19. 2. 2010

Lipidy & Membrány

Molekulárna biológia IV

Funkcie bunkových membrán

kompartmentalizácia

udržiavanie iónových gradientov

selektívny transport látok

tvorba a prenos elektrických signálov v nervových a svalových bunkách

receptorové funkcie (detekcia externých signálov a odovzdávanieinformácie)

EM - technika mrazového leptania

Základná architektúra membrány

Lipidová dvojitá vrstva ako univerzálny základ štruktury bunkových membrán

Štruktúra dvojitej vrstvy je dôsledkom chovania molekúl membránových lipidov vo vodnom prostredí

Lipidy

Lipidy sú nepolárne (hydrofóbne) zlúčeniny, ktoré

sú rozpustné v organických rozpúšťadlách.

Membránové lipidy sú väčšinou amfipatické, vlastnia

ako nepolárnu časť (koniec), tak aj časť polárnu.

Mastné kyseliny (MK) sú najjednoduchšími lipidmi,

majú uhľovodíkový reťazec s karboxylovou kyselinou

na jednom konci.

16-C MK: CH3(CH2)14-COO-

Non-polar polar

C

O

OH

Fatty acid with a cisdouble bond

14:0 myristová kyselina16:0 palmitová “18:0 stearová “18:1 cisD9 oleová “18:2 cisD9,12 linoleová “18:3 cisD9,12,15 a-linoneová “ 20:4 cisD5,8,11,14 arachidonová “20:5 cisD5,8,11,14,17 eicosapentaenová “

Skrátené označenie pre 16-C MK s jednou cis dvojitou väzbou medzi 9 a 10 uhlíkomje 16:1 cis D9.

Príklady:

Glycerofosfolipidy

Biosyntéza fosfatidylcholínu

Tri typy molekúl membránových lipidov

Interakcia molekúl vody s hydrofilnými a hydrofóbnymi molekulami

Vo vodných roztokoch fosfolipidy tvoria vezikuly Energetický nevýchodná

Energetický preferovaná

planar phospholipidbilayer with edges exposed to water

sealed compartment formed by phospholipid bilayer

Uzavretá štruktúra je stabilná, lebo v nej nedochádza k energeticky nepriaznivému vystaveniu hydrofóbnych uhlovodíkových reťazcov do vodného prostredia.

Lipozómy a ploché membrány

•Lipidová dvojná vrstva je dvojrozmernou kvapalinou.

•Flexibilita, je schopnosť membrány ohýbať sa a tá určuje spodnú hranicu 25 nm pre veľkosť vačkov (lipozómy 25 nm -1 mm).

• CHL- imobilizuje molekuly P-lipidov a nedovolí membráne deformovať sa a byť priepustnou pre malé molekuly. Znižuje tekutosť (fluiditu).

•Cis dvojitá väzba vytvára ohyb v reťazci MK, ktorý zabraňuje prechodu do “kryštalického” stavu a zvyšuje fluiditu. ( znižujú bod „tavenia“).

• Dĺžka reťazcov MK (kratšie = tekutejšia).

Fluidita (tekutosť) membrán umožňuje pohyb lipidových molekúl v rovine dvojvrstvy a závisí od početných faktorov

Ako môžeme určiť tekutosť membrány

FRAP

Prečo biologická membrána musí byť fluidná ?

• Umožňuje rýchlu difúziu membránových proteínov na povrchu dvojvrstvy a umožňuje interakcie (dôležité pre bunkové signalizácie)

• Pomáha distribúcii membránových lipidov a proteínov z miesta ich vsunutia do membrány (po syntéze) do iných častí buniek

• Dovoľuje fúzie membrán a „mix“ molekúl

• Zabezpečuje rovnomernú distribúciu membránových molekúl medzi dcérskymi bunkami po delení

Lipidová dvojitá vrstva je asymetrická

•Asymetria lipidov vzniká v priebehu tvorby membrán. Obidve vrstvy membrány obsahujú odlišné P-lipidy. (flipázy)

•Membránové glykolipidy majú ochrannú a izolačnú funkciu a môžu sa na ne viazať proteínové receptory. Na sfingolipidy sa viažu aj bunkové jedy (toxíny cholery a tetanusu).

• Sfingolipidy a cholesterol napomáhajú zhlukovaniu proteínov do tzv. „mikrodomén“. Tieto potom fungujú ako plávajúce ostrovy (platformy), ku ktorým sa pripájajú ďalšie proteíny v priebehu pohybu membrán v bunke a tak isto aj pri prenose signálov.

Syntéza membrán prebieha v ER

Nové membrány sú exportované do iných membrán pomocou vezikúl (pučaním a fúziou)

!!! Orientácia membrán je zachovaná:- cytosolická strana cytosol- vnútorná strana (noncytosolic face) von z bunky, alebovnútro organel

vesicle

membrane-boundorganelle

extracellular fluid

plasmamembrane

cytosol

Fosfatidylinositol je príkladom glycerofosfolipidu. Okrem toho, že je membránový lipid, zúčastňuje sa aj v bunkovej signalizácii.

O P

O

O

H2C

CH

H2C

OCR1

O O C

O

R2

OH

H

OH

H

H

OHH

OH

H

O

H OH

phosphatidyl- inositol

Amino skupina sfingozínu vytvára

amidovú väzbu s karboxylom MK za

vzniku ceramidov.

Vo väčšine ceramidov je polárna

hlavička je ďalej esterifikovaná.

H2CHC

OH

CH

N+ CH

C

CH2

CH3

H

H3

OH

( )12

sphingosine

H2CHC

OH

CH

NH CH

C

CH2

CH3

H

OH

( )12

C

R

O

ceramide

Sfingolipidy sú odvodené zozvláštnej MK -sfingozínu, ktorý má uhľovodíkový chvost, ako aj polárnu doménu, ktorá obsahujeamino skupinu.

Sphingolipids

Sfingomyelín, s fosfocholínovou hlavičkou je veľkosťou a tvarom podobný fosfatidylcholínu. Sfingomyelín je zložkou plazmatických membrán ktoré vytvárajú myelín nervov.

Sphingolipid Polar “head group”

sphingomyelin phosphocholine orphosphoethanolamine

cerebroside a monosaccharide such as glucoseor galactose

ganglioside a complex oligosaccharide,including the acidic sugar sialic acid

Asymetria lipidov sa rodí vo vnútri bunky

Lipidové dvojvrstvy sú nepriepustné prenenabité molekuly a pre ióny

„Vektorová“ biochémia

Zmeny objemu membránových veziklov

Asociácia membránových proteínov

s lipidovou dvojvrstvou

• Jeden alebo viac -helixov “single-pass” and “multipass” (1, 2).• -”barelovou” štruktúrou (3).• Pripojené k membráne kovalentnou väzbou k lipidu – napr. k MK (5)• Oligosacharidovou spojkou k P-inozitolu - GPI kotva (6)• Nekovalentnými väzbami k iným proteínom (7, 8)

Príklad: Intra-membránové domény receptora v PM

Polypeptidový reťazec obvykle prechádza dvojitou vrstvou ako -helix

Simplified helical wheel diagram of four

-helices lining the lumen of an ion channel.

Polar amino acid R-group Non-polar amino acid R-group

-helixami obalený a vodou-vyplnený kanál môže mať R-skupiny polárnych AK otočené k lumenu a nepolárne R-skupiny obrátené k lipidom, alebo k iným hydrofóbnym -helixom. Takto zmiešaná polarita môže zabrániť detekcii pomocou „hydropathy plot“.

“Helikálne koleso”je pohľad po osi, pozdĺž určitého

-helixu. Bočné reťazce AK vyčnievajú von.

MK (myristová alebo palmitová) isoprenoid (farnesyl alebo

geranylgeranyl) GPI (glykozylfosfatidyl-inozitol

t.j. glykolipid).

konformačnej zmeny, ktorá spôsobí, že kotva sa stiahne do vnútra proteínu.

hydrolytického štiepenia lipidov.

Lipidická kotva niektorých membránových proteínov môže byť tvorená:

Spojenie cez kotvu zaistí reverzibilné spojenie s membránou. Uvoľnenie môže nastať v dôsledku:

Porínový -barel

V -liste, R-skupiny AK alternujú pod a nad úrovňou listu. Primárna štruktúra porínu predstavuje alternujúce polárne & nepolárne AK. Polárne zvyšky pokrývajú len jednu stranu kanálu. Nepolárne zvyšky sú v kontakte s membránovými lipdmi.

polar R group

non-polar R group

Porín, je výnimkou a skladá sa prevažne z- listov, ktoré

vytvárajú cylindrický pór v membráne ( -

barel).

Membránové proteíny môžu byť solubilizovanédetergentom a prečistené

Iónová resp. polárna skupina

Využitie slabých detergentov na solubilizáciu, izoláciu a rekonštitúciu funkčných membránových komplexov

Topológia membrán

Proteázy (degradácia určí prítomnosť časti proteínu na povrchu)

Monoklonálne protilátky pripravené voči peptidovým sekvenciám dedukovaným z proteínov.

Enzýmy, ktoré pridávajú (značku) alebo modifikujú určité AK, cukry alebo lipidy.

Topológia membrán je študovaná pomocou „impermeabilných prób“, ktoré sa môžu pridaťa sú aktivné len z jednej strany membrány.

“Hydropathy plot”

20 AK -helix môže preklenúť lipidickú dvojvrstvu.

„Hydropathy ploty“ sa používajú pri hľadanísegmentov z cca 20 hydrofóbnych AK vo vnútri proteínov.

Predpokladané hydrofóbne transmembránové -helixy boli identifikované v mnohých

proteínoch a slúžia len k predpovedi transmembránovej lokalizácie určitej domény.

Určenie potenciálnych -helixových trans- membránových častí v peptidickom reťazci pomocou „hydropathy“ diagramu

Voľná energia potrebná na prenos následných segmentov peptidického reťazca z nepolárneho solventu do vody.

(+) – je potrebná voľná energia pre prenos do vody (t.j. segment je hydrofóbny).

- Časť otvorených čítacích rámcov v genóme, ktoré obsahujú aspoň jeden TM segment.

Membránové proteíny

Transmembránové proteíny sú amfipatické - majú hydrofóbne a hydrofilné domény.

Plazmatická membrána je zosilnená sieťou proteínov pripojených k membráne cez TM proteíny

( bunkový kortex)

„Bunkový kortex“ (sieť vláknitých proteínov) ľudských červených krviniek, založený na spektríne.

SDS-PAGE proteínov z membrány ľudských červených krviniek

Spectrín ľudských erytrocytov:-tenké ohybné vlákno dlhé asi 100 nm

Reštrikcia pohybu membránových proteínov

• Ukotvenie k bunkovému kortexu

• Spojenie s molekulami mimo bunky

• Spojenie s proteínmi z povrchu inej bunky

• Difúzne bariéry tvoria špecifické domény („tight junction“)

Reštrikcia pohybu membránových proteínov

Epitelialné bunky tenkého čreva

basal membrane

lateral membrane

apical membrane

tight junction

protein A

protein B

Membránové organely eukaryotických buniek

Niektoré funkcie plazmatickej membrány

Trojrozmerná struktúra porinu vo vonkajšej membráne Rhodobacter capsulatus

Proteín sa skladá z 16 pásov štruktúry, ktorá je zakrivená do tvaru súdka za vzniku transmembránového kanálu zaplneného vodou.

„Single-pass“ trans-mebránový proteín