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LIOFILIZACIN
CONSERVACIN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS
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Coleccin de Cultivo y servicio que ofreceQu son las Colecciones
de Cultivo?
- Son organizaciones que principalmente se ocupan de guardar
convenientemente cepas de microrganismos, clulas superiores o
diversos materiales biolgicos y los suministran, previa peticin, a
laboratorios microbiolgicos o de biologa celular.- Son por lo tanto
servicios de apoyo a los trabajos de microbiologa
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Cundo aparecieron las primeras colecciones de cultivo?-Kral
(Praga, siglo XIX) fue la primera en tener catlogo-La ms antigua
Lobaina (Belgica) (Hongos)-La ATCC,en 1925.No vinculos directos con
la Universidad,es de carcter comercial (Manassas,USA).-La CECT,nace
en el CSIC(Villanueva)(1960).-PRCC ,Profesor J.L.Ramos (Pseudomonas
putida)A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion
internacionaldenominada World Federation for Culture Collection
(WFCC).En Europa a su vez estan agrupadas en la European Culture
ColletionOrganization (ECCO) que se fund en 1982.
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Servicios que prestan las Colecciones de
Cultivos1.-Recoleccin,conservacin y suministro de cepas
microbianas.
-Recoleccin: Es el servicio mas tpico de una CC.Lascolecciones
reunen cepas que les llegan a traves de distintosconductos,las
conservan convenientemente y las suministra previa
peticin.-Conservacin:-Suministro: Se hace por correo de
superficie,areo o mensa-jera,pero siempre empaquetado correctamente
(tres envueltas)siempre hay que considerarlo como material
potencialmentepatgeno
2.-Recopilacin de datos de las cepas microbianas y difusi de los
mismosFichas,ordenadores,redes electronicas,public.de catlogos
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3.-Servicio de guardera de las cepas microbianasSe pueden
guardar por encargo cepas microbianas,cobrandouna tasa anual y
manteniendo el secreto de este depsito.
4.-Identificaciones microbianas.5.-Depsito de cepas
microbianas.
-Depsito pblico: Cualquier microbilogo puede depositar una cepa,
que considere interesante,en la coleccin. Esta cepa se incorpora en
el catlogo y puede suministrarsela a cualquier otromicrobilogo que
la solicite.
-Depsito no pblico:Algunas CC reciben el nombramiento de
Autoridad Internacional de Depsito para fines de patentes,de
estamanera se garantiza la descripcin total y reproduccin del
proceso patentado. Una vez conseguida la patente,la cepa puede
suministrarseprevia autorizacin escrita del propietario,aunque no
figure en el catlogo.
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6.-Organizacin de Cursos7.-Investigacin.8.-Asesoramiento en
general
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Normas generales para la conservacin de cepas microbianasLos
tres objetivos para una correcta conservacin:
1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA)2.-Que este
viva.(VIABILIDAD)3.-La cepa debe guardarse geneticamente
estable(ESTABILIDAD)Lapage en 1977 deca que:
Un cultivo inicial de una especie es una poblacinUn subcultivo
es una poblacin diferente derivada de este cultivo inicial.c) Una
cepa es una sucecin de subcultivos del cultivo inicial
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los datos del cultivo inicial seran los mismos en la cepa?
NO necesariamente porque se producen cambios en los
subcultivos
Los mtodos en la conservacin de las cepas microbianas tienenComo
objeto fundamental minimizar estos cambios
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LA CONSERVACIN DE CEPAS MICROBIANASMtodo de eleccin o de
conservacin a largo plazoConservacin por congelacinConservacin por
liofilizacin
Mtodos AlternativosConservacin por transferencia
peridicaConservacin por suspensin en agua destilada o en agua de
mar esteril
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Mtodos RestringidosDesecacin en papel de filtroDesecacin en
suelos,arena silicagel,etcDesecacin en bolitas de alginatoDesecacin
en sal gorda para halobacterias
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La conservacin de cepas microbianasMtodo de eleccin o de
conservacin a largo plazoConservacin por congelacinConservacin por
liofilizacin
Mtodos AlternativosConservacin por transferencia
peridicaConservacin por suspensin en agua destilada o en agua de
mar esteril
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CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS POR CONGELACINLa crioconservacin
consiste en la conservacin de los microorganismos a temperaturas
inferiores a cero grados centgrados. Se basa en la paralizacin del
metabolismo celular por la disminucin del agua disponible.
Objetivos de la crioconservacin- Mantenimiento de la
viabilidad-crioprotectores -La temperatura de almacenamiento-El
estado fisiolgico de la clula- Mantenimiento de la estabilidad-
Mantenimiento de la pureza
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BACTERIAH2OH2OH2OH2OHieloHieloHieloHieloHieloHieloHieloHielo
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AGENTES CRIOPROTECTORESOBJETIVOSMinimizar daos durante la
congelaci.Limitar la formacin de hielo (tasa de
congelacin)Vitrificacin del aguaCARACTERISTICASNo txico para la
clula.Penetrar facilmente en la menbrana celular.Unirse a los
electrolitos o a las molculas de agua.
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CRIOPROTECTORES MS COMUNESGlicerolDimetilfulfxido (DMSO)cido
glutmicoGlucosa Sacarosa Meso inositol LactosaLeche Descremada
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La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se
basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin
del agua disponible.
Objetivos de la crioconservacin- Mantenimiento de la
viabilidad-crioprotectores -La temperatura de almacenamiento
(-70,-139)-El estado fisiolgico de la clula (Final f.logartmica)-
Mantenimiento de la estabilidad- Mantenimiento de la
purezaConservacin de microorganismos por congelacin
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La crioconservacin consiste en la conservacin de los
microorganismos a temper.inferiores a cero grados centgrados. Se
basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin
del agua disponible.
Objetivos de la crioconservacin- Mantenimiento de la
viabilidad-crioprotectores -La temperatura de almacenamiento-El
estado fisiolgico de la clula- Mantenimiento de la estabilidad
(fenotpica y genotpica)- Mantenimiento de la pureza (Hacer
alcuotas)Conservacin de microorganismos por congelacin
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CONCLUSIONES Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o
final de la fase logartmica, a la temperatura ptima, en el medio ms
adecuado.Ajustar el n de clulas a una concentracin final de 2-6x106
cl/ml. Aadir los crioprotectores adecuados a una concentracin
ptima.Repartir la suspensin en ampollas de congelacin,cerrarlas
hermeticamente y mantenerlas 30 minutos a 30.Disminuir la t lo mas
rpido posible.A la hora de recuperar los microorganismos,
descongelar rpidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo
congelado en un bao a 37-40C.
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La conservacin de cepas microbianasMtodo de eleccin o de
conservacin a largo plazoConservacin por congelacinConservacin por
liofilizacin
Mtodos AlternativosConservacin por transferencia
peridicaConservacin por suspensin en agua destilada o en agua de
mar esteril
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FUNDAMENTOS TERICOS DE LA CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS POR
LIOFILIZACINLiofilizacinEs un mtodo de conservacin a largo plazo.Se
basa en la paralizacin del metabolismo celular por falta de
agua:congelacin y sublimacin
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PROCESOCongelar elagua libre delas clulasEliminacin del aguaAgua
congeladaVapor de aguaSublimacin1 Fase de la Desecacin2 Fase de la
Desecacin
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TIPOS DE LIOFILIZADORESLiofilizador con centrifugacinSe utilizan
ampollas de vidrio taponadasLa suspensin se centrifuga durante la 1
fase de la desecacinSe estrechan las ampollas y,despus de
conectarlas a una bomba de vaco,se sellan.Ventajas:Se utiliza la
centrifugacin para que el proceso de congelacin sea suave y de
forma homogneaLiofilizador con estantesLa suspensin se prepara en
viales y,es precongelada a T muy bajas antes de aplicar el vaco.La
segunda etapa de la desecacin se realiza tambin en el
liofilizador.Ventajas:La Desecacin es de manera progresiva y
continuada
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CUNDO APLICAR LA LIOFILIZACIN?Es un mtodo ampliamente utilizado
para conservar distintos Microorganismos. SI
NO-Bacterias,Levaduras,Hongos,Algunos virus,Algas-Dificultad de un
crecimiento Adecuado.-Microorganismos delicados que no resisten el
paso de congelacin.-A tamaos de clulas mayores, menos efectivo es
el procesoProtozoos,Clulas animales,Clulas
vegetales,Arqueobac-terias y bacterias
delicadasEjemplos:Rhodospirillum,,Azospirillum,vibrio y dems
bacterias marinas.-Levaduras miceladas con difi-cultad en la
esporulacin.-Hongos con grandes conidios o con dificultad en la
esporulacin.
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FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE
LIOFILIZACINCondiciones de Cultivo El medio de cultivo Depender del
tipo de microorganismo y sus requerimientos nutricionales. Fase de
crecimiento del cultivo.F.exponencial. Suspenciones celulares de
108-109Clulas/ml en bacterias, algo inferiores en hongos y
levaduras.Condiciones de incubacin.T,aerobiosis, anaerobiosis,
etc.
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FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE
LIOFILIZACINPreparacin de las clulas para su conservacinComposicin
del medio de la suspensin y adecuada densidad ptica El medio de la
suspensin deber proteger la viabilidad de las clulas. Usar el
crioprotector adecuado en cada caso. Glucosa 7,5% para Anaerobios
Glucosa 15% para Levaduras. Glutmico 0,67M para Bacterias Lcticas.
Inositol 5% para Bacterias. Leche descremada para Levaduras, Hongos
y Actinomicetos.
Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilizacin.Dependern
del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a liofilizar.
Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque
por su elevada resistencia ofrecern muchas dificultad en su
apertura.
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FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE
LIOFILIZACIN-Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja
posible, sin subir por encima de 50C.
Grado de deshidratacin alcanzado. Lo ms alto posible.
-Atmsfera de oxgeno en el tubo.Las clulas liofilizadas se
guardan en tubos al vaco para evitarRehidratacin o presencia de
gases (como el oxgeno) que puedendaar las clulas.
-Condiciones de almacenamiento.La temperatura debe ser constante
a 18C y sin bajar de los 0C y, en oscuridad
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LIOFILIZACIN VENTAJAS
-Reduccin de la variabilidad del microorganismo.-Largo tiempo de
conservacin.-Aplicabilidad para la produccin y distribucin de los
lotes
DESVENTAJAS
-El alto coste inicial del equipo.-La preparacin de forma
incorrecta de los distintos lotes puede desembocar en un
estancamiento de la viabilidad y/o en prdidas en la estabilidad de
los caracteres de los microorganismos
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La conservacin de cepas microbianasMtodo de eleccin o de
conservacin a largo plazoConservacin por congelacinConservacin por
liofilizacin
Mtodos AlternativosConservacin por transferencia
peridicaConservacin por suspensin en agua destilada o en agua de
mar esteril
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CONSERVACIN POR TRANSFERENCIA PERIDICA Es un mtodo en el que los
organismos permanecen activos durante el proceso. Consiste en la
inoculacin de microorganismos en un medio de cultivo adecuado,la
incubain a una T adecuada para obtener crecimiento y finalmente el
almacenamiento bajo unas condiciones adecuadas. El proceso es
repetido a intervalos que garanticen la obtencin de un cultivo
fresco antes de la prdida del viejo.
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PARA UNA BUENA RESIEMBRA PERIDICAMedio de cultivo.Temperatura,
tiempo y condiciones de incubacin.Intervalo entre dos
resiembrasReduccin de la temperatura de almacenamiento.Medios no
enriquecidos,con limitacin de nutrientes.Restriccin de la
accesibilidad de aire del cultivo.
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La conservacin de cepas microbianasMtodo de eleccin o de
conservacin a largo plazoConservacin por congelacinConservacin por
liofilizacin
Mtodos AlternativosConservacin por transferencia
peridicaConservacin por suspensin en agua destilada o en agua de
mar esteril
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CONSERVACIN POR SUSPENSIN EN AGUA DESTILADA O EN AGUA DE MAR
ESTRILEs un mtodo alternativo muy usado y que da altos porcentajes
de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos
filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en
Suspender en agua esteril unas cuantas clulas del cultivo que se
quiere conservar. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se
puede poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento
delHongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se
hace en agua de mar diluida.
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LA CONSERVACIN DE CEPAS MICROBIANASMtodos RestringidosDesecacin
en papel de filtroDesecacin en suelos,arena silicagel,etcDesecacin
en bolitas de alginatoDesecacin en sal gorda para halobacterias
