LIKVORSKA DIJAGNOSTIKA

Željka Vogrinc

Promjene sastava likvora mogu biti posljedica:

Poremećenog metabolizma živčanog tkiva Veće propusnosti barijera Upalne ili imunološke aktivnosti Ulaska ili prisustva stranih elemenata (krv,

zarazne klice, lijekovi, premosnice) Poremećaja u izmjeni likvora Neoplazme Smrti stanica...

Neke bolesti SŽS se ne mogu dijagnosticirati pregledom krvi i/ili urina promjene vidljive samo u likvoru

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

1950-60: nagli razvoj pretraga likvora – pretrage neizostavne u dijagnostici većine bolesti SŽS

Danas: slikovne tehnike (CT, MRI) zamjenjuju pretrage likvora u nekim stanjima (krvarenja, tumori...)

Važnost pretraga likvora: – Akutne upale SŽS (meningitis, Akutne upale SŽS (meningitis,

encefalitis)encefalitis)– Kronične upale SŽS (autoimune Kronične upale SŽS (autoimune

bolesti, vaskulitisi...)bolesti, vaskulitisi...)

Cerebrospinalni likvor

Krv

Ukupan broj stanica

Ukupni proteini

Sediment Supernatant Serum/plazma

Diferencijalna analiza stanica

Aktivirani B limfociti

Specijalna bojenja (RBM, po Gramu i dr.)

Albumin, IgG, IgA, IgM

Albumin, IgG, IgA, IgM

Moždani proteini

Oligoklonski

IgG

Oligoklonski

IgG

NSE

S-100

Prostaglandin D sintetaza

Biljezi demencije

Tumorski biljezi

CEAIgM2 mikroglobulinFeritin

Organizam-specifična

At

Organizam-specifična

At

Moždani proteini u krvi

Q

ASI

PREGLED LABORATORIJSKIH PRETRAGA CST

CITOLOGIJA BIOKEMIJA, IMUNOKEMIJA

Mikrobiologija,PCR

Autoimuna At

PRETRAGE LIKVORA NISU SPECIFIČAN

POKAZATELJ BOLESTI SŽS-a

za svrstavanje u pojedinu skupinu neuroloških bolesti (upalne, neoplastičke, metaboličke...)

PROTEOMIKA

?NOVI BIOMARKERI

Lumbalna punkcija Bolesnik u sjedećem

položaju nagnut prema naprijed ( 20°) ili ležeći na boku

Dezinfekcija, lokalna anestezija

Aseptični uvjeti Dovoljno dugo uzimanje

uzorka (polagano otpuštanje likvora)

Po završetku punkcije bolesnik na trbuhu min. 30 minuta

LIKVOR dostaviti u laboratorij odmah nakon punkcije !!!

LIKVOR dostaviti u laboratorij odmah nakon punkcije !!!

Punkcija :

lumbalna (L3-L4 ili L4-L5 ) - ventrikularna

- subokcipitalna

Punkcija :

lumbalna (L3-L4 ili L4-L5 ) - ventrikularna

- subokcipitalna

Sakupljanje u više epruveta (2-3)

Sakupljanje u više epruveta (2-3)

Istovremeno sakupljanje likvora i seruma!Istovremeno sakupljanje likvora i seruma!

Najčešće indikacije za lumbalnu punkciju:

Klinička sumnja na meningitis Konvulzije s temperaturom (i djeca mađa od 18 mj.) Subarahnoidalno krvarenje (uz normalan CT) Kronične upalne bolesti SŽS-a (MS, SSPE,

neuroborelioza...) Maligna infiltracija u SŽS (hemoblastoze,

adenokarcinomi...) Akutne upalne bolesti perifernog živčanog sustava

(poliradikuloneuritis)

Preporučeno vrijeme prve (dijagnostičke) punkcije

Bolest Preporučeno vrijeme punkcije (od pojave prvih simptoma)

Bakterijski meningitis Virusni meningitis Herpes encefalitis Guillain-Barré-ov poliradikulitis TBC meningitis Krvarenja, traume Akutni ishemijski inzult

1. ili 2. dan 3. do 5. dan 5. do 7. dan 3. do 5. dan 2. do 3. tjedan 6 do 10 sati 36 do 72 sata

Vrijeme ponovne punkcije (druga i treća punkcija) – ovisno o tijeku i kliničkoj slici bolesti

UZORCI LIKVORA KOJI STIŽU U LABORATORIJ:

1. LIKVOR DOBIVEN LUMBALNOM PUNKCIJOM2. LIKVOR DOBIVEN OSTALIM PUNKCIJAMA 3. LIKVOR IZ DRENAŽE (PAMPUS, EVD, LD...)

EPRUVETE:

-Staklene, sterilne bez dodataka

NIKAKO NE RADITI CITOLOGIJU IZ EPRUVETA S CLOT ACTIVATOROM!!

SAMO ZA CITOLOGIJU

OSNOVNE PRETRAGE LIKVORA

IZGLED I BOJA LIKVORA

CITOLOŠKE PRETRAGE

BIOKEMIJSKE PRETRAGE

IZGLED I BOJA LIKVORA

CITOLOŠKE PRETRAGE

BIOKEMIJSKE PRETRAGE

Izgled i boja likvora:

Normalan nalaz likvora: bistar, bezbojan

Zamućen ( leukociti)

(PRIJE I NAKON CENTRIFUGIRANJA)

Nakon centrifugiranja:- najčešće bistar, bilježi se boja

Krvav (eritrociti)

Nakon centrifugiranja:- bezbojan- ksantokroman (vrlo lagano, lagano...) - hemolitičan

1000 eritrocita = bistar, nema vidljive obojenosti

>1000 eritrocita = lagano krvav, krvav...

Ksantokroman

Ostalo (lijekovi, kontrast i sl.)

Krvarenje Eritrociti hemoglobin BILIRUBIN

Hiperbilirubinemija

Oksihemoglobin (412-415; 540; 575 nm)Methemoglobin (406-408; 630 nm)Bilirubin (430-470 nm)

Oksihemoglobin (412-415; 540; 575 nm)Methemoglobin (406-408; 630 nm)Bilirubin (430-470 nm)

Spektralna analiza hem-pigmenata (vidljivi dio spektra 400 – 700 nm)

APSORPCIONI MAKSIMUMI

U normalnom likvoru odrasle osobe hem-pigmenti nisu prisutni!

CITOLOŠKE PRETRAGE LIKVORA

Ukupan broj stanica

Vrste stanica – diferencijalna slika

PUNKCIJA

SPREMNICI (LABORATORIJ)

CITOCENTRIFUGA OBOJENI PREPARAT

CITOLOGIJA LIKVORA

MIKROSKOPSKA ANALIZA

BROJ STANICA

HITNO!

DIFERENCIJALNASLIKA: CITOGRAM

CITOLOGIJA LIKVORA

Vrsta stanica: dojenčad<1 godine Djeca 1-4

godine

odrasli

eritrociti varijabilno varijabilno nekoliko

leukociti 30 x 106/L 20 x 106/L 5 x 106/L

limfociti 5% - 35% 5% - 35% 40% - 80%

monociti 50% - 90% 50% - 90% 15% - 45%

neutrofilni granulociti < 8% < 8% < 6%

0

Nalaz stanica ovisan o dobi T limfociti i monociti, eritrocita

nema

Citološke pretrage likvora (1) Ukupan broj stanica u likvoru

Fuchs Rosenthalova komorica Broj stanica/3 u 1 l ( x 106 / L) Brojanje: nativno ili u razrjeđenju s

fiziološkom otopinom

Hematološki brojači

broj stanica x 106 / L

(3,2(3,2l)l)?

Leukociti se broje i izdaju zasebno od eritrocita

Citološke pretrage likvora (2)

Diferencijalna analiza stanica Izrada preparata:

CitocentrifugaVolumen uzorka : ~ 0.2 ml

Vrijeme izvedbe : <10 min.

Bojenje preparata Metoda po Pappenheimu (MGG)

Reakcija Berlinskog modrila (RBM)

Citokemijska i imunocitokemijska bojenja

Poremećaj stanica u likvoru se može očitovati na više načina:

Povećanjem ukupnog broja stanica (pleocitozom) i do

10000 puta iznad normale (u gnojnim meningitisima)

Pojavom nove vrste stanica (tumorskih, tkivnog porijekla)

Promjenom funkcionalnog stanja stanica (pojava

fagocita ili plazma stanica)

U PLEOCITOZI VEĆINA STANICA U LIKVORU SU REAKTIVNE STANICE

NEUTROFILNI GRANULOCITI

• Gnojne upale SŽS-a • Serozne upale SŽS-a • Reaktivne pleocitoze različite geneze

Gnojni meningitisStanični reaktanti akutne upale SŽS-a

Fagocitiraju strano tijelo, razaraju ga i sami ugibaju

Vrlo uspješan obrambeni mehanizam, ali nespecifičan i time

“opasan” za tkivo SŽS-a

Neutrofilna reakcije je stoga kratkotrajna, i brzo se zamjenjuje

mononuklearnom

EOZINOFILNI GRANULOCITI

• Parazitarne infekcije SŽS-a• Serozne upale različite geneze• Neoplastični procesi i krvarenja• Prisutnost stranog tijela

Meningoencefalitis (cisticerkoza)

Nađu se uz strane ili denaturirane proteine sposobne da izazovu

alergijsku reakciju

Imaju sposobnost fagocitoze

At+Ag kompleksa, stoga

se javljaju nešto kasnije u upali

MONONUKLEARNI FAGOCITI TRANSFORMIRAJU SE IZ MONOCITA I TKIVNIH STANICA

MONOCITI IZ KRVI

TKIVNE STANICE LIKVORSKIH PROSTORA

(mezenhimskog podrijetla)

Fagocitiraju strano tijelo, razaraju ga, nakon prerade mogu ga

predočiti imfocitima

Najčešći tip staničnog odgovora u bolestima SŽS-a

Aktivirani monociti (monocitoidne stanice)

Fagociti : prepoznaje se fagocitirani sadržaj

(leukofag, eritrofag, lipofag, pigmentofag i dr.)

Ishemički moždani udar

Leukofag

Faza “čišćenja” u bakterijskom

meningitisu

Eritrofag

Faza “čišćenja” kod krvarenja u

likvorski prostor

LIMFOCITIVirusni meningitis

• Serozne upale SŽS-a

• Rekovalescentna faza gnojnih upala

• Ostale reaktivne pleocitoze različite

geneze

Prepoznavanjem antigena pokreću specifičnu imunološku

otpornost (staničnu i humoralnu)

Virusni encefalitis (izrazito reaktivne forme limfocita)

Plazma stanice u SŽS-u

Limfoidna i plazma stanica

(Mumps meningitis)

Stvaraju antitijela unutar SŽS-a (intratekalna

sinteza)

Aktivirani B-limfociti plazmociti

U likvoru se dokazuju različitim kvantitativnim i kvalitativnim

metodama

● Subakutne i kronične upale SŽS-a različite etiopatogeneze

- infekcije “velikim” virusima grupa mikso/paramikso i herpes

- autoimune bolesti tipa multipla skleroza

Tumorske stanice (metastaze u SŽS-u)

Adenokarcinom

Limfatička leukemija

Biokemijske pretrage likvora:

Glukoza Laktat Kloridi CRP Proteini

Kvantitativne analize Kvalitativne analize

Za analize koristiti centrifugirani likvor!Za analize koristiti centrifugirani likvor!

GLUKOZA Koncentracija u likvoru ovisna o

koncentraciji u krvi (u likvoru 60 % vrijednosti iz krvi); ravnotežno stanje se uspostavlja nakon 3-4 sata (KMB)

Stabilnost ovisna o broju stanica i prisutnosti bakterija

Snižene vrijednosti :Bakterijski meningitis

- poremećeni mehanizmi ulaska iz krvi (olakšana difuzija)

- pojačana potrošnja (leukociti)KrvarenjaMetastaze u meningama i dr.

LAKTAT Pokazatelj anaerobne glikolize u moždanom tkivu Metaboličke promjene Neovisan o koncentraciji u krvi! Normalan nalaz : 1,2-2,2 mmol/L

Povišene vrijednosti: bakterijski meningitis – diferencijalna dijagnoza

(laktat CST laktat CST ≥≥ 4,0 4,0 mmol/L)CVIHipoksijaTraume glave, konvulzije i dr.

PROTEINI U LIKVORU

Oko 80 % proteina u likvoru je krvnog podrijetla, oko 15 % je antigenski srodno krvnim proteinima i dodatno se stvaraju i unutar SŽS-a (npr. prealbumin / transtiretin)

DOB REFERENTNE VRIJEDNOSTI:

0-6 mjeseci 0,10-1,20 g/L

odrasli 0,15-0,40 g/L

> 40 godina Porast koncentracije s dobi

Najčešći uzroci poremećaja proteina u likvoru:

Ulazak plazmatskih proteina kroz sustav barijera (akutne upale različite etiopatogeneze)

Usporena izmjena likvora (jaki edem mozga, tumorske tvorbe koje urastaju u likvorske prostore)

Direktan unos plazmatskih proteina (traume mozga, teška krvarenja u likvorski prostor)

Lokalna (intratekalna) sinteza protutijela unutar SŽS-a (kronične upale različite etiopatogeneze)

Evaluacija proteina u likvoru

Kvantitativne metodeKvantitativne metode Kvalitativne metodeKvalitativne metode

• Ukupni proteini

• Albumin, IgG, IgA, IgM (likvor + serum) → kvocijenti Q (L/S) Matematički model po Reiber-u za evaluaciju kvocijenata Q Procjena funkcije barijere i lokalne (intratekalne) sinteze imunoglobulina

• Elektroforeza

• Multifrakcionirana elektroforeza

• Izoelektrično fokusiranje

Ostali proteini (CEA, NSE, MBP i dr.)

Dokazivanje intratekalne sinteze imunoglobulina

Nalaz “oligoklonskih” IgG

Kvocijenti (Q) za procjenu stanja KMB i intratekalnu sintezu At:

Qalb = alb(likvor) / alb(serum)

QIgG = IgG(likvor) / IgG(serum)QIgG = IgG(likvor) / IgG(serum)

Qalb

QIgG

Stanje barijere

Sinteza At unutar SŽSSinteza At unutar SŽS

Reiberov matematičko-statistički modelza evaluaciju proteinskih kvocijenata

“REIBERGRAM” Procjena funkcije barijere i intratekalne sinteze

protutijela

1 – Normalna funkcija barijere

2 – Disfunkcija barijere s proporcionalnim

porastom Alb i IgG kvocijenta

3 – Disfunkcija barijere uz sintezu IgG

unutar SŽS-a

4 – Normalna funkcija barijere uz sintezu

IgG unutar SŽS-a

5 - Rezultati nesigurnog biološkog značaja (posljedica analitičke greške)

Elektroforeza proteina likvora Multifrakcionirana elektroforeza + imunoprecipitacija s anti-IgG antiserumom

Denzitometrijski prikaz

Serum

Likvor

Izoelektrično fokusiranje + imunoprecipitacija s anti-IgG antiserumom

Elektroforetske tehnike za evaluaciju proteina u likvoru i dokazivanje oligoklonskih IgG

Cilj kvalitativnih (elektroforetskih) metoda je dokazivanje promjena prvenstveno u gama globulinskoj frakciji – promjene imunoglobulina

DIFERENCIJALNA DIJAGNOSTIKA KRONIČNIH UPALNIH BOLESTI SŽS

Kronične upalne bolesti SŽS-a

Dugotrajna stimulacija humoralnog odgovora unutar SŽSa (limfocitna reakcija traje tjednima i mjesecima)

Lokalno (intratekalno) stvaranje antitijela (imunoglobulini A, G, M)

Lokalno stvoreni imunoglobulini – uske, oligoklonske zone u gama globulinskoj frakciji u elektroforezi

Karakteristične značajke humoralnog odgovora unutar SŽSa:

Intratekalno stvorena frakcija Ig i do 90% od ukupnog Ig

Dugotrajna sinteza i spora normalizacija “Oligoklonski” tip humoralnog odgovora

protutijela ograničene heterogenosti

Definicija OIgG u likvoru:Nalaz barem dvije vrpce Ig u likvoru koje nisu prisutne i u serumu

INDEKS ANTIGEN-SPECIFIČNIH PROTUTIJELA (AI)Određuje udio intratekalno stvorenih antigen-specifičnih protutijela u pulu imunoglobulina likvora (iste klase Ig)

1. Određivanje titrova specifičnih protutijela

2. Određivanje specifičnih protutijela ELISA metodom

CST- titar x serum - IgG

CST- IgG x serum - titar( normalno < 4 )

Kvocijent specifičnih At (CST/S)

Kvocijent imunoglobulina (CST/S)

Q spec. At

Q Ig(normalno < 1.5)

AI =

(Morbili, Rubela, Varicela zoster) - MRZ reakcija

AI =

NALAZI LIKVORA

Izgled: zamućen (bjelkast, žućkast)Citološki nalaz: pleocitozaUkupan broj leukocita: > 1000/LDiferencijalna slika: 80% neutrofilnih granulocita

Biokemijski nalaz:Glukoza : < 2,2 mmol/L- omjer glukoza CST/serum : < 0,6Laktat: > 4,0 mmol/LUkupni proteini: > 1,0 g/LCRP: > 1 mg/L

Mikrobiološki nalaz- izoloran uzročnik (70-90%)

Izgled: bistar, bezbojanCitološki nalaz:Ukupan broj leukocita: 100-1000/LDiferencijalna slika:mononuklearne stanice (limfociti, monociti)< 20% neutrofilnih granulocitaBiokemijski nalaz:Glukoza: normalan nalaz- omjer glukoza CST/serum : > 0,6Laktat: normalan nalazUkupni proteini: 0,5-1,0 g/LCRP: < 1,0 mg/L

Mikrobiološki nalaz:- negativan nalaz kulture

BAKTERIJSKI MENINGITIS VIRUSNI MENINGITIS

Nalaz likvora u encefalitisu

Citološki nalaz:Ukupan broj stanica: - blago do mjereno povišen Diferencijalna slika:- različiti reaktivni oblici mononuklearnih stanica, stanice ependima, bazofili

Biokemijski nalaz:Glukoza: normalna ili povišenaProteini: ovisno o etiologiji (blago do umjereno povišeni)

- povećana gama globulinska frakcija; moguć nalaz oligoklonskih Ig

Nalaz ovisi o etiologiji, proširenosti i stupnju patoanatomskih promjena u mozgu

Citološki nalaz likvora: • ukupan broj stanica normalan (remisija) ili blago do umjereno povišen (relaps) • prevladavaju mononuklearne stanice (limfociti, monociti, reaktivni oblici mononuklearnih stanica)

Biokemijski nalaz likvora: • Proteini: blago povišene vrijednosti

Elektroforeza proteina likvora: • povećana gama globulinska frakcija

IEF+imunofiksacija: nalaz oligoklonskih IgG (u 95-98%)

Dokazana lokalna sinteza IgG-a: (kvantitativno, Reiber) - oko 75%

MRZ reakcija: pozitivna

Nalaz likvora kod MS

Limfociti (mononuklearne stanice)

OIg

Reiberov dijagram

Nalaz likvora u svježem subarahnoidnom krvarenju:

Izgled, boja: - krvav, bistar/lag. ksantokroman

Hematogeni pigmenti:- oksiHb /trag bilirubina

Citološki nalaz:Nalaz eritrocita, odnos L:E veći od krvi(neutrofilija)

Biokemijski nalaz:Glukoza: sniženaLaktat: povišenUkupni proteini: povišeni (ovisno o jačini krvarenja)

OksiHb

NALAZ TRAUMATSKA PUNKCIJA

SAH

ksantokromija CST ne da

smanjenje broja E od 1. do 3. epruvete

da ne

spontana koagulacija CST da ne

omjer leukociti/eritrociti sličan perifernoj krvi (1:1000)

premašuje onaj u perifernoj krvi

OČEKIVANI NALAZI CST U TRAUMATSKOJ PUNKCIJI NASUPROT SAH