asocia selectividad y producción de aromas indicadores, asegurando una detección
rápida y precisa de dichas levaduras mucho antes que se produzca en el vino de Bodega. En la
siguiente tabla, se relacionan los días a los cuales se detecta el olor fenólico por el enólogo, con
la concentración de levaduras Dekkera/Brettanomyces por mL de muestra de vino o jugo de uva
estimada. Esta escala fue realizada por recuento de colonias desarrolladas en la superficie del
medio de cultivo sólido especifico para esta especie. ):
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Número de días a los que se detecta olor
fenólico
Número aproximado de células por mL de
muestra
2 105 - 10
6
4 104 - 10
5
6 103 - 10
4
8 101 – 10
2 - 10
3
10 101 - 10
2
10 a 15 1 - 10 células por cada 20 mL
15 o más Ausencia de contaminación
Validación de la técnica.
La presencia de estas levaduras en vinos o jugo de uva y la validación de este medio y método
microbiológico fueron confirmadas por la cuantificación de etilfenol y etilguaiacol por
cromatografía gaseosa de alta resolución. En caso de que el enólogo detecta la presencia del
defecto con este test, toma las medidas preventivas que considere necesarias para que las células
presentes no sigan desarrollándose, o si son vinos para embotellar definir una filtración más
estricta antes del embotellado del vino. AquiBrett esta siendo distribuido en Uruguay por la
empresa Abastecimientos.
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Novedades en la caracterización y trazabilidad de los taninos enológicos
Roberto Larcher y Giorgio Nicolini
Centro Transferimento Tecnologíco. Fondazione Edmund Mach di Institute San Michele all'Agige San Michele all Adige, Italia.
En esta presentación se muestran los resultados de la aplicación de nuevas herramientas
analíticas para la caracterización y trazabilidad del origen botánico de los taninos
enológicos. Las técnicas desarrolladas con este objetivo están enfocadas en la
cuantificación de azúcares por cromatografía iónica acoplada a detección amerométrica
pulsada (Ion Chromatograph Pulsed Amperometric Detection, IC-PAD) y de fenoles
simples por cromatografía líquida de alta presión acoplada a un detector de detección
electroquímica (HPLC-ECD). Estos enfoques analíticos, desarrollados en la Fundación
E. Mach de San Michele all'Adige (Trento, Italia), complementan y mejoran la
capacidad discriminante de los métodos analíticos de la OIV.
Se presentará también información en relación a la trazabilidad del origen botánico de
los taninos mediante el estudio de su composición isotópica y de microelementos.
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Tioles derivados de los taninos de la uva. Nuevas opciones enológicas
Giorgio Nicolini y Roberto Larcher
Centro Transferimento Tecnologíco. Fondazione Edmund Mach di Institute San Michele all'Agige San Michele all Adige, Italia.
El reciente descubrimiento de la presencia de precursores del 3-mercaptohexanol (por
unión con glutatión y cisteína) en algunos taninos de uvas comerciales, ha impulsado
evaluar la posibilidad de incidir realmente en la formación de la forma libre de este tiol
varietal en los vinos. El 3-mercaptohexanol es responsable en los vinos de notas frutales
como fruta de la pasión y pomelo.
En esta presentación se mostrarán los resultados obtenidos en experimentos realizados,
a escala de laboratorio y semi-industrial, sobre Sauvignon blanc, Mueller-Thurgau y
Traminer aromático.
Anexos
“Aislamiento e identificación molecular de especies de levaduras No-Saccharomyces presentes en uvas”
Ana Godoy
Tesis de grado , Licenciatura en Bioquímica , Facultad de Ciencias
Tutora: Dra Carina Gaggero, Departamento de Biología Molecular, IIBCE Co-tutora: M.Sc Karina Medina, Sección Enología, Facultad de Química
Montevideo, Uruguay Noviembre, 2013
Las levaduras del género No-Saccharomyces constituyen el 99% de la flora nativa de la uva.
Aunque la especie Saccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae) es la que predomina y completa el
proceso de fermentación, el aporte de ciertas cepas No-Saccharomyces durante las primeras
etapas de la misma, es de gran importancia ya que producen aromas deseables y enzimas
capaces de liberar aromas ligados mejorando así el “bouquet” del vino final. Mediante la
realización de fermentaciones mixtas, combinando levaduras S. cerevisiae con cepas
seleccionadas No-Saccharomyces, es posible mejorar la complejidad aromática del vino final
y su estructura en boca. Por otro lado, algunas de estas cepas No-Saccharomyces podrían
desempeñar un papel clave en el control biológico de fitopatógenos en uvas y otras frutas.
Este trabajo consistió en el aislamiento e identificación, a nivel de especie, de levaduras
nativas No-Saccharomyces presentes en uvas. A partir de diferentes vendimias y variedades
de vid, se lograron aislar un total de 165 aislamientos con morfologías diferentes en el medio
diferencial WLN. Se aislaron sus ADNs y se amplificaron y secuenciaron las regiones
ribosomales variables D1/D2, a partir de las cuales fue posible identificar 25 especies No-
Saccharomyces, pertenecientes a diez géneros diferentes. También se encontraron cepas
de S. cerevisiae y por lo tanto se discute cual sería la metodología más apropiada para evitar
el aislamiento de esta especie. Para un grupo de once cepas de la especie Hanseniaspora
guilliermondii (H. guilliermondii) se realizó una discriminación molecular a nivel de sub-
especie, evidenciando que se trataba de individuos diferentes.
Elaboración de un protocolo de calidad que defina atributos
diferenciales para vinos Tannat uruguayos de exportación con un
sello de calidad
Valeria Villar Tesis de Maestría. Sección Enología, Departamento de Ciencia y Tecnología de los
Alimentos, Facultad de Química.
Uruguay utiliza la variedad Tannat como carta de presentación ante el mercado vitivinícola mundial,
ya que entre las variedades de alta gama es la que presenta mayor área de superficie plantada. Pero la
competitividad internacional de los productores vitivinícolas de nuestro país ha sido difícil de lograr
desde hace décadas, debido fundamentalmente a su focalización en producir un vino destinado a
mercado interno como estrategia de producción. Un mercado de vino de mesa que se considera que a
mediano plazo no podrá seguir siendo rentable principalmente para establecimientos pequeños. Este
factor, junto con la competencia de regiones donde el costo de las uvas es mucho menor converge en la
necesidad nacional de implementar un sistema evaluador y certificador de las técnicas vitivinícolas
utilizadas para lograr un vino que se prestigie en el mercado internacional y que siga siendo
reconocido como típico de Uruguay, el Tannat.
Para implementar dicho sistema es necesario desarrollar un protocolo de calidad que defina atributos
de producto, proceso y envase. Para el desarrollo del protocolo de calidad del producto y de envase se
trabajó en caracterizar los vinos finos Tannat que se comercializan actualmente en mercados exigentes.
Se estudió el perfil de componentes volátiles de 10 vinos finos Tannat pertenecientes a distintas
bodegas y distintos años producidos en Uruguay, mediante análisis por cromatografía gaseosa
acoplada a masa (GC-MS), con el cual se identificaron y cuantificaron diferentes componentes
aromáticos. Conjuntamente se realizó una evaluación sensorial con consumidores, y varios análisis
fisicoquímicos clásicos. Mediante la representación gráfica del mapeo proyectivo obtenido, se logró
una buena agrupación de muestras según la gama del producto, De este ensayo se logró además
obtener una serie de descriptores aromáticos planteados por el panel.
Asimismo se desarrolló un protocolo de calidad del proceso de elaboración de estos vinos, con el fin
de lograr obtener un producto con los atributos composicionales identificados en el relevamiento
inicial. Este protocolo propone buenas prácticas de elaboración, considerando los siguientes aspectos:
- Requisitos generales
- Planificación estratégica y operativa
- Actividades tercerizadas o subcontratadas
- Información documentada
- Sistema de trazabilidad
- Condiciones del establecimiento
- Gestión de recursos humanos
- Calidad de agua
- Limpieza y desinfección
- Control de plagas
- Gestión de residuos
- Gestión de compras
- Procedimiento de Emergencias
- Retirada de productos del mercado
Finalmente se propone validar los protocolos propuestos, mediante la recolección de evidencia objetiva
que demuestre que los protocolos desarrollados son eficaces para el cumplimiento de los objetivos
propuestos, es decir, aspirar a obtener un vino Tannat de exportación con los atributos composicionales
identificados en la primera parte.
Método rápido para el seguimiento de la fermentación maloláctica.
Eduardo Boido1, Eduardo Dellacassa2, Francisco Carrau2 y Patrick Moyna2. 1 Escuela de Vitivinicultura, Ruta 48, Km 18, El Colorado, Canelones. 2 Facultad de Química, Avda. Gral. Flores 2124, 11800 Montevideo.
Resumen.
Para la obtención de vinos de calidad, el control de la fermentación maloláctica (FML) es
esencial. En este trabajo se describe un método por cromatografía en capa fina, mucho más
eficiente que la tradicional en papel, para el control de la FML en bodega. Las ventajas de
éste método son la rapidez de obtención del resultado (aproximadamente una hora), la buena
separación del ácido láctico y el succínico con lo cual se determina con facilidad el inicio de
la FML, su bajo costo y la sencillez para ser utilizada por el enólogo.
Introducción.
En la fermentación secundaria del vino por bacterias lácticas, llamada fermentación
maloláctica (FML), el ácido málico se metaboliza formando ácido láctico y CO2 (8, 9, 10).
La FML ocurre luego de la fermentación alcohólica, aunque en algunos casos se produce
durante la misma, siendo importante en la elaboración de vinos por tres razones:
desacidificación, modificación de las características organolépticas y estabilidad
microbiológica. Esta fermentación puede ser deseada o no según la región vitícola, variedad
de uva, composición del vino, técnicas de elaboración y el estilo buscado por el enólogo.
El seguimiento de la FML es imprescindible en la elaboración de vinos de calidad, ya sea en
aquellos en los cuales se desea que se produzca, y por lo tanto debe conocerse precisamente
el momento en que todo el ácido málico ha sido degradado, así como en aquellos en que
desea evitarse esta fermentación y por lo tanto debe determinarse que no exista formación de
ácido láctico.
El control de la FML puede realizarse por exámenes microbiológicos acompañados de
determinaciones de las cantidades de ácido málico y láctico por medio de métodos
enzimáticos (7) o por cromatografía líquida de alta performance (HPLC) (6).
El método más usado en general para la determinación de estos ácidos es la cromatografía en
papel, ya que las pequeñas bodegas no poseen potentes microscopios, espectrofotómetros o
cromatógrafos, siendo todos estos equipos de alto valor (1).
En cromatografía en papel se utilizan sistemas de solventes como butanol-ácido acético-agua,
usando como revelador azul de bromofenol (4, 11, 12, 13, 14). Este método presenta algunos
inconvenientes, como ser la dificultad para determinar el inicio
de la FML ya que el ácido láctico y succínico tienen la misma movilidad en este sistema, y
además el sistema de solventes necesita varias horas para evaporarse antes de que los ácidos
puedan visualizarse en el cromatograma (1). Todo lo cual lo hace un método poco eficiente.
Para solucionar estos inconvenientes se trabajó con cromatografía en capa fina (TLC, Thin
Layer Cromatography), la cual es una técnica analítica desarrollada hace más de 30 años y
que no requiere de equipos costosos (1, 2, 3).
El método utiliza placas de sílica gel y un sistema de solventes no acuoso ácido acético-
acetato de n-butilo, revelándose con azul de bromofenol. Entre las beneficios respecto a la
cromatografía en papel tenemos que este sistema corre en solo unos 15 a 20 minutos, los
solventes se evaporan rápidamente pudiendo revelar el cromatograma rápidamente y el inicio
de la FML se determina fácilmente por la mejor separación entre el ácido láctico y el
succínico.
En el presente trabajo, se describe un método para el seguimiento de la FML por
cromatografía en capa fina, se ajusta también un método para la cuantificación de los ácidos,
mediante la medida colorimétrica de las manchas obtenidas en la TLC utilizando un TLC-
Scanner (densitómetro).
Materiales y métodos.
Para la realización de la TLC se utilizaron los siguientes materiales:
1 - Una cuba para cromatografía de aproximadamente 10 cm de alto (envase de vidrio con
tapa para poder mantener la cámara saturada de solvente).
2 - Placas para cromatografía en capa fina, de sílica gel de espesor 0.25 mm, Macherey-Nagel
Polygam Sil G/UV254. Estas placas consisten en una fina capa de sílica gel unida a una hoja
de material plástico flexible.
3 - El sistema de solventes ácido acético-acetato de n-butilo (en relación 1-2). Estos
solventes tienen aproximadamente el mismo punto de ebullición y por lo tanto la mezcla es
estable, pudiendo guardarse en un recipiente cerrado por tiempo prolongado.
4 - El revelador utilizado es una solución de azul de bromofenol de 1 g/L en metanol, la que
se ajusta al tono sensible azul con unas gotas de NaOH al 0.4%.
El procedimiento seguido para realizar la TLC es el siguiente:
Las hojas de TLC se cortan de 8 a 10 cm de alto y el ancho suficiente para colocar el número
de muestras requerido, las cuales se colocan con una separación 8 a 10 mm. Las muestras se
colocan a una distancia aproximada de 10 mm del borde inferior, mediante el uso de una
s aplicaciones, secando con aire caliente
una aplicación antes de realizar la siguiente, no debiendo tener las manchas un diámetro
mayor a 2 mm. En la cuba de cromatografía se coloca el sistema de solventes (2 partes de
acetato de n-butilo y 1 parte de ácido acético) hasta tener una profundidad de unos 5 mm,
siendo conveniente colocar los solventes antes de preparar la
placa de cromatografía para dejar que se sature la cámara. Luego se coloca la placa de
cromatografía preparada, debiendo quedar las manchas de las muestras sobre el nivel de
solvente, se tapa y se deja que el solvente ascienda hasta aproximadamente 10 mm del borde
superior lo cual requiere unos pocos minutos en el sistema descrito. Se extrae la placa, se
deja secar los solventes bajo una corriente de aire caliente (durante 10 a 15 minutos) y se
aplica el revelador mojando la placa con un algodón humedecido en el mismo. Los ácidos se
revelan como manchas amarillas sobre un fondo azul.
Para la cuantificación se utiliza un TLC-Scanner Shimadzu CS-9000. Se realiza una curva de
calibración para ácido málico a partir de una solución conteniendo 4.036 g/L en agua
2.4216, 3.2288 y 4.036 g/L (referidos
determinó la longitud de onda de trabajo mediante barrido en el visible de las manchas
obtenidas, escogiéndose el máximo de reflexión que se produce a los 430 nm. La
cuantificación de las manchas se realiza mediante barrido en zig zag de 8 mm y a 430 nm,
relacionándose las áreas de los picos obtenidos con las concentraciones de ácido aplicadas,
determinándose la curva de calibración.
Resultados y discusión.
Los ácidos se separan mediante esta cromatografía ubicándose en orden ascendente el ácido
tartárico, málico, láctico y por último succínico con los valores de Rf que se muestran en la
tabla.
ÁCIDO Rf
Tartárico 0.2
Málico 0.60
Láctico 0.69
Succínico 0.82
La longitud de onda de trabajo para la realización de la curva de calibración es de 430 nm,
correspondiendo a un máximo en la curva de reflexión (figura 1). Este máximo es estable
hasta cinco días de realizada la cromatografía.
La curva de calibración se realiza a partir de los datos de concentración y área de los picos
obtenidos, los cuales se presentan en la tabla.
Concentración (g/L) Área
0.8072 16774,00
1.6144 31817,00
2.4216 48311,00
3.2288 57745,00
4.0360 59921,00
Los datos obtenidos se ajustaron a una curva cuadrática de la siguiente forma:
A = a.C2 + b.C + c
donde: A = área del pico
C = concentración (g/L)
y se obtienen los siguientes coeficientes: a = -3595
b = 31314
c = -7150
con un coeficiente de correlación r2 = 0.9936
En la figura 2 puede verse la curva de ajuste a los datos. El comportamiento de los mismos
es lineal (con correlación 0.999) para concentraciones menores a 3 g/L.
Conclusiones.
La TLC resulta ser un método sencillo, rápido y poco costoso. Los ácidos se revelan
fácilmente y se hacen visibles rápidamente. Los colores son estables por un tiempo
razonable. Por todo lo dicho antes, el método descrito resulta mucho más eficiente frente a la
tradicional cromatografía en papel, siendo más eficiente para controlar la FML en la bodega,
y de fácil aplicación por el enólogo.
Es posible, contando con un equipo más sofisticado, realizar una determinación cuantitativa
de los ácidos del vino.
Bibliografía.
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2 - Dirchner, J.G.; Thin layer chromatography. Wiley-Interscience, New York (1978)
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4 - Ribereau-Gayon, J., Peynaud, E., Sudraud, P., Ribereau-Gayon, P.; Tratado de enología:
Ciencias y técnicas del vino. Tomo I. Hemisferio Sur, Buenos Aires (1980)
5 - Skoog, D.A., West, D.M.; Análisis instrumental. Interamericana, México (1984)
6 - Farinotti, R.; Caude, M.; Mahuzier, G.; Rosset, R.; Separation et detection d'acides mono
carboxyliques saturés a courte chaine par chromatographie ne phase liquide. Analysis, 7,
449-453 (1979)
7 - Boehringer Mannheim; Methods of enzimatic food analysis. Mannheim, West Germany
(1980)
8 - Henick-Kling, T.; Wine, microbiology and biotechnology. Chapter 10: Malolactic
fermentation. Harwood Academic Publishers, Switzerland (1993)
9 - Davis, C.R.; Wibowo, D.; Eschenbruch, R.; Lee, T.H.; Fleet, G.H.; Practical implications
of malolactic fermentation: a review. Am. J. Enol. Vitic., 36 (4), 290-301 (1985)
10 - Henschke, P.A.; An overview of malolactic fermentation research. Wine Industry
Journal, February, 69-79, (1993)
11 - Marsh, G.L.; Kean, C.C. Wines and vines, 33, 19 (1952)
12 - Zampelas, D.A.; Clark, W.L. American Journ. Enol., 8, 43 (1957)
13 - Ribereau-Gayon, J.; Peynaud, E. Bull. Soc. Chim., 5, 226 (1938)
14 - Michod, J.; Rev. romande agric. vitic. arboric., 15, 85 (1959)
Zimevit: un biofungicida que combina la acción de una bacteria y una levadura
para el control del moho gris de la vid ocasionado por Botrytis cinerea.
Zimevit: a biofungicide that combines the action of one bacteria and one yeast for thecontrol of gray mold of grape caused by Botrytis cinerea.
MONDINO, Pedro1; CASANOVA, Leticia1; CALERO, Graciela2; BETANCUR, Oscar3; ALANIZ, Sandra1
1 Unidad de Fitopatología, Facultad de Agronomía, Montevideo - Uruguay, [email protected],[email protected], [email protected]; 2 Escuela Superior de Vitivinicultura, Universidad del Trabajo delUruguay, El Colorado Canelones - Uruguay, [email protected]; 3 Departamento de Estadística y Cómputo,E.E.M.A.C, Paysandú - Uruguay, [email protected]
RESUMO: Botrytis cinerea, provoca pérdidas importantes en la producción de vid. Zimevit, un biofungicida
desarrollado en Uruguay que combina la acción de una bacteria (Bacillus subtilis, UYBC38) y una levadura
(Metschnikowia pulcherrima, M26) fue evaluado a campo en las variedades Cabernet Franc y
Gewurztraminer. Los tratamientos fueron: Zimevit; iprodione como tratamiento convencional y agua como
testigo. En los tres ensayos efectuados la aplicación de Zimevit resultó en una menor incidencia y severidad
del moho gris en los racimos al momento de la cosecha sin diferenciarse del fungicida iprodione. El hecho
de que Zimevit haya logrado reducir tanto la incidencia como la severidad de la enfermedad estaría
demostrando la existencia de un doble efecto inhibitorio, tanto sobre la germinación de esporas como sobre
el desarrollo posterior de la enfermedad. Si bien se recomienda realizar nuevas evaluaciones para conocer
su comportamiento en años con clima favorable al desarrollo de la enfermedad, puede afirmarse que
Zimevit aparece como una herramienta potencial a ser usada en sistemas de manejo integrado del moho
gris de la vid en Uruguay.
PALABRAS CLAVE: Botrytis cinerea; control biológico; moho gris; Zimevit
ABSTRACT: Botrytis cinerea, causes significant losses in grapes production. Zimevit, a biological product
developed in Uruguay that combines the action of a bacterium (Bacillus subtilis, UYBC38) and the yeast
(Metschnikowia pulcherrima, M26), was tested in field in the varieties Cabernet Franc and Gewurztraminer.
The treatments were: Zimevit, iprodione as conventional treatment, and water as untreated control. In the
three tests carried, Zimevit application resulted in a lower incidence and severity of gray mold on grapes at
harvest. No statistically significant differences were observed between the Zimevit and iprodione
treatments. The decrease in the incidence and severity would indicate that Zimevit has a double inhibitory
effect on B. cinerea, both on spores germination and disease development. This effect is attributed to the
combined action of M. pulcherrima and B. subtilis. In spite of that further evaluations are needed in years
with favorable conditions to disease development, Zimevit appears as a tool with potential for use in
integrated management systems of gray mold of grapes in Uruguay.
KEY WORDS: biological control; Botrytis cinerea; grey mold,; Zimevit
Revista Brasileira de AgroecologiaRev. Bras. de Agroecologia. 7(3): 127-134 (2012)ISSN: 1980-9735
Correspondências para: [email protected]
Aceito para publicação em 20/04/2012
Introducción
La viticultura en Uruguay ocupa 8.000 ha con
aproximadamente 27 millones de plantas. La
producción de uva en el año 2010 superó los 110
millones de kilogramos y se destina en su mayoría
a la elaboración de vino (INAVI, 2010). El principal
desafío de los viticultores consiste en lograr una
producción de muy alta calidad, cuidando el medio
ambiente y la salud del consumidor. El moho gris
causado por Botrytis cinerea Pers.:Fr causa
podredumbres de los racimos, provocando
pérdidas importantes en la producción e
interfiriendo con la fermentación, afectando el
sabor y color del vino.
El manejo de B. cinerea basado en el uso de
fungicidas de síntesis química ha demostrado no
ser sustentable, debido a la facilidad con que las
poblaciones de B. cinerea se han tornado
resistentes a los principales grupos químicos
utilizados (POMMER & LORENZ, 1982; ELAD et
al., 1991; LATORRE et al., 1994). En trabajos
recientes se pudo constatar la resistencia a
fungicidas por parte de B. cinerea en Uruguay
(GEPP et al., 2011). Por otra parte, la mayor
conciencia y conocimiento público sobre los efectos
negativos del uso de fungicidas en el medio
ambiente y en la salud de aplicadores y
consumidores se ha visto reflejado en las
regulaciones gubernamentales que han restringido
fuertemente su uso. Las mayores restricciones
impiden la aplicación de fungicidas especialmente
durante el período de precosecha. Es precisamente
durante este período, que las uvas maduran y se
tornan más susceptibles a la infección por B.
cinerea (ELMER & REGLINSKI, 2006).
Las limitaciones del control químico del moho
gris de la vid han obligado al desarrollo de métodos
culturales y biológicos que, incorporados en
sistemas de manejo integrado (MI), permitan
minimizar las pérdidas. El control biológico aparece
como una herramienta promisoria y factible de ser
utilizada en estos sistemas, debido entre otras
cosas, a que los agentes de biocontrol son
percibidos como poco agresivos sobre el medio
ambiente. A su vez, al poseer complejos modos de
acción, su riesgo de generar resistencia es menor.
El hecho de que existan diversos productos
biológicos para el control de B. cinerea que han
alcanzado la etapa comercial muestra que es
posible lograr un control exitoso. Algunos de los
géneros de microorganismos que han mostrado
poseer potencial para el bicontrol de B. cinerea son
Trichoderma y Clonostachys entre los hongos
filamentosos (HARMAN et al., 1996; LATORRE et
al., 1997; SUTTON et al., 1997; COTA el al., 2008),
Bacillus y Pseudomonas entre las bacterias
(WALKER et al., 2001; JACOBSEN et al., 2004) y
Cryptococcus, Pichia y Candida entre las levaduras
(XIANG-HONG et al., 2010; LIMA et al., 1998;
NUNES, et al., 2002; MASIH et al., 2000;
KARABULUT et al., 2003; GARMENDIA et al.,
2005). Las levaduras tienen la capacidad de
colonizar las superficies de las plantas y las heridas
por largos periodos bajo condiciones de muy baja
humedad y antagonizan a los patógenos mediante
la competencia por espacios y nutrientes (SCHENA
et al., 2000; MERCIER & WILSON 1994). En el
caso de las bacterias como Bacillus y
Pseudomonas su principal modo de acción parece
ser la producción de antibióticos (ANJAIAH 2004;
HANG et al., 2005).
Si bien el control biológico de B. cinerea en
ensayos de campo ha tenido resultados erráticos,
eso se explica entre otros factores, por la
variabilidad natural del ambiente en el campo. Para
mejorar la efectividad del control biológico se han
propuesto diversos mecanismos entre los cuales se
encuentra la combinación de agentes de biocontrol
con modos de acción complementarios (GUETSKY
et al., 2001; ELMER & REGLINSKI, 2006).
Aplicaciones foliares tanto de bacterias como de
levaduras saprófitas han demostrado ser efectivas
en el control de B. cinerea (ELAD et al., 1994;
MAGNIN-ROBERT et al., 2007; LIU et al., 2010).
Bacterias y levaduras pueden aplicarse en forma
conjunta debido a que poseen requerimientos
Mondino, Casanova, Calero, Betancur & Alaniz
Rev. Bras. de Agroecologia. 7(3): 127-134 (2012)128
ecológicos y nutricionales diferentes entre sí. Por
otra parte los mecanismos mediante los cuales
ejercen su acción biocontroladora son diferentes y
su aplicación simultanea ha mostrado tener un
efecto sinérgico en el control de B. cinerea
(NUNES et al., 2002; CALVO et al., 2003).
Zimevit es un producto biológico desarrollado en
Uruguay que combina las acciones de una bacteria
y una levadura, aisladas a partir de muestras de
suelo de un viñedo y de la superficie de las uvas
respectivamente. La bacteria es una cepa de
Bacillus subtilis (cepa UYBC38) y la levadura fue
identificada como Metschnikowia pulcherrima
(cepa M26). Ambos aislamientos demostraron ser
fuertemente inhibitorios del crecimiento de B.
cinerea in vitro y no interfieren con las levaduras
responsables de la fermentación para la producción
de vino (RABOSTO et al., 2006).
B. cinerea tiene la capacidad de establecerse
en los restos florales durante el período de floración
de la vid, luego al crecer el racimo queda protegido
dentro del mismo (infecciones latentes). Finalmente
cuando las uvas maduran, se tornan susceptibles a
la invasión de este hongo (ELMER &
MICHAILIDES, 2004). Esta característica del ciclo
de B. cinerea en la uva, define los momentos de
aplicación: floración, previo al cierre del racimo y
envero. La aplicación de agentes de control
biológico tiene por objetivo lograr que los
antagonistas se instalen y colonicen los sitios de
infección antes de que arribe el patógeno
(Mondino, 2006).
La variedad Cabernet Franc es apropiada para
zonas frías por su temprana maduración; presenta
racimos de tamaño mediano-pequeño con una
compacidad media, las bayas son de tamaño
pequeño y contienen un grosor de piel medio. Estas
características le otorgan alta sensibilidad al moho
gris. Gewurztraminer es una variedad de uva de
color rosado y especialmente aromática y de sabor
cítrico, originaria de Europa central empleada para
la elaboración de ciertos vinos blancos de calidad.
Presenta racimos pequeños y compactos lo que
dificulta la aireación de las bayas haciéndolos muy
sensibles a B. cinerea, a pesar del grueso tamaño
de la piel de la uva.
El presente trabajo tiene por objetivo evaluar el
uso del biofungicida Zimevit que combina la acción
de una cepa de la bacteria Bacillus subtilis con una
cepa de la levadura Metschnikowia pulcherrima, en
ensayos de campo para el control del moho gris
ocasionado por Botrytis cinerea en uva de las
variedades Cabernet Franc y Gewurztraminer.
Materiales y métodos
Localización de los ensayos y variedades de
uva utilizadas
Los ensayos fueron realizados en viñedos
pertenecientes a la Escuela Superior de
Vitivinicultura, Universidad del Trabajo del
Uruguay, Ruta 48 km 18, El Colorado Canelones.
Coordenadas 34º 42` 48 S y 56º 14`56 O. El primer
ensayo se realizó durante la temporada 2008-2009
en la variedad Cabernet Franc y los dos siguientes
durante la temporada 2009-2010 en las variedades
Cabernet Franc y Gewurztraminer.
Ambos viñedos son conducidos en espaldera de
1,5m de altura, guiada por 3 alambres sostenidos
por postes de madera separados 8m entre ellos. La
orientación de la filas es Norte Sur y el marco de
plantación 1m entre plantas por 3m entre filas.
Tratamientos efectuados, forma y momentos de
aplicación
En los tres ensayos se efectuaron los siguientes
tratamientos: 1) biofungicida Zimevit (Laboratorio
Santa Elena, Montevideo, Uruguay) a una
concentración de 300mL 100L-1 de agua, 2)
fungicida Rovral (iprodione) (Rovral Aquaflo, Bayer,
500g i.a. L-1) a una concentración de 150mL 100L-
1 de agua como tratamiento convencional y, 3)
agua como testigo sin aplicación.
En cada ensayo se utilizaron 6 filas de 80m.
Cada fila posee 10 tramos de 8m delimitados por
Zimevit: un biofungicida que
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postes de madera. Los tramos terminales de cada
fila se excluyeron del ensayo para eliminar el efecto
de borde. Cada tratamiento estuvo compuesto por
tres repeticiones. Cada repetición se compuso por
cuatro tramos consecutivos evaluándose solamente
los dos tramos centrales. Los tratamientos fueron
asignados mediante sorteo aleatorio.
En cada tratamiento la aplicación de los
productos se realizó en forma manual mediante
máquina de mochila aplicando directamente a la
zona de los racimos hasta lograr el punto de goteo,
en los estadios fenológicos de floración, estadio de
“arveja” y envero.
Evaluación de los ensayos
Al inicio de la cosecha se evaluó incidencia y
severidad en la totalidad de los racimos de los dos
tramos centrales de cada tratamiento. Para evaluar
incidencia se consideró que un racimo se
encontraba enfermo si poseía al menos una baya
afectada. Para la evaluación de la severidad se
utilizó una escala visual que diferencia entre siete
valores de porcentaje de infección: 1, 5,10, 20, 30,
50 y 75% (CHAMBRE D´AGRICULTURE
GIRONDE, 2000). El uso de la escala visual fue
entrenado previamente y una sola persona realizó
la evaluación, mientras que otra anotaba los datos
de forma de minimizar errores debido a la
subjetividad del evaluador.
Análisis de los resultados
Los valores de incidencia se analizaron
utilizando un modelo lineal generalizado asumiendo
una distribución binomial y la función de enlace
logit, mientras que los valores de severidad
mediante un modelo lineal generalizado asumiendo
una distribución multinomial y la función de enlace
logit acumulativa. En ambos casos las medias
fueron comparadas mediante el test Tukey con un
valor de P ≤ 0,05. Todos los análisis se efectuaron
el paquete estadístico SAS 9.2 (SAS Institute Inc.,
Cary, NC. USA)
Resultados y discusión
Los resultados de incidencia y severidad de B.
cinerea en racimos de uva de los tres ensayos
efectuados, se muestran en la Tabla 1.
La aplicación de Zimevit resultó en una menor
incidencia del moho gris en los racimos al momento
de la cosecha comparado con el tratamiento testigo
en los tres ensayos efectuados. Con excepción del
ensayo 3, las diferencias entre las medias
resultaron estadísticamente significativas.
En los tres ensayos las aplicaciones de Zimevit
redujeron la severidad de la enfermedad en los
racimos afectados. En todos los casos la reducción
lograda resultó estadísticamente significativa en
comparación con el tratamiento testigo.
En ninguno de los 3 ensayos realizados hubo
diferencias estadísticamente significativas entre las
aplicaciones del producto biológico Zimevit y del
fungicida iprodione tanto para la incidencia como
para la severidad del moho gris. En el caso del
ensayo realizado sobre la variedad Gewurztraminer
el valor de severidad obtenido fue menor incluso, al
logrado mediante el fungicida iprodione, aunque sin
diferenciarse estadísticamente de éste. Estos
resultados alimentan la expectativa de uso del
Zimevit en el manejo del moho gris de la vid tanto
en sustitución, como en complemento del control
químico en base a iprodione.
El hecho de que Zimevit haya logrado reducir
tanto la incidencia como de la severidad de la
enfermedad estaría demostrando la existencia de
un doble efecto inhibitorio, tanto sobre la
germinación de esporas como sobre el desarrollo
de la enfermedad. Este efecto se debe atribuir a la
acción combinada de M. pulcherrima y de B.
subtilis.
Diferentes levaduras y bacterias han
demostrado ser útiles para el control de B. cinerea
en diferentes cultivos. Recientemente se ha
demostrado que la aplicación de Hanseniaspora
uvarum redujo la incidencia del moho gris en uvas
Mondino, Casanova, Calero, Betancur & Alaniz
Rev. Bras. de Agroecologia. 7(3): 127-134 (2012)130
tanto inoculadas artificialmente como por
inoculación natural. Los autores del trabajo
sugieren que la inhibición lograda se debe
principalmente a su efecto inhibidor de la
germinación de esporas y del desarrollo de las
lesiones (LIU et al., 2010). En tanto que
Saravanakumar et al., (2008) demostraron que la
cepa MACH1 de Metschnikowia pulcherrima inhibe
la germinación de conidios y produce degeneración
del micelio de B. cinerea. Otros trabajos muestran
que cepas de B. subtilis han sido capaces de
antagonizar a B. cinerea mediante la producción
de diferentes antibióticos (HANG et al., 2005). Sin
embargo no se han encontrado trabajos que
evalúen el potencial biocontrolador de ambos tipos
de microorganismos actuando en conjunto. El
control del moho gris en uva mediante el uso de
Zimevit resulta de la acción combinada de estos
dos antagonistas y los ensayos realizados son los
primeros evaluando este formulado comercial.
En los tres ensayos realizados la incidencia y
severidad de la enfermedad resultaron ser muy
bajas, menor al 1% y 5% respectivamente, lo que
es consecuencia de años poco favorables al
desarrollo del moho gris en racimos. Durante las
dos temporadas en que se realizaron los ensayos,
los eventos de lluvia fueron aislados. Durante la
temporada 2008-2009 no ocurrieron
precipitaciones en los meses de diciembre y enero
con un periodo de 55 días consecutivos sin lluvia,
mientras que durante la temporada 2009-2010 no
ocurrieron lluvias luego del 7 de febrero y hasta la
Zimevit: un biofungicida que
Rev. Bras. de Agroecologia. 7(3): 127-134 (2012) 131
Tabla1: Efecto del biofungicida Zimevit (Bacillus subtilis + Metschnikowia pulcherrima) en la incidencia y
severidad del moho gris causado por B. cinerea en uvas de las variedades Cabernet Frank y
Gewurztraminer durante las zafras 2008-2009 y 2009-2010.
a Para evaluar la incidencia todo racimo con al menos una baya afectada se considero enfermo.b Para evaluar la severidad se utilizó una escala visual que diferencia entre siete valores de porcentaje de infección 1,
5, 10, 20, 30, 50 y 75%.c En cada ensayo las medias en las columnas seguidas por la misma letra no se diferencian estadísticamente según el
test de Tukey (P ≤ 0,05).d Iprodione (500g i.a. L-1)
cosecha. Como consecuencia no existieron
periodos lo suficientemente prolongados de alta
humedad relativa como para que la epidemia de B.
cinerea alcanzase la etapa de desarrollo
exponencial.
Las condiciones climáticas poco conducentes al
desarrollo de la enfermedad ponen un manto de
dudas acerca de qué desempeño tendría Zimevit en
condiciones ambientales más favorables al
desarrollo del moho gris. Esto es debido a que
existiría la posibilidad de que los niveles de
enfermedad hubiesen sido mayores si el patógeno
hubiera tenido mejores condiciones para
desarrollarse sobre la planta. Sin embargo se debe
tener en cuenta que las condiciones ambientales
que favorecen al patógeno también pueden
potenciar la acción de estos antagonistas
favoreciendo su actividad antagónica.
B. cinerea es un hongo oportunista por
excelencia y su estrategia es invadir tejidos muertos
o en descomposición, como los restos florales, y
establecerse allí esperando la oportunidad de
invadir los tejidos sanos (HOLZ et al., 2004). Es por
esto que la precolonización de los órganos de la
planta y de las heridas por parte de los
antagonistas, es un elemento clave en el biocontrol
de B. cinerea. La estrategia de aplicación de
Zimevit durante la floración y antes del cierre de
racimo procura que tanto la levadura como la
bacteria antagonistas colonicen estos restos
florales, compitan por ellos con B. cinerea y ejerzan
un efecto antagónico directo sobre el patógeno. Es
importante que esta acción colonizadora y
antagonista la puedan ejercer cuando las
condiciones ambientales sean favorables al
patógeno. En nuestro caso no disponemos de
información generada acerca de cuáles serían las
condiciones ambientales que potencien la acción
colonizadora de flores y frutos por ambos
antagonistas. Lo óptimo sería que las mismas
condiciones que favorecen al patógeno en forma
simultánea favorezcan también la acción de los
antagonistas. Si esto fuese así, es probable que,
condiciones como las ocurridas durante las dos
temporadas en que se desarrollaron los ensayos,
hayan perjudicado simultáneamente tanto a los
antagonistas como al patógeno.
La aplicación de mezclas de antagonistas puede
brindar algunas ventajas como por ejemplo la de
afectar al patógeno en diferentes etapas de su
desarrollo, evitando la infección o previniendo la
esporulación. En este caso el producto biológico ha
demostrado que impide la instalación de las
infecciones reduciendo la incidencia de la
enfermedad en todos los ensayos. A su vez las
reducciones en la severidad logradas en los tres
ensayos pueden explicarse por una menor
esporulación de B. cinerea sobre las bayas
afectadas minimizando el contagio a bayas
contiguas.
Si bien las temporadas en que se realizaron los
ensayos fueron desfavorables al desarrollo de la
enfermedad por las esporádicas precipitaciones
ocurridas, los resultados obtenidos indican que es
posible pensar en la integración del biofungicida
Zimevit en un programa de manejo integrado del
moho gris de la vid. Sin embargo será necesario
evaluar el comportamiento de este biofungicida en
condiciones de mayor presión de enfermedad por lo
que es recomendable repetir ensayos de campo
antes de brindar una recomendación definitiva.
Agradecimientos
Todos los ensayos fueron realizados en viñedos
pertenecientes a la Escuela Superior de
Vitivinicultura, Universidad del Trabajo del Uruguay.
Laboratorio Santa Elena formuló y cedió sin costo el
Zimevit utilizado en estos ensayos. Colaboraron en
los tres ensayos los estudiantes Esteban
Valenzuela; Fiorella Chiola; Leonel López y Juan
Porro.
Mondino, Casanova, Calero, Betancur & Alaniz
Rev. Bras. de Agroecologia. 7(3): 127-134 (2012)132
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4. Vitis vinifera Tannat, chemical characterization and functional properties.
Ten years of research
F. Carrau1, E. Boido1, C. Gaggero2, K. Medina1, L. Fariña1
E. Disegna3 and E. Dellacassa1,4
1Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Gral. Flores 2124 11800-Montevideo, Uruguay; 2Departamento de Biología Molecular
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Avenida Italia 3318 11600-Montevideo, Uruguay; 3Instituto Nacional de Investigación
Agropecuaria, Estación Experimental INIA-Las Brujas, Km. 10 de la Ruta 48 Rincón del Colorado, Canelones, Uruguay; 4Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales, Facultad de Química, Universidad de la República
Gral. Flores 2124, 11800-Montevideo, Uruguay
Abstract. Although the ancient Vitis vinifera Tannat variety is virtually unknown in the international wine market, the strategy to promote it as the Uruguayan emblematic grape variety is starting to become successful in the red wines market. This paper presents a summary of the latest research and developments performed in Uruguay with Tannat since the late 1970s, its origin and production statistics. As an expression of the state-of-the-art viticultural technology developed in Uruguay for this variety during the last ten years, the chemical characterization of the polyphenolic and aroma profiles, typical for this variety, is also presented. The high
Correspondence/Reprint request: Dr. E. Dellacassa, Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales, Facultad de Química, Universidad de la República, Gral. Flores 2124, 11800-Montevideo, Uruguay E-mail: [email protected]
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polyphenolic content of this V. vinifera variety, when compared to other red grapes, confer its wines a high free radicals scavenging activity. Furthermore, from the winemaking point of view, some New World wine-producing countries have planted this grape to blend it with their own varieties, with the purpose of adding more structure and aging potential to their premium red wines. 1. Historical context and origin of Tannat With the arrival of the Spaniards in Uruguay at the end of the 16th century, the first vines were introduced for religious purposes. Spaniards continued to be important in the development of vineyards, and they were instrumental in the arrival of commercial viticulture in Uruguay in 1870, mainly by Basques and Catalans from the Pyrenees region. Many other founding families came from south of France and north of Italy, and a few from Germany, Switzerland and Algeria. Most of them established their vineyards in the south, near the capital city Montevideo. The two main grape varieties first established were Vitis vinifera Tannat and Folle Noir, originating from France [1]. The first one was introduced by Pascual Harriague, a Frenchman from the Basque region, who planted a vineyard of Tannat in 1870, 400 km north of Montevideo, on the outskirts of the city of Salto. Later in the 1880s, this vineyard together with a small winery were bought by the British brothers G. and C. Dickinson & Co., who transformed the winery into one of the best of that time, including a laboratory for microbiology [1]. This was an interesting contribution to the South American wine technology of those days, taking into account that the first studies concerning wine microbiology were published by Louis Pasteur in 1866. Although the technology improved between 1930 and 1970, the wine producers thought in terms of increasing quantity rather than increasing quality. This could be explained by the existence of a closed market for imported wines, very little demand for quality by the consumer and an increase in the local consumption of wine from about 15 to 28 1iters per capita. During the 50s the first hybrids were introduced, the production of Tannat wines were usually blended with Muscat varieties or with these red hybrids and the Harriague wine (name given to Tannat at the time), did not have very good reputation. The search for quality During the 70’s an important phase started aiming for quality and with one clear objective: export. A few private projects began to develop a regional fine wines market, particularly searching for new soils and region conditions all around the country.
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Some of the pioneers of these changes were Juan Carrau in the northeast Rivera region in collaboration with the University of California, Davis [2]; the Faraut family in the central part of the country (Durazno Province); Dante Irurtia in the Carmelo region and other smaller producers that created in 1975 the CREA groups (Regional Centers for Agricultural Experimentation) of grape growers. The first Tannat selected clones and virus free plants were introduced in those days, imported from France and California. Therefore, the Uruguayan Tannat vines are composed by many very old vineyards coming from the original plant material brought by Harriague in 1870, and these first selected clones introduced 100 years later. A summary of the present statistics of the Uruguayan wine industry is shown in Tables 1 and 2. Uruguay is a land of small vineyards in private enterprises (only 1.02% organized in cooperatives and 1.76% in CREA groups). Most of these grape-growers have been running their businesses for more than three generations. The Uruguayan wine industry is, for example, comparable in size with the New Zealand wine industry, except that Uruguayans consume 32 liters per capita per year, doubling the domestic general consumption of New Zealand [3]. It must also be highlighted that Uruguay is considered the purest environment for vineyards of the world, according to the Environmental Sustainability Index (ESI) developed by Yale and Columbia Universities, where different key parameters like air, soil, water, education, etc., are evaluated within 143 countries [4]. According to this index, Uruguay ranked third in the world, after Finland and Norway. An overview of the amount of Vitis vinifera planted in Uruguay is shown in Table 2. Since the 1970’s, Uruguay has been producing fine wines with the Tannat grape which is today considered the Uruguayan flagship variety [5]. It accounts for 1784 hectares of the area of V. vinifera grapes planted in 2009 (Table 2), representing 25% of the total wine grapes. Uruguay was the only country in the Americas where this grape was found 15 years ago [6]. For this reason, the strategy has been to produce wines with this grape using state-of-the-art viticultural technology. In comparison to the viniferas that were planted 10 years ago, there has been an increase of around 3.000 hectares in this period [5]. Oenology: R&D in the industry In 1988, the first oenology course of international level was organized by the CREA groups under the guidance of Professor Robert Cordonnier (from Montpellier). In the 1990s, although the quality of viticultural material had
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Table 1. Statistics of the Uruguayan wine and vines sector.
Hectares planted with vineyards 8.300
Hectares of Vitis vinifera wine varieties 7.500
Grapes producers 2.500
Wine production / year 800.000 hectoliters in 2009
Local consumption 97.0 % (32 L /capita /year including
imported wines)
Exports 3.0% (35.000 cases in 1996)
Total wineries 258 (52% producing under 100.000
liters per year). Source INAVI - Instituto Nacional de Vitivinicultura – Uruguay (2009). Table 2. Major V. vinifera wine varieties in Uruguay, total grape area for 2009 were 7.500 hectares.
Source INAVI - Instituto Nacional de Vitivinicultura – Uruguay (www.inavi.com.uy, 2009).
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improved, R&D on winemaking and oenology under Uruguayan conditions was still very limited. During this time, only a few missions organized by the Centro de Bodegueros (Consultant winemaker Paul Hobbs from California) and wine tastings organized by INAVI (Consultant Dr M. Isabel Mijares, Professor D. Cabezudo and Dr Jose Saez, all from Spain) continued to maintain a minimal critical evaluation, necessary for the evolution of wine quality. Aiming to fill this gap and to give the Uruguayan winemakers the opportunities to acquire the essential knowledge for the next millennium, the School of Chemistry of the Universidad de la República started to organize Advanced Courses of Oenology in 1996 with invited researchers [5]. The first part of these courses included: aroma compounds (Dr G. Versini, Italy), wine microbiology and biotechnology (Dr P. Henschke, Australia) and practical winemaking (invited winemaker Charles Hopkins, South Africa). Since 1994, the oenology section of the School of Chemistry (previously directed by Prof. Cano Marotta) has designed a strategic plan for improving research and has undertaken research projects on:
1. recovery and genetic characterization of old and new Tannat clones 2. biological control of Vitis viniferas pathogenic fungi with native
yeasts and bacteria [7] 3. selection of native yeasts and lactic bacteria. Mixed strain fermentations
with an impact on aroma compounds resulting in increased Tannat complexity.
4. characterization of aroma and phenol compounds from V. vinifera Tannat and other grapes cultivated in Uruguay
5. antioxidant potential and health benefits of V. vinifera Tannat wines. Grape and wine composition
6. understanding consumer expectations about Tannat, sensory analysis, communication and packaging [8].
Tannat clones diversity Paradoxically, very few studies have genetically differentiated clones within a grape variety and together with Pinot noir, the quite unknown Tannat variety is one of the exceptions. Many analyzed microsatellite loci amplified only one allele, implying that Tannat is a highly homozygous variety. For a given set of 15 microsatellites the level of homozygosity was 53 % for Tannat, in contrast to 6 % for Pinot, 20 % for both Cabernet Franc and Chardonnay and 33 % for Cabernet Sauvignon.
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Gonzalez Techera et al. [9] showed that the Tannat clones are genetically very uniform and that the ampelographic differences assigned to the different clones [10] are probably due to epigenetic differences. Only one microsatellite (VMCNg 1d12) out of 89 tested in this study, could clearly distinguish two groups of clones. Both old Uruguayan clones and French commercial clones were found in each group, suggesting that the original sources were probably the same. Interestingly, studying the molecular diversity within Pinot noir clones, 15 microsatellite loci out of 100 were found to be polymorphic, 12 clones out of the 25 under study could be uniquely distinguished and the remaining 13 clones could be separated into 3 groups [11]. These results for Pinot noir contrast with those found for Tannat clones, suggesting that there could have been only two different original sources and propagation histories for these Tannat clones. The considerable clonal diversity observed in Pinot noir may reflect the old origin of this variety, its spreading and crossing history and/or a genome that is more prone to accumulate mutations. However, in spite of the very limited clone diversity found in Tannat, this variety was defined by Durquety as an ancient “cépage” [12] of southwestern France. Historically, Tannat was the dominant and almost exclusive variety planted in the Madiran region of France [13]. This geographic isolation may have promoted natural events of self-fertilization which could explain the high frequency of homozygous loci found for this variety. In contrast with the Pinots, where the viability of selfed progenies declines after a few generations [14], an inbreeding process is not detrimental to Tannat. In the breeding programs of INRA, France, self-fertilization of Tannat plants has been performed successfully, although the resulting new varieties did not perform very well for red wines [15]. On the other hand, the statistical analysis of concentrations for aroma compounds from microvinifications also resulted in the same two groupings of Tannat clones [9]. Interestingly, this was the first report of a correlation between aroma-related compounds and molecular markers within clones of a Vitis vinifera cultivar. 2. Tannat grape and wine composition. Aroma and polyphenols Free and bound volatile compounds of grapes and wines play a definitive role in the quality of our food and luxury products, as a result of their pronounced effect on our sensory organs. As is the case with most food products, the aroma or "bouquet" of a wine is influenced by the action of several hundred different compounds on the human sensory organs.
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Besides, the composition of odorous molecules in grapes is often used for varietal differentiation. The rationale for these studies is that the concentration of volatile compounds of grapes including several alcohols, esters, acids, terpenes, ketones, and aldehydes, can vary depending on the variety [16-18]. Specifically, quali-quantitative composition of terpenes is considered to be very strictly related to varietal origin [16-19]. Genes encoding enzymes catalyzing the biosynthesis of monoterpenes are responsible for the production of these compounds with large structural diversity. In grapes and wines, terpenes can be present in free or bound (glycoside) form. After their synthesis they are converted into their more hydrophilic form in order to prevent cell membrane damage [20]. Glycosidically conjugated terpenes are not odorous and in most cases they are more abundant than non-glycosylated free forms; they give a potential contribution to the aroma of the grape as they are varietal aroma precursors and, during the winemaking process, some terpene compounds can be generated from these precursors through slow enzymatic or chemical hydrolysis [21, 22]. In wines the aroma is influenced by many different factors: grape variety, climate, soil, fermentation conditions, yeast strains, and other oenological production processes. The resulting aromatic profile, with its qualitative and quantitative descriptors, has a key role in the characterization of a typical wine, and compounds considered strictly related to the variety like terpenes and norisoprenoids can be important for the expression of varietal characteristics in wine [23, 24].
Finally, the total content of aroma compounds in wine amounts to approximately 0.8-1.2 g/1, which is equivalent to about 1% of the ethanol concentration. Significant differences exist amongst the individual grape varieties pertaining to the composition of the aroma compounds. From the aromagrams (finger print patterns) it is clear that the quantity of different components (key substances) vary greatly from one another. The work carried out in recent years has demonstrated that most flavor compounds in non-floral grapes are in glycosylated form [25, 26]. It has been proved that some important aromas in wine come from these flavor precursors. For example, β-damascenone, vitispirane, Riesling acetal, 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN), and tert-1-(2,3,6-trimethylphenyl)but-1,3-diene (TPB) are present as free molecules at low or even null levels in grapes, whereas they can be found at higher concentrations in aged wines [27, 28]. Some important monoterpenes, such as α-terpineol, linalool, and geraniol, are also formed from glycoside precursors during fermentation [29, 30], although in this case other sources coexist, such as de novo synthesis [31] or the chemical transformation of free monoterpenes by wine yeasts [31, 32]. In any case, it can be stated that there is strong evidence supporting the
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existence of a connection between the aromatic quality of wine and the grape content of aroma precursors [33]. Tannat grapes produce a very colorful wine, with high acidity and amounts of tannins which allow it to keep for a long time; however, its aroma intensity has been considered moderate when compared to other grape varieties like Cabernet Sauvignon. In our research strategy regarding the aroma components of Tannat wines, we focused the attention principally on compounds possibly linked to varietal peculiarities, in particular the isoprenoids and compounds such as monoterpenols and their bound forms, with the aim of improving the characterization and classification of young Tannat wines [34]. The analytical characterization of the complex flavor profile of Tannat [35] was started as the first approach to better understand this variety. The presence of high concentrations of aromatic glycosylated compounds in Tannat derived from aromatic aglycones, such as C13-norisoprenoids, benzene derivatives, volatile phenols and aliphatic alcohols was determined [36]. From a sensory point of view, Tannat wine aromas were described as raspberry, plum, quince, and small-berry-like scents. In aged wines the aroma descriptors change to dry fruits, smoked, and licorice character [37, 38]. Possible peculiarities of the free forms and also the heteroside fraction may explain some of these aroma descriptors [35]. Sensory analysis of hydrolyzed products also demonstrates the contribution of other glycosylated compounds on Tannat wines [39, 40]. On the other hand, the process of acid hydrolysis occurs quite slowly and can also promote the rearrangement of aglycones, resulting in new aroma molecules [41-43]. Furthermore, the richness of the flavor and quality improvement can be reached through malolactic fermentation (MLF). The influence of lactic acid bacteria during MLF on glycosylated compounds of V. vinifera Tannat wines, using traditional winemaking conditions has also been demonstrated [44, 45]. β-Glycosidase activity of lactic acid bacteria can be proposed as a useful tool for aroma liberation in winemaking. Some modifications found were related to fruity aroma notes, for example differences in “raspberry”, “cherry”, “apricot”, and “dried fig” descriptors. Finally, according to our first results [40], the application of GC-olfactometry technique could also be used for a more in-depth study of the impact of free and bound aroma compounds in this variety. Our data confirmed the presence and potential importance of the relatively high amounts of γ-decalactone and the low levels of linalool, ethyl 2-methylpropanoate, and ethyl hexanoate in the wines of the Tannat variety which were also found to be rich in β-damascenone.
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These results clearly indicate the ability to objectively measure fruit quality as an important requirement to enhance wine quality. However, for glycosylated compounds, no correlation has been found between the classic parameters of fruit evaluation (sugar, pH, acidity) and their concentration. The only method fast enough to assess these glycoconjugates (Glycosyl-Glucose method) is the one developed by Williams et al. [25] and further modified, but this assay might still be considered as a too complex and time-consuming analytical method for practical use when many samples need to be analyzed in a short period of time. Recently, we examined the potential of NIR spectroscopy in combination with chemometric techniques to determine the concentration of the different glycosylated aroma compounds present in Tannat grapes cultivated in Uruguay [46]. Occurrence of polyphenols in Tannat wines Grapes and wine contain different classes of polyphenols. Anthocyanins are responsible for the wine red color while flavan-3-ols are responsible for wine astringency and bitterness. Polymerization of both polyphenol groups contributes to the stabilization of aged wine color. Another group of polyphenols, the flavonols, are usually found as glycosidic forms in almost all higher plants. Phenolic compounds are mainly found in the seeds and internal layers of grape skins, whereas the pulp usually contains very low amounts. Their concentration depends on the cultivar and is influenced by viticultural and environmental factors. The color of wine is one of the first features perceived by consumers, influencing its acceptance and informing about its age, storage conditions, etc. Anthocyanins are extracted to the must during winemaking, providing the characteristic red-purple hue of the young red wines. Once extracted, and at the end of the fermentation, its concentration begins to decline probably due to adsorption by yeasts in the first steps of winemaking, as it was demonstrated for Tannat wines anthocyanins [47]. Later, anthocyanins disappearance could be related to their precipitation or to different type of chemical transformations as condensation, polymerization and oxidation reactions. Some of these chemical modifications imply the anthocyanins degradation, whereas other modifications could yield products that can provide, in turn, different hues to the wine. As a result, during aging the color of the wine evolves to orange-brick hues.
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In the international wine market there is an increasing demand for Tannat wines because they are considered to be original, rich in structure and with aging potential. In fact, one of the most remarkable features of these wines is their intense color, and some studies have shown that Tannat wines, when compared to red wines made from other grape varieties, possess the highest pigment contents [4, 48]. These wines are also characterized by high tannin contents, which lend structure to the wine. Thus, the phenolic fraction of this variety is, nowadays, beginning to be the aim of different studies. The main anthocyanins and their variations with vintage and vineyard treatments have also been reported for Tannat grapes [49]. The anthocyanins composition in young Tannat wines [49, 50] and the qualitative and quantitative changes produced during aging in the main pigment families (anthocyanins, pyranoanthocyanins, direct and acetaldehyde-mediated flavanol-anthocyanin condensation products) have been reported in detail [49]. The wine color properties were considered in order to monitor the color evolution during a 6-year aging period, and also to establish the contribution of the anthocyanin profile to the wine quality [49]. The flavonols, which are found in the grape skins, are extracted to the wine during the vinification. Their content in Tannat grapes was studied and the main compounds quantified were the glucosides and galactosides of quercetin and miricetin, and the laricetin and syringetin glucosides [51]. Grape tannins are sensorial significant components for wine quality. In the wine, the term tannin describes a range of polyphenolic compounds which includes the flavan-3-ol monomers and the proanthocyanidins. Proanthocyanidins are found in all the grape parts, but skins contain lower amounts of proanthocyanidins than do seeds, and their structural characteristics also differ [52]. Grape seed tannins comprise only the procyanidins [53, 54], whereas grape skin tannins comprise both prodelphinidins and procyanidins [53, 55]. Skin proanthocyanidins have a higher mean degree of polymerization (mDP) and a lower percentage of galloylated subunits than those from seeds [56, 57]. Tannat seed flavan-3-ols showed mDP values ranging from 2,5 to 3,0 with an increase during ripening, while the galloylation percentage was around 40% with lower values during maturity [51] (Table 3). In the Tannat skin flavan-3-ol, the prodelphinidins percentage ranged from 30% to 35%, but galloylated forms were not detected [51].
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Table 3. Flavan-3-ol evolution in V. vinifera cv Tannat grape seeds.
Sampling: m1, 20 days after veraison; m2, 10 days before harvest; m3, harvest. Different letters indicate significant differences (p<0.05)3. Functional nutrient and health. 3. Functional nutrient and health
Tannat and oxidative stress During the past decade, many epidemiological studies have shown that the Mediterranean diet appears to have beneficial effects on cardiovascular diseases, a fact that has been known as the “French paradox” [58]. Epidemiological studies have also indicated that dietary habits could influence the incidence or evolution of pathologies such as neurodegenerative disorders [59] in which oxidative stress has been identified as a main contributor. The regular and moderate consumption of wine, especially red wine, appears to be one of the main reasons for these healthy effects. Flavan-3-ols or flavonoids, such as catechin, epicatechin and procyanidins, contribute to the major antioxidant activity of red wines in the prevention of low-density lipoprotein (LDL) cholesterol oxidation [60]. The amount of flavonoids in red wine depends on the grape variety, cultivation area, sun exposure, wine-making technique and wine age [61-63]. Stilbene derivatives present in red wines, as resveratrol, are also postulated as the compounds responsible for the French Paradox. The measurement of resveratrol levels in Tannat wines resulted in an average of 2.7 mg/L, a value higher than the one reported for Pinot Noir, Merlot and Cabernet wines [64]. More recently, Corder et al. [64] used cultured endothelial cells to identify the most potent vasoactive polyphenols in red wine. These compounds were shown to be straight-chain B-type oligomeric procyanidins (OPCs) (tetra-epicatechin gallate, m/z = 1305; procyanidin trimer-gallate, m/z = 1017; procyanidin tetramer, m/z = 1153; and pentamer-gallate, m/z = 1593) by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry. To investigate how the OPC content of red wines from a particular region might relate to mortality in that region, the authors compared wines produced in areas of increased longevity (as an index of overall good health) with a broad selection of wines
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from different countries. Gers or the Southwest of France was shown to have the higher index of human longevity, and this was correlated to the higher OPC content of the wines produced in that region. The authors mention that the higher OPC concentration in wines from southwest France is due to the flavonoid-rich Tannat grape, which makes up a large proportion of the grapes used to produce local wines in the Gers area but is rarely grown elsewhere [65]. Tannat antioxidant activity Moreover, the prevention of pathologies associated with oxidative stress has been related to red wine consumption and the antioxidant phenolic compounds have been suggested as being responsible for this effect. Although a correlation between the antioxidant properties of red wine and its content of phenolic compounds such as flavanols, anthocyanins and tannic acid has been described, the antioxidant properties of red wine has been linked with total polyphenol concentration rather than with individual polyphenols [66]. In this context, different viticultural practices, vinification and maturation processes of the red wine Tannat variety were studied [67] as possible factors influencing the antioxidant capacity and phenolic composition of red wines. In all Tannat wines studied, antioxidant capacity increased with aging although most of the phenolic families remained constant, suggesting the relevance of qualitative changes of these compounds for antioxidant capacity. The same authors [68] intended to assess the cytoprotective capacity of Tannat wine and its phenolic fractions against an oxidative stress stimulus in the pheochromocytoma cell line PC12. The results pointed to natural polyphenols as potential neuroprotective compounds and showed that the specific phenolic fraction is involved in wine cytoprotective properties. Guigluicci et al. [69] reported biochemical modifications of the wine flavonoids during aging that modified their antioxidant properties. The authors paid particular attention to polyphenols of Tannat wine using human low-density lipoprotein (LDL) as clinical model and spectroscopic analysis to follow the oxidation products. In this case it was reported that younger Tannat wines had a more active inhibition of the LDL oxidation by peroxinitrite and lipooxigenase and, as it was expected, shorter macerations time during vinification and barrel aging could also decrease this capacity. On the other hand, Tannat wines with similar total polyphenol content as a Californian Merlot or Cabernet Sauvignon demonstrated double inhibition effect in the oxidation of LDL. The dilution factor for these experiments in a standard red wine is about 1/1000 [70], while for the Tannat wines dilutions
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up to 1/3000 were necessary to discriminate the different treatments. Interestingly, they also showed that an open bottle could lose 30% of its antioxidant capacity after being open for 6 hours [69]. Based on these previous results, Bracesco et al. [71] analyzed a possible genome protection provided by Tannat wine in yeast cell populations exposed to H2O2. Haploid and diploid strains of Saccharomyces cerevisiae were used as eukaryotic model. Cell samples were exposed to H2O2 in a nutrient medium. Chromosomal DNA was analyzed after isolation and separation by pulsed field electrophoresis. Double strand breaks were determined by laser densitometry and application of Poisson distribution. Both haploid and diploid cells showed H2O2 dose dependent DNA fractionation, as well as an increase of lethal -and mutation- events. Upon combination of the Tannat wine and H2O2, a significant decrease of double strand breaks was observed, in association with an increase in surviving fractions. Moreover, no mutagenic effect was observed after wine exposure. Part of the observations regarding protective wine effect was simulated by exposure to high concentrations of α-tocopherol. These results indicate that a grape derivative could act as a genome shielder increasing cell survival probabilities. Among others, the molecular targets involved could be components of transduction redox cascades as well as DNA repair enzymes. 4. Winemaking technology, the Uruguayan strategy As mentioned above, the cultivation area for V. vinifera Tannat is the most extensive in Uruguay and represents the double of hectares cultivated in the French Pyrenees region. Tannat wines are rich in color and tannin contents (two or three times the total polyphenol content of an average Cabernet Sauvignon), but this may result in limited aroma intensity [5]. Moreover, the high polyphenol content of this variety could be explained by a different adaptation to its natural habitat when compared to other varieties. For example, Muscat aromatic varieties may have developed a different environmental strategy, reaching monoterpene concentrations one hundred times higher than other white varieties (e.g. Chardonnay or Sauvignon) or the majority of red varieties. In the last ten years, Uruguayan winemakers and researchers have focused their work in the search for modifications that could increase the aroma expression of the glycosylated aroma compounds of this variety. In parallel, “sur lie” aging winemaking practices resulted in more soft and friendly tannins in the final wine. The results of this work had a great impact on the development of new approaches for the canopy and fruit management,
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open tanks maceration methods, native yeast selection, barrel microxygenation processes and bottle aging. In fact, many vineyard and winemaking practices are being investigated to increase grape aroma precursors and the sensory expression of this variety [31, 34, 45, 47, 73, 74]. As it was stated, the presence of high concentrations of aromatic glycosylated compounds in Tannat [36] furthered the selection of yeast strains applicable for this grape variety and showing increased glucosidase capacity [75]. These odorless glycosidic compounds can be hydrolysed by yeast and malolactic bacteria enzymes during fermentation, as it was demonstrated for Tannat [45]. On the other hand, the presence of high levels of phenolic acids in this variety, the precursors of ethyphenol aroma typically developed by Brettanomyces strains during barrel aging in red wines, has challenged winemakers to monitor this contamination more strictly [76] than for other red wines so as to prevent losing fruit intensity of the final wine. Interestingly, from the winemaking point of view it is worthy to answer the question of: why has this variety been planted in the last 10 years in California, Chile, Argentina, Australia and South Africa. The evident answer is that Tannat grapes give wines with great structure and components which contribute to the wine protection from oxidation in the bottle during the marketing process. Furthermore, between 1985 and 1992, well-known varieties from exotic countries were attractive for a very limited type of consumer. During the last 15 years, an 'experimental consumer' has appeared in the market, particularly interested in New World wines. In this last period, the Tannat variety started to grow and open some important markets. Tannat is the Uruguayan answer to Argentinean Malbec or New Zealand’s Sauvignon blanc. So, although in the beginning it was somewhat difficult to export wines from a small unknown country to the rest of the world, after some years of traveling and participating in fairs in Europe and North America, markets have started to open where Uruguayan wine had not been available before. These new markets include countries such as Finland, Germany, the Netherlands, Denmark, United States, UK, Switzerland, Sweden, Norway and Canada. Even though exports are still too small to be known in the international market, they are expected to increase five-fold by the year 2020. A new organization, Wines of Uruguay (WOU), has defined Tannat as the flagship wine for the next 5 years marketing strategy for the US and European markets, as the ideal wine to differentiate Uruguay from other New World wine producers. This country could occupy an interesting position within the quality wines of the international market in the near future.
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Tannat: Signature red of Uruguay, one example of the many interesting wines now fighting for shelf space from all over the world. The ABCs of Wine Updated Glossary by Dorothy J. Gaiter and John Brecher
The Wall Street Journal, Sunday May 16th, 2009. 5. Perspectives for the 21st century Our researchers in oenology, both chemists and biologists, employ the most efficient analytical methods to conduct their research on the Tannat variety. New molecules of wine aroma, color and flavor have been identified. Besides, we have profiled red wines for important polyphenolic secondary metabolites such as proanthocyanidin and tannins. Sensory analysis, included in the laboratory alongside chemical analysis methods, reveals the importance of molecules present at very low concentrations and the importance of the interactions between them. Genomics used in research on plants, yeast and bacteria reveals the extraordinary complexity of this work for the optimal use of the natural biodiversity involved. Wondering about how chemical composition affects the flavor and body of a wine took our group from the work in viticulture and enology into metabolomics research. There are so many questions in wine science that maybe only a global analysis might start to give answers. Is the so called wine-omics the answer? Does knowing the chemistry behind that wonderful bottle of wine take away the pleasure? Research, Development and Innovation - no question, 21st century is all about them. Acknowledgements The authors wish to thank the scientific assistance of Dr. G. Versini (Istituto Agrario di San Michele all’Adige, Trento, Italy) and Dr. P. Henschke (Australian Wine Research Institute, Adelaide, Australia). Financial support for these ten years of research came from Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA), Comisión Sectorial de Investigación Científica (CSIC-UdelaR), Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII-PDT, Fondo Clemente Estable). We also wish to thank to Dr. Rosana Filip for her invitation to participate in this publication.
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