BIOCHIMIE, 1977, 59, 163-170.

L'induction gratuite de la $-glucuronidase d'Escherichia colt • • F • n et son double meeamsme de represslo .

Marie-Andr6e MANDI~AND-BERTHELOT ~, Georges NOVEL (*) et Madeleine NOVEL ( ' ) . Laboratoire de Microbiologie (406) de l'Institut National

des Sciences Appliqu~es de Lyon, 20, Avenue Albert Einstein, 6962l Villeurbanne Cedex.

(6-10-1976).

K 1 2

Summary. - - Using natural inducers of ~-glucuronidase, methyl-glucuronide and fruc- turonate, under gratuitous conditions (without metabolic conversion of these two compounds), 'we corroborate the fact that both molecules are required simultaneously in order to derepress the enzyme synthesis to a maximum level.

Structurally related analogs of the natural inducers, thiophenyl-glucuronide and mannonic amide respectively, ~vere assayed in the wild type and suitable mutant strains of E. coil The results are in agreement ~,vith the model ~,vhere the dual negative regulation of the enzyme synthesis is exerted by two regulatory genes uidR and uxuR [7, 8]. The concerted action of rnannonie amide and thiophenyl-glucuronide, which alone fail to induce significantly ~glueuronidase synthesis, reveals that a cooperative effect of the two repressor molecules responsible for the complete blocking of the enzyme synthesis is oecuring.

INTRODUCTION.

Chez Escherichia colt la 8-D-glucuronidase (E.C. 3.2.1.31), premi6re enzyme de la vote d6gra- dative des hexuronides et des hexuronates , hydro- lyse les ~- , -glucuronides [1] et les ~-o-galacturo- nides [2, 3] pour donne r respect ivement glucuro- nate et galacturonate qui sont ensuite m6tabolis6s selon la s6quence d6erite par Ashwell [4] (fig. 1).

L ' induc t ion de la ~-glucuronidase est diff6rente de celle des enzymes suivantes du syst~me hexu- ronate ~5]. Elle est engendr6e par la presence simultan6e h l ' in t6r ieur de la cellule bact6r ienne de deux types d'effecteurs (co-inducteurs) : d 'une

(**) Abr~viations : MeGleU : m6thyH~-o-glueuronide ; TPhGlcU : thio-

ph6nyl<~-D-glueuronide ; GleU : 9-glucuronate ; FruU : o-fructuronate ; ManM : amide-o-mannonique.

Pour les abr6viations des enzymes, voir la 16gende de la figure 1.

uidR, uxuR : g6ues r6gulateurs de uidA, et comrnun uidA et uxuA-B respectivement. uidA, uxuA, uxuB et uxaC: g6nes de structure de

la r~-glucuronidase, de l'hydrolyase mannonique, de l'oxydor6ductase manuonique et de l'isom6rase uro- nique respectivement.

Activit6 UID : aetivit6 de la ~-glueuronidase. NTG : N-mdthyl-2W-ndtro-N-nitrosoguanidine. TDS : taux diff6reutiel de synthbsc. (*) Adresse aetuelle : Laboratoire de Biochimie,

Universit6 de Caen, Esplanade de la Paix, 14032 Caen Cedex.

© A qui toute correspondance doit ~tre adress~e.

par t le substrat de l 'enzyme, le m6thyl-~-a-glucu- hide (MeGlcu **) (les [~-galacturonides ne sont pas inducteurs) ou son produit , le glucuronate ; d 'au- tre par t le m6tabolite suivant, le f ructuronate issu de l ' i som6risat ion du glucuronate [6].

Parall~lement, l 'expression du gbne de s t ructure uidA de ]a B-glucuronidase se trouve sous ]a d6- pendance de deux g6nes r6gulateurs dist incts uidR et uxuR synth6t isant p robab lement deux mol6cu- les de type r6presseur agissant de fa¢on eoopdra- tive - - l 'une renforqant l 'ac t ion de l 'autre et r6ci- p roquement --- pour r6pr imer la biosynth6se de l 'enzyme [7, 8]. Le produi t du g6ne uxuR rdprime 6galement la synth6se de l 'oxydor6ductase manno- nique (E.C. 1.1.1.57) et de l 'hydrolyase m a n n o n i - que (E.G. 4.2,1.8) [8]. En outre certaines indica- t ions indirectes sugg~rent tr~s for tement que le m6thyl-glucuronide ou le glucuronate agit sp6ci- f iquement au niveau du r6presseur issu d'uidR tandis que le f ruc turonate s 'oppose au r6presseur issu d'uxuR [6, 7, 8].

Afin d 'appor ter des preuves suppl6mentai res en faveur du mode or iginal de r6gulat ion de la ~-glu- curonidase, 1 ' induct ion de cette enzyme a 6t6 r6a- lis6e dans des condi t ions de gratuit6 (non-t rans- format ion des compos6s induc teurs par la cellule bact6r ienne) : d 'une part en 6tudiant l 'ac t ion d ' in- ducteurs naturels de la ~-glucuronidase sur des mutants d~ficients en une ou plusieurs enzymes de

164 M.-A. Mandrand-Berthelot et coll.

la voie des hexurona tes (souches isom6rase - nbga- fives [6, 9, I0], oxydor6duc tase inannonique - - ou h y d r o l y a s e m a n n o n i q u e - n6ga t ives E9, 11]), chez

n a t u r e l et c o - i n d u c t e u r g ra tu i t p o t e n t i e l chez ce r - t a i n e s s o u c h e s a p p r o p r i 6 e s . C e t r ava i l a fa i t ] 'oh- je t d ' u n e no te p r ~ l i m i n a i r e [121.

Gtucuronide ~ Giucuronate ~ Fructuronate ~ Mannonate

MOR ~HLM

UID ISO gtuconate

AOR /HI.A 6aiacturonide-,,~6alacturonate~Tagaturonate ~ AI.tronate

KIN ALD 2-C~t0- 2-ceto- pyruvate

3-desoxy- --~ 3-desoxy- ~ +

6-phospho- triose-

giuconate phosphate

FiG. 1. - - Schdma de la vole ddgradatioe des hexuronides et des hexuronates chez Escherichia coll.

Enzymes impliqu~es : UID : ~-glucuronidase: ISO ~somerase uromque. MOR: oxydor6ductase mannonique. AOR : oxydor6ductase altronique. HLM: hydrolyase mannonique. HLA : : hydrolyase altronique. KIN 2-edto-3-d6soxyglueonate kinase. ALD 2-e~to-3-d6soxy-6-phosphoglueonate aldolase.

lesquels ces compos6s ne sont pas d6grad6s ; d 'au- t re pa r t en r eche rchan t , p a r m i les analogues s t ruc- t u r a u x des i n d u c t e u r s na tu re l s , des m o l 6 c n l e s in- d u c t r i c e s n o n m 6 t a b o l i s a b l e s p a r Escherichia coli d o n t ]es a p t i t u d e s c o r r e s p o n d e n t h ce l les des d e u x t y p e s de c o - i n d u c t e u r s . D a n s le m 6 m e t e m p s , nous a v o n s exp lo i t6 la pos s ib i l i t 6 d ' a s s o c i e r i n d u c t e u r

M A T E R I E L ET METHODES.

Prodnits chimiqaes. Le m6thyl~-D-glucuronide , le D-fructuronate et

l ' a m i d e - D - m a n n o n i q u e on t &t6 s y n t h 6 t i s 6 s darts ce l a b o r a t o i r e s e lon des m 6 t h o d e s d6jh d 6 c r i t e s [1, 13]. Les t h i o g l u c u r o n i d e s s o n t un d o n de F. Stoe-

TABLEAU I.

Souches bact~riennes.

S0uche Sexe Genotype 0rigine R616rences

P4X . . . . . . . .

AU128 . . . . . . MH2 . . . . . . . . JBI . . . . . . . . CM8 . . . . . . . . GMS819 . . . . .

GMS870 . . . . .

GMS788 . . . . .

Hfr

Hfr Hfr Hfr Hfr Hfr

Hfr

Hfr

metB1

metB1, uxaC1 metB1, uxaC2 mdB1, uxuA1 metB1, uxuB8 uxaC1, uxaB8

uxaC1, uxuA1

uxaC1, argH1

mutant NTG du P4X mutant NTG dn P4X mutant spontan6 du P4X mutant NTG du P4X recombinant Met + Arg + du

eroisement : Hfr CM8 x pb6noeopie F- GMS788

recombinant Met + Arg ~ du eroisement : Hfr JB1 x ph~nocopie F- GMS788

d6riv6e de l'AU128

E. Wollmann (via J. Puig)

[6] [101 [91 [l t]

ce travail

ce travail

[81

La nomenclature gdndtique utilisSe dans ce tableau est en accord avec Taylor et Trotter [14]. Pour la signification des symboles uxaC, n.ruA, u.ruB et NTG, voir les abrd- viations.

BIOCItlMIE, 1977, 5g, n ° 2.

I n d u c t i o n gra tu i te de la g lucuron idase d'E. coli. 165

ber [1]. L e u-glucuronate provien t de Sigma Che- mical Co., le p-nitroph6nyl-~-D-glucuronide de Sig- ma, Calbiochem ou Boehringer.

Souches et cultures.

Toutes les souches bact6r iennes employ6es d6ri- vent d'Escherichia colt K 12 ou sont obtenues dans ce laboratoire comme mutants spontan6s ou in- duits apr~s act ion de la n i t rosoguan id ine (ta- bleau I).

Les cultures bact6r iennes sont r6alis6es sous agitation, en a6robiose h 37°C, en mil ieu min6- ral 63 [15] addi t ionn6 de glyc~,rol (3 h 4 mg/ml) , de th iamine (0,5 t~g/ml) et de r.-m6thionine (10.0 ~g/ml) si n6cessaire. Le ou les induc teu r (s) sont ajout6s h la concent ra t ion appropri6e (de 0,5 mM h 10 mM selon les exp6riences).

Induction de la ~-glucuronidase.

Dans le cas d 'une d6terminat ion ponctuel le d'ac- tivit6 glucuronidasique, une pr6cul ture de la nu i t sur glyc6rol est dilu6e dans le m6me mi l ieu et le ou les inducteur(s) ajout6(s) imm6diatement . Apr6s trois ou quatre g6n6rations en phase expo- nentiel le, la croissance est arr6t6e par addi t ion de chlorarnph6nicol (50 ~g/ml), les bact6ries sont r6colt6es, lav6es et remises en suspension dans un tampon phosphate s o d i u m - p o t a s s i u m 20 mM pH 7,1.

Lors des exp6riences oh sont mesur6s les taux diff6rentiels de synth6se [16], l ' i nduc teu r est ajout6 seulement apr~s une g6n6ration cellulaire en phase exponentiel le. Des 6chanti l lons pr61ev6s

interval les de temps r6guliers sont trait6s com- me pr6c6demment afin de d6terminer l 'accroisse- ment cel lulaire (par mesure de la densit6 optique h 600 nrn) et l 'activit6 glucuronidasique.

Extract ion enzgmatique.

Les suspensions cellulaires (0,1 h 0,6 mg de poids sec bae t6r ien /ml) sont trait6es au tolu6ne (0,1 rnl pour 2 ml de suspension) et agit6es h 37°C pendan t 30 ran.

Dosage de la ~-glucuronidase.

I1 est r6alis6 aussit6t apr6s l 'extract ion. L 'hy- drolyse du p-ni t roph6nyl-g-o-glucuronide est sui- vie pendan t au moins 10 m n /i 405 nm et /L 30°C grhce h u n spectrophotombtre enregis t reur Jobin et Yvon Ultraspac ~ double faisceau. Le mi l ieu r6act ionnel cont ient : 20 mM de tampon phosphate sodium-potass ium pH 7,1 ; 100 rnM de 2-rnercap- to6thanol ; 1 mM de p -n i t roph6nyl~-o-g lucuron ide et l 'extrai t ~ la di lut ion appropri6e ajout6 pour d6clencher la r6action. Une unit6 d'activit6 6-glu- euronidas ique est la quantit6 d 'enzyrne hydroly-

sant une ~anole de p-nitroph6nylq~-D-glucuronide par minute . L 'act ivi t6 sp6cifique est donn6e en unit6s par rng de poids sec bact6rien.

RI3SULTATS.

1 - - Action des e[fecteurs naturels de la ~-glucu- ronidase utilisds dans des condit ions de gra- tuit&

Nous avons utilis6 pour cette 6tude des mutants chez lesquels les compos6s naturels induc teurs de la ~-glucuronidase ne sont pas transforrn6s et peu- vent done agir de fapon gratuite. A par t i r d 'un mutan t isom6rase u r o n i q u e - n 6 g a t i f d6riv6 de la

1.5

E \

1.0

"o

-o

>

"6 o

0.5

TOS= 4,4 U / m g ~

.Y ..y

o.1 0.2 03

AB (mg potd . . . . boot . . . . . . ml culture) FIG. 2. - - Action du frueturonate sur la synth~se de

la ~-9lucuronidase induite par le m~thyl-glucuronide chez la souche GMS819 (ISO MOR- HLM-).

A une culture de GMS819 sur glyc6rol (3 mg/rnl) sont ajoutds sdpardment les effecteurs suivants : A, MeGIcU (10 raM) ; O, fructuronate (0,5 mM) ; II, MeGleU (10 mM) + frueturonate (0,5 mM). Les pr~l~- vements pour ]e dosage enzymatique et la croissanee bact6rienne sont r~alis~s comme indiqu6 dans Materiel et Mdthodes. AE repr+sente la variation de l'aetivit~ enzymatique et AB la variation du poids see bact6rien.

soucbe AU128 (G55S788, tableau I), nous avons const ru i t les souches GMS819 et G~MS,870 (tableau I) poss6dant en plus des muta t ions affectant deux enzymes de la vote du glucuronate ( l 'hydrolyase rnannonique e t /ou l 'oxydor6ductase mannon ique) . La souche GMS819 (I, SO- MOR- HLM-) est par t icu- l ibrement destin6e h ce t ravai l puisque ses d6fi- eiences conjointes en isom6rase uronique, oxydo-

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ~ 2.

166 M . - A . M a n d r a n d - B e r t h e l o t et col l .

r6ductase m a n n o n i q u e et hydrolyase m a n n o n i q u e in terd isent le mdtabolisme dn mdthyl-glucuronide, du glueuronate et du f ruc turonate par la vote nor- male de ddgradat ion (cf. fig. 1). Selon les analyses des cindtiques de biosynth6se, le g lucuronide (10 mM) est sans act ion sur l ' i nduc t ion de la ~-glu- curonidase, m~me apr6s trois g6ndrations eellu- laires landis que le f ruc turonate (0,5 raM) n 'a qu 'uu effet ddrdpressif fort res t reint (fig. 2). Par contre une induc t ion maximale de la ~-glucuronidase est

i -~ 0,2 DS 6

g,

"-a "5

01 0:2 o:3 o:~ o.~

~ S ling poid . . . . boct6rten/ml culture)

Fro. 8. - - Action du fructuronate sur la synlh~se de la .~-glucuronidase induite par le mdthyl-glucuronide ou par le fflucuronate chez la souche AU128 (ISO-).

A u n e culture d'AU128 sur glycdrol (3 mg/ml) sont ajoutds sdpardrnent les effectenrs suivants : A, MeGlcU (10 mM) ; @, fructuronate (~ mM) ; II, MeGIcU (10 raM) + fructuronate (2 mM) ; [3, GlcU (10 mM) + fructu- ronate (2 mM). Pour la signification des symboles AE et AB voir la ldgende de ]a figure 2.

obtenue par l 'associat ion simultande de ces deux induc teurs h une culture sur g lyce ro l ; elle se ma in t i en l tout au long de la croissance.

Ce type d 'exal tat ion de l 'activit6 de synth~sc de la ~-glucuronidase est h rapprocher des observa- t ions faites chez une souche s implement ddficiente en isomdrase u ron ique : &U128 (fig. 3). 'Lh encore, le g lucuronide (10 raM) ddrdprinle h peine la fJ-glu- curonidase et le f ructuronate , ici consomm6, mats essayd h plus forte concent ra t ion (2 raM), n ' i n d u i t que ldg6rement. Ensemble ces deux effecteurs sti- mulen t net tement la synth6se indui te de l 'enzyme, m6me si l ' ac t ivat ion d6croit aprbs deux gdndra- l ions cellulaires (voir plus loin).

2 ~ A c t i o n de l 'amide D-mannonique sur l ' induc- l ion de la [5-glucuronidase.

L'amide n -mannon ique est un analogue structu- ral du D-fructuronate et du D-mannonate ; il pdn6- ire dans les cellules d'E. colt, mats n 'est pus mbta- bolisd. II se comporte comme un excellent induc- teur gratuit de la synthbse des enzymes du sys- t6me des hexuronates (h l 'except ion toutefois de la kinase et de l 'aldolase) [5, 9]. Son pouvoi r induc- teur est comparable h celui du fructuronate , un des induc teurs in ternes physiologiques de cette vote [9] et no tamment des deux enzymes, oxydo- rdductase m a n n o n i q u e et hydrolyase mannon ique , sous le contr61e du g6ne rdgulateur uxuR.

Cependant cette mol6cule ne ddrdprime pas signi~icativement la synth6se de la ~-glucuronidase chez la souche sauvage [5] ou chez les diverses souches mutantes 6prouvdes, quelle que soil sa concent ra t ion (:1 h 10 raM). Le fructuronate , lui, paral t susceptible de mont re r une capacit6 induc- tr ice supdrieure chez les souches bloqudes part iel- lement pour son mbtabolisme (tableau II).

Nous avons remarqu6 que l ' amide m a n n o n i q u e prdsente un effet analogue h celui du f ruc turonate

TABLEAU II.

I n d u c t i o n compar~e de la syn th~se de la ~-glucuronidase par l 'amide m a n n o n i q u e et le f ruc turona te .

Souches

P4X . . . . . . . . AU128 . . . . . . MH2 . . . . . . . CM8 . . . . . . . . GMS819 . . . . .

D6ficienee enzymatique correspondante

sauvage iso- (') ISO- MOR- HLM- ISO- MOR- FILM-

Activitd spdcifique de la ~-glucuronidase (U/fog poids see bactdrien) aprbs addition de :

Saps inducteur t mM

0,002 0,08 0,002 0,04 0,002 0,04 0,002 r

0,001

ManN 3 mM

0,11 0,06 0,07 0,08 0,10

10 to_ M

0,12 / 0,07

0,08

FruU I mM

0,01 0,43 0,37 1,45

(*) : (--) indique l'absenee de l'activitd enzymatique correspondante dans les conditions habituelles d'induetion [5].

BIOCH1MIE, 1977, 59, n ° 2.

Induction gratuite de la glucuronidase d'E. colt . 167

dans le syst~me hexurona te [9] et que le f ructuro- hate est 1ui-m6me capable de s t imuler la biosyn- th6se indui te de la ~-glucuronidase lorsqu ' i l est associ6 au m6thyl -g lucuronide ou au glucuronate chez des souches isom6rase-n6gatives (fig. 2 et 3) [6]. Gas deux observat ions nous ant condui ts pa r

la concen t ra t ion d 'amide rnannonique engendre une 616vation progress ive de la synthbse de la ~-glucuronidase ; pour de fortes teneurs en glucu- ronate (10 raM) l ' induc t ion semble ind6pendante de la concent ra t ion en amide rnannonique (ceci est par t icu l i~rement net pour la souche AU12,8).

TABLEAU IIl .

Induction de la synth~se de la ~-glucuronidase par l'amide mannoniqtte en association au mdthgl-glucuronide ou au glucuronate.

Activit6 sp6cifique de la ~-glneuronidase (U/rag poids see bact6rien) apr~s addition de :

Souches D6fieianee

enzymatique correspondante

P4X . . . . . . . . sauvage AU128 . . . . . . ISO- MH2 . . . . . ISO- GMS819.. . ISO_ MaR-

• "i HLM- GMS870 . . . . ISO- HLM-

--MeGIcUa [

5,00 [ 0,02 l 0,05 }

0,002 ]

0,01 /

MeGIcUa I GIcU + ManN ~ I mM t0 mM

4,47 5,41 5,19

4,80 4,00

0,04 0,06 0,07 0,50

0,50

GIeU : t mM t mM ! mM IGIeU : t0 mM t0 mM t0 mM + I +

ManN: t mM 3 mM t0 mMIManN : tmM 3 mM 10 mM

0,83 1,38 1,49 2,24 3,34 4,46

1,65 1,55 1,25 3,75 4,07 3,49 2,61 3,36 4,34

a : MeGIcU est ajout6 h la concentration de 10 raM. b : Mann est ajout~ h la concentration de 3 raM.

compara i son h 6tudier Fact ion conjointe de l 'ami- de mannon ique et du glucuronate ~ ou du glucu- ron ide ~ sur les na~mes souches ; chez celles-ci ces deux dern iers compos6s ne sont pas on peu t ransform6s par la cellule (le g lucuronate notam- merit agit de facon gratuite) (tableau III, 12). Chez toutes les souches d6ficientes en isom6rase uroni- que, off le mdthyI-glucuronide a pe rdu toute capa- cit6 induc t r i ce pu isqu ' i l n 'est pas m6tabolis6 jusqu 'au stade f ruc turonate [6], l ' associa t ion ami- de mannon ique-g lucuron ide permet une synthese indui te maximale de la glucuronidase. De m6me, l ' i nduc t ion par le glucuronate (qui ne deviant effi- cace qua dans des souches oh, non m6tabolis6, il s 'accumule) est fo r tement stimul6e (de 8 'h 50 fats) en pr6sence d ' amide mannonique . Pour de faibles teneurs en glucuronate (1 raM) l ' augmenta t ion de

M6me chez la souche sauvage P4X l ' amide man- nonique en associat ion au glucuronate (ici con- saturn6) d6r6prime s ignif ica t ivement la synthbse de la g-glucuronidase, cependant h u n niveau trois fats mo ind re qua chez les souches isom6rase-n6ga- t ives dans les m6mes condi t ions .

Darts t o u s l e s cas (souches sauvage ou mutantes) , la d6r6pression obtenue avec l 'associa t ion glucu- ron ide-amide mannon ique d6passe calla corres- pondant au couple g lucuronate-amide mannoni - nique.

3 - - A c t i o n des thio,f~-glucurotlides sur l'induc- tion de la $-glucuronidase.

Les thio-~-glucuronides sont des analogues s t ruc turaux des t3-glucuronides vrais comme le m6thylq3-u-glucuronide, non rn6tabolisablcs pa r la

TABLEAU IV.

Induction de la sgnth~se de la ~-glucuronidase par le thiophdnyl-~-glucuronide et l'amide mannoniqtte.

Souches

P4X . . . . . . . . . . . . . . JB1 . . . . . . . . . . . . . .

b6ficience enzy matique

correspondante

sauvage HLM-

Aetivit6 sp6cifique de la 13-glucuronidaae (U/mg poids sac baet6rien) apr~s addition de :

TPhGIcU 0,1 mM I mM 5 mM

0,002 0,003 0,007 0,004 0,022

ManN : 3 mM 3 mM 3 mM 3 mM +

TPhGIcU: 0,2 mM 0,5 mM I mM 5 mM

3,02 3,27 3,50 5,00 6,70

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 2.

168 M.-A. Mandrand-Ber the lo t et coll.

cellule bac td r i enne (absence d ' h y d r o l y s e p a r la 8-g lucuronidase d'E. colt, absence d ' i n c o r p o r a t i o n de ces compos6s darts les f rac t ions ce l lu la i res) . I ls d6rd.priment g ra tu i t ement la synth6se de la ~-g lucuronidase chez la souche ~L30 d'E. colt off leur pouvo i r i nduc teu r d iminue au fur et h mesure que la ta i l le de l ' ag lycone augmente [1]. Parrot les d ivers t h iog lucu ron ides mis h no t re dis- pos i t ion , seul le th iophdnyl -~-g lucuron ide s 'est r6vdl6 u t i l i sable ca r p u t h l ' ana lyse chromatogra - phique.

Con t ra i r emen t au ph6nom~ne observ6 chez la souche ~L30, le th ioph6nyl -8 -g lucuron ide seul est i ncapab le de d6 r6pr imer la synth6se de la ~-glucu- ron idase chez la soucbe K 12 d 'E. colt, quelle que soit la concen t ra t ion ut i l isde ( tableau IV, 12). Mats associ6 h l ' amide mannonique , lui-m6me incapab le d ' ag i r seul (of. t ab leau II), il engendre une d6r6- p ress ion spec tacu la i r e de la ~-glucuronidase chez les souches 6.prouv6es. Cette for te ddr6press ion est obtenue chez la souche sauvage, p a r a d d i t i o n de tr~s faibles quant i t6s de tb ioph6nyl -~-g lucuron ide (0,2 raM) h des cul tures con tenan t de l ' amide man- noniqne.

DISCUSSION.

L ' i nduc t ion de la 6-glucuronidase se p r o d u i t toutes les fois que les effecteurs de la synth~se de cette enzyme, g lucuron ide (ou g lucuronate) et f ruc tu rona te sont prdsents au moins t r ans i to i re - men t et s imul tan6ment h l ' i n t6 r i eu r de la cel lule [6]. La souche G~$819 ddpourvue des enzymes isomdrase uronique , oxydor~duc tase et h y d r o l y a s e mannon iques fut un outi l app rop r i~ pou r v6r i f ie r in vivo la ndcessit~ de la p rdsence conjo in te de ces deux types de molecules dans ] ' i nduc t ion de la ~-glucuronidase. Nous appor tons ic i une preuve supp ldmen ta i r e que le f ruc tu rona te agit de facon coopdra t ive avec le g lucuron ide pour r e s t au re r une synth~se act ive de la ~-glucuronidase chez la souche GMS849 comme chez la souche AU128. Pa r la mesure des taux diff6rent iels de synth~se [16], nous mont rons que l ' a s soc ia t ion g lucuron ide- f ruc- tu rona te about i t h une exal ta t ion de la synth~se de l ' enzyme une fois et demie supdr ieure chez la souche GMS819 h celle obtenue chez la souche AU128, et cela avec une concen t ra t ion de f ructu- rona te quatre fois p lus faible ( c o m p a r e r fig. 2 et fig. 3). Cette diff6rence notable ent re les deux sou- ches pou r r a i t r6sul ter du mdtabo l i sme u l td r i eur du f ruc tu rona te qui n 'a l ieu que chez la souche AU128 ; en effet la d iminu t ion de la synth~se de l ' enzyme chez cette dern i~re souche p o u r r a i t s 'ex- p l i que r : 1) p a r la p lus fa ible teneur in t race l lu - la i re de ce eomposd induc teu r ; 2) p a r la p rdsence

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d 'un mdtabol i te issu du f ruc tu rona te capable de r6p r imer la synthbse de la p r emib re enzyme de la s6quence d6grada t ive ou encore d ' i nac t i ve r cette enzyme (fig. 1). Un tel compos6 semble exis ter chez la souche AU128 seule off se manifes te une ddcro issance d 'ac t iv i t6 enzymat ique aprbs deux g6n6rat ions ce l lu la i res ( compare r fig. 3 et fig. 2) ; ce phdnombne d i spa ra i t si le f ruc tu rona te est rem- placd p a r l ' amide mannonique , i nduc teu r non dd- grad6 (rdsultats in6dits) , et i l est en p a t t i e a t t r ibu6 h l ' i nac t iva t ion ca tabol ique de l ' enzyme [6].

Chez routes les souches, ] ' amide mannon ique , p r e m i e r induc teu r gra tui t employd, p rovoque une induc t ion ldg~re de la ~-glucuronidase ( tableau II) . A la m6me concen t ra t ion (1 raM) le f ruc tu rona te a un effet supdr ieur (20 fois) chez des souches off il peut 6tre isomdris6 en g lucurona te (CMS, ta- b leau II) : d a n s ce cas le couple g lucuronate- f ruc- tu rona te prdsen t dans la cellule est r e sponsab le de ] ' induc t ion de la ~-glucuronidase. Chez les souches i somdrase u r o n i q u e - ndgatives, le f ruc tu rona te semble avoi r d galement un fa ib le effet induc teur , mats l ' ana lyse c b roma tog ra ph ique de ce composd r6vble une ldg~re con tamina t ion p a r du glucuro- nate, i sombre diff ici le h sdpare r du f ruc tu rona te et qui p roba b l e me n t agit en synerg ie avec lui pour i ndu i r e l ' enzyme.

Chez routes les souches i somdrase u r o n i q u e - ndgatives (AU128, Mtt2, GMS819 et GMS870) l ' amide mannon ique associd en rant que co- induc- teur au g lucuron ide res taure une synthbse indu i t e max ima le de la ~-glucuronidase, dquivalente au n iveau obtenu avec le seul g lucuron ide chez la souche sauvage ( tableau I,II, 12). A un niveau moindre , l ' amide mannon ique s t imule la synth6se indu i te pa r le g lucurona te (souches AU128 et MH2) : le mdthy l -g lucuron ide se r6vble donc meil- leur i nduc teu r que le g lucuronate et n6cessaire une induc t ion maximale . En outre l ' i m p o r t a n c e de la b iosynthbse de la 8-glucuronidase p a r a i t dtroite- ment fide ~ la t eneur respec t ive des i nduc t eu r s g lucuronate et amide mannon ique lorsqu ' i l s sont employds h faible concen t ra t ion ; c ependan t une concen t ra t ion d.lev6e (,10 raM) de Fun ou de l ' au t re suffit h p rovoque r une forte ddr6press ion, indiffd- ren te aux concen t ra t ions de l ' i nduc t eu r associd (souche A~U128).

Chez la souche GMS8,19, l ' ac t iva t ion de la syn- thbse p a r le couple g lueuron ide - f ruc tu rona te (fig. 2) est trbs vois ine de cel le ob tenue avec le couple g lucu ron ide -amide ma nnon ique (ta- b leau HI), ce qui conf i rme l 'dquiva lence d ' ac t ion entre le f ruc tu rona te p l a t 6 dans des cond i t ions de gratui td et ] ' amide mannonique . P a r contre , chez la souehe AU128, l ' a mide mannon ique a une

I n d u c t i o n g r a t u i t e d e la g l u c u r o n i d a s e d ' E . coli . 169

act ion deux ou trois fois sup6rieure h celle du f ruc turonate employ6 dans des condi t ions simi- laires, selon qn ' i l est associ6 respec t ivement au g lucuronide ou au glucuronate (comparer la figure 3 et le tableau IH). Comme indiqu6 plus haut, ces donn6es sugg6rent que la faible capacit6 induc t r i ce du f ruc turonate par rappor t h celle de l ' amide mannonique , induc teur gratuit , est impu- table h la consommat ion du f rnc turonate chez des souches oh les enzymes de son m6tabol isme ult6- r ieur sont pr6sentes. L 'ac t ion diff6rentiel le de ces deux compos6s est confirm6e chez la souche sau- r a g e : en pr6sence de glucuronate, seul l ' amide mannon ique d6r6prime la biosynth6se de la g-glu- curonidase (tableau I I I : soucbe P4X) ; le fructu- ronate est sans effet dans un tel cas [17].

L ' amide mannon ique se compor te donc de facon semblable au f ruc turonate en associat ion au glucu- ron ide ou au glucuronate. I1 appara i t ainsi comme un co- inducteur gratui t de la synth6se de la 13-glu- curonidase capable, au ln~me t i t re que le fructu- ronate, de con t r eca r r e r la r6press ion exerc6e par le p rodu i t issu du g6ne r6gulateur n x u R sur l 'ex- press ion de l 'op6ron u idA . Ces indica t ions sont confirm6es par le fait que l ' amide mannon ique seul indui t les mutants de type u i d R u x u W , faible- ment d6r69rim6s pour la syntb6se de la ~-glucu- ron idase (chez lesquels subsiste la r6pression exer- c6e par le g6ne n x u R ) et pas ceux de type u x n R u i d R ~ [8].

Comme r a m i d e mannonique , le thioph6nyl4}- g lucuronide est incapable d 'agir seul, mats se r6vble un excel lent co- inducteur de la synth6se de la ~-glucuronidase cbez la souche K 12 d'E. co l t (tableau IV, 12). La forte d6r6pression obtenue par le couple amide m a n n o n i q u e - th ioph6nyl-glucuro- hide cor respond sensiblement h l ' induc t ion maxi- male engendr6e par le m6tabolisme du glucuro- hide chez la soucbe sauvage (cf. tableau IlI) . Son analogie de s t ructure avec le m6thyl -g lucuronide et le fait qu ' i l r emplace ce dern ie r dans la co- induc t ion avec l ' amide mannon ique paraissent le d6signer comme un effecteur capable d ' inac t ive r le p rodu i t issu du g6ne r6gulateur u i d R . D'ai l leurs le th ioph6nyl -g lucuronide employ~ seul est capa- ble d ' indu i re les mutants de type u x u R u i d R +, fai- b lement d6r6prim6s pour la synth6se de la f3-glu- curonidase (o6 subsiste la r6pression gouvern6e par le g6ne u i d R ) , et pas ceux de type u i d R u x u R +

Is].

Ces t ravaux soul ignent la n6cessit6 d 'un couple de mol6cules pour indui re eff icacement la ~-glu- curonidase et sont en accord avec le mod61e de double r6gulat ion n6gative propos6 anl6rieure- merit [8]. En mont ran t que deux inducteurs gra-

tuits sont capables d 'agi r en synergie pour lever la barr i6re de la double r6pression command6e par les g6nes r6gulateurs u i d R et u x u R , ils sont favo- rables h une act ion di recte des inducteurs sur les sites de contr61e de l 'op6ron u i d A , en m6me temps qu' i ls 6tayent l 'hypolh6se d 'une in terac t ion coop6- ra t ive de ces deux mol6cules.

Remerc iements .

Ce travail a b6n6fici6 de l'aide du Centre National de la Recherche Seientifique (Equipe de Recherche Assoei6e n ° 177), de la D616gation G6n6rale h la Re- cherche Seientifique et Technique (Action Compl6men- taire Coordonn6e : (< Interactions Mol6culaires en Bio- logic >>) et de la Fondation pour la Recherche M6dicale Franqaise.

Nous remereions vivement M n~ Gis61e Couchoux pour sa pr6eiense assistance technique.

RfiSUM~.

L'utilisation d'inducteurs naturels de la ~-glucuro- nidase, m6thyl-glueuronide et fructuronate, darts des conditions de gratnit6 (non-transformation m6tabo- lique de ces deux compos6s) eonfirme la n6cessit4 de la pr6sence conjointe de ces deux types de mol6cules pour d6r4primer au maximum la hiosynth6se de cette enzyme.

Des analogues structuraux de ces inducteurs natu- rels, respectivement thioph6nyl-glucuronide et amide mannonique, out 6t6 essay6s sur des souches sauvage et mutantes appropri4es d'E. colt, Les r6sultats obtenus viennent renforcer 1.e mod61e d6j~ avanc6 seton lequei la double r6gulation n6gative de la synth6se de Fen- zyme est exere6e par deux g~nes r6gulateurs uidR et uxnR [7, 8]. En effet, Faction coneert6e de l'amide mannoniqne et du thioph6nyl-glucuronide, ineapahles d'agir s6par6ment sur la synth6se de la ~-glucuroni- dase, d6montre l'effet coop6ratif des deux r6presseurs bloquant la synth6se de l'enzyme.

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