Promjene sastava likvora mogu biti posljedica:
Poremećenog metabolizma živčanog tkiva Veće propusnosti barijera Upalne ili imunološke aktivnosti Ulaska ili prisustva stranih elemenata (krv,
zarazne klice, lijekovi, premosnice) Poremećaja u izmjeni likvora Neoplazme Smrti stanica...
Neke bolesti SŽS se ne mogu dijagnosticirati pregledom krvi i/ili urina promjene vidljive samo u likvoru
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
1950-60: nagli razvoj pretraga likvora – pretrage neizostavne u dijagnostici većine bolesti SŽS
Danas: slikovne tehnike (CT, MRI) zamjenjuju pretrage likvora u nekim stanjima (krvarenja, tumori...)
Važnost pretraga likvora: – Akutne upale SŽS (meningitis, Akutne upale SŽS (meningitis,
encefalitis)encefalitis)– Kronične upale SŽS (autoimune Kronične upale SŽS (autoimune
bolesti, vaskulitisi...)bolesti, vaskulitisi...)
Cerebrospinalni likvor
Krv
Ukupan broj stanica
Ukupni proteini
Sediment Supernatant Serum/plazma
Diferencijalna analiza stanica
Aktivirani B limfociti
Specijalna bojenja (RBM, po Gramu i dr.)
Albumin, IgG, IgA, IgM
Albumin, IgG, IgA, IgM
Moždani proteini
Oligoklonski
IgG
Oligoklonski
IgG
NSE
S-100
Prostaglandin D sintetaza
Biljezi demencije
Tumorski biljezi
CEAIgM2 mikroglobulinFeritin
Organizam-specifična
At
Organizam-specifična
At
Moždani proteini u krvi
Q
ASI
PREGLED LABORATORIJSKIH PRETRAGA CST
CITOLOGIJA BIOKEMIJA, IMUNOKEMIJA
Mikrobiologija,PCR
Autoimuna At
PRETRAGE LIKVORA NISU SPECIFIČAN
POKAZATELJ BOLESTI SŽS-a
za svrstavanje u pojedinu skupinu neuroloških bolesti (upalne, neoplastičke, metaboličke...)
PROTEOMIKA
?NOVI BIOMARKERI
Lumbalna punkcija Bolesnik u sjedećem
položaju nagnut prema naprijed ( 20°) ili ležeći na boku
Dezinfekcija, lokalna anestezija
Aseptični uvjeti Dovoljno dugo uzimanje
uzorka (polagano otpuštanje likvora)
Po završetku punkcije bolesnik na trbuhu min. 30 minuta
LIKVOR dostaviti u laboratorij odmah nakon punkcije !!!
LIKVOR dostaviti u laboratorij odmah nakon punkcije !!!
Punkcija :
lumbalna (L3-L4 ili L4-L5 ) - ventrikularna
- subokcipitalna
Punkcija :
lumbalna (L3-L4 ili L4-L5 ) - ventrikularna
- subokcipitalna
Sakupljanje u više epruveta (2-3)
Sakupljanje u više epruveta (2-3)
Istovremeno sakupljanje likvora i seruma!Istovremeno sakupljanje likvora i seruma!
Najčešće indikacije za lumbalnu punkciju:
Klinička sumnja na meningitis Konvulzije s temperaturom (i djeca mađa od 18 mj.) Subarahnoidalno krvarenje (uz normalan CT) Kronične upalne bolesti SŽS-a (MS, SSPE,
neuroborelioza...) Maligna infiltracija u SŽS (hemoblastoze,
adenokarcinomi...) Akutne upalne bolesti perifernog živčanog sustava
(poliradikuloneuritis)
Preporučeno vrijeme prve (dijagnostičke) punkcije
Bolest Preporučeno vrijeme punkcije (od pojave prvih simptoma)
Bakterijski meningitis Virusni meningitis Herpes encefalitis Guillain-Barré-ov poliradikulitis TBC meningitis Krvarenja, traume Akutni ishemijski inzult
1. ili 2. dan 3. do 5. dan 5. do 7. dan 3. do 5. dan 2. do 3. tjedan 6 do 10 sati 36 do 72 sata
Vrijeme ponovne punkcije (druga i treća punkcija) – ovisno o tijeku i kliničkoj slici bolesti
UZORCI LIKVORA KOJI STIŽU U LABORATORIJ:
1. LIKVOR DOBIVEN LUMBALNOM PUNKCIJOM2. LIKVOR DOBIVEN OSTALIM PUNKCIJAMA 3. LIKVOR IZ DRENAŽE (PAMPUS, EVD, LD...)
EPRUVETE:
-Staklene, sterilne bez dodataka
NIKAKO NE RADITI CITOLOGIJU IZ EPRUVETA S CLOT ACTIVATOROM!!
SAMO ZA CITOLOGIJU
OSNOVNE PRETRAGE LIKVORA
IZGLED I BOJA LIKVORA
CITOLOŠKE PRETRAGE
BIOKEMIJSKE PRETRAGE
IZGLED I BOJA LIKVORA
CITOLOŠKE PRETRAGE
BIOKEMIJSKE PRETRAGE
Izgled i boja likvora:
Normalan nalaz likvora: bistar, bezbojan
Zamućen ( leukociti)
(PRIJE I NAKON CENTRIFUGIRANJA)
Nakon centrifugiranja:- najčešće bistar, bilježi se boja
Krvav (eritrociti)
Nakon centrifugiranja:- bezbojan- ksantokroman (vrlo lagano, lagano...) - hemolitičan
1000 eritrocita = bistar, nema vidljive obojenosti
>1000 eritrocita = lagano krvav, krvav...
Ksantokroman
Ostalo (lijekovi, kontrast i sl.)
Krvarenje Eritrociti hemoglobin BILIRUBIN
Hiperbilirubinemija
Oksihemoglobin (412-415; 540; 575 nm)Methemoglobin (406-408; 630 nm)Bilirubin (430-470 nm)
Oksihemoglobin (412-415; 540; 575 nm)Methemoglobin (406-408; 630 nm)Bilirubin (430-470 nm)
Spektralna analiza hem-pigmenata (vidljivi dio spektra 400 – 700 nm)
APSORPCIONI MAKSIMUMI
U normalnom likvoru odrasle osobe hem-pigmenti nisu prisutni!
PUNKCIJA
SPREMNICI (LABORATORIJ)
CITOCENTRIFUGA OBOJENI PREPARAT
CITOLOGIJA LIKVORA
MIKROSKOPSKA ANALIZA
BROJ STANICA
HITNO!
DIFERENCIJALNASLIKA: CITOGRAM
CITOLOGIJA LIKVORA
Vrsta stanica: dojenčad<1 godine Djeca 1-4
godine
odrasli
eritrociti varijabilno varijabilno nekoliko
leukociti 30 x 106/L 20 x 106/L 5 x 106/L
limfociti 5% - 35% 5% - 35% 40% - 80%
monociti 50% - 90% 50% - 90% 15% - 45%
neutrofilni granulociti < 8% < 8% < 6%
0
Nalaz stanica ovisan o dobi T limfociti i monociti, eritrocita
nema
Citološke pretrage likvora (1) Ukupan broj stanica u likvoru
Fuchs Rosenthalova komorica Broj stanica/3 u 1 l ( x 106 / L) Brojanje: nativno ili u razrjeđenju s
fiziološkom otopinom
Hematološki brojači
broj stanica x 106 / L
(3,2(3,2l)l)?
Leukociti se broje i izdaju zasebno od eritrocita
Citološke pretrage likvora (2)
Diferencijalna analiza stanica Izrada preparata:
CitocentrifugaVolumen uzorka : ~ 0.2 ml
Vrijeme izvedbe : <10 min.
Bojenje preparata Metoda po Pappenheimu (MGG)
Reakcija Berlinskog modrila (RBM)
Citokemijska i imunocitokemijska bojenja
Poremećaj stanica u likvoru se može očitovati na više načina:
Povećanjem ukupnog broja stanica (pleocitozom) i do
10000 puta iznad normale (u gnojnim meningitisima)
Pojavom nove vrste stanica (tumorskih, tkivnog porijekla)
Promjenom funkcionalnog stanja stanica (pojava
fagocita ili plazma stanica)
U PLEOCITOZI VEĆINA STANICA U LIKVORU SU REAKTIVNE STANICE
NEUTROFILNI GRANULOCITI
• Gnojne upale SŽS-a • Serozne upale SŽS-a • Reaktivne pleocitoze različite geneze
Gnojni meningitisStanični reaktanti akutne upale SŽS-a
Fagocitiraju strano tijelo, razaraju ga i sami ugibaju
Vrlo uspješan obrambeni mehanizam, ali nespecifičan i time
“opasan” za tkivo SŽS-a
Neutrofilna reakcije je stoga kratkotrajna, i brzo se zamjenjuje
mononuklearnom
EOZINOFILNI GRANULOCITI
• Parazitarne infekcije SŽS-a• Serozne upale različite geneze• Neoplastični procesi i krvarenja• Prisutnost stranog tijela
Meningoencefalitis (cisticerkoza)
Nađu se uz strane ili denaturirane proteine sposobne da izazovu
alergijsku reakciju
Imaju sposobnost fagocitoze
At+Ag kompleksa, stoga
se javljaju nešto kasnije u upali
MONONUKLEARNI FAGOCITI TRANSFORMIRAJU SE IZ MONOCITA I TKIVNIH STANICA
MONOCITI IZ KRVI
TKIVNE STANICE LIKVORSKIH PROSTORA
(mezenhimskog podrijetla)
Fagocitiraju strano tijelo, razaraju ga, nakon prerade mogu ga
predočiti imfocitima
Najčešći tip staničnog odgovora u bolestima SŽS-a
Aktivirani monociti (monocitoidne stanice)
Fagociti : prepoznaje se fagocitirani sadržaj
(leukofag, eritrofag, lipofag, pigmentofag i dr.)
Ishemički moždani udar
Leukofag
Faza “čišćenja” u bakterijskom
meningitisu
Eritrofag
Faza “čišćenja” kod krvarenja u
likvorski prostor
LIMFOCITIVirusni meningitis
• Serozne upale SŽS-a
• Rekovalescentna faza gnojnih upala
• Ostale reaktivne pleocitoze različite
geneze
Prepoznavanjem antigena pokreću specifičnu imunološku
otpornost (staničnu i humoralnu)
Virusni encefalitis (izrazito reaktivne forme limfocita)
Plazma stanice u SŽS-u
Limfoidna i plazma stanica
(Mumps meningitis)
Stvaraju antitijela unutar SŽS-a (intratekalna
sinteza)
Aktivirani B-limfociti plazmociti
U likvoru se dokazuju različitim kvantitativnim i kvalitativnim
metodama
● Subakutne i kronične upale SŽS-a različite etiopatogeneze
- infekcije “velikim” virusima grupa mikso/paramikso i herpes
- autoimune bolesti tipa multipla skleroza
Biokemijske pretrage likvora:
Glukoza Laktat Kloridi CRP Proteini
Kvantitativne analize Kvalitativne analize
Za analize koristiti centrifugirani likvor!Za analize koristiti centrifugirani likvor!
GLUKOZA Koncentracija u likvoru ovisna o
koncentraciji u krvi (u likvoru 60 % vrijednosti iz krvi); ravnotežno stanje se uspostavlja nakon 3-4 sata (KMB)
Stabilnost ovisna o broju stanica i prisutnosti bakterija
Snižene vrijednosti :Bakterijski meningitis
- poremećeni mehanizmi ulaska iz krvi (olakšana difuzija)
- pojačana potrošnja (leukociti)KrvarenjaMetastaze u meningama i dr.
LAKTAT Pokazatelj anaerobne glikolize u moždanom tkivu Metaboličke promjene Neovisan o koncentraciji u krvi! Normalan nalaz : 1,2-2,2 mmol/L
Povišene vrijednosti: bakterijski meningitis – diferencijalna dijagnoza
(laktat CST laktat CST ≥≥ 4,0 4,0 mmol/L)CVIHipoksijaTraume glave, konvulzije i dr.
PROTEINI U LIKVORU
Oko 80 % proteina u likvoru je krvnog podrijetla, oko 15 % je antigenski srodno krvnim proteinima i dodatno se stvaraju i unutar SŽS-a (npr. prealbumin / transtiretin)
DOB REFERENTNE VRIJEDNOSTI:
0-6 mjeseci 0,10-1,20 g/L
odrasli 0,15-0,40 g/L
> 40 godina Porast koncentracije s dobi
Najčešći uzroci poremećaja proteina u likvoru:
Ulazak plazmatskih proteina kroz sustav barijera (akutne upale različite etiopatogeneze)
Usporena izmjena likvora (jaki edem mozga, tumorske tvorbe koje urastaju u likvorske prostore)
Direktan unos plazmatskih proteina (traume mozga, teška krvarenja u likvorski prostor)
Lokalna (intratekalna) sinteza protutijela unutar SŽS-a (kronične upale različite etiopatogeneze)
Evaluacija proteina u likvoru
Kvantitativne metodeKvantitativne metode Kvalitativne metodeKvalitativne metode
• Ukupni proteini
• Albumin, IgG, IgA, IgM (likvor + serum) → kvocijenti Q (L/S) Matematički model po Reiber-u za evaluaciju kvocijenata Q Procjena funkcije barijere i lokalne (intratekalne) sinteze imunoglobulina
• Elektroforeza
• Multifrakcionirana elektroforeza
• Izoelektrično fokusiranje
Ostali proteini (CEA, NSE, MBP i dr.)
Dokazivanje intratekalne sinteze imunoglobulina
Nalaz “oligoklonskih” IgG
Kvocijenti (Q) za procjenu stanja KMB i intratekalnu sintezu At:
Qalb = alb(likvor) / alb(serum)
QIgG = IgG(likvor) / IgG(serum)QIgG = IgG(likvor) / IgG(serum)
Qalb
QIgG
Stanje barijere
Sinteza At unutar SŽSSinteza At unutar SŽS
Reiberov matematičko-statistički modelza evaluaciju proteinskih kvocijenata
“REIBERGRAM” Procjena funkcije barijere i intratekalne sinteze
protutijela
1 – Normalna funkcija barijere
2 – Disfunkcija barijere s proporcionalnim
porastom Alb i IgG kvocijenta
3 – Disfunkcija barijere uz sintezu IgG
unutar SŽS-a
4 – Normalna funkcija barijere uz sintezu
IgG unutar SŽS-a
5 - Rezultati nesigurnog biološkog značaja (posljedica analitičke greške)
Elektroforeza proteina likvora Multifrakcionirana elektroforeza + imunoprecipitacija s anti-IgG antiserumom
Denzitometrijski prikaz
Serum
Likvor
Izoelektrično fokusiranje + imunoprecipitacija s anti-IgG antiserumom
Elektroforetske tehnike za evaluaciju proteina u likvoru i dokazivanje oligoklonskih IgG
Cilj kvalitativnih (elektroforetskih) metoda je dokazivanje promjena prvenstveno u gama globulinskoj frakciji – promjene imunoglobulina
DIFERENCIJALNA DIJAGNOSTIKA KRONIČNIH UPALNIH BOLESTI SŽS
Kronične upalne bolesti SŽS-a
Dugotrajna stimulacija humoralnog odgovora unutar SŽSa (limfocitna reakcija traje tjednima i mjesecima)
Lokalno (intratekalno) stvaranje antitijela (imunoglobulini A, G, M)
Lokalno stvoreni imunoglobulini – uske, oligoklonske zone u gama globulinskoj frakciji u elektroforezi
Karakteristične značajke humoralnog odgovora unutar SŽSa:
Intratekalno stvorena frakcija Ig i do 90% od ukupnog Ig
Dugotrajna sinteza i spora normalizacija “Oligoklonski” tip humoralnog odgovora
protutijela ograničene heterogenosti
Definicija OIgG u likvoru:Nalaz barem dvije vrpce Ig u likvoru koje nisu prisutne i u serumu
INDEKS ANTIGEN-SPECIFIČNIH PROTUTIJELA (AI)Određuje udio intratekalno stvorenih antigen-specifičnih protutijela u pulu imunoglobulina likvora (iste klase Ig)
1. Određivanje titrova specifičnih protutijela
2. Određivanje specifičnih protutijela ELISA metodom
CST- titar x serum - IgG
CST- IgG x serum - titar( normalno < 4 )
Kvocijent specifičnih At (CST/S)
Kvocijent imunoglobulina (CST/S)
Q spec. At
Q Ig(normalno < 1.5)
AI =
(Morbili, Rubela, Varicela zoster) - MRZ reakcija
AI =
Izgled: zamućen (bjelkast, žućkast)Citološki nalaz: pleocitozaUkupan broj leukocita: > 1000/LDiferencijalna slika: 80% neutrofilnih granulocita
Biokemijski nalaz:Glukoza : < 2,2 mmol/L- omjer glukoza CST/serum : < 0,6Laktat: > 4,0 mmol/LUkupni proteini: > 1,0 g/LCRP: > 1 mg/L
Mikrobiološki nalaz- izoloran uzročnik (70-90%)
Izgled: bistar, bezbojanCitološki nalaz:Ukupan broj leukocita: 100-1000/LDiferencijalna slika:mononuklearne stanice (limfociti, monociti)< 20% neutrofilnih granulocitaBiokemijski nalaz:Glukoza: normalan nalaz- omjer glukoza CST/serum : > 0,6Laktat: normalan nalazUkupni proteini: 0,5-1,0 g/LCRP: < 1,0 mg/L
Mikrobiološki nalaz:- negativan nalaz kulture
BAKTERIJSKI MENINGITIS VIRUSNI MENINGITIS
Nalaz likvora u encefalitisu
Citološki nalaz:Ukupan broj stanica: - blago do mjereno povišen Diferencijalna slika:- različiti reaktivni oblici mononuklearnih stanica, stanice ependima, bazofili
Biokemijski nalaz:Glukoza: normalna ili povišenaProteini: ovisno o etiologiji (blago do umjereno povišeni)
- povećana gama globulinska frakcija; moguć nalaz oligoklonskih Ig
Nalaz ovisi o etiologiji, proširenosti i stupnju patoanatomskih promjena u mozgu
Citološki nalaz likvora: • ukupan broj stanica normalan (remisija) ili blago do umjereno povišen (relaps) • prevladavaju mononuklearne stanice (limfociti, monociti, reaktivni oblici mononuklearnih stanica)
Biokemijski nalaz likvora: • Proteini: blago povišene vrijednosti
Elektroforeza proteina likvora: • povećana gama globulinska frakcija
IEF+imunofiksacija: nalaz oligoklonskih IgG (u 95-98%)
Dokazana lokalna sinteza IgG-a: (kvantitativno, Reiber) - oko 75%
MRZ reakcija: pozitivna
Nalaz likvora kod MS
Limfociti (mononuklearne stanice)
OIg
Reiberov dijagram
Nalaz likvora u svježem subarahnoidnom krvarenju:
Izgled, boja: - krvav, bistar/lag. ksantokroman
Hematogeni pigmenti:- oksiHb /trag bilirubina
Citološki nalaz:Nalaz eritrocita, odnos L:E veći od krvi(neutrofilija)
Biokemijski nalaz:Glukoza: sniženaLaktat: povišenUkupni proteini: povišeni (ovisno o jačini krvarenja)
OksiHb