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Los protistas flagelados y ciliados constituyen importantes
comunidades microbianas implicadas en el funcionamiento de los
sistemas acuáticos debido a su ubicuidad y abundancia en todos los
tipos de hábitats. Los protistas fagotrofos se encuentran distribuidos,
literalmente, de polo a polo, desde los lagos en los valles secos de la
Antártida (Laybourn-Parry y col., 2000) hasta el agua de mar bajo el
hielo del Ártico (Sherr y col., 1997).
Las comunidades de flagelados y ciliados participan activamente
en las redes y cadenas alimenticias esenciales y, por tanto, en el
conocido "bucle microbiano" (Azam y col., 1983): el bacterioplancton
utiliza el material orgánico disuelto, liberado en su mayor parte por el
fitoplancton, adquiriendo la característica de material particulado. La
comunidad de bacterias soporta el crecimiento de los protistas
bacterívoros que, a su vez, actúan como nexo de unión entre el bucle
microbiano y la cadena trófica clásica. La liberación de nutrientes
inorgánicos y orgánicos por procesos de respiración y excreción de
diferentes organismos, estimula el crecimiento en los niveles tróficos
inferiores, comenzando de nuevo el ciclo. Este proceso supone una
transferencia de carbono y energía a los niveles superiores, peces y
mamíferos, y por lo tanto, condiciona la productividad biológica del
sistema. Así, las comunidades de flagelados y ciliados, sirven como
principales descomponedores y mediadores del reciclaje de nutrientes
en los sistemas acuáticos (Patterson y Larsen, 1991; Reid y col., 1991;
Wetzel, 2001).
Tradicionalmente el medio ambiente pelágico se percibía como
relativamente homogéneo, sin embargo, trabajos de investigación
llevados a cabo durante las últimas dos décadas sugieren que los
microorganismos pelágicos viven en ambientes muy estructurados en
los que tienen gran importancia partículas de muy distintos tamaños
(Alldredge y Silver, 1988, Koike y col., 1990; Alldredge y col., 1993;
Simon y col., 2002). En base a características tales como morfología y
estrategia alimenticia, los protistas flagelados y ciliados marinos pueden
encontrarse bien nadando libremente en la columna de agua o bien
temporal o permanentemente adheridos a estas partículas (Pernthaler,
2005).
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En el medio acuático marino abunda la materia coloidal en
suspensión (Honjo y col., 1984: Asper, 1986) poseedora de un poder de
adsorción tal que le permite conglomerarse con otro tipo de material
particulado, pudiendo llegar a generar en la columna de agua formas
visibles conocidas como macroagregados.
En los sistemas acuáticos marinos los macroagregados en
suspensión están distribuidos de forma ubicua. Las fuentes de estos
macroagregados en el plancton son numerosas: procesos de floculación
del fitoplancton, excreciones y mudas de diversas especies de
zooplancton y fitoplancton, restos de organismos muertos, arcilla y
otros materiales inorgánicos de origen terrestre, etc. (Alldredge y Silver,
1988; Alldredge y Gotschalk, 1990, Herndl, 1992, Grossart y col., 1997,
Kiørboe y col., 1998). Así, se puede definir a los macroagregados en
suspensión como conglomeraciones de más de un tipo de partículas, y
en los trabajos científicos se hace referencia a ellos mediante términos
como "agregados amorfos", "partículas en sedimentación" o "nieve
marina". Este último término fue introducido en la literatura científica
por Suzuki y Kato en 1953 para describir "...el material floculento
presente en la columna de agua...", aunque la definición más
ampliamente utilizada en los trabajos recientes es la propuesta por
Alldredge y Silver en 1988: "...aquellas partículas agregadas presentes
en el mar mayores de 500µm de longitud...".
A pesar de los diversos orígenes y componentes de los
macroagregados, todos ellos tienen en común que son microhábitats
enriquecidos en carbono orgánico (Alldredge, 1979: Silver y Alldredge,
1981) y nutrientes (Shanks y Trent, 1980: Fellows y col., 1981,
Alldredge y Cohen, 1987; Glibert y col., 1988) en comparación con el
agua circundante oligotrofa, lo que les convierte en sitios especialmente
adecuados para la colonización y el crecimiento de microorganismos
heterotrofos. Los macroagregados se caracterizan por contener una
densidad y biomasa bacterianas 2-3 órdenes de magnitud superiores a
las encontradas en el agua circundante (Caron y col., 1982; Müller-
Niklas y col., 1994, Turley y Mackie, 1994, Ploug y Grossart, 2000;
Grossart y col., 2003). Así, los agregados juegan un papel fundamental
tanto en el flujo de energía a través de las comunidades microbianas
como en el transporte vertical de algunos elementos en el océano
(Caron, 1991, Kiørboe, 2001, Kiørboe y Jackson, 2001).
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La escasez de trabajos acerca de las comunidades microbianas
asociadas a agregados es debida, probablemente, a las dificultades
metodológicas implícitas en el trabajo experimental con agregados
naturales. Los instrumentos de toma de muestras que se utilizan
habitualmente, tales como bombas (Gibbs, 1981) o botellas
oceanográficas (Calvert y McCartney, 1979; Gibbs y Konwar, 1983), así
como el posterior transporte y manejo de las muestras de agua,
conllevan la disgregación de las partículas que contienen. Por esta
razón, la información disponible sobre nieve marina deriva
fundamentalmente de observaciones “in situ” y recolecciones directas
utilizando sumergibles o buzos con escafandra autónoma. Además, la
presencia de agregados en el sistema marino se encuentra relacionada
con el ciclo estacional, con el estado nutricional del sistema y con el
régimen de turbulencia del mismo.
A la vista de las mencionadas dificultades en relación con el
estudio de agregados naturales, es comprensible que se hayan llevado a
cabo diversas tentativas encaminadas a la búsqueda de un sistema
experimental que permita la obtención de agregados similares a los
naturales, bajo condiciones controladas en el laboratorio. Con objeto de
favorecer la formación de agregados, el agua de mar ha sido en
ocasiones suplementada con materia orgánica de diferentes orígenes
(Krank y Milligan, 1980; Davoll y Silver, 1986, Biddanda, 1985, Crocker
y Passow, 1995, Engel y Schartau, 1999, Ploug y Grossart, 2000, Engel
y col., 2002), si bien algunos autores (Shanks y Edmonson, 1989) han
cuestionado la representatividad de los agregados así formados como
modelos generales de nieve marina. Otros autores (Shanks y
Edmonson, 1989; Alldredge y col., 1995; Unanue y col., 1998a), han
conseguido formar en el laboratorio agregados marinos a partir de
únicamente agua de mar sin adicionar ningún tipo de material
alóctono, y tras analizar sus características morfológicas, químicas y
biológicas, se han revelado como modelos válidos para el estudio de
procesos microbiológicos (Shanks y Edmonson, 1989; Unanue y col.,
1998a).
En general, los estudios microbiológicos de agregados marinos
tienen como objetivo principal el conocimiento de las comunidades
bacterianas que llevan asociadas (Alldredge y Youngbluth, 1985;
Alldredge y col., 1986; Herndl, 1988; Azam y col., 1993; Müller-Nicklas
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y col., 1994; Unanue y col., 1998a y b). No obstante, cabe suponer que
los protistas jueguen un papel en los procesos de transformación y
descomposición de los agregados marinos, si bien su relevancia es aún
hoy en día objeto de discusión (Lochte, 1991; Turley, 1991; Fukuda y
Koike, 2000).
Por un lado, los protistas se encuentran directamente implicados
en la degradación de los agregados tanto por rotura de los mismos
mediante hidrólisis enzimática (Nagata y Kirchman, 1992; Karner y col.,
1994), como por consumo directo de material coloidal, el cual se
encuentra presente en las fases iniciales y finales del proceso de
degradación (Tranvik y col., 1993). Por otro lado, los protistas asociados
a agregados son mayoritariamente microorganismos fagotrofos, cuya
fuente de nutrientes está constituida principalmente por bacterias. De
esta manera, consumiendo bacterias adheridas, podrán controlar de
forma indirecta la velocidad de remineralización de la materia orgánica
que lleva a cabo el componente procariota de los agregados.
A la hora de profundizar en el conocimiento de la función de los
protistas en los agregados marinos, resulta previo llevar a cabo una
caracterización de las comunidades asociadas a los mismos. Patterson y
col. publicaron en 1993 un exhaustivo estudio en el que describieron 40
especies diferentes de flagelados heterotrofos asociados a detritus. No
obstante, la información disponible en relación con la identificación y
caracterización de las comunidades de protistas bacterívoros asociadas
a agregados respecto de las de vida libre, no aporta resultados
concluyentes, por lo que se hace necesario seguir profundizando en la
investigación. Algunos autores (Caron y col., 1982; Patterson y Fenchel,
1990; Caron, 1991; Rogerson y Laybourn-Parry, 1992; Zimmermann-
Tim, 1998) han observado que muchas de las especies de protistas
asociados a partículas, son formas mal adaptadas a una existencia
planctónica, tal y como lo son las especies bentónicas. Por el contrario,
otros autores (Fenchel, 1982) han observado las mismas especies de
protistas en agregados y en el agua circundante.
La presencia de agregados en el agua hace que se origine una
heterogeneidad espacial de los componentes bióticos y abióticos en la
zona planctónica del sistema marino, que afecta a la distribución,
comportamiento y función de las comunidades de protistas presentes.
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En ausencia de estas partículas, todos los protistas de la columna de
agua comparten las mismas condiciones tanto en cuanto al medio físico
en el que se encuentran, como en cuanto a la disponibilidad de presas
del mismo. La presencia de agregados suspendidos en el sistema
conlleva la aparición de un nuevo y muy distinto microhábitat
potencialmente aprovechable por parte de la comunidad de protistas
marinos.
En el primer capítulo de esta Memoria pretendemos determinar si
la presencia de macroagregados suspendidos en la columna de agua del
sistema origina una nueva distribución espacial de la comunidad de
protistas marinos preexistente. Para ello obtendremos macroagregados
a partir de agua de mar en microcosmos de laboratorio y
caracterizaremos la abundancia, la estructura taxonómica principal y
algunas características del comportamiento de los protistas bacterívoros
que pueden habitar sistemas acuáticos espacialmente heterogéneos.
Una vez establecido que los agregados orgánicos constituyen focos
localizados de alimento en la columna de agua que son rápidamente
colonizados tanto por el bacterioplancton como por el protozooplancton,
abordaremos el estudio de la depredación ejercida por las comunidades
de protistas sobre las comunidades bacterianas en los agregados y sus
cercanías. Recientemente, Agis y col. (1998) y Unanue y col. (1998b)
trabajando con macroagregados derivados de fitoplancton, demostraron
que estas partículas contenían altas densidades de bacterias
fuertemente adheridas, de tamaño más elevado de lo habitual y que
poseían altas actividades hidrolíticas y bajas velocidades de consumo de
monómeros. De esta manera, los agregados podrían ser considerados
como verdaderos reactores biológicos que liberan al medio de forma
continua nutrientes de bajo peso molecular (Smith y col. 1992; Grossart
y Simon 1998, Unanue y col. 1998b), haciendo que la capa de agua más
próxima al agregado contenga elevadas densidades de una comunidad
bacteriana en suspensión que aprovecha los nutrientes liberados desde
el agregado. Parece lógico suponer que el nivel trófico inmediatamente
superior al bacteriano, es decir el nivel protista (microorganismos
bacterívoros), constituya igualmente una activa comunidad tanto en los
propios agregados como en el agua inmediatamente circundante, dadas
las altas densidades poblacionales de presas disponibles en estos dos
microhábitats.
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Durante las dos últimas décadas se han publicado numerosos
trabajos referentes a la depredación ejercida por los protistas sobre
comunidades de bacterias en suspensión (ej. Sherr y col. 1989; Sanders
y col. 1992), sin embargo, y a pesar de la importancia de la presencia de
macroagregados orgánicos en el medio marino, cabe resaltar la escasa
información disponible acerca de la depredación ejercida sobre
bacterias adheridas a partículas. Esta carencia se debe en buena parte
a que la comunidad científica no dispone de una técnica válida para
cuantificar velocidades de depredación de protistas en sistemas
particulados.
De las múltiples técnicas empleadas para cuantificar velocidades
de depredación de protistas sobre bacterias en suspensión (Landry,
1994; Strom, 2000) una de las más satisfactorias y mejor consideradas
es la cuantificación de la ingestión de bacterias teñidas con un
colorante fluorocromo (Fluorescently Labeled Bacteria, FLB) propuesta
por Sherr y col. en 1987. Uno de los pocos inconvenientes de esta
técnica es que resulta únicamente válida para sistemas libres de
partículas, ya que uno de sus principales requerimientos consiste en
ofrecer a los protistas bacterias teñidas, en cantidad traza,
uniformemente distribuidas entre las bacterias no teñidas, no pudiendo
por tanto ser utilizada en muestras de agua que contienen sistemas
particulados.
A falta de una técnica universalmente aceptada, distintos autores
han llevado a cabo estimas de depredación sobre comunidades de
bacterias adheridas, utilizando metodologías muy diversas. Caron
(1987) estimó la depredación ejercida por microflagelados heterotrofos
sobre bacterias adheridas comparando las densidades de bacterias
adheridas a partículas de quitina en presencia y ausencia de
depredadores. Albright y col. (1987) utilizaron bacterias teñidas con el
colorante fluorocromo 5-([4,6-diclorotriazin-2,4´-il] amino) fluoresceína
(DTAF), adheridas a bolas de alginato para cuantificar velocidades de
ingestión de protistas ciliados estuarinos. Hondeveld y col. (1992) y
Epstein (1997) calcularon velocidades de ingestión de protistas en
sedimentos marinos adicionando FLB en suspensión (no adheridas) a
los sedimentos. Por último Starink y col. (1994, 1996) propusieron un
nuevo método y cuantificaron la depredación ejercida por protistas
heterotrofos bénticos a partir de sedimentos teñidos que contenían FLB
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adheridas. En este método, las bacterias adheridas a los sedimentos se
teñían adicionando el fluorocromo DTAF directamente a los sedimentos.
Tras repetidos lavados para retirar el exceso de colorante, los
sedimentos teñidos se mezclaban con muestras de sedimento sin teñir
en proporciones adecuadas. La cantidad de bacterias teñidas ingeridas
se determinaba por microscopía de epifluorescencia mediante la
enumeración de las mismas en las vacuolas alimenticias de los
protistas.
En el segundo capítulo de esta Memoria nos hemos planteado la
utilización de partículas modelo de estudio creadas en el laboratorio a
partir de agua de mar natural, con el fin de cuantificar la capacidad
depredadora de especies de protistas bacterívoros sobre bacterias
adheridas. Como objetivo preliminar nos propusimos modificar la
técnica de ingestión de FLB uniformemente dispersas descrita por Sherr
y col. (1987), con el fin de hacerla efectiva para estimar velocidades de
depredación de protistas sobre comunidades bacterianas firmemente
adheridas a macroagregados orgánicos. Además, con objeto de evaluar
la importancia de la bacterivoria en partículas, paralelamente se
llevaron a cabo experiencias en las que se cuantificó la bacterivoria
ejercida por los protistas sobre bacterias en suspensión a las bajas
densidades poblacionales características de los sistemas marinos y a las
altas densidades que caben esperarse en la capa de agua circundante a
los agregados. De esta manera, podremos conocer la transferencia de
materia y energía entre bacterias y protistas en las partículas y tener
una idea más precisa de la importancia relativa de los tres nichos
ecológicos diferentes que se crean en el medio marino en presencia de
sistemas particulados.
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El objetivo general del presente trabajo consiste en analizar
comparativamente la capacidad depredadora de protistas bacterívoros
marinos flagelados y ciliados sobre el bacterioplancton adherido a
material particulado frente al bacterioplancton en suspensión, así como
evaluar la importancia de la presencia de macroagregados en el medio
marino desde el punto de vista del flujo de materia y energía entre los
niveles tróficos bacteria y protista de la red trófica microbiana.
Conseguir este objetivo requiere un estudio profundo acerca de las
comunidades de protistas asociadas a los macroagregados y una
metodología que posibilite cuantificar depredación en estos sistemas
particulados.
Con el fin de alcanzar este objetivo general, el estudio se dividió en
dos objetivos parciales cada uno de los cuales constituye un capítulo de
esta tesis:
Objetivo 1
Analizar la distribución espacial de las comunidades de protistas
en sistemas marinos que contienen macroagregados, así como la
sucesión de protistas bacterívoros que tiene lugar en macroagregados
marinos formados en el laboratorio.
Con el fin de alcanzar este primer objetivo parcial, el estudio se ha
desglosado en los siguientes subobjetivos:
1.1. Diseñar un microcosmos experimental que, a partir de agua
de mar, permita el establecimiento y estudio, en condiciones
controladas de laboratorio, de dos fases: particulada (macroagregado) y
líquida (agua circundante).
1.2. Analizar la diversidad de protistas en el microcosmos a lo
largo del proceso de formación/disgregación de los macroagregados,
caracterizando al mismo tiempo la estrategia de los protistas en la
colonización de los mismos.
1.3. Determinar la importancia cuantitativa de las comunidades de
protistas bacterívoros asociadas a macroagregados frente a las
comunidades de protistas bacterívoros en suspensión.
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1.4. Analizar las modificaciones que experimenta la distribución
espacial de la comunidad de protistas existente en el agua de mar
cuando en el sistema aparece material particulado en forma de
macroagregados.
1.5. Aislar, identificar y mantener en cultivo en el laboratorio
protistas flagelados y ciliados representativos del agua de mar y de
macroagregados marinos.
Objetivo 2
Cuantificar y analizar comparativamente la depredación ejercida
por protistas bacterívoros marinos sobre bacterioplancton en
suspensión y bacterioplancton adherido a material particulado.
Este segundo objetivo parcial se ha dividido en los siguientes
subobjetivos:
2.1. Diseñar una metodología nueva que permita cuantificar
depredación por protistas bacterívoros sobre bacterioplancton adherido
a material particulado.
2.2. Cuantificar y analizar comparativamente la capacidad
depredadora de protistas bacterívoros en los tres microhábitats
diferentes que se generan en sistemas marinos que contienen
agregados: macroagregado, capa de agua que rodea al agregado y agua
de mar.
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Los resultados de este primer Capítulo han sido recogidos en dos publicaciones internacionales que se incluyen al final de la Memoria:
“Succession of bacterivorous protists on laboratory-made
marine snow”. Journal of Plankton Research 19: 1429-1440. 1997.
En este trabajo se estudió el patrón de colonización y sucesión de
protistas bacterívoros que tiene lugar en macroagregados formados en
el laboratorio a partir de agua de mar natural.
“Spatial distribution of protists in the presence of
macroaggregates in a marine system”. FEMS Microbiology Ecology
33: 191-196. 2000.
En este trabajo se analizó la distribución espacial de los protistas
marinos que tiene lugar cuando en la columna de agua del sistema
aparecen macroagregados en suspensión.
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Con el fin de estandarizar la formación de macroagregados a partir
de muestras de agua de mar, se diseñó un sistema experimental
(microcosmos) modificado a partir del descrito por Shanks y Edmonson
en 1989. En estos microcosmos se llevaron a cabo una serie de
experiencias en las que se diferenciaron dos fases, particulada y líquida.
Una vez formados los macroagregados, se tomaron muestras a lo
largo del proceso de descomposición de los mismos, tanto de
macroagregados como de agua circundante, las cuales fueron
analizadas cualitativa y cuantitativamente. El análisis cualitativo de
ambos tipos de muestras se llevó a cabo mediante observación en vivo
por microscopía óptica acoplada a un sistema de contraste
interferencial Nomarski. La cuantificación de las comunidades
microbianas se realizó mediante microscopía de epifluorescencia.
El estudio de la distribución espacial de los protistas presentes en
el agua tras la formación de macroagregados se llevó a cabo mediante
análisis cualitativos y cuantitativos comparativos entre las
comunidades microbianas presentes en las muestras de agua de mar
recién tomadas, y las muestras de agua circundante y macroagregados
tomadas del microcosmos experimental al 6º día de rotación del mismo.
Por último, se realizaron aislamientos utilizando técnicas de
micromanipulación de aquellos protistas más representativos de las dos
fases, macroagregados y agua circundante. Su identificación se llevó a
cabo en base a sus caracteres morfológicos y comportamiento. Estos
protistas se mantuvieron en cultivo realizándose resiembras
periódicamente y constituyen la actual colección de bacterívoros del
Grupo de Investigación Microbios Marinos de la UPV-EHU.
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3.2.1. Estación de muestreo y toma de muestras
La estación de muestreo se estableció en un sistema marino litoral
situado a dos millas frente a la playa de Sopelana (Vizcaya), cuya
localización geográfica fue 43°24,51'55'' N; 3°02,07'00''O (Figura 1). Las
muestras de agua se recogieron a 5m de profundidad utilizando una
botella oceanográfica de 10 litros de capacidad tipo PWS (Hydro-Bios).
El tiempo transcurrido entre la toma de muestras y su procesamiento
en el laboratorio no superó las 6 horas.
Figura 1. Localización geográfica de la estación de muestreo
Con el fin de enumerar la comunidad bacteriana presente en el
agua se fijaron dos submuestras de 50ml con formalina (concentración
final 2% v/v) y para enumerar las comunidades de protistas otras dos
submuestras de 200ml fueron fijadas con lugol (concentración final
0,5% v/v) - formalina (concentración final 3% v/v) (Sherr y col., 1988).
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3.2.2. Diseño del microcosmos experimental
La extremada fragilidad de los macroagregados marinos naturales
dificulta su recogida y manipulación. Es por esto que diseñamos un
sistema de laboratorio que permitiera la formación controlada de
macroagregados orgánicos a partir de muestras de agua de mar.
El sistema utilizado para la obtención de macroagregados se diseñó
siguiendo las indicaciones de Shanks y Edmonson (1989). Este aparato
consta de un soporte sobre el que se colocan unos cilindros de goma
movidos por un motor eléctrico con regulador de velocidad. Sobre este
sistema se colocaron los tanques cilíndricos de polipropileno (34cm
diámetro x 12cm fondo) con 11 litros de agua de mar procedente de la
estación de muestreo (Figura 2a).
Figura 2. Obtención de macroagregados en el laboratorio: (a) sistema utilizado para su formación y (b) observación macroscópica de
macroagregados. Barra de escala = 12mm
En los tanques se dejó una cámara de aire con el fin de evitar bajas
concentraciones de oxígeno durante el transcurso de las experiencias.
La apertura periódica de los tapones que cerraban los tanques facilitó la
renovación del aire contenido en los mismos. El control de la velocidad
de rotación de los cilindros permitió obtener macroagregados de
diferente tamaño, ajustándose de esta manera las condiciones óptimas
para la formación de macroagregados estables en tamaño (longitud
máxima 5-6mm) y en consistencia a 2,5rpm (Figura 2b).
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3.2.3. Toma de muestras de macroagregados y agua
Con el fin de observar y cuantificar los protistas característicos de
los distintos microhábitats creados en los microcosmos, así como de
estudiar la posible sucesión de grupos de protistas a lo largo del
proceso de descomposición, se tomaron submuestras de agua y
macroagregados a distintos tiempos de rotación de los tanques.
Para tomar las submuestras, tras detener la rotación del sistema,
los tanques cilíndricos se mantuvieron en reposo durante 2-5 minutos
permitiendo así la sedimentación de los macroagregados. Las muestras
de macroagregados destinadas a la observación directa de protistas se
tomaron a intervalos regulares de 12 horas. Mediante un tubo flexible
se extrajeron tres macroagregados que fueron depositados en una
cámara de observación Sedgewick-Rafter que contenía 1ml de agua de
mar filtrada a través de 0,2µm y autoclavada. En cámaras de
observación paralelas se depositaron muestras de 1ml de la fase líquida
de los microcosmos.
La toma de muestras para observación directa de protistas,
continuó hasta que los macroagregados fueron muy pequeños y frágiles
debido a su descomposición (aproximadamente durante 11 días).
Por otro lado, a distintos intervalos de tiempo, se tomaron
submuestras de macroagregado y de agua circundante para su
observación por microscopía de epifluorescencia y enumeración de las
distintas comunidades microbianas. Los macroagregados se extrajeron
con un tubo flexible, igual que en el caso anterior, y se depositaron y
mantuvieron durante 1 minuto en una placa de Petri, que contenía
agua de mar filtrada por 0,2µm y autoclavada, con el fin de que la
mayor parte de las bacterias suspendidas en el agua intersticial de los
agregados pasaran al agua de la placa. A continuación se tomaron
submuestras de 7µl de macroagregado sin agua circundante colocando
la punta de una micropipeta automática directamente sobre las
partículas, y se resuspendieron en 1ml de agua de mar filtrada por
0,2µm y autoclavada. Las submuestras para determinación de la
densidad de protistas fueron fijadas por la técnica de decoloración de
lugol (concentración final 0,5% v/v) - formalina (concentración final 3%
v/v) y las destinadas a la enumeración de bacterias se fijaron con
formalina tamponada con carbonato cálcico (concentración final 2%
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v/v). En el caso del agua circundante se tomaron volúmenes de 10ml de
agua que fueron fijados como en el caso de los macroagregados. Todas
la submuestras fueron almacenadas a 4°C para su posterior recuento.
3.2.4. Enumeración de las comunidades microbianas
Los recuentos de las comunidades microbianas en suspensión
(muestras de agua) se realizaron por duplicado en tanto que los
correspondientes a las comunidades microbianas adheridas a los
agregados (muestras de partículas) se hicieron por triplicado.
La enumeración de la comunidad bacteriana se realizó según la
técnica de tinción con naranja de acridina y recuento directo mediante
microscopía de epifluorescencia (Hobbie y col., 1977). En el caso de las
muestras de material particulado se siguió la modificación descrita por
Velji y Albright (1986). Muestras de 7µl de macroagregados previamente
fijadas fueron tratadas con una solución de pirofosfato tetrasódico
estéril (concentración final 10mM) e incubadas durante 1 hora a
temperatura ambiente en un agitador orbital (12rpm). Una vez enfriadas
durante 15 minutos a 4ºC, las muestras fueron sonicadas a 100W 6
pulsos de 5 segundos de duración. La sonicación se realizó en baño de
hielo para evitar el calentamiento de las muestras. Tras la sonicación
las muestras fueron teñidas con naranja de acridina (concentración
final 0,01% peso/vol) durante 2 minutos y filtradas a través de filtros
negros de policarbonato de 0,2µm de tamaño de poro. Se llevaron a
cabo 3 lavados con 2ml de agua desionizada filtrada y los filtros se
montaron sobre portaobjetos con aceite de inmersión de baja
fluorescencia. Las preparaciones se observaron en un microscopio de
epifluorescencia Nikon Optiphot bajo luz incidente azul a 1.250
aumentos. Se contaron las bacterias presentes en al menos 30 campos
seleccionados al azar que contenían aproximadamente 20-30 bacterias
por campo.
En el caso de las muestras de agua, la técnica utilizada para el
recuento de la comunidad bacteriana fue la descrita por Hobbie y col.
(1977). Volúmenes adecuados de agua se tiñeron 2 minutos con una
solución de naranja de acridina (concentración final 0,01% peso/vol) y
posteriormente fueron filtrados, lavados y observados siguiendo el
mismo proceso indicado en las muestras de macroagregado.
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Las densidades de protistas flagelados y ciliados fueron estimadas
siguiendo la metodología propuesta por Porter y Feig (1980). Volúmenes
adecuados de las muestras de macroagregados y de agua circundante
previamente fijadas, se tiñeron con el colorante 4', 6'-diamidino-2-fenil
indol (DAPI) (concentración final 0,2µg ml-1) durante 7 minutos, y se
filtraron a través de filtros Millipore de policarbonato previamente
teñidos (solución de negro irgalán 0,2% peso/vol en ácido acético 2%
durante 24h.). El tamaño de poro del filtro fue de 0,8µm cuando se
quiso retener y contar protistas flagelados y de 3,0µm de tamaño de
poro para el recuento de protistas ciliados.
Los filtros se montaron empleando aceite de inmersión de baja
fluorescencia. Las preparaciones se observaron en un microscopio de
epifluorescencia Nikon Optiphot. Los recuentos de los protistas
flagelados heterotrofos se llevaron a cabo utilizando luz incidente
ultravioleta a 1.250 aumentos. Para cada muestra se examinaron 100
campos de microscopio tomados al azar. Los protistas flagelados
autotrofos se distinguieron de los heterotrofos por la autofluorescencia
roja que presentaban bajo la incidencia de luz azul y no fueron tenidos
en cuenta. Los recuentos de los protistas ciliados se llevaron a cabo a
200 y 1.250 aumentos con luz ultravioleta, examinándose en este caso
toda la superficie del filtro.
3.2.5. Determinación de los factores de enriquecimiento
Con objeto de comparar la abundancia de las distintas
comunidades microbianas en agregados y en el agua circundante se
calcularon los correspondientes factores de enriquecimiento (F.E). Estos
factores representan el cociente entre el número de microorganismos
presentes en 1 ml de agregado y el número de microorganismos
presentes en 1 ml de agua circundante:
Por un lado, se calcularon los factores de enriquecimiento
correspondientes a las distintas comunidades de protistas a lo largo del
proceso de descomposición de los agregados en dos de las experiencias
=Factor de Enriquecimiento (F.E.)nº microorganismos ml -1 agregado
nº microorganismos ml -1 agua=Factor de Enriquecimiento (F.E.)
nº microorganismos ml -1 agregado
nº microorganismos ml -1 agua
- 17 -
llevadas a cabo, una correspondiente a la situación más fría del sistema
(Febrero) y la otra correspondiente a la situación más cálida del mismo
(Septiembre). Para ello, se tomaron y fijaron muestras de agregado y
agua a intervalos de 24 h. desde el 4º hasta el 10º día de rotación del
agua en los tanques.
Por otro lado, en siete de las experiencias, en el momento en que
los agregados estaban densamente colonizados por las distintas
comunidades microbianas (6º día de rotación del tanque) y, a partir de
las densidades poblacionales de bacterias y de protistas flagelados y
ciliados en los macroagregados y en el agua circundante, se calcularon
igualmente los factores de enriquecimiento (F.E.) de estas tres
comunidades.
3.2.6. Observación, caracterización e identificación de protistas en
macroagregados y agua circundante
Los protistas característicos de las tres fases creadas en los
microcosmos, agua, macroagregado y capa de agua que rodea al
agregado, fueron identificados en base a sus caracteres morfológicos y
comportamiento utilizando microscopía óptica y de epifluorescencia.
La observación "in vivo" permitió determinar la forma, tamaño,
movimiento, tipo de nutrición y reproducción de los protistas de las
distintas fases y se llevó a cabo sobre muestras vivas en cámaras
Sedgewick-Rafter de 1ml de capacidad. El material fue observado por
microscopía óptica a 200 y 1.250 aumentos (microscopios Nikon
Diaphot-TMD y Optiphot equipados con sistema Nomarsky). En el caso
de los protistas en suspensión característicos de la primera de las fases,
su observación se realizó en muestras de la fase líquida sin partículas.
En el caso de los macroagregados, éstos se mantuvieron durante
unos minutos en la cámara para permitir que los protistas presentes en
su interior sedimentaran. Los protistas habitantes del interior de los
agregados se detectaron tras la suave ruptura de los mismos mediante
una punta de pipeta estéril, ruptura que no afectó a la movilidad de los
protistas. Por último, consideramos la tercera de las fases creadas en
los microcosmos como la microzona de unos 50µm que rodea al
agregado. En ella se detectaba una gran acumulación de comunidades
microbianas tanto de bacterias como de protistas, tal y como
- 18 -
describieron Bell y Mitchell en 1972 al formular el concepto de
"ficosfera” y Biddanda y Pomeroy en 1988 cuando definieron el de
“detritosfera”. Los microorganismos habitantes de estas microzonas
pueden estar tanto en suspensión como adheridos a la superficie de las
partículas. Los protistas caracterizados como habitantes de la capa de
agua que rodea al agregado se detectaron observando los bordes y el
agua inmediatamente próxima al agregado.
La observación al microscopio de epifluorescencia mostró la forma y
posición de los núcleos de los protistas y, en el caso de los ciliados, el
número de los mismos. Para preparar las muestras se siguió la
metodología propuesta por Porter y Feig (1980). Las muestras de
macroagregados y de agua se tiñeron con el colorante DAPI en
concentración final 0,02mg ml-1 durante 7 minutos, y se filtraron a
través de filtros Millipore de policarbonato de 0,8µm de tamaño de poro
previamente teñidos (solución de negro irgalán 0,2% peso/vol en ácido
acético 2% durante 24h.). Los filtros se montaron empleando aceite de
inmersión de baja fluorescencia. Las preparaciones se observaron bajo
luz incidente ultravioleta a 200 y 1.250 aumentos (protistas ciliados) y
1.250 aumentos (protistas flagelados) en un microscopio de
epifluorescencia Nikon Optiphot equipado con luz ultravioleta.
3.2.7. Aislamiento de protistas representativos de macroagregados
y de agua
Algunos de los protistas representativos de macroagregados y de
agua de mar fueron aislados mediante micromanipulación utilizando un
microinyector Narishige IM-188. Esta técnica consiste en recoger
mediante un capilar con una abertura en el extremo de 0,5-1,0mm una
única célula de la especie deseada y transferirla a un medio en el cual
se pueda multiplicar, como es el medio de Infusión de Hojas de Cereal
al 0,01% (IHC) (Lee y Soldo, 1992).
Tras recoger células individuales, se lavaron mediante
transferencia al medio IHC y se introdujeron finalmente en un
recipiente con 10ml del mismo medio. Todo este proceso se realizó bajo
observación en un microscopio invertido Nikon Diaphot-TMD a 200 y
400 aumentos. El cultivo de protistas se incubó en oscuridad a 15°C y
se chequeó al cabo de 2, 7 y 14 días. Cuando se obtuvo un crecimiento
- 19 -
positivo de un solo tipo de protista, se realizaron subcultivos y se
continuó con el mantenimiento del cultivo.
3.2.8. Mantenimiento de los cultivos de protistas aislados
Los cultivos de protistas se llevaron a cabo en placas de plástico
estériles de 35mm de diámetro y 10ml de capacidad. En estas placas se
inoculó 1ml de la suspensión de protistas y bacterias acompañantes en
9ml de medio IHC.
Estos cultivos se incubaron a 15°C en oscuridad y se realizaron
chequeos del crecimiento de los protistas en los días posteriores a la
siembra.
A partir de aquí, y para mantener la colección de protistas, se
realizaron resiembras cada tres semanas utilizando como inóculo el
cultivo de fecha inmediatamente anterior.
- 20 -
3.3.1. Formación de agregados en el laboratorio
En todos los ensayos llevados a cabo, la formación de agregados en
el laboratorio siguió un patrón similar. Las primeras partículas
agregadas se observaron a las 24 horas de rotación del agua de mar en
las cámaras cilíndricas y su aglomeración dio origen a agregados
estables en tamaño (longitud máxima 5-6mm) y consistencia al cuarto
día. Estos agregados observados bajo el microscopio óptico a 200
aumentos aparecían como una masa compacta y opaca en la que se
distinguían cuerpos de algas, mudas de organismos vivos, etc.,
procedentes del agua de mar (Figura 3). A partir del octavo día de
rotación, y debido posiblemente al efecto de degradación de las
comunidades microbianas, los agregados comenzaron a disgregarse,
dando lugar a partículas cada vez más pequeñas y frágiles.
Figura 3. Observación microscópica de los agregados obtenidos. Barra de escala = 20µm.
- 21 -
3.3.2. Enriquecimiento de la comunidad de protistas en los
agregados
En las dos experiencias de sucesión llevadas a cabo y como
consecuencia de que las abundancias de protistas flagelados y ciliados
fueron notablemente superiores en los agregados que en el agua
circundante, se obtuvieron unos factores de enriquecimiento >1, tal y
como se observa en la Tabla 1. Esto significó que en las dos situaciones
del ecosistema estudiadas, los agregados fueron ambientes más
favorables para el crecimiento de los protistas que el agua. Además los
factores de enriquecimiento fueron mayores al comienzo de las
experiencias, es decir, cuando los agregados estaban recién formados y
colonizados, que al final de las mismas, excepto para la comunidad de
flagelados en la situación cálida del sistema, registrándose en este caso
muy baja variabilidad de los factores de enriquecimiento durante todo el
proceso de colonización y disgregación de los agregados.
Flagelados
Tiempo (día de rotación) 4 5 6 7 8 9 10
Situación fría 7,1�103 3,6�103 3,5�104 3,1�103 9,9�102 6,3�102 1,9�102
Situación cálida 6,7�102 1,2�104 7,6�103 7,6�103 1,0�104 2,5�103 3,4�102
Ciliados
Tiempo (día de rotación) 4 5 6 7 8 9 10
Situación fría - 5,5�104 4,8�104 - 1,6�103 6,7�102 1,5�102
Situación cálida
3,0�103 - 3,3�102 5,7�102 4,8�102 1,6�102 0,8�102
Tabla 1. Factores de enriquecimiento de los protistas flagelados y ciliados en las dos situaciones estudiadas.
- 22 -
3.3.3. Sucesión de protistas en los agregados
En todas las experiencias llevadas a cabo, la sucesión de protistas
durante el proceso de formación y descomposición de los agregados
siguió un patrón similar: una vez formados los agregados, al cuarto día
de rotación de los tanques, fueron rápidamente colonizados por
pequeños protistas flagelados (Figura 4a), entre los que predominaron
especies que se caracterizaron como bodónidos debido a su
característico movimiento de suave deslizamiento en contacto con el
sustrato, y como bicosoécidos ya que se adherían al sustrato mediante
una lórica o un flagelo. Aproximadamente 24-48 horas más tarde se
detectaron los primeros ciliados (Figura 4b) y sarcodinos (Figura 4c).
Figura 4. Colonización de los agregados por protistas: a) flagelados, b)
ciliado, c) sarcodino (ameba). Barras de escala = 20µm.
La observación de los protistas sarcodinos presentó gran dificultad
debido a su débil contraste con el agregado y a su escasa movilidad.
Así, las amebas sólo pudieron ser detectadas cuando abandonaban el
agregado y sedimentaban en una cámara de observación Sedgewick-
Rafter, mientras que la observación de heliozoos y radiolarios fue
únicamente posible tras la ruptura del agregado. Muchos de los
sarcodinos observados fueron amebas desnudas que adoptaban formas
flotantes radiadas cuando pasaban a la fase líquida. Estas formas de
locomoción presentaban una masa esférica de la que partían
pseudópodos de diferentes longitudes, los cuales eran reabsorbidos en
pocos minutos cuando las amebas se posaban sobre la cámara de
observación.
- 23 -
Al respecto de los protistas ciliados, la mayoría fueron células de
morfología ovoide con ciliatura holotrica y de rápidos movimientos,
caracterizadas como escuticociliados, y células ovoides que presentaban
una zona adoral de membranelas y cirros ventrales que utilizaban para
desplazarse sobre el sustrato, y fueron caracterizadas como hipotricos.
3.3.4. Distribución espacial de protistas frente a material
particulado
3.3.4.1. Análisis cuantitativo
Los recuentos de las distintas comunidades microbianas
correspondientes a las siete experiencias llevadas a cabo con objeto de
analizar las modificaciones que experimenta la distribución espacial de
los microorganismos del agua cuando en el sistema aparecen agregados
en suspensión, se recogen en la tabla 2.
En el caso de las muestras de agua de mar natural, la abundancia
bacteriana media detectada fue de 1,4�106 bacterias ml-1, en tanto que
la comunidad de protistas flagelados heterotrofos se mantuvo en valores
tres órdenes de magnitud inferior (valor medio 0,7�103 flagelados ml-1).
La abundancia de la comunidad de ciliados fue muy baja, con un valor
medio de 0,7 ciliados ml-1 de agua de mar. Hay que tener en cuenta que
en tres de las siete experiencias realizadas, no se cuantificó ningún
ciliado, siendo el límite de detección del método empleado de 0,02
ciliados ml-1.
En el caso de los microcosmos, se cuantificaron las abundancias
de las distintas comunidades microbianas en las fases: agua (fase
líquida) y agregado (fase particulada). Los recuentos se llevaron a cabo
al sexto día de rotación del agua de mar en los tanques, es decir,
cuando los agregados estables en tamaño y consistencia, estaban
densamente colonizados. Los valores obtenidos se muestran en la tabla
3. Tal y como se puede apreciar, las densidades tanto de bacterias como
de protistas fueron tres órdenes de magnitud superior en los agregados
que en el agua circundante. Además, se calcularon los factores de
enriquecimiento del mismo modo que ha sido descrito en el apartado
anterior de este capítulo. El enriquecimiento medio fue de 1,9�103 para
las bacterias, 0,6�103 para los flagelados y 2,2�103 para los ciliados, que
resultaron ser la comunidad más enriquecida.
- 24 -
AGUA DE MAR MICROCOSMOSa
NATURAL Agua Agregado FE
b
Bacterias ml-1
1,4�106
(0,6�106-2,4�10
6)
1,1�106
(0,5�106-1,8�10
6)
1,8�109
(1,4�109-2,0�10
9)
1,9�103
(1,1�103-3,5�10
3)
Flagelados
heterotrofos ml-1
0,7�103
(0,3�103-1,3�10
3)
3,1�103
(1,7�103-4,7�10
3)
1,6�106
(0,7�106-3,5�10
6)
0,6�103
(0,2�103-1,0�10
3)
Ciliados ml-1
0,7
(<0,02-2,7)
14,0
(3,4-37,2)
2,7�104
(0,1�104-15,0�10
4)
2,2�103
(43,0-1,2�104)
a recuentos correspondientes al 6º día de rotación de las cámaras.
b FE: Factor de Enriquecimiento, calculado como el cociente entre el número de microorganismos presentes en 1ml
de agregado y el número de microorganismos presentes en 1ml del agua del microcosmos.
Tabla 2. Densidades poblacionales de las comunidades microbianas en las muestras de agua natural y en los microcosmos tras la formación de
agregados. Datos expresados como valor medio (rango)
3.3.4.2. Análisis cualitativo
Como resultado de la observación microscópica de las fases líquida
y particulada, llevada a cabo en siete experiencias, desde la aparición
de los agregados hasta su disgregación (8-10 días de rotación de los
tanques), se reconocieron un total de 27 tipos de protistas, entre
flagelados, ciliados y sarcodinos. Estos protistas mostraron una clara
preferencia entre los tres microhábitats generados en los microcosmos,
el agregado en sí, el agua próxima al agregado, y el resto del agua de las
cámaras, tal y como se recoge en la tabla 3.
- 25 -
Háb it a t en el m icrocosm os
Agregado
Agu a qu e
rodea a l
a gregado
Agu a
FLAGELADOS O. Euglen ida Ploeotia sp . Du ja rd in 1841 +
Entos iphon sp . Stein 1878 + O. Dinoflagellid a Oxy rrh is sp . Du ja rd in 1841 + + O. Bicos oecid a Cafeteria s p . Fen ch el & Pa t ters on 1988 +
Bicos oeca m aris Picken 1941 + Ps eud obodo trem ulans Gries sm an n 1913 + +
O. Kinetop las tid a Bodo d es ign is Sku ja 1948 + + Rhy nchomonas nas u ta Kleb s 1893 + +
O. Choanoflagellid a Desmare lla sp . Ken t 1878 + Coan oflagela dos desn u dos + Sa lp ingoeca s p. J ames -Cla rk 1866 + + Coan ofla gela dos lor ica dos y teca dos + +
Apu s om on a ds Amas tigomonas sp . de Sa edeleer 1931 + Cercom on ads Mas s is teria sp . La rs en&Pa t ter son 1990 + + Ch r is oph ytes Paraphy s omonas sp . de Sa edeleer 1 929 +
CILIADOS O. Hypotrich id a Euplotes vannus Mü ller 1786 + +
Aspid is ca s te in i Bu dden b rock 1920 + + O. Scu ticocilia tid a Uronem a m arinum Du ja rd in 1841 + +
Cohnilem bus puncta tus Kah l 1931 + Uropeda lium opis thos om a Kah l 1931 +
O. Oligotrich id a S trobilid ium s p . Sch ewiakoff 1893 + Lohm ann iella sp . Leega rd 1915 + Tin t ín idos +
SARCODINOS Su bcl. Gymnamoeb ia Vannella s p . Bovee 1965 + +
Amoeba rad ios a Bory de S t.Vin cen t 1822 + Cl. Heliozoea Heliozoos +
Cl. Poly cy s tinea Radiola r ios + Abrevia tu ra s : O.: Orden ; Su bcl.: Su bcla s e; Cl.: Cla s e.
Tabla 3. Protistas detectados en las tres fases de los microcosmos experimentales: agregado, capa de agua que rodea al agregado y agua.
- 26 -
Algunos protistas fueron siempre detectados en la fase líquida del
microcosmos pero nunca asociados a los agregados. Es el caso de la
forma flotante Amoeba radiosa, el flagelado Paraphysomonas sp. y
algunos coanoflagelados, así como los ciliados Cohnilembus punctatus,
Uropedalium ophistosoma, y especies de los géneros Strobilidium,
Lohmanniella y algunos tintínidos no identificados.
Los flagelados Ploeotia sp., Entosiphon sp. y Amastigomonas sp.
fueron detectados únicamente en agregados. El flagelado Massisteria
sp. y la ameba Vanella sp. fueron habitualmente detectados en
agregados y ocasionalmente en el agua de los microcosmos.
El agua inmediatamente próxima al agregado fue el tercer
microhábitat generado en los microcosmos. Algunos de los protistas que
se localizaron en este hábitat, como los flagelados Cafeteria sp. y
Bicosoeca maris, no fueron nunca detectados ni dentro del agregado, ni
en el resto del agua del microcosmos. Sin embargo, algunos otros de los
protistas localizados en las proximidades del agregado, fueron también
detectados en otro de los microhábitats. Es el caso de los flagelados
Bodo designis y Rhynchomonas nasuta y de los ciliados Euplotes vannus
y Aspidisca steini, que también solían encontrarse en el interior de las
partículas, y de los flagelados Oxyrrhis sp., Pseudobodo tremulans y
Salpingoeca sp. y el ciliado Uronema marinum, que también solían
localizarse en el agua de los microcosmos, lejos de los agregados.
3.3.5. Protistas asociados al agregado
Se identificaron diez de los protistas representativos asociados a
los agregados formados a partir de agua de mar: siete protistas
flagelados, dos ciliados y un sarcodino. La identificación de todos ellos
se realizó a partir del análisis de sus caracteres morfológicos y de su
comportamiento observado mediante microscopía óptica.
3.3.5.1. Protistas flagelados
Los flagelados Amastigomonas sp., Entosiphon sp. y Ploeotia sp.,
fueron detectados únicamente en agregados. Bodo designis, Jakoba
libera y Rhynchomonas nasuta se encontraron también en el agregado o
en la interfase agregado-agua. Por último, Massisteria marina fue
- 27 -
habitualmente detectado en agregados y ocasionalmente en el agua de
los microcosmos.
Amastigomonas sp. de Saedeleer, 1931 (Figura 5). Flagelado de
forma ovalada, con un tamaño muy pequeño, menor de 10µm de
longitud, morfológicamente parecido a Rhynchomonas sp.. Presentaba
un solo flagelo, de muy difícil observación, insertado en la parte
anterior de la célula y dirigido hacia la posterior. En la parte anterior se
observó una probóscide o "nariz" con la que barría el sustrato. La parte
dorsal de la célula era rígida, mientras que la parte ventral era bastante
plástica, emitiendo pseudópodos hacia la parte posterior.
Figura 5. Amastigomonas sp.. Barra de escala = 5µm
Era un flagelado con poca capacidad natatoria. Presentaba un
movimiento de deslizamiento lento hacia adelante al desplazarse sobre
el sustrato.
Entosiphon sp., Stein, 1878 (Figura 6). Euglénido heterotrofo de
morfología ovalada y aproximadamente 20µm de longitud y 10µm de
anchura. Resulto fácilmente identificable por su característico aparato
de ingestión en forma de sifón. Poseía dos flagelos: uno de ellos estaba
dirigido hacia adelante y solía hacer un movimiento de batida, mientras
que el flagelo posterior o recurrente era arrastrado sobre la superficie
del agregado. Es un flagelado descrito como capaz de ingerir detritus.
- 28 -
Figura 6. Entoshiphon sp.. Barra de escala = 5µm
Ploeotia sp., Dujardin, 1841 (Figura 7). Era un flagelado rígido
aplastado dorso-ventralmente con forma ovoide, algo plano en la parte
anterior y puntiagudo en la parte posterior, de un tamaño medio
aproximado de 20µm de largo y 10µm de ancho. Presentaba dos flagelos
desiguales insertados en una invaginación anterior, de los cuales, el
más corto se dirigía hacia adelante y era activamente movido, mientras
que el más largo, 3-4 veces la longitud de la célula, lo arrastraba por
detrás. Presentaba un aparato de ingestión bien desarrollado en forma
de bastón. En la superficie de la célula se apreciaban claramente unas
seis estrías longitudinales. Poseía un característico movimiento de
deslizamiento.
Figura 7. Ploeotia sp. Imágenes tomadas de http://starcentral.mbl.edu/microscope/portal.php
- 29 -
Bodo designis, Skuja, 1948 (Figura 8). Protista bodónido
biflagelado, de forma ovalada y tamaño aproximado de unos 10µm de
longitud y 5µm de anchura. Poseía dos flagelos diferentes en tamaño y
movimiento insertados en la parte anterior de la célula. El flagelo corto
era más activo e iba dirigido hacia delante, mientras que el flagelo largo
posterior o recurrente le permitía mantenerse en contacto con el
sustrato. Era un protista poco nadador, pero capaz de deslizarse sobre
superficies debido a la actividad del flagelo anterior, con un
característico movimiento basado en pequeños saltos.
Figura 8. B. designis. Barra de escala = 5µm
Jakoba libera, (Ruinen, 1938) Patterson, 1990 (Figura 9). Era un
protista biflagelado de forma elipsoidal y dimensiones aproximadas de
5-12µm de longitud y 3-5µm de anchura. El flagelo anterior estaba
apicalmente insertado, terminaba en forma de gancho y a menudo era
utilizado para fijarse al agregado. El otro flagelo se encontraba en un
surco ventral del cuerpo y normalmente era batido activamente para
crear una corriente de agua de donde separaba las bacterias.
Figura 9. J. libera. Barra de escala = 5µm
- 30 -
Rhynchomonas nasuta, (Stokes, 1888) Klebs, 1893 (Figura 10).
Pequeño flagelado de forma elipsoidal y menos de 10µm de longitud y
5µm de anchura. Resultó de fácil identificación al visualizar su
característica probóscide en la parte anterior de la célula, con la que
barría rápidamente el sustrato. Presentaba un único flagelo
posteriormente orientado, que le permitía mantenerse en contacto con
la superficie. Era un flagelado con poca capacidad natatoria, y se movía
lentamente hacia adelante mediante la actividad espasmódica de la
probóscide.
Figura 10. R. nasuta. Barra de escala = 5µm
Massisteria marina Larsen y Patterson, 1990 (Figura 11).
Pequeño biflagelado de entre 2,5 y 5µm de diámetro. Podía encontrarse
en dos formas diferentes, una forma sésil y otra móvil. En la forma sésil
la célula no utilizaba los flagelos. Emitía varios brazos radiados o
pseudópodos muy finos con pequeños extrusomas, que excedían
aproximadamente 5 veces el diámetro de la célula y con los que se
adhería al agregado. Cuando la célula se desprendía del sustrato y
pasaba a la fase líquida, reabsorbía los pseudópodos y activaba los
flagelos. Mediante tinción con naranja de acridina de un portaobjetos
mantenido en agua y posterior observación al microscopio de
epifluorescencia se detectó al flagelado en su forma inmóvil con
pseudópodos (Figura 9b).
- 31 -
Figura 11. M. marina: a) forma móvil y b) forma sésil con pseudópodos. Barras de escala = 5µm
3.3.5.2. Protistas ciliados
Las dos especies de ciliados identificadas asociadas a la fase
particulada solían encontrarse tanto desplazándose sobre el sustrato
como nadando en la interfase agregado-agua.
Aspidisca steini Buddenbrock, 1920 (Figura 12). Ciliado
hipotrico, de forma ovoide, dorso-ventralmente aplastado. La
observación en vivo mostró un pequeño ciliado de aproximadamente
30µm de longitud y 20µm de anchura. Presentaba una característica
zona adoral de membranelas dividida en dos partes y un pequeño
número de cirros fuertemente desarrollados que utilizaba para
desplazarse sobre el sustrato.
Figura 12. A. steini. Barra de escala = 15µm
- 32 -
Euplotes vannus (Müller, 1786) Minkjewicz, 1901 (Figura 13).
Pequeño ciliado hipotrico, de forma ovoide, con un claro aplastamiento
dorso-ventral y el cuerpo ligeramente curvado hacia la derecha. Sus
dimensiones medias fueron de unos 60µm de longitud y 35µm de
anchura. Presentaba cirros ventrales que le permitían desplazarse
fácilmente por las superficies y una zona adoral de membranelas con la
que creaba corrientes de agua hacia el citostoma.
Figura 13. E. vannus. Barra de escala = 15µm
3.3.5.3. Protistas sarcodinos
Vannella sp. Bovee, 1965 (Figura 14). Ameba aplanada en forma
de abanico con una marcada zona hialina en la parte anterior de la
célula. Era de anchura variable entre 20 y 50µm. Sólo presentaba
pseudópodos al despegarse del sustrato y adoptar una forma flotante
radiada. Desplazaba su cuerpo sobre el sustrato moviéndose como una
masa única.
Figura 14. Vannella sp.: a) forma sedentaria y b) forma flotante. Barra de escala = 15µm
- 33 -
3.3.6. Protistas asociados a la interfase agregado-agua
Además de los anteriormente descritos como característicos tanto
de agregado como de interfase, se identificaron seis de los protistas
representativos de la interfase agregado-agua de nuestros microcosmos:
cinco protistas flagelados y un ciliado. La identificación de todos ellos se
realizó a partir del análisis de sus caracteres morfológicos y de su
comportamiento observado mediante microscopía óptica.
3.3.6.1. Protistas flagelados
Los flagelados Bicosoeca maris y Cafeteria sp., fueron detectados
únicamente en este microhábitat, en tanto que Oxyrrhis marina,
Pseudobodo tremulans y Salpingoeca sp. se encontraron tanto en la
interfase como nadando libremente por el agua.
Bicosoeca maris, Picken, 1941 (Figura 15). Protista bicosoécido
biflagelado, de forma esférica o elipsoidal de aproximadamente 5µm de
longitud y 3µm de anchura que presentaba una lórica. Los flagelos
estaban insertados cerca de una estructura peristomal en forma de
labio prominente. El flagelo largo estaba extendido y agarrado a una
fina curva en la parte anterior de la célula. El otro flagelo se curvaba
hacia atrás para unirse a la base de la lórica. Cuando el protista era
perturbado, contraía el flagelo corto, la célula se encerraba dentro de la
lórica y el flagelo más largo se enrollaba en el extremo anterior de la
célula.
Figura 15. B. maris. Barra de escala = 5µm
- 34 -
Cafeteria sp. Fenchel y Patterson 1988 (Figura 16). Era un
flagelado de pequeño tamaño (3-10µm de longitud) con el cuerpo en
forma de D y un surco en la parte izquierda de la célula. Presentaba dos
flagelos subapicalmente insertados y de similar longitud a la célula y
utilizaba el posterior para adherirse al sustrato. Cuando el protista se
desprendía del agregado y se encontraba en movimiento, dirigía el
flagelo anterior hacia adelante y lo batía en un movimiento helicoidal,
en tanto arrastraba el flagelo posterior.
Figura 16. Cafeteria sp. Barra de escala = 5µm
Oxyrrhis marina Dujardin, 1841 (Figura 17). Era un pequeño
dinoflagelado incoloro de apariencia bastante inusual entre los
dinoflagelados. De forma entre ovoide y cónica tenía un tamaño medio
de 30µm de longitud y 16,5µm de anchura. En la parte posterior
presentaba una depresión o corte ventral que comenzaba en el ecuador
de la célula. Al comienzo de este corte se observaba una protuberancia
redondeada de la que partían dos flagelos. El movimiento coordinado de
ambos flagelos se traducía en un movimiento giratorio de la célula.
Figura 17.O. marina. Barra de escala = 5µm.
- 35 -
Pseudobodo tremulans, Griessmann, 1913 (Figura 18). Pequeño
biflagelado bicosoécido, de forma esférica y un diámetro de unos 10µm
de longitud. Se encontraba tanto adherido al sustrato como de forma
libre nadando en la interfase. Presentaba dos flagelos desiguales
insertados anterolateralmente, de los cuales el más corto era contráctil,
iba dirigido hacia la parte posterior de la célula y le permitía adherirse
al sustrato. Cuando el protista se desprendía del sustrato, este flagelo lo
llevaba arrastrando sobre la superficie. El flagelo largo estaba dirigido
hacia adelante cuando el flagelado nadaba libremente y lateralmente
con forma de lazo o arco en las formas sésiles. Junto al área citostomal
se observaba una probóscide claramente visible cuando la célula
permanecía sésil.
Figura 18. Ps. tremulans. Barra de escala = 5µm.
Salpingoeca sp., James Clark, 1868 (Figura 19). Coanoflagelado
de forma más o menos esférica que residía en una lórica en forma de
copa. En la parte anterior presentaba un único flagelo rodeado por un
collar de finísimos pseudópodos. El movimiento del flagelo atraía el
agua a través del collar donde las bacterias y otras pequeñas partículas
eran atrapadas y posteriormente ingeridas. Cuando el protista era
molestado tanto el flagelo como el collar podían ser retraídos.
- 36 -
Figura 19. Salpingoeca sp. Barra de escala = 10µm. Imagen tomada de http://starcentral.mbl.edu/microscope/portal.php
3.3.6.2. Protistas ciliados
Uronema marinum, Dujardin, 1841 (Figura 20). Escuticociliado
de forma ovalada, con la parte dorsal algo curvada y la parte ventral
recta. Era de pequeño tamaño, con una longitud media de 30µm y una
anchura media de 10µm. Presentaba ciliatura holotrica, con una placa
plana desprovista de cilios en el polo anterior y un único cilio caudal. La
abertura oral y la membrana paraoral, localizadas a la altura del
ecuador de la célula eran pequeñas y poco visibles. Era un buen
nadador con rápidos movimientos en todas direcciones.
Figura 20. U. marinum. Barra de escala = 5µm.
- 37 -
3.3.7. Protistas asociados al agua
Se identificaron ocho de los protistas que fueron únicamente
detectados en el agua de los microcosmos y nunca asociados a los
agregados: dos protistas flagelados, cuatro ciliados y dos sarcodinos. La
identificación de todos ellos se realizó a partir del análisis de sus
caracteres morfológicos y de su comportamiento observado mediante
microscopía óptica.
3.3.7.1. Protistas flagelados
Desmarella sp., Kent, 1880 (Figura 21). Era una colonia de
pequeños flagelados en suspensión unidos lateralmente. Cada una de
las células tenía forma entre esférica y ovoide con un tamaño medio de
6µm. En la parte anterior presentaban un flagelo rodeado por un fino
collar en forma de embudo. El movimiento de los flagelos de las células
producía un movimiento espiral de la colonia.
Figura 21. Desmarella sp.. Barra de escala = 5µm.
Paraphysomonas sp. De Saedeleer, 1929 (Figura 22). Flagelado
crisofita incoloro fagotrofo rodeado por un halo alrededor de la célula
presumiblemente correspondiente a la cubierta de finas espículas
característica de este género. Presentaba dos flagelos de diferente
longitud batiendo el más largo con un movimiento ondulante para
llevar las bacterias en suspensión en el agua hacia la superficie de la
célula.
- 38 -
Figura 22. Paraphysomonas sp.. Barra de escala = 10µm. Imagen tomada http://starcentral.mbl.edu/microscope/portal.php
3.3.7.2. Protistas ciliados
Cohnilembus punctatus, Kahl, 1928 (Figura 23). Pequeño ciliado
alargado y estrechado en su parte anterior. Sus dimensiones medias
eran de 45µm de longitud y 10µm de anchura. Presentaba ciliatura
holotrica con un único cilio caudal. La abertura oral y la membrana
paraoral, localizadas a la altura del estrechamiento de la célula eran
muy visibles. Presentaba una vacuola contráctil en la parte posterior.
Era un ciliado buen nadador cuyo movimiento se basaba en lentos giros
en todas direcciones.
Figura 23. C. punctatus. Barra de escala = 10µm.
- 39 -
Lohmaniella sp., Leegaard, 1915 (Figura 24). Ciliado oligotrico no
loricado, de forma más o menos esférica y mediano tamaño (20-40µm
de diámetro). Carecía de ciliatura somática y presentaba una zona
adoral con dos tipos distintos de membranelas.
Figura 24. Lohmaniella sp. Barra de escala = 10µm.
Strobilidium sp., Schewiakoff, 1892, (Figura 25). Ciliado oligotrico
no loricado de forma cónica o cilíndrica (dimensiones aproximadas:
50µm de longitud y 40µm de anchura). Presentaba una zona adoral de
membranelas muy desarrollada y de tipo cerrado, es decir, las
membranelas cerraban un círculo alrededor del ápice de la célula.
Figura 25. Strobilidium sp.. Barra de escala = 20µm. Imagen tomada de http://starcentral.mbl.edu/microscope/portal.php
- 40 -
Uropedalium ophistosoma, (Lepsi, 1926) Kahl, 1931 (Figura 26).
Ciliado ovoide alargado de pequeño tamaño (30µm de longitud y 10µm
de anchura). Presentaba una abertura oral en la parte posterior de la
célula. La ciliatura somática se disponía en forma espiral y presentaba
un cilio caudal. Poseía una vacuola contráctil en la parte posterior. Era
un buen nadador cuyo movimiento se basaba en rápidos saltos en
todas direcciones.
Figura 26. U. ophistosoma. Barra de escala = 10µm.
Tintínidos. Este grupo de ciliados espirotricos fue detectado
únicamente en el agua de los microcosmos y nunca asociado a los
agregados. No se completó su identificación sino que fueron
caracterizados únicamente a nivel de grupo. Eran células incluidas
dentro de lóricas opacas de unos 65µm de longitud y 50µm de anchura,
a las que se encontraban adheridos materiales como granos de arena o
restos orgánicos (Figura 27). Nadaban por medio de una zona adoral de
membranelas que sobresalía de la lórica.
Figura 27. Tintínido. Barra de escala = 10µm.
- 41 -
3.3.7.3. Protistas sarcodinos
Vannella sp. (forma flotante). Ver Vannella en agregado.
Amoeba radiosa Ehrenberg, 1830 (Figura 28). Forma flotante que
adquieren algunas amebas como mecanismo de búsqueda de nuevos
hábitats. De morfología redondeada (aproximadamente 20µm de
diámetro), presentaba finos pseudópodos radiales.
Figura 28. A. radiosa. Barra de escala = 20µm. Imagen tomada de http://flickr.com/photos/microagua
Heliozoos. Como en el caso de los tintínidos, estos protistas
fueron caracterizados únicamente a nivel de grupo. Eran sarcodinos
esféricos (Figura 29) de un diámetro aproximado de 40µm y estaban
provistos de una especie de pseudópodos, los axopodios, que irradiaban
desde la superficie de la célula hacia fuera, dando a estos protistas su
característico aspecto de sol.
Figura 29. Heliozoo. Barra de escala = 20µm.
- 42 -
3.3.8. Colección de protistas representativos de agregados
Los cuatro protistas flagelados (Bicosoeca maris, Bodo designis,
Pseudobodo tremulans y Rhynchomonas nasuta) y los tres ciliados
(Aspidisca steini, Euplotes vannus y Uronema marinum) considerados
más representativos de los agregados formados en el laboratorio a partir
de agua de mar fueron aislados mediante técnicas de
micromanipulación y mantenidos en cultivos en medio IHC a 15°C en
oscuridad.
- 43 -
A pesar de que los macroagregados o “nieve marina” constituyen
un importante componente del medio marino, en la literatura científica
existen muy pocos estudios sobre las comunidades de protistas que,
temporalmente o de forma continuada, viven asociados a material
particulado. Este hecho es debido fundamentalmente a las numerosas
dificultades que conllevan tanto la recogida como la posterior
manipulación de este material en el laboratorio. A la vista de estas
dificultades, resulta comprensible la búsqueda de métodos que
permitan la formación de agregados similares a los naturales bajo
condiciones controladas en el laboratorio.
En este sentido, desde 1980 diversos investigadores han
conseguido con éxito la formación de material particulado en el
laboratorio a partir de agua de mar enriquecida con diversos sustratos.
Kranck y Milligan (1980) formaron agregados añadiendo al agua
sedimento glacial y materia orgánica procedente de peces y plancton
triturado; Biddanda (1985) utilizó como enriquecimiento materia
orgánica de origen algal y Caron y col. en 1986 enriquecieron con
mucus de ctenóforos. En 1989 Shanks y Edmonson propusieron la
formación de agregados alterando el régimen de turbulencia del agua al
hacerla girar a baja velocidad en un tanque cilíndrico. Siguiendo esta
idea, Agis y col. en 1998 y Unanue y col. en 1998 (a y b) formaron
agregados añadiendo cuerpos celulares y productos extracelulares
fitoplanctónicos al agua de mar.
En el presente trabajo se eligió el modelo de Shanks y Edmonson
como el sistema de laboratorio más apropiado para la formación de
agregados orgánicos similares a los naturales. Dado que los agregados
se crearon a partir de únicamente agua de mar no filtrada, éstos
estaban compuestos por una mezcla de diferentes substratos
provenientes del agua de la estación de muestreo, tales como material
fecal de organismos marinos, diatomeas, restos de organismos muertos,
etc.. De esta manera, los agregados constituían un fiel reflejo de la
cantidad y tipo de material particulado que se hubiera generado en el
sistema natural si el régimen de turbulencia hubiera sido el apropiado.
En la literatura, se ha reflejado la importancia de los sistemas
particulados frente al agua como factor que potencia el crecimiento de
los protistas (Caron y col., 1986; Alldredge y Silver, 1988; Turley y
- 44 -
Mackie, 1994), si bien resulta difícil cuantificar de forma precisa el
grado de concentración de los protistas presentes en las partículas,
debido a que éstos contienen cierta cantidad de agua que no se puede
excluir durante su muestreo (Alldredge y Cox, 1982; Karner y Herndl,
1992). En nuestros experimentos se ha observado un elevado
enriquecimiento de la comunidad de protistas en la fase particulada con
respecto a la fase líquida, encontrándose las densidades poblacionales
de flagelados y ciliados entre 2 y 4 órdenes de magnitud superiores en
el agregado que en el agua de los microcosmos. Tal y como se observa
en la Tabla 4, estos valores de enriquecimiento son comparables a los
calculados por otros autores. Factor Enriquecimiento (F.E.) Referencia
123 Prezelin y Alldredge, 1983
17-114 Caron y col., 1986
273-18400 * Caron y col., 1986
107-987 Davoll y Silver, 1986
3200 Herndl, 1992
1300-33000 Turley y Mackie, 1994
80-811 Unanue y col., 1998a
100-1100 Kiørbe, 2000
2-3 órdenes Wörner y col., 2000
15-4000 Grossart y col., 2003
(*) valores de F.E. basados en recuentos de flagelados por Número Más Probable
Tabla 4. Factores de Enriquecimiento de la comunidad de protistas flagelados
en agregados orgánicos de origen marino
Los factores de enriquecimiento más altos fueron los registrados en
la situación fría del sistema (temperaturas medias del agua: 9ºC en
época fría y 19ºC en época cálida). Este hecho sugiere que las bajas
temperaturas y concentración de nutrientes propias de la situación fría
potenciarían la oligotrofia del sistema intensificando la importancia de
los agregados como microambientes más favorables para los protistas.
- 45 -
Este mismo hecho ya ha sido descrito por Caron (1991) estudiando
diversos sistemas pelágicos en gradiente eutrófico-oligotrófico.
Además, los factores de enriquecimiento tendieron a disminuir
conforme aumentaba el grado de descomposición de los agregados,
debido al incremento de la densidad de protistas en el agua
circundante. Este resultado se interpreta como un reflejo de la
liberación de nutrientes orgánicos procedentes de los agregados hacia el
agua y el consecuente incremento en la densidad de la comunidad
bacteriana de vida libre (Herndl, 1988). En algunos trabajos (Unanue y
col., 1998b, Agis y col., 1998) se ha estudiado en profundidad el
fenómeno de desacoplamiento entre actividad hidrolítica e
incorporación de monómeros resultantes que se observa en la
comunidad procariota adherida a agregados. La actividad
ectoenzimática de las bacterias adheridas es elevada, y no se
corresponde con las producciones y velocidades de crecimiento que
muestra la comunidad. Es decir, el sistema se encuentra desacoplado
de tal manera que el exceso de monómeros que no son incorporados no
generan producción y son liberados al agua circundante, donde
constituyen una fuente de carbono y energía importante para los
procariotas en suspensión que residen en un hábitat pobre en
compuestos orgánicos. El consiguiente aumento en la densidad de las
presas en suspensión favorece el crecimiento de sus predadores (Peters,
1994, Iriberri y col., 1995), lo que conlleva el incremento de la densidad
de protistas bacterívoros en el agua circundante.
Así, la nieve marina que se encuentra sedimentando en la columna
de agua, actúa como un reactor enzimático (Azam, 1998) que, no sólo
favorece el crecimiento microbiano en las partículas, sino que también
favorece la actividad microbiana en el agua circundante a causa de la
liberación en su descenso por la columna de agua de materia orgánica
fácilmente utilizable.
En algunos de los trabajos previamente mencionados se
caracterizaron las comunidades de protistas asociados a agregados, si
bien los resultados publicados no son muy concluyentes. Así, autores
como Small y col. (1983) y Silver y col. (1984) observaron especies no
descritas de protistas ciliados asociados a nieve marina, lo que sugería
que los macroagregados eran un microhábitat único con fauna
- 46 -
endémica. Patterson y Fenchel (1990) también detectaron la existencia
de un protista flagelado específico de agregados, Massisteria marina. Sin
embargo, otros autores (Caron y col., 1982; Fenchel, 1982) observaron
la presencia de especies de protistas similares tanto asociados a
agregados como en suspensión. Con objeto de aportar más información
al respecto, en el presente trabajo se realizaron una serie de
experiencias en las que se analizó la composición de las comunidades
de protistas asociadas a los microhábitats generados en nuestros
microcosmos, en los que partiendo de agua de mar se pasaba de una
situación de "sólo agua" a una nueva situación de "agua más
agregados". Además, se estudió la sucesión de protistas en los
agregados a lo largo del proceso de descomposición de los mismos.
La aparición de agregados en un sistema marino implica la
diversificación de microhábitats accesibles a los microorganismos
planctónicos. Desde un punto de vista comparativo, mientras la fase
acuosa se caracteriza por la presencia de bajas densidades de pequeñas
presas bacterianas en suspensión y mayoritariamente inactivas
(Alldredge y Youngbluth, 1985; Iriberri y col.,1987; Alldredge y
Gotschalk, 1990; Smith y col., 1992; Worm y Søndergaard, 1998) los
agregados suponen un soporte sólido con altas densidades de bacterias
firmemente adheridas a los agregados o embebidas en sus matrices
poliméricas (Iriberri y Herndl, 1995; Heissenberger y col., 1996) y que
expresan elevadas actividades ectoenzimáticas y extracelulares con el
fin de utilizar los polímeros de los agregados (Smith y col., 1992; Agis y
col., 1998; Unanue y col., 1998b). Como consecuencia de estas altas
actividades, en el sistema pueden establecerse gradientes químicos que,
si bien en algunos casos suponen condiciones hostiles para los
microorganismos (Kiørboe y col., 2003) también implican la liberación
desde el agregado tanto de materia orgánica disuelta utilizable (UDOM)
como de bacterias en crecimiento activo (Jacobsen y Azam, 1984;
Kjelleberg y col., 1987; Unanue y col., 1992).
Además de los ya expuestos, cabe destacar la presencia de un
tercer microhábitat, la capa de agua que rodea al agregado, y que
hemos denominado interfase agregado-agua. Las evidencias indirectas
(Smith y col., 1992, Kiørboe y Jackson, 2001) junto con nuestra propia
observación, nos conducen a asumir que esta capa se encuentra
habitada por una densa comunidad de bacterias que comparten
- 47 -
características tanto con las bacterias de vida libre como con las
asociadas a agregados, es decir, se mostrarían activas, grandes y se
encuentran en suspensión en el sistema.
El establecimiento de estos nichos ecológicos provoca una
reestructuración espacial de la comunidad de protistas en nuestros
microcosmos. Es de esperar que los protistas que permanecían en la
fase líquida fueran buenos nadadores y estuvieran adaptados a sacar
provecho de bajas densidades de presas en suspensión mediante
mecanismos de ingestión de presas raptorial o por filtración. En esta
fase fueron observados coanoflagelados del género Desmarella, y otros
coanoflagelados desnudos no identificados, así como especies del género
Paraphysomonas. Entre los ciliados, se detectaron los escuticociliados
Cohnilembus punctatus, Uropedalium opisthosoma, algunos tintínidos no
identificados y especies de los géneros Strobilidium y Lohmanniella.
Igualmente en el agua permanecieron algunos heliozoos y radiolarios, y
Amoeba radiosa, forma flotante con pseudópodos que adquieren
algunas amebas como mecanismo de búsqueda de nuevos hábitats.
Todos estos protistas deben ser considerados como característicos
nadadores en suspensión puesto que no fueron encontrados ni en
agregados ni en la capa de agua que los rodea.
El flagelado Massisteria marina y la ameba Vannella sp.
presentaban la misma estrategia, en la fase líquida adquirían una forma
nadadora no alimenticia que les permitía dispersarse por el sistema,
mientras que cuando se posicionaban en los agregados adoptaban una
forma trófica adaptada a alimentarse de presas bacterianas adheridas a
material particulado.
Respecto a los protistas asociados a agregados, se observó un
patrón común de colonización y sucesión de las comunidades
microbianas a lo largo del proceso de descomposición de los mismos,
caracterizada por un rápido crecimiento de la comunidad bacteriana,
seguido de la sucesiva aparición en el tiempo de protistas
nanoflagelados, ciliados y finalmente sarcodinos. Este modelo de
colonización ya había sido descrito por otros autores (Pomeroy y Deibel,
1980; Pomeroy y col., 1984; Davoll y Silver, 1986; Biddanda y Pomeroy,
1988; Caron, 1991).
- 48 -
El papel pionero de los flagelados heterotrofos en la colonización de
agregados puede ser debido al hecho de que los flagelados presentan
densidades más altas que los demás protistas que habitan el plancton
marino. Este hecho, a su vez, se debería a su mayor facilidad para
crecer y reproducirse beneficiándose de las bajas densidades de
bacterias en suspensión que se suelen encontrar en los sistemas
marinos (Caron, 1991). La comunidad de protistas ciliados apareció con
posterioridad a la de flagelados debido, probablemente, a que precisan
de mayores abundancias de presas para reproducirse. Esta comunidad
parece jugar un papel fundamental en la estructura de las comunidades
detríticas, ya que es probable que contribuya a las tasas de
descomposición del material particulado, no sólo por la ingestión de
bacterias, sino también por el consumo de protistas flagelados (Silver y
col., 1984). En cuanto a las amebas, se conoce muy poco acerca de su
diversidad en material particulado debido a dificultades metodológicas y
taxonómicas. Sin embargo, se sabe que puede haber un número
abundante de sarcodinos, principalmente amebas desnudas, asociados
a agregados orgánicos (Arndt, 1993).
Entre los protistas asociados a agregados identificados en este
estudio, se observaron dos tipos de estrategia distintas: colonización del
interior de las partículas y colonización de la capa de agua circundante
al agregado o interfase.
Los encontrados únicamente en los agregados eran capaces de
desplazarse sobre superficies sólidas y poseían estructuras que les
permitían desprender las presas adheridas a los agregados. Los
euglénidos Ploeotia sp. y Entosiphon sp. se desplazaban mediante
deslizamiento y se alimentaban de bacterias adheridas utilizando su
aparato de ingestión. El protista apusomonado Amastigomonas sp. se
movía igualmente por deslizamiento y se alimentaba de presas
adheridas, en este caso barriendo la superficie de los agregados con su
probóscide.
El resto de los protistas asociados a agregados prefirieron
permanecer en la interfase, microhábitat en el que se encontró la mayor
diversidad específica. Algunos, como A. steini, E. vannus, B. designis y
R. nasuta han sido ya descritos como protistas asociados a partículas
(Patterson y col., 1993; Lee y col., 1985; Caron, 1987; Albright y col.,
- 49 -
1987) puesto que, si bien no son buenos nadadores, se mueven
fácilmente sobre y dentro de los agregados. Los dos ciliados creaban
fuertes corrientes de agua con las membranelas de la zona adoral
despegando bacterias adheridas y arrastrándolas hacia sus áreas de
ingestión. A continuación filtraban las presas bacterianas en
suspensión que se encontraban en esas corrientes de agua. En cuanto
a los flagelados, B. designis y R. nasuta se mantenían en contacto con el
material particulado utilizando su flagelo recurrente y usaban su flagelo
anterior o su probóscide, respectivamente, para despegar las bacterias
adheridas y poderlas capturar más fácilmente. Por lo tanto eran
capaces de aprovechar tanto las presas adheridas a los agregados como
las que se encontraban en suspensión a su alrededor. Caron en 1987
observó que tanto Bodo sp. como Rhynchomonas nasuta se movían y
depredaban efectivamente cuando estaban en contacto con una
superficie, pero que eran pobres nadadores y presentaban bajas
eficiencias de depredación sobre bacterias en suspensión.
Los flagelados Cafeteria sp. y Bicosoeca maris fueron los únicos
protistas que se detectaron solamente en la interfase agregado-agua.
Permanecían adheridos al agregado por el flagelo posterior o la lórica,
respectivamente y se alimentaban de bacterias en suspensión cercanas
a las partículas capturándolas mediante su flagelo anterior.
De acuerdo con Davoll y Silver (1986), los agregados son hábitats
en la zona pelágica que soportan el crecimiento de poblaciones con
características combinadas de sistemas pelágicos y bénticos. Sin
embargo, la mayoría de las especies observadas en los agregados en
este estudio fueron más comunes de hábitats bénticos que pelágicos. La
existencia pelágica de especies de Bodo, Rhynchomonas, Cafeteria y
Bicosoeca depende indudablemente de la existencia de superficies en el
plancton (Caron, 1991). De la misma manera, siempre que Euplotes y
Aspidisca han sido encontrados en la columna de agua, ha sido
asociados a superficies (Lee y col., 1985). Por último, la existencia de
una forma móvil y una forma sedentaria para alimentarse en Vannella
parece ser una adaptación para explotar agregados detríticos
enriquecidos, ampliamente distribuidos en el espacio (Patterson y
Fenchel, 1990).
- 50 -
Los flagelados Ps. tremulans y especies del género Salpingoeca han
sido igualmente descritos como protistas asociados a nieve marina
(Patterson y col., 1993; Caron, 1991). En nuestros microcosmos los
hemos observado tanto nadando dispersos por el agua, probablemente
en busca de nuevos alimentos, como adheridos de forma transitoria a la
superficie de los agregados. Autores como Lighthill, (1976) y Fenchel,
(1982) concluyeron que la fijación de los protistas a los sustratos les
permite filtrar el agua a velocidades mayores que cuando se encuentran
nadando libres en el medio. Así, la adherencia transitoria a agregados
observada en estos protistas pudiera ser considerada como un
mecanismo que utilizan para alimentarse más eficientemente.
Resulta sorprendente la permanencia en la cercanía de los
agregados de ciertos protistas reconocidos como buenos nadadores. Es
el caso del flagelado O. marina. y el ciliado U. marinum, que fueron
detectados en dos de los microhábitats, el agua y la capa de agua más
próxima al agregado. Parece que, en presencia de partículas en el
sistema, estos protistas se dirigen hacia ellas y permanecen cercanos a
su superficie. Podría interpretarse que estos protistas sean capaces de
detectar cambios químicos alrededor de los agregados producidos por la
actividad de las bacterias que los han colonizado, naden hacia estas
zonas de altas disponibilidades de presas y permanezcan en sus
proximidades.
En síntesis, hemos observado que la heterogeneidad espacial
creada por la presencia de agregados en los sistemas marinos tiene una
notable influencia en las comunidades de protistas. Por un lado, los
agregados constituyen microambientes altamente enriquecidos en estas
comunidades. Además, dependiendo de la estrategia alimenticia,
estructura y comportamiento de los protistas, estos microorganismos
son capaces de elegir el microambiente más conveniente para ellos. De
esta manera, mientras que algunos protistas permanecen en
suspensión en el agua, otros se aproximan y en algunos casos llegan a
colonizar las partículas. Cabe destacar la preferencia mostrada por
diversos protistas a quedarse en la capa de agua más próxima al
agregado, la cual puede ser explicada por la presencia de altas
densidades de presas grandes y activas fácilmente utilizables por
distintos mecanismos alimenticios.
- 51 -
Los resultados de este segundo Capítulo han dado origen a una
publicación internacional incluida al final de la Memoria
“Grazing rates of bacterivorous protists inhabiting diverse
marine planktonic microenvironments”. Limnol. Oceanogr. 47: 142-
150. 2002.
En este trabajo se cuantificó y analizó comparativamente las
velocidades de depredación ejercidas por protistas bacterívoros marinos
en agregados y agua.
- 52 -
En primer lugar, utilizando los microcosmos previamente
diseñados, se formaron agregados a partir de agua de mar que
presentaban una comunidad bacteriana adherida constituida por una
mezcla de proporciones conocidas de bacterias no teñidas y bacterias
teñidas con un fluorocromo (Fluorescently Labeled Bacteria, FLB). La
utilización de estos agregados con trazadores adheridos y teñidos, nos
permitió cuantificar la ingestión de bacterias adheridas a
macroagregados por parte de los protistas bacterívoros ensayados.
Para la cuantificación de la actividad depredadora de los protistas
sobre bacterias en suspensión se utilizó la misma técnica de
incorporación de FLB llevada a cabo, en este caso, en microcosmos
libres de partículas, en los que los bacterívoros disponían de FLB libres
en proporciones conocidas, distribuidas homogéneamente entre las
bacterias no marcadas en proporciones conocidas. Se cuantificaron las
velocidades de depredación de los protistas analizados sobre bacterias
en suspensión, en agua de mar a dos densidades de presas diferentes: a
las bajas densidades normalmente encontradas en el agua de mar y a
las altas densidades esperables en la capa de agua que rodea a los
macroagregados.
- 53 -
4.2.1. Depredación sobre bacterias adheridas a agregados
4.2.1.1. Protistas ensayados
Para llevar a cabo las experiencias de depredación se eligieron tres
nanoflagelados bacterívoros (Bodo designis, Jakoba libera y
Rhynchomonas nasuta) y un microciliado escuticociliado bacterívoro
(Uronema marinum).
En tanto que el nanoflagelado J. libera procedía de la colección de
cultivos de microorganismos CCAP (Culture Collection of Algae and
Protozoa 1954/1), el resto de los protistas fueron aislados en nuestro
laboratorio a partir de muestras de agua de mar que contenían material
particulado agregado (Artolozaga y col., 1997).
Todos ellos han sido descritos en la literatura científica como
protistas asociados a material particulado (Patterson y col., 1993;
Sieburth, 1984), aunque presentan diferentes estrategias de
alimentación. B. designis y R. nasuta depredan bacterias adheridas
(Fenchel, 1991; Sleigh, 1991), mientras que J. libera es un eficaz
depredador de presas bacterianas en suspensión (Caron, 1987;
Patterson y col., 1993). En cuanto al escuticociliado, U. marinum está
reconocido como un buen nadador que se alimenta de bacterias en
suspensión mediante un mecanismo de filtración (Turley y col., 1986;
Sleigh, 1991), si bien suele ser habitualmente observado en las
cercanías del material particulado (Sieburth, 1979; Fenchel, 1980),
Con el fin de obtener suspensiones densas de protistas con las que
realizar las experiencias de depredación, los protistas ensayados junto
con sus bacterias acompañantes fueron inoculados en medio IHC al
0,03% (J. libera y U. marinum) o al 0,05% (B. designis y R. nasuta) e
incubados a 20°C y 100rpm en oscuridad hasta llegar al final de la fase
exponencial de crecimiento (durante 1 semana aproximadamente).
4.2.1.2. Obtención de las bacterias marcadas fluorescentemente
El bacterioplancton procedente del agua de la playa La Salvaje se
tiñó con un colorante fluorocromo de acuerdo con el método descrito
por Sherr y col. (1987). Para ello, un volumen de agua se filtró por
gravedad en condiciones de esterilidad, a través de un filtro de 0,45µm
- 54 -
de tamaño de poro que sólo permitía el paso de bacterias, obteniéndose
en el filtrado una concentración bacteriana en el rango 105-106
bacterias ml-1. El filtrado se inoculó en una botella con extracto de
cereal al 0,06% para potenciar su crecimiento y tras una semana de
incubación a 20ºC se obtuvo una suspensión densa de células en fase
exponencial tardía de crecimiento. Las bacterias se recogieron por
centrifugación (12.000rpm, 12 minutos) en una pastilla, se
resuspendieron en 10ml de solución salina tamponada y se tiñeron a
60°C durante 2 horas con el colorante fluorocromo 5-(4,6-diclorotriazin-
2,4'-il) aminofluoresceína (DTAF), en concentración final 0,2mg ml-1.
Esta suspensión de bacterias marcadas fluorescentemente (a partir de
aquí denominadas como FLB) fue lavada 3 veces mediante sucesivas
centrifugaciones y resuspensiones en solución salina, para eliminar los
restos de colorante. Por último, la pastilla de bacterias se resuspendió
en 20ml de solución de pirofosfato tetrasódico, el cual favorece la
dispersión y evita la formación de acúmulos o conglomerados de
bacterias. Esta suspensión se sonicó suavemente con 4 pulsos de 1
segundo a 70w para deshacer los acúmulos de células que pudieran
haberse formado.
Para la enumeración de estas bacterias teñidas se filtraron
alícuotas de las mismas a través de filtros negros de policarbonato de
0,22µm de tamaño de poro y 25mm de diámetro (Millipore). El filtro se
montó para su observación por microscopía de epifluorescencia. Los
recuentos se realizaron a 1.000 aumentos bajo luz de excitación azul,
contándose un mínimo de 300 bacterias.
La suspensión de bacterias se repartió en alícuotas de 1ml en
criotubos de 1,6ml de capacidad y se almacenó a -20°C en oscuridad.
En estas condiciones podía mantenerse durante tiempo indefinido.
Para su utilización se descongeló una alícuota lentamente en agua
fría o hielo y se sonicó suavemente antes de añadirse a las muestras el
volumen adecuado.
4.2.1.3. Diseño del sistema depredador-presa en agregados
Las cámaras cilíndricas de polipropileno se llenaron con 11 litros
de agua de mar procedente de la estación de muestreo. Con el fin de
obtener macroagregados que contuvieran bacterias adheridas marcadas
- 55 -
fluorescentemente, inmediatamente después de llenadas, a cada una de
las cámaras se adicionaron 109 FLB. En todas las experiencias fue
necesaria la utilización de varias cámaras cilíndricas para obtener el
suficiente número de macroagregados con el que realizar las
experiencias de depredación. Tras la adición de FLB las cámaras se
oscurecieron para evitar la pérdida de fluorescencia de las bacterias, así
como para no permitir el crecimiento de protistas autotrofos y se
pusieron a rodar en las condiciones descritas en el apartado 3.2.2. del
Capítulo 1 de este trabajo. La rotación se mantuvo durante 36-48 horas
dependiendo del número y consistencia de los macroagregados
formados. Además, durante este período de tiempo los recién formados
macroagregados no fueron densamente colonizados por protistas.
Una vez formados los macroagregados se procedió a su recogida en
la forma descrita en el apartado 3.2.3. del Capítulo 1 de este trabajo.
Las submuestras de 7µl de material particulado fueron cuidadosamente
lavadas en agua de mar estéril antes de ponerlas en contacto con el
protista con el que se iba a realizar la experiencia de depredación.
4.2.1.4. Experiencias de incorporación de bacterias marcadas y
adheridas
Las experiencias de incorporación de FLB fueron llevadas a cabo
según el protocolo que se representa en la Figura 30. Inmediatamente
antes de cada experimento, varias réplicas de un volumen de 7µl de
muestra de macroagregados resuspendido en 1ml de agua de mar
estéril fueron fijadas con formalina tamponada con carbonato cálcico y
almacenadas a 4°C hasta su procesamiento, con el fin de determinar la
densidad bacteriana total así como el porcentaje de FLB adheridas de la
muestra. La densidad bacteriana fue estimada siguiendo la técnica de
recuento directo DAPI descrita por Starink y col. (1994).
- 56 -
Figura 30. Esquema del protocolo experimental de incorporación de bacterias marcadas y adheridas
Con objeto de dispersar las bacterias adheridas al material
particulado, se adicionó a las muestras fijadas una solución de
pirofosfato tetrasódico estéril (concentración final 10mM).
Inmediatamente las muestras fueron sonicadas en baño de hielo a
100w durante 6 pulsos de 5 segundos de duración. Tras diluir las
muestras sonicadas, las células fueron teñidas con DAPI durante un
mínimo de 15 minutos en oscuridad y filtradas a través de filtros negros
de policarbonato de 0,22µm de tamaño de poro. Los filtros se montaron
sobre portaobjetos con aceite de inmersión de baja fluorescencia y las
preparaciones se observaron en un microscopio de epifluorescencia
Nikon Optiphot.
Para la enumeración de FLB (que presentaban fluorescencia
amarilla) la observación se realizó utilizando luz incidente azul, en tanto
que las bacterias teñidas con DAPI (que presentaban fluorescencia azul)
se contaron utilizando luz incidente ultravioleta, a 1.250 aumentos en
ambos casos. Se contaron las bacterias presentes en, al menos, 30
Agua de mar
Adición 1ml bacterias teñidas (7�108 – 1�109)
Rotación 2,5 rpm 24-48 horas en oscuridad
Tª ambiente Enumeración de protistas: 14µl agregado
10ml agua mar filtrada y estéril 50µl lugol
600µl formalina Mantenimiento de los agregados en agua de mar filtrada (1 minuto)
Cultivo del protista 100rpm
Oscuridad 17ºC
Adición del cultivo a la placa de Petri
tiempo de contacto
t1 t2
Enumeración de bacterias teñidas ingeridas: 14µl agregado
10ml agua mar filtrada y estéril 50µl lugol
600µl formalina
Enumeración de bacterias adheridas: 7µl agregado
1ml agua de mar filtrada estéril 50µl formalina
t3 ...
- 57 -
campos seleccionados al azar que contenían aproximadamente 30
bacterias por campo. En las distintas experiencias realizadas, la
densidad bacteriana total en los agregados y el porcentaje de FLB
adheridas a los mismos se mantuvieron en los siguientes rangos:
2,4�108 - 4,92�108 bacterias ml agregado-1 y 14,0 - 31,6% FLB
Para realizar las experiencias de incorporación de FLB las
muestras de macroagregados que contenían FLB adheridas fueron
cuidadosa y equidistantemente (3cm aproximadamente) depositadas en
placas de Petri de 140mm de diámetro que contenían una suspensión
densa del protista con el que se iba a realizar la experiencia de
depredación.
En estas experiencias, la incorporación de FLB por los protistas se
siguió con detalle durante un período de 30 minutos: se recogieron
submuestras de 2 macroagregados de 7µl cada 2 minutos durante los
primeros 15 minutos y cada 5 minutos durante los últimos 15 minutos.
Estas submuestras se resuspendieron en 10ml de agua de mar filtrada
y autoclavada, se fijaron por la técnica lugol-formalina y se
almacenaron a 4°C en oscuridad hasta su observación al microscopio.
4.2.1.5. Enumeración de bacterias ingeridas marcadas y adheridas
Un volumen adecuado de las submuestras recogidas a lo largo de
las experiencias de incorporación de FLB se tiñó con el colorante DAPI
en concentración final 0,02 mg ml-1, tal y como se ha descrito en el
apartado 4.2.1.4. de esta sección.
Los protistas flagelados teñidos con DAPI se localizaron a 1.250
aumentos y los ciliados a 200 aumentos, utilizando luz incidente
ultravioleta. Una vez localizado el protista se cambió la luz incidente a
luz azul para contar las FLB situadas dentro de él a 1.250 aumentos
(Figura 31). Con el fin de determinar el valor medio de FLB dentro de
cada tipo de protista, en cada submuestra se contaron las FLB
ingeridas por 100 protistas flagelados y 30 protistas ciliados.
- 58 -
Figura 31. a) Ejemplo de una preparación de muestra de agregado teñida con DAPI para su observación por microscopía de epifluorescencia; b y c)
Localización de un protista (U. marinum en la imagen) y enumeración de las bacterias teñidas ingeridas. Barras de escala a) = 5µm; b y c) = 15µm
La velocidad de ingestión de FLB (FLB protista-1 minuto-1) fue
determinada a partir de la pendiente de la regresión lineal del número
de FLB ingeridas por protista frente al tiempo.
- 59 -
4.2.1.6. Cálculo de la velocidad de depredación sobre bacterias
adheridas
La velocidad de depredación (VD) se define como el número total de
bacterias ingeridas por protista en la unidad de tiempo (bacterias
protista-1 hora-1).
Para realizar este cálculo se tuvo que tener en cuenta el porcentaje
de FLB adheridas a los macroagregados y asumir que dicho porcentaje
era lo suficientemente bajo como para no provocar cambios en la
actividad depredadora de los protistas y que los protistas no
discriminaban entre FLB y bacterias naturales.
La velocidad de depredación se calculó según la expresión:
donde,
VD representa la velocidad media de depredación de los protistas
estudiados (bacterias protista-1 hora-1).
VIFLB representa la velocidad media de ingestión de FLB de los
protistas estudiados (FLB protista-1 minuto-1).
B representa la densidad de bacterias naturales adheridas
(bacterias ml agregado-1).
FLB representa la densidad de FLB adheridas (FLB ml agregado-1).
4.2.1.7. Cálculo del Índice de Colonización de agregados
Con el fin de establecer el grado de colonización de los agregados
por los protistas ensayados, se calculó lo que denominamos “Índice de
Colonización” (I.C.). Este índice es la fracción dada entre la densidad del
protista añadido que había colonizado 7µl de agregado y la densidad del
protista presente en 7µl de la fase líquida de la placa. El índice se
calculó a partir de muestras de agregado y suspensión tomadas al inicio
de las experiencias de incorporación de bacterias marcadas y adheridas.
Los valores de Índice de Colonización superiores a 1 reflejaron una
tendencia positiva de acercamiento y colonización de los agregados por
parte de los protistas.
VD VIFLB= B + FLB
FLB� 60 �VD VIFLB= B + FLB
FLB
B + FLB
FLB� 60 �
- 60 -
4.2.2. Depredación sobre bacterias en suspensión
4.2.2.1. Protistas ensayados y obtención de bacterias marcadas
fluorescentemente
Se ensayaron los mismos protistas que en el caso de los agregados.
B. designis, J. libera, R. nasuta y U. marinum.
Las bacterias marcadas con un colorante fluorocromo se
prepararon de la misma forma que en el caso de las experiencias con
agregados.
4.2.2.2. Diseño del sistema depredador-presa en agua
Las experiencias para cuantificar la depredación de protistas en
agua se simultanearon con las de cuantificación de depredación en
agregados. Una cámara cilíndrica de polipropileno se llenó con 11 litros
de agua de mar procedente de la estación de muestreo y sin adicionar
FLB se puso a rodar durante el tiempo y en las condiciones descritas en
el apartado 4.2.1.3.
Inmediatamente antes de cada experiencia un volumen de muestra
del agua de la cámara fue fijado con formalina tamponada con
carbonato cálcico y almacenado a 4°C hasta su procesamiento, con el
fin de determinar el número de bacterias de la muestra. La densidad
bacteriana fue estimada siguiendo la técnica de recuento directo con
naranja de acridina (AODC, Hobbie y col., 1977) descrita en el Capítulo
1 de esta memoria. Así, fue posible calcular el volumen de la
suspensión de FLB que se debía añadir a las muestras de agua para
que las FLB estuvieran presentes en una densidad que representara
aproximadamente un 20% de la densidad total bacteriana en las
experiencias realizadas con flagelados y un 10% en las realizadas con
ciliados (Sherr y col., 1987). Las densidades bacterianas determinadas
en el agua de las cámaras estuvieron entre: 2,30�105 - 4,95�106
bacterias ml-1.
Asimismo, y con el fin de realizar experiencias de depredación de
protistas en agua con alta densidad de presas se hizo preciso el
enriquecimiento del agua recogida en la estación de muestreo. Con este
objetivo el agua de mar natural fue filtrada por gravedad a través de
filtros de 0,45µm de tamaño de poro y mantenida en extracto de hoja de
- 61 -
cereal al 0,06% durante 1 semana, en oscuridad, a 17ºC y 100rpm.
Transcurrido este período de enriquecimiento en el agua se
consiguieron unas densidades poblacionales de presas bacterianas en
el rango: 107 - 108 bacterias ml-1.
Inmediatamente antes de cada experiencia se recogió 1 litro de
agua con baja o alta densidad de presas, según el tipo de ensayo a
realizar, al que se añadió un volumen variable de una densa suspensión
del cultivo del protista con el que se iba a realizar la experiencia de
depredación. Las densidades finales de los protistas en el sistema
depredador-presa estuvieron en el rango: 9,10�101- 4,90�104 flagelados
ml-1 y 0,21 - 4,00 ciliados ml-1.
4.2.2.3. Experiencias de incorporación de bacterias marcadas y en
suspensión
Las experiencias de incorporación de FLB en agua fueron llevadas
a cabo según el protocolo descrito en la Figura 32. Las FLB utilizadas
en estas experiencias eran las mismas que las utilizadas en las
experiencias en macroagregados (ver apartado 4.2.1.4. de esta sección),
pero ofrecidas a los protistas monodispersas en el agua.
Las experiencias de incorporación de FLB se llevaron a cabo en
matraces de 2 litros estériles que contenían 1 litro de agua de las
cámaras al que se había añadido una densa suspensión del cultivo del
protista con el que se iba a realizar la experiencia de depredación.
Después de añadir el volumen necesario de la suspensión de FLB (ver
apartado anterior), los matraces se agitaron suavemente y, a partir de
este momento, se siguió con detalle la incorporación de FLB por los
protistas durante un período de 45 minutos: se recogieron submuestras
de 10ml a intervalos de 2, 10 y 15 minutos (Figura 32). Inmediatamente
después de tomar cada alícuota, ésta se fijó por la técnica de
decoloración lugol-formalina y las submuestras se almacenaron a 4°C
en oscuridad hasta su observación al microscopio.
- 62 -
Figura 32. Esquema del protocolo experimental de incorporación de bacterias marcadas y en suspensión
4.2.2.4. Enumeración de bacterias ingeridas marcadas y en
suspensión
Un volumen adecuado de las submuestras recogidas a lo largo de
las experiencias de incorporación de FLB se tiñó con el colorante DAPI
en concentración final 0,02mg ml-1, tal y como se ha descrito en el
apartado 4.2.1.5. de esta sección. Con el fin de contar las FLB situadas
en el interior de los protistas flagelados y ciliados teñidos, éstos fueron
localizados y examinados tal y como se ha descrito en ese mismo
apartado.
Asimismo, la velocidad de ingestión de FLB (FLBprotista-1minuto-1)
se estimó a partir de la pendiente de la regresión lineal del número de
FLB ingeridas por protista frente al tiempo.
Filtración 0,45µmCultivo en IHC 0,06%1 semana. 100 r.p.m.17ºC. Oscuridad
24-48 horasRotación 2,5 r.p.m.Oscuridad
Adición de bacterias teñidas (FLB)
Adición de bacterias teñidas (FLB)
0’2’4’8’10’20’30’45’
10 mllugol-formalina
10 mllugol-formalina
Tinción y observación al microscopio
105 - 106 bact/ml 107 - 108 bact/ml
2’4’8’10’20’30’45’
0’
Filtración 0,45µmCultivo en IHC 0,06%1 semana. 100 r.p.m.17ºC. Oscuridad
24-48 horasRotación 2,5 r.p.m.Oscuridad
Adición de bacterias teñidas (FLB)
Adición de bacterias teñidas (FLB)
0’2’4’8’10’20’30’45’
10 mllugol-formalina
10 mllugol-formalina
Tinción y observación al microscopio
105 - 106 bact/ml 107 - 108 bact/ml
2’4’8’10’20’30’45’
0’
- 63 -
4.2.2.5. Cálculo de la velocidad de depredación sobre bacterias en
suspensión
La velocidad de depredación (VD) de los protistas en agua
expresada como bacterias protista-1 hora-1 se calculó de la forma
descrita en el apartado 4.2.1.6., teniendo en cuenta en este caso el
porcentaje de FLB y la densidad de bacterias totales en el agua.
- 64 -
4.3.1. Nueva técnica de cuantificación de velocidades de
depredación sobre bacterias adheridas
La Tabla 5 recoge las características de los agregados que se
formaron en los microcosmos de las 14 experiencias llevadas a cabo. En
todos los casos, los agregados fueron colonizados por la comunidad
bacteriana natural, detectándose una abundancia de bacterias
adheridas en un rango entre 2,0�108 y 21,0�108 bacterias por ml de
agregado, con un valor medio de 6,2�108 bacterias por ml de agregado.
Si bien la cantidad de FLB añadida en todos los microcosmos fue la
misma, los porcentajes de FLB respecto al total de bacterias calculados
en cada microcosmos al comienzo de las experiencias de ingestión varió
entre un 2,1% y un 65%, aunque en el 75% de los casos las bacterias
teñidas suponían entre un 10% y un 30% del total de bacterias
adheridas.
Protista
Experiencia
Densidad protista ensayado
(Protistas ml-1) a
Índice de Colonización
(I.C.)
Densidad bacterias adheridas
(Bacterias ml-1) a
Porcentaje FLB
adheridas (%)
B. designis I 1,4�106 1,6 4,1�108 24,6
II 1,3�106 0,7 20,0�108 2,0
III 3,6�106 3,3 2,2�108 28,0 J. libera I 0,4�106 3,5 4,7�108 7,9
II 0,5�106 4,2 4,8�108 8,0
III 1,1�106 6,5 2,0�108 19,6 R. nasuta I 0,4�106 30,4 3,2�108 27,3
II 0,7�106 5,2 2,4�108 31,6
III 2,1�106 4,4 21,0�108 3,0
IV 1,5�106 3,4 2,3�108 29,0 U. marinum I 0,9�103 7,6 4,2�108 30,7
II 2,9�103 26,1 2,6�108 65,0
III 0,4�103 0,1 2,4�108 14,0
IV 0,3�103 0,2 2,7�108 56,0
Tabla 5. Caracterización de los agregados utilizados en la cuantificación de las velocidades de depredación de los protistas ensayados sobre bacterias
adheridas a agregados.
- 65 -
Los agregados fueron también colonizados por protistas
procedentes del agua de mar con la que se llenaron las cámaras
rodantes. A lo largo del proceso de formación de los agregados se fueron
controlando las abundancias de los protistas naturales que se habían
situado en los agregados y decidimos dar comienzo a las experiencias de
ingestión cuando esas abundacias no eran demasiado grandes: en las
distintas experiencias las comunidades de nanoflagelados naturales se
encontraban en el rango entre 0,3�105 y 6,9�105 protistas por ml de
agregado, y las comunidades de ciliados naturales estaban entre 0,7�102
y 10,0�102 protistas por ml de agregado.
Al comienzo de las experiencias de ingestión, los agregados fueron
cuidadosamente depositados en una suspensión del protista ensayado,
y, tal y como se puede ver en la Tabla 5, resultaron densa y
rápidamente colonizados por el protista en cuestión: los valores del
índice de colonización muestran que, exceptuando la segunda
experiencia realizada con B designis, los nanoflagelados se desplazaron
hacia los agregados y se mantuvieron en ellos. Los tres nanoflagelados
ensayados, B. designis, J. libera y R. nasuta se convirtieron en la
población de protistas predominante en los agregados, alcanzando
densidades (valor medio 1,3�106 protistas por ml de agregado)
superiores en un orden de magnitud a las densidades de los
nanoflagelados naturales.
Aunque se llevaron a cabo 4 experiencias con el microciliado U.
marinum, este protista tan sólo colonizó los agregados en dos de los
ensayos (experiencias I y II), alcanzando densidades superiores en un
orden de magnitud a la densidad poblacional de la comunidad de
ciliados naturales. En el resto de los casos (experiencias II y IV) los
valores del índice de colonización fueron demasiado pequeños como
para estimar con una cierta fiabilidad las velocidades de depredación de
este bacterívoro.
La Figura 33 muestra las rectas de regresión de la ingestión de
bacterias frente al tiempo correspondientes a las 12 experiencias
realizadas. En todas ellas, durante los primeros 10-15 minutos de
incubación se observó un incremento lineal (R2>0.95, p<0.05) del
número de bacterias ingeridas por protista a lo largo del tiempo.
- 66 -
Figura 33. Representaciones de la ingestión de bacterias frente al tiempo en las 12 experiencias realizadas en agregados. VD es la velocidad de depredación (bacterias protista-1 h-1) y viene dada por la pendiente de la recta. Nótense las
diferentes escalas utilizadas en los datos de ingestión.
Uno de los factores que más puede afectar a la precisión de la
técnica empleada es la detección y enumeración microscópica de las
FLB ingeridas dentro de las vacuolas digestivas de los protistas
ensayados. Con el fin de minimizar este problema y para detectar
cualquier posible desviación de los resultados, cada uno de los puntos
de las dinámicas de ingestión de las distintas experiencias realizadas
fue analizado al microscopio por dos observadores. El posterior análisis
estadístico indicó que no hubo diferencias significativas entre estos
recuentos (test de Mann Whitney, p>0.05).
4.3.2. Velocidades de depredación sobre bacterias en distintos
microhábitats
Las velocidades de depredación ejercidas por los bacterívoros en
las 45 experiencias llevadas a cabo se calcularon a partir de las
velocidades de depredación de FLB. En todos los casos se obtuvieron
regresiones estadísticamente significativas (p<0,05) entre la ingestión de
bacterias por protista y el tiempo.
Uronema marinumRhynchomonas nasutaBodo designis Jakoba libera
0,0
1,0
2,0I
VD = 6,50,5
1,5
0,0
1,0
VD = 7,2
II
0,5
1,5
1510500,0
1,0
III
VD = 1,20,5
1,5
0,0
0,4
IV
VD = 0,7
151050
0,2
0,6
III
VD = 9,70,0
2,0
1,0
3,0
II
VD = 6,50,0
2,0
1,0
3,0
0,0
0,4
0,8
VD = 2,0
I
0,2
0,6I
VD = 33,70
20
40
30
10
II
VD = 20,7
3020100
0
20
30
10
Bacterias adheridas protista-1
0,0
0,2
0,4
VD = 2,1
I
tiempo (min)
III
VD = 1,3
151050
0,2
0,4
0,0
VD = 9,0
II
2,0
4,0
0,0
0,1
0,3
1,0
3,0
0,3
0,1
0,5
tiempo (min)
tiempo (min)
tiempo (min)
- 67 -
Las velocidades de depredación calculadas para cada protista en
las diferentes condiciones se recogen en la Tabla 6. Los resultados
indican que: 1) los tres nanoflagelados y el microciliado fueron capaces
de alimentarse tanto de bacterias adheridas como de bacterias en
suspensión, y 2) la localización espacial del protista afectaba a las
velocidades de depredación ejercidas.
Agregado Agua alta densidad presas baja densidad presas
Protista
Velocidad depredación
(bacterias protista-1 h-1)
n
Velocidad depredación
(bacterias protista-1 h-1)
n
Velocidad depredación
(bacterias protista-1 h-1)
n
B. designis 4,1 3 9,1 8 1,3 3 (1,3-9,0) (3,8-15,9) (0,2-2,9)
J. libera 5,0 3 29,7 3 6,5 3 (1,2-7,2) (14,5-41,0) (4,2-10,0)
R. nasuta 4,7 4 10,3 7 1,0 3 (0,7-9,7) (4.9-18,7) (0,4-1,5)
U. marinum 27,2 2 382 3 33,3 3 (20,7-33,7) (262-592) (26,1-46,4)
Tabla 6. Velocidades de depredación de los protistas ensayados sobre bacterias adheridas a agregados y bacterias en suspensión. Datos expresados
como valor medio (rango).
A este respecto, cabe resaltar que las velocidades de depredación
sobre bacterias adheridas fueron similares (test Mann Whitney, p>0,05)
a las velocidades de depredación sobre bacterias en suspensión a las
bajas densidades de presas que se suelen encontrar en el agua de mar:
los valores medios de velocidad de los nanoflagelados fueron de 4,6
bacterias protista-1 h-1 (rango 0,7 - 9,7 bacterias protista-1 h-1) cuando
depredaron sobre agregados y de 2,9 bacterias protista-1 h-1 (rango 0,2 -
10,0 bacterias protista-1 h-1) cuando depredaron sobre bacterias en
suspensión en condiciones de baja densidad de presas. Las velocidades
medias del microciliado fueron de 27,2 bacterias protista-1 h-1
depredando sobre bacterias adheridas y de 33,3 bacterias protista-1 h-1
depredando sobre bacterias en suspensión en condiciones de baja
densidad de presas.
- 68 -
Como era de esperar, conocida la influencia ejercida por la
densidad de presas sobre la depredación por protistas, las mayores
velocidades de bacterivoria fueron las detectadas cuando los protistas
se alimentaron de bacterias en suspensión en condiciones de alta
densidad de presas: los valores medios de velocidad fueron de 13
bacterias protista-1 h-1 (rango 3,8 - 41,0 bacterias protista-1 h-1) en el
caso de los nanoflagelados, en tanto que el microciliado fue capaz de
depredar a una velocidad media de 382 bacterias protista-1 h-1 (rango
262 - 592 bacterias protista-1 h-1).
Dado que desconocíamos si la densidad de presas puede afectar a
las velocidades de depredación de la misma forma cuando las presas se
encuentran en suspensión y cuando están adheridas, en la figura 34
hemos representado todas las velocidades de depredación obtenidas
frente a las densidades bacterianas, tomando en consideración cómo se
encontraban las presas: adheridas, en las experiencias realizadas con
agregados, y en suspensión tanto en las experiencias llevadas a cabo en
a las bajas densidades bacterianas que normalmente se encuentran en
el agua de mar como a las realizadas a las altas densidades bacterianas
que caben esperar en la capa de agua de mar que rodea a los
agregados. Hemos encontrado una buena y estadísticamente
significativa (p<0,05) relación positiva entre los valores logarítmicos de
las velocidad de depredación y los valores logarítmicos de la densidad
bacteriana en todos los casos.
Sin embargo, los valores de las pendientes indicaron que la
relación era diferente según la localización de las presas, suspendidas
en el agua o adheridas a agregados. Las pendientes de la relación
logarítmica entre velocidad de depredación y densidad de presas en
suspensión fueron semejantes en el caso del microciliado y de los
nanoflagelados (0,51 y 0,45, respectivamente), lo que indica que la
densidad de presas afecta de la misma manera a las velocidades de
depredación de estos dos tipos de protistas. Por otro lado, el elevado
valor de la pendiente de esta misma relación logarítmica (0,83)
detectada para los nanoflagelados depredando en agregados, es decir,
sobre presas adheridas, indica que el efecto de la densidad de presas
sobre la velocidad de depredación es más importante en el caso de
bacterias adheridas que en el de bacterias en suspensión.
- 69 -
Figura 34. Velocidad de depredación del microciliado (U. marinum ) y de los nanoflagelados (B. designis, ; J. libera y R. nasuta ) sobre bacterias
en suspensión en baja y alta densidad poblacional y bacterias adheridas. Además, se representan los valores medios correspondientes a las tres
situaciones para cada uno de los protistas (símbolos negros) así como los valores medios para el conjunto de nanoflagelados ( ), las rectas de regresión
frente a la densidad poblacional de presas y los valores de las pendientes. Nótese la diferencia en las escalas de velocidad de depredación en el
microciliado y los nanoflagelados.
2,0
-1,0
0,0
1,0
2,0
Log densidad bacteriana (bacterias ml-1)
65 7 8 9
1,5
2,5
1,5
0,5
-0,5
Log velocidad depredación (bacterias protista-1h-1)
Bacterias adheridas
Agregado
Bacterias en suspensión
Agua
MicrociliadoU. marinum
Nanoflagelados:B. designisJ. libera R. nasuta
y = 0,516x-1,379
R2= 0,858-2
p = 0,8 E
y = 0,448x-2,516
R2= 0,545-4p = 1,0 E
=
y = 0,833x-6,701
R2 0,552-2p = 1,0 E
2,0
-1,0
0,0
1,0
2,0
Log densidad bacteriana (bacterias ml-1)
65 7 8 9
1,5
2,5
1,5
0,5
-0,5
Log velocidad depredación (bacterias protista-1h-1)
Bacterias adheridas
Agregado
Bacterias en suspensión
Agua
MicrociliadoU. marinum
Nanoflagelados:B. designisJ. libera R. nasuta
y = 0,516x-1,379
R2= 0,858-2
p = 0,8 E
y = 0,448x-2,516
R2= 0,545-4p = 1,0 E
=
y = 0,833x-6,701
R2R2 0,552-2p = 1,0 E
- 70 -
Considerando únicamente la densidad de presas se observa que los
cuatro protistas mostraron velocidades de depredación mayores cuando
se alimentaron de altas densidades de bacterias en suspensión, aunque
estas densidades bacterianas fueran menores a las detectadas en
agregados.
- 71 -
4.4.1. Nueva técnica de cuantificación de depredación sobre
bacterias adheridas
Mediante la nueva metodología propuesta en este trabajo hemos
conseguido cuantificar velocidades de ingestión de especies individuales
de protistas bacterívoros nanoflagelados y microciliados, sobre bacterias
adheridas a macroagregados orgánicos. Básicamente la técnica consiste
en formar agregados macroscópicos a partir de agua de mar natural
utilizando tanques rodantes. Al comienzo de la experiencia se añade al
agua de mar una densidad de bacterias teñidas con un colorante
fluorocromo de tal manera que, una vez formados, los agregados
contienen una proporción de bacterias adheridas, cuya dinámica de
ingestión por el bacterívoro puede ser seguida utilizando microscopía de
epifluorescencia. La técnica no es sencilla y requiere de una
manipulación cuidadosa, pero permite obtener resultados válidos para
especies individuales o, aunque no ha sido éste el caso, para mezclas de
protistas bacterívoros. A continuación se discutirán los distintos
aspectos positivos y negativos que a nuestro entender presenta el
método propuesto.
El diseño de la técnica se basó en origen en la observación de que,
si se añadía una suspensión de bacterias teñidas a un tanque rodante
que contenía agua de mar natural y se mantenía girando durante unas
24-48 horas, los trazadores se adherían junto con las bacterias vivas
formando agregados que contenían bacterias teñidas. En esta técnica se
formaron agregados a partir de únicamente agua de mar natural.
Consideramos que este tipo de material particulado es el idóneo para
nuestro estudio, puesto que supone una mínima alteración de la
muestra de agua, consiguiéndose la cantidad de material particulado
que se hubiera generado en el sistema natural si el régimen de
turbulencia hubiera sido el apropiado. Una consecuencia de esta
decisión, que al mismo tiempo supone ventajas e inconvenientes, es que
los agregados que se forman a partir de distintas muestras de agua de
mar son distintos en cantidad y probablemente también en calidad,
debido a que constituyen un fiel reflejo de la situación general del
ecosistema y, en particular, de las concentraciones de material disuelto
y particulado. Es decir, se introduce un punto de variabilidad en el
ensayo.
- 72 -
Este hecho, que tiene como ventaja el que se consigue un reflejo
más fiel del sistema, presenta como inconveniente que la proporción de
bacterias teñidas que se consigue es distinta en cada experiencia, dado
que la concentración de bacterias naturales adheridas en el agregado es
variable. Si bien al comienzo de todas las experiencias la cantidad de
bacterias marcadas añadida por microcosmos fue la misma (7�108-1�109
FLB en 11 litros de agua), el porcentaje de FLB adheridas con respecto
al número total de bacterias en los agregados no fue el mismo en todos
los ensayos. No obstante, en el 75% de las experiencias llevadas a cabo,
las bacterias teñidas adheridas supusieron entre un 10% y un 30% del
total de bacterias adheridas (ver tabla 5), porcentajes similares a los
utilizados por otros autores (Sherr y col. 1987; Bloem y col., 1989;
Keller y col. 1994; Boenigk y col., 2001). En este sentido, Sherr y Sherr
en 1993 indicaron que el porcentaje óptimo de bacterias teñidas a
añadir en los ensayos de depredación mediante FLB era aquel que fuera
suficiente para poder cuantificar fácilmente las velocidades de ingestión
y que no supusiera un gran incremento en la densidad de presas. De
esta manera, atendiendo a los porcentajes utilizados en este trabajo,
consideramos que éstos no influyeron en la estimación de las
velocidades de depredación, puesto que ni los valores inferiores fueron
tan bajos como para impedir la observación de bacterias teñidas dentro
de los protistas, ni los superiores tan elevados como para alterar
significativamente la velocidad de depredación como resultado de un
incremento artificial en la concentración de presas.
Otra importante cuestión a la hora de validar esta técnica es tener
la seguridad razonable de que cuando se lleva a cabo el ensayo de
ingestión, el bacterívoro ingiere realmente las bacterias asociadas al
agregado (bacterias firmemente adheridas o embebidas en la matriz
polimérica del agregado) y no bacterias suspendidas en el agua
intersticial del agregado. Por esta razón en la metodología se incluye un
paso de “lavado suave” de los agregados antes de ser depositados en la
placa donde se encuentra el protista (ver Figura 30). El paso consiste en
mantener durante 1 minuto el agregado en una placa intermedia que
contiene el mismo agua en la que se encontraba el agregado pero libre
de bacterias, es decir, filtrada por 0,2 µm de tamaño de poro. De esta
manera, cuando el agregado entra en contacto con el protista, podemos
asegurar que principalmente lo que contiene son bacterias adheridas al
material particulado.
- 73 -
El seguimiento de la dinámica de ingestión por el protista de
presas adheridas teñidas, se realiza de forma semejante que en el caso
de bacterias en suspensión, es decir, siguiendo el protocolo de Sherr y
col. (1987). El uso de FLB como sustitutos bacterianos ha recibido
mucha atención durante los últimos años y hay varios estudios
centrados en determinar la naturaleza de la discriminación de los
protistas entre las bacterias naturales y sus equivalentes muertas por
calor (Landry y col. 1991; González y col., 1993). Si bien es verdad que
se ha encontrado cierto grado de discriminación entre las FLB y las
bacterias vivas, debido principalmente a diferencias en características
superficiales bacterianas y en movilidad, esta discriminación es
probablemente menor a la que tiene lugar en el caso de utilizar
trazadores no bacterianos del tipo bolas de alginato o microesferas (para
una revisión comparativa de la metodología ver Landry, 1994 y Strom,
2000).
Por otra parte, en el caso particular del uso de FLB adheridas,
estos dos factores –características superficiales y movilidad- se
reducirán al mínimo dadas las especiales características de los
agregados. Los procesos de adherencia bacteriana bajo condiciones
naturales pueden ser activos, por medio de fimbrias o de producción de
material polimérico por las bacterias vivas, o pasivos, por adsorción,
que será el mecanismo mediante el que las FLB se adhieren a las
partículas. Si este mecanismo pasivo diera lugar a una fuerza de
adherencia más débil en el caso de las bacterias muertas que en el de
las vivas, debemos considerar una posible sobrestimación de las
velocidades de depredación calculadas sobre bacterias adheridas. Sin
embargo, durante el proceso de formación del agregado, las bacterias
naturales producen grandes cantidades de material adhesivo, que
permite no sólo la adherencia de las propias bacterias productoras sino
también la incrustación de partículas planctónicas (Heissenberger y
col., 1996). En el presente trabajo, estas partículas consistían en
material presente en el agua de mar natural, como bacterioplancton,
restos de organismos muertos y las FLB añadidas. Aunque no podemos
constatarlo, suponemos que la fuerza de adherencia con la que se
conglomeran todos estos tipos de partículas será parecida, puesto que
las bacterias naturales y las FLB se encuentran mezcladas y englobadas
en los agregados.
- 74 -
Con respecto al segundo factor mencionado, discriminación del
protista por diferencias de movilidad de las bacterias, dado que se trata
de bacterias adheridas, las bacterias naturales carecen de libertad de
movimiento en las partículas y, por lo tanto, este factor no debe ser
considerado importante en la discriminación que pueda ejercer el
protista entre las bacterias vivas y las FLB.
Finalmente, esta técnica resulta útil para medir velocidades de
ingestión de bacterias por protistas que tienden a asociarse a los
agregados. Para cuantificar esta tendencia, hemos estimado un índice
de colonización (IC), que se calcula como el cociente entre las
densidades poblacionales de los protistas en el agregado frente a la fase
líquida. En este sentido, hemos encontrado dos respuestas diferentes
dependiendo de la clase de protista analizado: en el caso de los
nanoflagelados, todos los ICs calculados, con una única excepción,
fueron superiores a 1 (ver Tabla 5), lo que indica un esfuerzo positivo de
acercamiento y colonización, y demuestra que los agregados eran
atractivos para estos nanoflagelados. Este hecho no resulta
sorprendente puesto que los tres nanoflagelados analizados han sido
con frecuencia descritos en la literatura como capaces de alimentarse
de bacterias adheridas (Fenchel, 1991).
Con respecto al ciliado, U. marinum es un protista buen nadador y
no presenta ningún tipo de estructura morfológica que le permita unirse
al agregado, aunque a menudo se encuentra asociado a partículas
(Sieburth, 1984). De los cuatro experimentos realizados con este
protista, solamente dos de ellos mostraron ICs mayores que 1. Es
posible que en estos dos casos la composición de los agregados atrajera
al ciliado y éste respondiera nadando hacia el agregado y
permaneciendo en sus cercanías. Tal clase de mecanismo quimiotáctico
ha sido ya descrito para algunos géneros de protistas heterotrofos
(Sibbald y col., 1987; Blackburn y Fenchel, 1999; Fenchel y Blackburn,
1999).
En resumen, la metodología propuesta resulta eficaz para
cuantificar depredación sobre bacterias adheridas por protistas
bacterívoros en agregados. Aunque se trata de una técnica tediosa y
requiere una cuidadosa manipulación y observación, parece ser
- 75 -
conveniente y fiable para analizar procesos de bacterivoria en agregados
a nivel de especie.
4.4.2. Depredación sobre bacterias adheridas y en suspensión
Diversos estudios han demostrado claramente la preferencia de
protistas nanoflagelados y ciliados para depredar sobre presas
bacterianas grandes y activas (Davis y Sieburth, 1984; Gasol y col.,
1995; del Giorgio y col., 1996). Además, las velocidades de ingestión
suelen estar generalmente muy relacionadas con la densidad de presas
(Peters, 1994; Iriberri y col., 1995). Así, parece lógico esperar que los
valores más altos de las velocidades de depredación correspondieran a
la bacterivoria ejercida por los protistas sobre bacterias adheridas a
agregados, puesto que este microhábitat está densamente colonizado
por bacterias adheridas que son, con frecuencia, más grandes y más
activas que sus equivalentes en suspensión (Iriberri y col., 1987; Simon
y col., 1990). Sin embargo, tal y como se refleja en la Tabla 6, los
nanoflagelados mostraron una velocidad de depredación en agregados
muy baja, a pesar de las altas densidades bacterianas encontradas en
ellos.
Los valores medios de velocidad de depredación calculados en los
experimentos realizados en agregado y en los llevados a cabo a las bajas
densidades de presas encontradas generalmente en agua de mar no
fueron diferentes, lo cual resulta altamente relevante porque estos
nanoflagelados han sido descritos como bacterívoros “asociados a
partículas” (Patterson y col., 1993), y se considera que son capaces de
alimentarse eficientemente de bacterias adheridas (Caron, 1987;
Sibbald y Albright, 1988; Fenchel, 1991). Con respecto al ciliado, las
velocidades de ingestión mostradas por U. marinum en agregados eran
demasiado bajas para sostener el crecimiento de este protista (Iriberri y
col., 1995). Parece que este microciliado no podía aprovechar las altas
densidades de presas presentes en los agregados, debido probablemente
a la imposibilidad de capturar bacterias adheridas.
Las velocidades de depredación sobre bacterias adheridas
observadas en este estudio entran dentro del rango de los valores
obtenidos por otros autores. Starink y col. (1996) trabajando con
- 76 -
sedimentos, utilizaron FLB adheridas a partículas como sustitutos
bacterianos para cuantificar velocidades de depredación de
nanoflagelados, y obtuvieron unos valores que variaron entre 3,8 y 64,2
bacterias protista-1h-1. Albright y col. (1987) también utilizaron
bacterias adheridas a microesferas teñidas, y detectaron velocidades de
depredación de ciliados en un rango entre 14 y 334 bacterias protista-1
h-1 para las comunidades naturales de ciliados, y un valor de
bacterivoria de 28 bacterias protista-1 h-1 para una especie marina del
género Uronema. Hay otros estudios sobre depredación ejercida por
protistas en partículas, pero no es posible comparar sus resultados con
los nuestros puesto que la metodología utilizada fue distinta. En estos
trabajos no utilizaron FLB adheridas sino que añadieron FLB dispersas
sobre las partículas, y por lo tanto en estos casos el esfuerzo requerido
por los protistas para separar las presas bacterianas de las partículas
no queda reflejado en sus resultados. Así, las velocidades de
depredación oscilaron en el rango 2,5 - 72 bacterias protista-1 h-1 para
los flagelados (Epstein y Shiaris, 1992; Hondeveld y col., 1992; Epstein,
1997) y entre 37 y 525 bacterias protista-1 h-1 para los ciliados (Epstein
y Shiaris, 1992; Epstein, 1997; Kemp, 1988).
De hecho, parece que alimentarse de bacterias adheridas implica
un esfuerzo para los protistas estudiados (ver Figura 34). Si aplicamos
la ecuación de la regresión entre velocidad de depredación y densidad
de presas obtenida en el caso de presas bacterianas suspendidas a las
densidades bacterianas medias encontradas en los agregados (6,65�108
bacterias ml-1), los valores de bacterivoria teóricos estimados son de
30,2 bacterias protista-1 h-1 para los nanoflagelados y 1349 bacterias
protista-1 h-1 para el microciliado. Estos valores teóricos son mucho más
altos que los valores experimentales observados, 4,6 bacterias protista-1
h-1 para los nanoflagelados y 27,2 bacterias protista-1 h-1 para el
microciliado. Esta diferencia indica que estos protistas depredan mucho
más lentamente bacterias adheridas que bacterias en suspensión, 7
veces en el caso de los nanoflagelados y 50 veces en el del microciliado.
Caso de que las velocidades de depredación sobre bacterias adheridas
estuvieran, tal y como se ha discutido previamente, sobrestimadas esta
diferencia sería incluso más alta. Por lo tanto, la adherencia podría
conferir a las bacterias una resistencia frente a la depredación, puesto
que una vez adheridas resultan más difíciles de ser depredadas por los
protistas bacterívoros. Esta resistencia puede ser consecuencia de un
- 77 -
refugio espacial dependiendo del origen y estructura física de las
partículas y de la localización de las bacterias dentro de la partícula
(Jürgens y Güde, 1994).
Sin embargo, y a pesar de las bajas velocidades de depredación
mostradas por los protistas sobre bacterias adheridas a agregados a
nivel individual, es bien cierto que la comunidad de protistas que habita
estas partículas es muy densa, generalmente 2-4 órdenes de magnitud
superior que la comunidad de protistas planctonicos (Prézelin y
Alldredge, 1983; Caron y col., 1986; Turley y Mackie, 1994). Este hecho
puede ser debido a varias razones.
En primer lugar, debe tenerse presente la cantidad total de presas
bacterianas disponible en los agregados, la cual es varios órdenes de
magnitud superiores a las que se encuentran en el agua. Aunque las
velocidades de depredación mostradas por los protistas eran muy
similares cuando se alimentaban en los agregados y en las bajas
densidades de bacterias en suspensión encontradas generalmente en
agua de mar, el crecimiento de las comunidades de protistas adheridos
no estaría limitado por el alimento, como parece suceder en el caso de
los protistas nadadores en suspensión. Además, debemos considerar
igualmente la abundancia de otros alimentos en los agregados, tales
como macromoléculas y materia orgánica disuelta, que pueden también
ser utilizados por protistas fagotrofos (Tranvik y col., 1993).
Por otra parte, el coste energético asociado al movimiento requerido
para encontrar presas bacterianas debe ser mucho más bajo en estos
agregados densamente colonizados que en el conjunto del agua,
pudiendo compensarse el esfuerzo que los protistas deben hacer para
separar la presa bacteriana.
Por último, debemos considerar los agregados como microhábitats
dinámicos donde las actividades hidrolíticas de la comunidad
bacteriana adherida generan y liberan material orgánico a las capas de
agua circundantes. En esta situación, cabe esperar el crecimiento de
una densa y activa subcomunidad de bacterias libremente suspendidas
alrededor de los agregados (Cho y Azam, 1988; Smith y col., 1992;
Grossart y Simon, 1998; Unanue y col., 1998b). La colonización de los
agregados estaría aumentada por esos protistas planctónicos capaces
de detectar y acercarse a sus alrededores donde las bacterias estarían
- 78 -
creciendo rápidamente. Esta clase de comportamiento móvil
quimiosensorial en protistas ha sido recientemente descrita por
Blackburn y Fenchel (1999) y Fenchel y Blackburn (1999), y parece
desempeñar un relevante papel en la búsqueda de focos localizados de
alimento en los sistemas acuáticos (Antipa y col., 1983; Sibbald y col.,
1987).
Cabe concluir que la importancia de los diversos microhábitats que
se generan en los sistemas acuáticos con heterogeneidad espacial,
queda perfectamente clarificada al comparar a nivel de comunidades la
potencial canalización de biomasa bacteriana en el agua frente a los
agregados. Nuestros resultados indican que los nanoflagelados
heterotrofos libres y los asociados a partículas mostraron, a nivel
individual, velocidades de depredación similares, pero hay que tener en
cuenta que las densidades de estas dos comunidades en los
ecosistemas naturales son muy diferentes. En tanto que la abundancia
de flagelados libres en el agua es relativamente baja y muy similar en
diversos sistemas marinos acuáticos, variando entre 1�102 y 13�102 HNF
ml-1 (Davis y col., 1985; Fuhrman y col., 1989; Caron y col., 1995,
1999; Artolozaga y col., 2000), la abundancia de flagelados en los
agregados es mucho mayor y más variable, alcanzando valores tan altos
como 1,3�105 y 330�105 HNF ml-1 (Caron y col., 1986; Turley y Mackie,
1994). Por lo tanto, a igualdad de volumen, la biomasa bacteriana
canalizada a través de la comunidad de flagelados asociados a agregado
puede ser incluso 3 órdenes de magnitud superior a la canalizada por la
comunidad de flagelados en suspensión. Estos datos pueden reflejar la
trascendencia ecológica potencial de los agregados en la transferencia
de la materia en los sistemas acuáticos.
- 79 -
1. La utilización en condiciones controladas de las cámaras
rodantes diseñadas, promueve la floculación de las partículas presentes
en la columna de agua y permite diferenciar la fase particulada
(agregados) de la fase líquida (agua). Los agregados recién formados
constituyen un microhábitat rico en nutrientes, que soporta el
crecimiento rápido de bacterias presa y es subsecuentemente
colonizado por los protistas bacterívoros. Esta colonización comienza
con la presencia de pequeños flagelados principalmente bodónidos, y es
seguida de una sucesión de formas mayores en tamaño, como
microciliados, posteriormente grandes ciliados y finalmente protistas
ameboides.
2. Los agregados, material particulado, sirven de sustrato a una
amplia variedad de especies de protistas especialistas que
habitualmente se encuentran sésiles o asociados a superficies, y que,
por tanto, son más comunes de sistemas bénticos que de sistemas
pelágicos. Desde el punto de vista ecológico, el material particulado
presente en la columna de agua representa un microambiente
particular y abundante en los sistemas planctónicos. Su importancia es
elevada ya que de su presencia depende la existencia pelágica de este
grupo funcional de protistas bacterívoros.
3. La enorme diferencia observada en el tamaño de las
comunidades de protistas nanoflagelados y ciliados presentes en el
material particulado frente al agua, indica que los agregados son
microambientes mucho más favorables para el crecimiento de los
protistas bacterívoros que el agua. Por tanto, en estas partículas puede
residir camuflada una depredación que no se puede detectar por las
metodologías habituales y que suministraría una explicación en el caso
de aquellos ecosistemas donde el consumo de bacterias por protistas en
suspensión sólo se corresponde con una pequeña parte de la
producción secundaria bacteriana.
4. La nueva metodología propuesta en este trabajo es válida para
cuantificar velocidades de depredación (ingestión) sobre bacterias
adheridas a agregados generados a partir de agua de mar, por parte de
especies de protistas nanoflagelados y ciliados bacterívoros.
- 80 -
5. Las velocidades de depredación de bacterias adheridas que
muestran los nanoflagelados bodónidos especialistas Jakoba libera,
Bodo designis y Rynchomonas nasuta, así como del escuticociliado
Uronema marinum, son cerca de un orden inferior de lo que cabría
esperar en función de la densidad poblacional de bacterias adheridas
que habitan en el material particulado. Esto es debido a que las
bacterias presa, dada su adherencia, son más difíciles de ingerir y
adquieren de esta manera un grado de resistencia potencial a la
depredación.
6. El crecimiento continuo de la comunidad de bacterias adheridas
a material particulado hace que, también de forma continua, se
desprendan las bacterias hijas resultantes, creando una microcapa
alrededor de los agregados altamente colonizada por bacterias presa en
suspensión. Esta microcapa es objeto de intensa depredación por
protistas tanto en suspensión como adheridos a los agregados y su
enorme importancia puede explicar la supervivencia de especies de
bacterívoros que difícilmente podrían sobrevivir en la columna de agua
atendiendo a los bajos niveles de densidad poblacional de presas
existentes.
7. Se ha conseguido y se mantiene en depósito en el Grupo de
Investigación en Microbios Marinos de la UPV-EHU, una colección de
protistas flagelados y ciliados representativos del agua de mar y de
macroagregados marinos.
- 81 -
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