luận án

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ VN

VIỆN HÓA SINH BIỂN

NGUYỄN THỊ DIỆU THUẦN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI XÁO LEO

(PARAMIGNYA SCANDENS (GRIFF.) CRAIB) Ở LÂM ĐỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2015

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ VN

VIỆN HÓA SINH BIỂN

NGUYỄN THỊ DIỆU THUẦN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI XÁO LEO

(PARAMIGNYA SCANDENS (GRIFF.) CRAIB) Ở LÂM ĐỒNG

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC HỮU CƠ

MÃ SỐ: 62.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học 1: GS.VS. Châu Văn Minh

Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Hữu Toàn Phan

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.VS. Châu Văn Minh và TS.

Nguyễn Hữu Toàn Phan - những người Thầy đã dành cho tôi sự hướng dẫn,

chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ hết sức nhiệt

tình của:

- Các Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Hóa

sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Nghiên cứu Khoa học

Tây Nguyên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Ban Chủ nhiệm Chương trình Khoa học và Công nghệ phục vụ phát

triển Kinh tế - Xã hội vùng Tây Nguyên và Chủ nhiệm đề tài TN3/T14.

Tôi xin chân thành cám ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Nguyễn Thị Diệu Thuần

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số

liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Nguyễn Thị Diệu Thuần

MỤC LỤC

Trang

Lời cám ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình ảnh, đồ thị

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. Nguồn tài nguyên dược liệu tại Lâm Đồng .............................................................. 3

1.1.1. Khái quát về tiềm năng cây thuốc của Lâm Đồng ......................................... 3

1.1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở

Việt Nam của một số loài thực vật tương tự tại Lâm Đồng ..................................... 5

1.1.3. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của một số

loài thực vật (tương tự loài ở Lâm Đồng) ................................................................ 7

1.2. Giới thiệu chung về chi Paramignya (Rutaceae): .................................................... 8

1.2.1 Đặc điểm sinh học của chi Paramignya (Rutaceae): ...................................... 8

1.2.2 Hoạt tính sinh học của chi Paramignya (Rutaceae): .................................... 11

1.2.2.1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoit ....................................... 11

1.2.2.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất coumarin ...................................... 14

1.2.2.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất triterpen dạng khung tirucallan ... 15

1.2.2.4. Hoạt tính sinh học của chi Paramignya ................................................ 16

1.3. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paramignya (Rutaceae) ..................... 18

1.3.1. Tổng quan các kết quả trong và ngoài nước ................................................ 18

1.3.1.1. Các công trình đã công bố trên thế giới ................................................ 18

1.3.1.2. Các công trình đã công bố trong nước: ................................................. 21

1.4. Các hợp chất Tirucallan .......................................................................................... 23

1.4.1. Phổ 1H-NMR của các hợp chất tirucallan .................................................... 24

1.4.2. Phổ 13C-NMR của các hợp chất tirucallan ................................................... 27

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 28

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 28

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ....................................................................... 28

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ............................................................................... 28

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ............................................................................ 29

2.2.3. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................ 29

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ......................................................... 29

2.3.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV) ....................................................... 29

2.3.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR) .................................................... 29

2.3.3. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................ 30

2.3.4. Phương pháp khối phổ (MS) ........................................................................ 30

2.3.5. Thiết bị phân tích ......................................................................................... 31

2.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào................................................. 31

2.4.1. Mục tiêu và cơ sở lý thuyết .......................................................................... 31

2.4.2. Vật liệu ......................................................................................................... 32

2.4.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 32

2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kích hoạt enzym caspase 3/7 .............................. 34

2.6. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm: ................................................................ 35

2.6.1. Nuôi cấy tế bào ............................................................................................ 35

2.6.2. Đo Cytokine ................................................................................................. 35

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 36

3.1. Điều chế các dịch chiết từ Paramignya scandens: ................................................. 36

3.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học dịch chiết ............................................................... 37

3.3. Nghiên cứu hóa học cây P. scandens ..................................................................... 37

3.3.1. Quy trình phân lập ........................................................................................ 37

3.3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được: ................. 40

3.3.2.1. Hợp chất 01 (PS16): Paramignyol A (Chất mới) .................................. 40

3.3.2.2. Hợp chất 02 (PS15): Paramignyol B (Chất mới) .................................. 40

3.3.2.3. Hợp chất 03 (PS31): Paramignyoside A (Chất mới) ............................. 41

3.3.2.4. Hợp chất 04 (PS32): Paramignyoside B (Chất mới) ............................. 42

3.3.2.5. Hợp chất 05 (PS28): Paramignyoside C (Chất mới) ............................. 43

3.3.2.6. Hợp chất 06 (PS30): Paramignyoside D (Chất mới) ............................. 44

3.3.2.7. Hợp chất 07 (PS29): Paramignyoside E (Chất mới) ............................. 45

3.3.2.8. Hợp chất 08 (PS01): Methyl isolimonate .............................................. 46

3.3.2.9. Hợp chất 09 (PS02): (6R,9S)-roseoside ................................................ 46

3.3.2.10. Hợp chất 10 (PS03): -D-glucopyranoside methyl salicylate............. 47

3.3.2.11. Hợp chất 11 (PS05): Adenosine .......................................................... 47

3.3.2.12. Hợp chất 12 (PS09): 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-

glucopyranoside .................................................................................................. 47

3.3.2.13. Hợp chất 13 (PS10): Syrigin ............................................................... 48

3.3.2.14. Hợp chất 14 (PS13): Atripliside B ...................................................... 48

3.3.2.15. Hợp chất 15 (PS18): trans-N-p-coumaroyl tyramine.......................... 49

3.3.2.16. Hợp chất 16 (PS20): 2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--

L-rhamnopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside .......................................... 49

3.3.2.17. Hợp chất 17 (PS21): Gusanlungionoside C ........................................ 50

3.3.2.18. Hợp chất 18 (PS23): Betulalbuside B ................................................. 50

3.3.2.19. Hợp chất 19 (PS25): Syringaresinol di-O--D-glucopyranoside ........ 51

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 52

4.1. Quy trình phân lập .................................................................................................. 52

4.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất ........................................................................ 54

4.2.1. Hợp chất 01: Paramignyol A (Chất mới) ..................................................... 54

4.2.2. Hợp chất 02: Paramignyol B (Chất mới) ..................................................... 59

4.2.3. Hợp chất 03: Paramignyoside A (Chất mới) ................................................ 63

4.2.4. Hợp chất 04: Paramignyoside B (Chất mới) ................................................ 69

4.2.5. Hợp chất 05: Paramignyoside C (Chất mới) ................................................ 72

4.2.6. Hợp chất 06: Paramignyoside D (Chất mới) ................................................ 75

4.2.7. Hợp chất 07: Paramignyoside E (Chất mới) ................................................ 79

4.2.8. Hợp chất 08: Methyl isolimonate ................................................................. 82

4.2.9. Hợp chất 09: (6R,9S)-roseoside ................................................................... 86

4.2.10. Hợp chất 10: -D-glucopyranoside methyl salicylate ............................... 89

4.2.11. Hợp chất 11: Adenosine ............................................................................. 91

4.2.12. Hợp chất 12: 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-glucopyranoside ........... 93

4.2.13. Hợp chất 13: Syrigin .................................................................................. 95

4.2.14. Hợp chất 14: Atripliside B ......................................................................... 97

4.2.15. Hợp chất 15: trans-N-p-coumaroyl tyramine .......................................... 100

4.2.16. Hợp chất 16: 2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--L-

rhamnopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside .................................................. 102

4.2.17. Hợp chất 17: Gusanlungionoside C ......................................................... 105

4.2.18. Hợp chất 18: Betulalbuside B .................................................................. 108

4.2.19. Hợp chất 19: syringaresinol di-O--D-glucopyranoside ......................... 111

4.3. Kết quả thử hoạt tính ............................................................................................ 114

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................................ 114

4.3.2. Hoạt tính kháng viêm ................................................................................. 117

4.4. Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens ............................ 117

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 120

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................................ 121

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 122

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 128

DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải

13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

cacbon 13

1H-NMR

Proton nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton

BMDC Bone marrow-derived dendritic

cells

Tế bào đuôi gai từ tủy xương

CC Column chromatography Sắc kí cột

COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt

nhân 1H-1H

CTPT Công thức phân tử

DEPT

Distortionless enhancement by

polarisation transfer

Phổ DEPT

DMSO Dimethyl sulfoxide

ESI-MS

Electron spray ionization mass

spectra

Phổ khối lượng ion hóa phun mù

điện tử

Fl Fibril sarcoma of Uteus Ung thư màng tử cung

Glc Glucopyranoside

HeLa Henrietta lacks Ung thư cổ tử cung

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan người

HL-60 Human leukemia 60 Ung thư bạch cầu

HMBC

Heteronuclear mutiple bond

connectivity

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

nhiều liên kết

HR-ESI-MS

High resolution electronspray

ionization mass spectrum

Phổ khối lượng phân giải cao

phun mù điện tử

HSQC Heteronuclear single-quantum

coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1

liên kết

IC50

Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng

thử nghiệm

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

KB Human epidemoid carcinoma Ung thư biểu mô người

LNCaP Human prostatic carcinoma Ung thư tiền liệt tuyến người

LU Human lung carcinoma Ung thư phổi người

MCF7 Michigan cancer foundation-7 Ung thư vú người

NF-B Nuclear factor kappa-light-

chain-enhancer of activated B

cells

Yếu tố nhân kappa B

NOESY Nuclear overhauser effect

Spectroscopy

Phổ NOESY

OD Optical density Mật độ quang học

Rha Rhamnopyranoside

RD Rhabdo sarcoma Ung thư màng tim

ROESY Rotating frame nuclear

overhauser effect spectroscopy

Phổ ROESY

RP18 Reserve phase C-18 Silica gel pha đảo RP-18

SRB Sulphorhodamine B

TCA Trichloracetic acid Trichloracetic acid

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TMS Tetramethylsilane Tetramethyl silan

TNF-α Tumor necrosis factor α Yếu tố hoại tử khối u α

Xyl Xylopyranoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) của hợp chất 1-3 ............. 25

Bảng 1.2. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 4-6 ............................................. 26

Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên cao toàn phần của cây Xáo leo ... 37

Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 01 .............................................. 58



Bảng 4.4. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PS32 ......................................... 71


Bảng 4.6. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PS30 ......................................... 77




Bảng 4.10. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 10 ............................................ 90





Bảng 4.15. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 15 .......................................... 102





Bảng 4.20. Kết quả hoạt tính diệt tế bào ung thư in vitro của Paramignyol A và

Paramignyol B ............................................................................................................. 115

Bảng 4.21. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất Paramignyoside A-E .................. 117

Bảng 4.22. Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens ................. 117

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 2.1. Cây xáo leo - Paramignya scandens (Griff.) Craib....................................... 28

Hình 3.1. Sơ đồ tạo các dịch chiết từ cây P. scandens .................................................. 36

Hình 4.1. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết CHCl3 của cây P. scandens ............... 52

Hình 4.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước W1 của cây P. scandens .......... 53

Hình 4.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước W2 của cây P. scandens .......... 53

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 01 ..................................... 54

Hình 4.5. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 01 .................................... 55

Hình 4.6. Phổ NOESY của hợp chất 01 ........................................................................ 57

Hình 4.7. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 01 ............................... 57

Hình 4.8. Tương tác NOESY chính của hợp chất 01 .................................................... 57

Hình 4.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất 01 ................................................................. 59

Hình 4.10. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 02 ................................... 59

Hình 4.11. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 02 .................................. 60

Hình 4.12. Phổ NOESY của hợp chất 02 ...................................................................... 61

Hình 4.13. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 02 ............................. 61

Hình 4.14. Tương tác NOESY chính của hợp chất 02 .................................................. 61

Hình 4.15. Cấu trúc hóa học của hợp chất PS15 ........................................................... 63



Hình 4.18. Phổ COSY của hợp chất 03 ......................................................................... 65

Hình 4.19. Phổ ROESY của hợp chất 03 ...................................................................... 66

Hình 4.20. Cấu trúc hóa học và tương tác COSY, HMBC và ROESY chính

của hợp chất 03 .............................................................................................................. 67



Hình 4.23. Cấu trúc hóa học và tương tác COSY ( ) và HMBC () chính

của hợp chất 04 .............................................................................................................. 70




của hợp chất 05 .............................................................................................................. 74


Hình 4.28. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất PS30 .............................. 76


của hợp chất 06 .............................................................................................................. 77




của hợp chất 07 .............................................................................................................. 80

Hình 4.33. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 08 ..................................... 83

Hình 4.34. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất 08 .................................... 84

Hình 4.35. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất 08 .................... 85



Hình 4.38. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất 09 .................... 88

Hình 4.39. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 10 ..................................... 89

Hình 4.40. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất 10 .................................... 90


Hình 4.42. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất 11 ................................ 91

Hình 4.43. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất 11............................... 92

Hình 4.44. Cấu trúc hoá học của hợp chất 11 ............................................................... 92







Hình 4.51. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất 14 ................................ 98

Hình 4.52. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất 14............................... 99


Hình 4.54. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 15 ................................. 101

Hình 4.55. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 15 ................................ 101

Hình 4.56. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất 15 .................. 102



Hình 4.59. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất 16 .................. 104



Hình 4.62. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất PS21 ............. 107



Hình 4.65. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất PS23 ............. 111

Hình 4.66. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất 19 .............................. 112

Hình 4.67. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất 19............................. 113

Hình 4.68. Cấu trúc hoá học của hợp chất 19 ............................................................. 113

Hình 4.69. Khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của Paramignyol A và B ........... 115

1

MỞ ĐẦU

Từ ngàn xưa, cây thuốc được xem là nguồn gốc dược liệu quan trọng giúp

chữa bệnh cho con người. Những tác dụng chữa bệnh, tăng cường và bảo vệ sức

khoẻ của cây cỏ đối với con người chủ yếu là do các hợp chất tự nhiên mà chúng đã

sinh tổng hợp, tích luỹ trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đến nay, mặc dù đã

có rất nhiều các dược phẩm được sản xuất bằng con đường tổng hợp hoá học; tuy

nhiên theo nhiều tài liệu thì có tới hơn 50% các loại thuốc đang được sử dụng trên

thế giới có nguồn gốc thực vật. Đó là do mức độ nguy hiểm của sự kháng thuốc và

các tác dụng phụ kéo theo khi sử dụng các dược phẩm hoá học và các loại thuốc có

nguồn gốc thực vật đã thực sự hồi sinh.

Lâm Đồng là tỉnh miền núi phía Nam Tây Nguyên có độ cao trung bình từ

800 - 1.000m so với mặt nước biển với diện tích tự nhiên 9.772 km2; địa hình tương

đối phức tạp chủ yếu là bình sơn nguyên, núi cao đồng thời cũng có những thung

lũng nhỏ bằng phẳng đã tạo nên những yếu tố tự nhiên khác nhau về khí hậu, thổ

nhưỡng, động thực vật... Riêng về cây thuốc, kết quả điều tra dược liệu đến nay đã

ghi nhận được trên 1000 loài thực vật làm thuốc, trong đó có nhiều loài cây thuốc

quý. Nhiều nghiên cứu trước đây ở Việt Nam về các loài thực vật có hoạt tính diệt

tế bào ung thư cho thấy tại Lâm Đồng có nhiều loài thực vật có hoạt tính như Taxus

wallichiana Zucc., dừa cạn Catharanthus roseus, Coptis japonica, Coscinium

usitatum, Crinum latifolium… Ngoài ra, còn có nhiều loài thực vật có hoạt tính gây

độc tế bào nhưng chưa hoặc ít được nghiên cứu về hóa học ở Việt Nam và trên thế

giới, đây là cơ sở quan trọng cho việc định hướng chọn lọc đối tượng nghiên cứu

của luận án.

Trên cơ sở sàng lọc một số loài thực vật ở Lâm Đồng theo định hướng hoạt

tính gây độc tế bào, chúng tôi đã phát hiện dịch chiết methanol của loài Xáo leo

(Paramignya scandens Craib) có hoạt tính mạnh, trong khi loài này chưa được

nghiên cứu hóa học ở Việt Nam và trên thế giới. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của

2

loài Xáo leo (Paramignya scandens (Griff.) Craib) ở Lâm Đồng” nhằm nâng cao

giá trị sử dụng và góp phần vào kho tàng cây thuốc đặc hữu của Lâm Đồng nói

riêng và Việt Nam nói chung.

Theo hướng nghiên cứu này, luận án có các nhiệm vụ sau:

- Nghiên cứu được thành phần hóa học của loài Xáo leo (Paramignya

scandens (Griff.) Craib) ở Lâm Đồng.

- Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập

- Đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập được nhằm định hướng

cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nguồn tài nguyên dược liệu tại Lâm Đồng:

1.1.1. Khái quát về tiềm năng cây thuốc của Lâm Đồng:

Lâm Đồng là tỉnh miền núi phía Nam Tây Nguyên có độ cao trung bình từ 800

- 1.000m so với mặt nước biển với diện tích tự nhiên 9.772 km2; địa hình tương đối

phức tạp chủ yếu, là bình sơn nguyên, núi cao đồng thời cũng có những thung lũng

nhỏ bằng phẳng đã tạo nên những yếu tố tự nhiên khác nhau về khí hậu, thổ

nhưỡng, thực động vật... Nhiều loài cây thuốc của Lâm Đồng được sử dụng làm

thuốc chữa cảm sốt, chữa lỵ, chữa trị giun sán, chữa ho hen, chưa đau dạ dày, chữa

huyết áp, tim, chữa tai mũi họng, chữa về bộ máy tiêu hóa, chữa mụn nhọt, chữa

phong thấp, thuốc nhuận tràng, tẩy, thuốc thông tiểu, thông mật, an thần, bổ dưỡng.

Riêng về cây thuốc, kết quả điều tra dược liệu đến nay đã ghi nhận được trên 1000

loài thực vật làm thuốc. Trong đó có nhiều loài cây thuốc quý, hiếm như: thiên niên

kiện (Homalomena occulta), thảo nam sơn (Xantolis cambodiana), vấn vương

(Galium aparine), nữ lang (Valeriana hardwickii), thiên môn ráng (Asparagus

finicinus), hoàng tinh (Polygonatum punctatum), sa nhân tím (Amomum

longiligulare), mã hồ (Mahonia nepalensis), thiên niên kiện lá to (Homalonema

gigantea), sơn tra (Malus doumeri), một lá tím (Nervilia crispata), một số loài

thuộc họ nhân sâm (Araliaceae): Schefflera kontumensis, Schefflera sp3., Aralia

hiepiana, Macropanax schmidii, chè dây (Ampelopsis cantoniensis), thông đỏ

(Taxus wallichiana), bình vôi (Stephania rorunda), ba gạc lá to (Rauwolfia

cambodiana)…[1].

Trong đó, có nhiều loài thực vật chưa hoặc ít được nghiên cứu về hóa học ở

Việt Nam và trên thế giới nên là cơ sở quan trọng cho việc định hướng chọn lọc đối

tượng nghiên cứu.

Theo điều tra, đánh giá nguồn tài nguyên dược liệu tỉnh Lâm Đồng, có các loài

quý hiếm ghi trong Sách đỏ Việt Nam (2007) (40 loài), phần lớn các cây thuộc diện

nguy cấp và sẽ nguy cấp như: thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.), đỉnh tùng

(Cephalotaxus mannii Hook. F.), bách xanh (Calocedrus marolepis Hurz), du sam

4

(Keteleeria evelyniana Mast.), thông 2 lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte), thông 5 lá

(Pinus dalatensis Ferre,), pơmu (Fokenia hodgnsii (Dunn) A. Henry & Thomas), lan

1 lá (Nervilia crispata (Blume) Schltr. ex Kraenzl.), lệ dương (Aeginetia indica (L.)

Roxb.), ba gạc lá to (Rauwolfia cambodiana Pierre ex Pitard), đảng sâm

(Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.), nữ lang (Valeriana hardwickii Wall.), lan

kim tuyến (Anoetochilus setaceus Blume), thiên môn ráng (Asparagus filicinus

Buch.- Ham ex D. Don), hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC.), sơn dương

(Rhopalocnemis phalloides Jungh.), lá khôi nhung (Ardisia silvestris Pitard), hoàng

tinh vòng (Polygonatum kinggianum Coll. ex Hemsl), nắp ấm trung bộ (Nepenthes

annamensis Macfll), nắp ấm (Nepenthes mirapilis (Lour.) Druce.)…

Những loài đặc hữu của Lâm Đồng: gò đồng Bi đúp (Gordonia bidoupensis

Ganep.), đại đinh Schmidii (Macropanax schmidii C.B. Shang), hà biện lá thài lài

(Habenaria commelinifolia (Roxb.) Wall. Ex Lindl.), bóng nước lanbiang

(Impatiens langbianensis Tardieu), hải đường langbiang (Begonia langbianensis

Baker f.), côm bi dúp (Elaeocarpus bidupensis Ganep.), cuồng Hiệp (Aralia

hiepiana J. Wen & Lowry)… Những loài có trữ lượng khá gặp nhiều trên các tuyến,

có thể khai thác phục vụ cho y học cổ truyền như: thạch xương bồ (Acorus

gramineus Soland.), kinh giới đất (Elsholtizia winitiana Craib), rau bánh lái

(Pentaphragma sinense Hemsl.), ban nhật (Hypericum japonicum Thunb. Ex

Murray), muối/ ngũ bội tử (Rhus chinensis Mill.), thiên niên kiện (Homalomena

occulta (Lour.) Schott), chè dây (Ampelopsis cantoniensis (Hook. Et Arn.) Planch),

màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers), đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. Ex

Lindl.) Vis.), đơn châu chấu (Aralia armata (Wall) Seem.), hà thủ ô trắng

(Streptocaulon juventas (Lour.) Pers.), mũi mác (Desmodium trifolum (L.) DC.), kê

huyết đằng (Sphatholobus parviflorus (Roxb.) Kuntze), lạc tiên (Passiflora foetida

L.), hồng tùng (hoàng đàn giả) (Dacrydium elatum (Roxb.), ráng đuôi phụng cứng

(Drynaria rigidula (Sw) Bedd.), đa đa (Harrisonia perforata (Blanco). Merr.), bách

bệnh (Eurycoma longifolia Jack.), gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.), trà tiên

5

(Ocimum basilicum var. pilosum (Willd.) Benth.), sa nhân tím (Amomum

longiligulare T.L. Wu), dạ cẩm (Hedyotis capitellata Wall. ex G. Dob)…[1].

1.1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở Việt

Nam của một số loài thực vật tương tự tại Lâm Đồng:

Trong giai đoạn 1996-2005, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tiến

hành chương trình sàng lọc trên một nghìn mẫu dịch chiết thô của các thực vật thu

hái ở một số khu vực của Việt Nam, cơ sở lựa chọn dựa vào các kinh nghiệm dân

gian trong điều trị kháng u và kháng viêm, các dịch chiết này đã được sàng lọc in

vitro hoạt tính kháng u trên các dòng tế bào ung thư người Hep-G2, KB, Fl, Lu và

RD nuôi cấy. Kết quả đã phát hiện ra một số loài thực vật triển vọng như lá bạch

đồng nữ Cleodendrum philippinum, diếp cá Houttuynia cordata, gừng gió Zingber

zerumbe, thành ngạnh Cratoxylum pruniflorum...

Hợp chất 8,13-epoxy-3-en-7-hydroxy-6,11-O-dibenzoyl-15,16-derodanolid

thể hiện hoạt tính kháng ung thư khá cao trên nhiều dòng tế bào ung thư người như:

MCF7 (ung thư vú), LU (ung thư phổi), LNCaP (ung thư tuyến tiền liệt) và KB

(ung thư biểu mô), hợp chất này được chiết xuất từ cây bán chi liên Scutellaria

barbata D. Don [2].

Sàng lọc một số hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư B16 của 50

thực vật trong các bài thuốc chống u và viêm khớp đã tìm ra các loài Siegesbeckia

orientalis, Notopterygium incisium và Mimosa pudica thể hiện hoạt tính mạnh [3].

Ba hợp chất là ent-(16S)-18-acetoxy-7β-hydroxykauran-15-one, ent-1α,14α-

diacetoxy-7β-hydroxykauran-16-en-15-one và ent-1α-acetoxy-7β,14α-dihydroxy

kauran-16-en-15-one từ cây Khổ sâm Croton tonkinensis Gagnep, kết quả đánh giá

hoạt tính cho thấy cả ba chất thể hiện hoạt tính ức chế NF-B [4] và gây độc tế bào

mạnh trên các dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, LU và Fl.

Hai hợp chất 10-methoxy-normacusin-B và 10-methoxy-affinisin-N(4)-oxid từ

cây dừa cạn Catharanthus roseus thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với

dòng tế bào ung thư gan Hep-G2. Cũng từ đối tượng cây Dừa cạn, hai hợp chất

vindolin và catharanthin được phân lập và các nhà khoa học ở Viện Hoá học Công

6

nghiệp đã tiến hành tổng hợp vinblastin sunfat và vincristin sunfat làm thuốc chữa

ung thư máu. Nghiên cứu công nghệ chiết tách zerumbon từ cây Gừng gió làm

thuốc chống ung thư cũng đã được đưa vào thực hiện tại chương trình hóa dược

quốc gia.

Andrographolide ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan (Hep-G2), được

chiết xuất từ cây Xuyên tâm liên Andrographis paniculata Needs, hiện nay quy

trình chiết xuất hợp chất này ở quy mô pilot đang được Nguyễn Thượng Dong và cs

(Viện Dược liệu) thực hiện.

Từ lá cây Taxus wallichiana Zucc đã phân lập được 7 taxoit và 1 biflavonoit

trong đó có 5 chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên dòng tế bào ung thư

gan người Hep-G2 là taxol, 7-xyloside-10-deacetyl taxol, 7-xyloside-10-deacetyl

taxol C, cephalomanine và sciadopitysin [5]. Trong khuôn khổ các đề tài cấp Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, GS.TSKH Trần Văn Sung và cs đã

nghiên cứu thành công quy trình công nghệ bán tổng hợp Taxol và Taxotere từ 10-

DAB III [6].

Hướng sàng lọc nhắm đích với các phép thử trên các enzym, protein hoặc yếu

tố nhân đã được các nhà khoa học tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam thực hiện trong khuôn khổ các đề tài hợp tác theo Nghị định thư giữa Chính

phủ Việt Nam và Hàn Quốc. Từ chương trình sàng lọc này đã phát hiện ra nhiều

chất có hoạt tính diệt tế bào ung thư như Atractylodin, Atractylodinol từ cây

Atractyloides lancea; Benzoic acid-2-methyl-benzylester từ Demos chinensis;

Malloapelta B-G từ cây Mallotus apelta; axit ursolic và axit betulic từ Liquidambar

formosana.

Điểm lại những nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy hầu hết các đối tượng nghiên

cứu theo hướng diệt tế bào ung thư đều có mặt tại vùng Lâm Đồng. Trong khu vực

này, theo các kết quả nghiên cứu của một số đề tài trước đây cho thấy sự có mặt của

các dược liệu như thông đỏ Taxus wallichiana Zucc, nhân sâm Panax vietnamensis,

dừa cạn Catharanthus roseus, Coptis japonica, Coscinium usitatum, Crinum

latifolium...

7

1.1.3. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của một

số loài thực vật (tương tự loài ở Lâm Đồng)

Một số loài thực vật có ở Lâm Đồng chưa được nghiên cứu về thành phần hóa

học như thảo nam sơn (Xantolis cambodiana) hoặc ít được nghiên cứu như thiên

niên kiện (Homalomena occulta), vấn vương (Galium aparine), nữ lang (Valeriana

hardwickii), thiên môn ráng (Asparagus finicinus), hoàng tinh (Polygonatum

punctatum)…

Từ loài hoàng tinh (Polygonatum punctatum) mới chỉ có 1 công bố của Yang

Q.X. và cs [7] đã phân lập được 4 hợp chất saponin steroid mới từ rễ là:

(3,23S,25R)-23-(-L-arabinopyranosyloxy)spirost-5-en-3-yl 4-O-(6-deoxy--L-

mannopyranosyl)-D-glucopyranoside, (3,23S,25R)-23-[(2-O-acetyl--L-arabino-

pyranosyl)oxy]spirost-5-en-3-yl 4-O-(6-deoxy--L-manno-pyranosyl)-D-glucopy-

ranoside, (3,23S,25R)-23-[(3-O-acetyl--L-arabinopyranosyl)oxy]spirost-5-en-3-

yl 4-O-(6-deoxy--L-manno pyranosyl)-D-glucopyranoside và (3,23S,25R)-23-

[(4-O-acetyl--L-arabinopyranosyl)oxy]spirost-5-en-3-yl 4-O-(6-deoxy--L-manno

-pyranosyl)-D-glucopyranoside. Các hợp chất này đều có hoạt tính gây độc tế bào

trên dòng tế bào HeLa.

Từ rễ của loài Thiên môn ráng (Asparagus finicinus) Wu J. J. và cs. [8] đã

phân lập được hai hợp chất spirostanoide mới filiasparosides E và filiasparosides F,

một furostanoside mới là filiasparoside G, 1 ecdysterone mới: stachysterone A-20,

22-acetonide, và 6 saponin steroid đã biết: asparagusin A, filiasparoside A,

filiasparoside B, aspafilioside A, aspafilioside B, filiasparoside C. Trong đó 3 hợp

chất aspafilioside A, aspafilioside B, filiasparoside C có hoạt tính gây độc tế bào

trên dòng MDA-MB-231 với IC50 3.4 - 6.6 M.

Qua các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, nguồn tài nguyên dược liệu của

Lâm Đồng mới chỉ được nghiên cứu một phần, còn rất nhiều loài chưa được nghiên

cứu về hóa học cũng như về hoạt tính sinh học ở trong nước và nước ngoài nên việc

tập trung sàng lọc theo định hướng hoạt tính sinh học để chọn lọc các loài có hoạt

tính cao tiến hành nghiên cứu sâu hơn về hóa học là cần thiết và có cơ sở.

8

1.2. Giới thiệu chung về chi Paramignya (Rutaceae):

1.2.1 Đặc điểm sinh học của chi Paramignya (Rutaceae):

Chi Cựa gà, Xáo (Paramignya Wight) của họ Cam (Rutaceae) được Robert

Wight đặt tên vào năm 1839 trong Illustrations of Indian Botany, vol 1, dựa trên

loài chuẩn là Paramignya monophylla Wight thu được ở Ấn Độ. Ông cho rằng đặc

tính “leo” (scandent) của chi này cho thấy nó gần gũi với chi Luvunga.

Theo các dữ liệu thực vật học do nhiều tổ chức nghiên cứu và các nhà thực vật

của Vườn Thực vật Hoàng gia Kew (Anh Quốc) và Vườn Thực vật Missouri (Hoa

Kỳ), đến năm 2013, có 30 loài được cho là thuộc chi Paramignya đã được đề cập

đến trong các tài liệu khác nhau gồm:

Paramignya andamanica Tanaka

Paramignya angulata Kurz

Paramignya armata Oliv.

Paramignya beddomei Tanaka

Paramignya blumei Hassk.

Paramignya brassii C.T.White

Paramignya citrifolia Hook.f.

Paramignya citrifolia Oliv.

Paramignya confertifolia Swingle

Paramignya cuspidata (Ridl.) Burkill

Paramignya dubia Koord. & Valeton ex Moll & Janssonius

Paramignya glabra Tanaka

Paramignya grandiflora Oliv.

Paramignya griffithii Hook.f.

Paramignya hainanensis Swingle

Paramignya hispida Pierre ex Guillaumin

Paramignya littoralis Miq.

Paramignya lobata Burkill

Paramignya longipedunculata Merr.

Paramignya longispina Hook.f.

9

Paramignya micrantha Kurz

Paramignya mindanaensis Merr.

Paramignya missionis (Oliv.) Burkill

Paramignya monophylla Wight

Paramignya petelotii Guillaumin

Paramignya rectispinosa Craib

Paramignya ridleyi Burkill

Paramignya scandens Craib

Paramignya surasiana Craib

Paramignya trimera (Oliv.) Burkill

Thực tế, tình trạng phân loại chi Paramignya chưa được thống nhất giữa các

nhà phân loại học thực vật. Gần đây, Zhang D. X. [9] cho rằng chi Paramignya có

khoảng 15 loài và phân bố ở Nam Á, Đông Nam Á và miền Bắc nước Úc.

Ở Việt Nam, theo các tài liệu đã công bố cho thấy có 7 loài thuộc chi

Paramignya [10], bao gồm:

Paramignya armata Oliv. var. andamanica King, 1874 [11] - Cựa gà, Gai

xanh, Quýt gai.

Mọc ở Đà Nẵng, Khánh Hòa và được trồng ở Nam bộ. Đây là loại cây nhỡ leo

cao 1-4 m hay hơn, có nhánh vàng vàng, ở nách lá có gai ngắn, cong ra phía sau, dài

6-12 mm. Lá dạng màng, dai, nguyên, hình bầu dục hay thuôn, tròn ở gốc, tận cùng

là một mũi nhọn hình tam giác nhọn, nhẳn, dài 7,5-12,5 cm, rộng 3,5-4,5 cm, có

cuống ngắn. Hoa xếp 1-2 cái ở nách các lá. Quả đen hay vàng, hình cầu, mang bởi

một cuống dài 3-3,5 cm, có 6 thùy. Mọc theo bụi hoặc gỗ leo, cao 1-10m. Ra hoa

tháng 8. Quả ăn được. Lá và quả đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho…[12].

Paramignya griffithii Hook. F, 1875 [11]- Xáo griffith.

Phân bố ở Lâm Đồng, Khánh Hòa. Là tiểu mộc leo, có gai cong, cành mảnh.

Lá có phiến bầu dục vào 6x3 cm, rộng ở nửa trên, mỏng. Hai mặt nâu lợt lúc khô,

gân phụ 5-7 cặp. Cuống dài 6-10 mm. Hoa 1-3 ở nách lá, dài 5 mm, cọng mảnh; đài

10

hình đĩa, tiểu nhụy 6-10, rời nhau chỉ ngắn hơn bao phấn; noãn sào có lông. Trái

xanh tròn to 1 cm, thịt quả nhớt. Mọc dạng bụi leo.

Paramignya hispida Pierre ex Guillaum, - Cựa gà nhám.

Phân bố ở Nghệ An, Quảng Trị, Đồng Nai [10]. Là dạng tiểu mộc leo, có gai

cong xuống, dài đến 1 cm; nhánh mảnh, lúc non có lông. Lá có phiến to 6-10x2-4

cm, xoan tròn dài, đáy hình tim; gân phụ không rõ, tuyến nhỏ, nhiều; cuống có lông,

dài 2 cm. Hoa cô độc, cọng dài 5-6 mm; lá đài 5, có lông mặt ngoài; cánh hoa cao 1

cm; tiểu nhụy 10, rời nhau; đĩa mật làm thành thư đài; noãn sào tròn, không lông,

buồng 5, 2 noãn. Trái nhỏ [11]. Dạng sống và sinh thái: Bụi leo [10].

Paramignya monophylla Wight, 1840 [11], - Xáo một hoa.

Phân bố ở Hà Tây (Ba Vì). Là cây tiểu mộc leo, có gai cong cong. Lá xoan

thon, to vào 6-7x2,5 cm, đầu thon, đáy tà, gân rất mảnh, có tuyến thấy rõ ở mặt

dưới; cuống dài 1 cm, hoa 1-2 ở nách lá, cọng ngắn; đài 4 mm,cánh hoa dài 13mm,

bầu dục hẹp. In vitro, chống siêu khuẩn R.D [11]. Dạng sống và sinh thái: Bụi leo

[10].

Paramignya petelotii Guillaum, 1944 [11] - Xáo petelot.

Mọc ở Hòa Bình (Mai Châu). Dạng tiểu mộc leo; cành già xám, bì khẩu nhỏ,

nhiều, trăng trắng; gai nhỏ, cong cong. Lá có phiến bầu dục tròn dài, to 10x5 cm,

mỏng, lục tươi lúc khô, gân phụ mảnh, vào 10 cặp, cuống 5-10 mm. Hoa ở nách lá,

dài 15 mm; đài cao 5-6mm; cánh hoa hẹp; tiểu nhụy 10, dài bằng cánh hoa; dĩa mật;

noãn sào có lông, 5 buồng. Dạng sống và si

nh thái: Bụi leo, cành già màu xám [10].

Paramignya scandens (Griff.) Craib, 1926 [11] - Xáo leo.

Phân bố ở Hà Nam, Quảng Trị, Lâm Đồng. Là dạng tiểu mộc leo; cánh non có

lông mịn, nâu; gai nhỏ cong, có lông. Lá có phiến bầu dục, vào 7x3,5 cm, đầu tà

hay có đuôi ngắn, đáy tròn, gân-phụ 9-11 cặp; cuống 4-6 mm, có lông mịn. Hoa

thường 1 ở nách lá, cọng 1 cm; lá dài nhỏ, rìa lông; cánh hoa dài 7 mm; tiểu nhụy

10, bằng nhau, chi có lông; noãn sào có lông. Trái không lông, xoan, dài đến 1,5

cm. Dạng sống và sinh thái: Bụi leo, cành non có lông màu nâu [10].

11

Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum., 1946 [11] - Xáo tam phân.

Mọc ở núi Lấp Vò (Tây Ninh) [10]. Là dạng cây có gai dài, hơi cong xuống;

cành không lông. Lá có phiến tròn dài hẹp, bề ngang 1-1,5 cm, lúc khô hai mặt nâu,

bìa uống xuống, gân phụ 8- 10 cặp, cuống ngắn 2-3 mm. Chùm ở nách gai; cọng

hoa 2 mm; đài ba răng, cánh hoa 3, dài 4 mm; tiểu nhụy 3, rời nhau noãn sào 3

buồng 1 noãn, trái tròn to 15 mm. Sống theo dạng bụi leo.

Như vậy theo mô tả, chi Paramignya có dạng cây tiểu mộc leo, gai dài cong,

phân bố chủ yếu ở vùng trung trung bộ của Việt Nam. Tuy nhiên một số loài như

xáo tam phân còn tìm thấy ở những nơi khác như Khánh Hòa và loài Xáo leo đã

được tìm thấy ở Lâm Đồng.

1.2.2 Hoạt tính sinh học của chi Paramignya (Rutaceae):

Hiện nay chưa có nhiều các công trình nghiên cứu công bố về các loài thuộc

chi Paramignya. Một số nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy, thành phần hóa học

chính là các hợp chất flavonoit, coumarin và triterpen dạng khung tirucallan.

1.2.2.1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoit

Flavonoit là một nhóm hợp chất rất thường gặp trong thực vật, có mặt trong

hầu hết các bộ phận của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa, tạo cho hoa

những màu sắc rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây.

Trong cây, flavonoit giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn axit ascorbic

trong tế bào, ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn

trùng,…), một số còn có tác dụng điều hoà sự sinh trưởng của cây cối. Flavonoit

cũng là một nhóm hoạt chất lớn trong dược liệu có nhiều tác dụng sinh học do:

- Các dẫn chất flavonoit có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO..

Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA

thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung

thư, tăng nhanh sự lão hoá.

- Flavonoit tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này

là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hoá. Các flavonoit có 3,5,3',4'-hydroxy có khả

http://hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-hien-dai/nhien-lieu-sinh-hoc.html

12

năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonyl hoặc

3',4'-orthodioxyphenol.

- Thành phần của màng tế bào có các chất lipit dễ bị peroxit hoá, tạo ra những

sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự huỷ hoại tế bào. Ðưa các

chất chống oxy hoá như flavonoit vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa

các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, tổn thương do bức xạ,

thoái hoá gan...

- Flavonoit cùng với axit ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của

enzym oxy hoá - khử. Flavonoit còn ức chế tác động của hyaluronidase. Enzym này

làm tăng tính thấm của mao mạch. Khi enzym này thừa thì gây hiện tượng xuất

huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P (P avitaminose). Các chế phẩm

chứa flavonoit chiết từ các loài Citrus như "Cemaflavone", "Circularine"...,

flavonoit từ lá bạc hà (diosmin) như "Daflon", "Diosmil", flavonoid từ hoa hoè

(rutin) với nhiều biệt dược khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch,

làm giảm tính "dòn" và tính thấm của mao mạch. Tác dụng này được tăng cường

khi có mặt axit ascorbic. Flavonoit được dùng trong các trường hợp rối loạn chức

năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng

trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần

hoàn võng mạc. Các dẫn chất anthocyanozit có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và

đã được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm.

- Tác dụng chống độc của flavonoit thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ

được chức năng gan khi một số chất độc được đưa vào cơ thể súc vật thí nghiệm

(CCl4, benzen, ethanol, CHCl3, quinin, novarsenol...). Dưới tác dụng của flavonoit

ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng. Sự tích lũy

glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan.

Việc sử dụng một số dược liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào

gan rất hiệu quả như: cây actisô, có biệt dược là Chophytol. Cây Silibum marianum

Gaertn có biệt dược "Legalon"; cây bụt dấm - Hibiscus sabdariffa…

13

- Tác dụng kích thích tiết mật thể hiện ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon,

flavonol và flavan-3-ol.

- Flavonoit thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật,

ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Ví dụ apigenin có tác dụng làm

giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, acetylcholin, seretonin.

- Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoit thuộc nhóm flavon, flavanon, flavonol

thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt. Scoparoside trong Sarothamnus scoparius,

lespecapitosid trong Lespedeza capitata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoit của

cây râu mèo đều có tác dụng thông tiểu.

- Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycoside của rễ cam thảo đã

được ứng dụng để chữa đau dạ dày. Một số dẫn chất khác như catechin, 3-O-methyl

catechin, naringenin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét.

- Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoit thuộc các nhóm flavon, flavanon,

dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, isoflavon, biflavon, 4-aryl

coumarin, 4-aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất

flavonoit này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin.

Người ta đã sử dụng rutin, citrin, leucodelphinidin, quercetin, catechin để điều

trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị.

- Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoit thuộc nhóm flavonol, flavan-3-ol,

anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelargonin, hỗn hợp catechin của trà có

tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim, thí nghiệm làm hồi

phục tim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, methanol, bình thường lại sự rối loạn

nhịp.

Cao chiết từ lá cây bạch quả - Ginko biloba chứa các dẫn chất 3-rutinoside của

kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và

isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược ví dụ

"Ginkogink", "Tanakan" có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh

mạch và mao mạch. Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trí

nhớ, khả năng làm việc bằng trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt.

14

- Trên hệ thần kinh, một số C-flavon glycoside của hạt táo - Ziziphus vulgaris

var. spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác

dụng an thần rõ rệt.

- Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất

như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của

một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O--D-

galactopyranoside.

- Các dẫn chất thuộc nhóm isoflavonoid có tác dụng estrogen ví dụ genistein

(5,7,4' trihydroxyisoflavon), daizein (7,4' dihydroxyisoflavon). Tác dụng này được

giải thích do sự gần nhau về cấu trúc với diethylstilboestrol.

- Một số flavonoid khác thuộc nhóm rotenoit như chất rotenon có trong dây

mật - Derris elliptica Benth thì tác dụng diệt côn trùng đã được biết và đã được ứng

dụng từ lâu.

1.2.2.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất coumarin

Tác dụng đáng chú ý của các dẫn chất coumarin là chống co thắt, làm giãn nở

động mạch vành mà cơ chế tác dụng tương tự như papaverin. Hàng loạt các chất

coumarin tự nhiên cũng như tổng hợp đã được thí nghiệm. Người ta nhận thấy rằng

đối với coumarin nhóm 1 nếu OH ở C-7 đuợc acyl hóa thì tác dụng chống co thắt

tăng, gốc acyl có 2 đơn vị isopren (ví dụ geranyloxy) thì tác dụng tốt nhất. Ðối với

nhóm psoralen, nếu nhóm hydroxy, methoxy hay isopentenyloxy ở vị trí C-5 hay C-

8 thì tăng tác dụng. Ðối với nhóm angelicin, nếu có methoxy ở C-5 hay C-5 và C-6

cũng tăng tác dụng. Những dẫn chất acyldihydrofuranocoumarin và

acyldihydropyranocoumarin thì tác dụng chống co thắt rất tốt, nhóm acyl ở đây tốt

nhất là có 5 carbon nếu kéo dài mạch carbon thì tác dụng bị hạ thấp.

Một số dược liệu được ứng dụng để khai thác tác dụng nêu trên như: rễ Tiền

hồ - Peucedanum morisonii Bess, hạt cà rốt - Daucus sativus, Ammi visnaga (L.)

Lam.

Tác dụng chống đông máu của coumarin cũng được biết từ lâu. Nhưng chú ý

rằng tính chất này chỉ có đối với các chất có nhóm thế OH ở vị trí 4 và có sự sắp

15

xếp kép của phân tử, ví dụ chất dicoumarol lần đầu tiên được phát hiện khi chất này

sinh ra trong khi ủ đống các cây thuộc chi Melilotus và khi súc vật ăn thì bị bệnh

chảy máu do làm giảm sự tổng hợp prothrombin. Hiện nay dicoumarol được chế tạo

bằng con đường tổng hợp.

Tác dụng như vitamin P (làm bền và bảo vệ thành mạch), ví dụ bergapten,

aesculin, fraxin.

Tác dụng chữa bệnh bạch biến hay bệnh lang trắng và bệnh vẩy nến. Tính chất

này chỉ có ở những dẫn chất furanocoumarin như psoralen, angelicin, xanthotoxin,

imperatorin.

Tác dụng kháng khuẩn: Nhiều dẫn chất coumarin có tác dụng kháng khuẩn,

đặc biệt chất novobiocin là một chất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng có trong

nấm Streptomyces niveus.

Một số có tác dụng chống viêm, ví dụ calophyllolide có trong cây mù u -

Calophyllum inophyllum có tác dụng chống viêm bằng 1/3 oxyphenbutazon còn các

chất calanolide là các dẫn chất coumarin có trong cây mù u - Calophyllum

lanigerum thì gần đây được phát hiện thấy có tác dụng ức chế HIV.

Ta cũng cần chú ý rằng các chất aflatoxin là những coumarin độc có trong

mốc Aspergillus flavus có thể gây ung thư.

1.2.2.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất triterpen dạng khung

tirucallan

Từ lá cây Aquilaria sinensis các nhà khoa học Hàn Quốc đã tách được hai

hợp chất mới aquilacallane A-B có hoạt tính kháng trên cả 5 dòng tế bào ung thư

người gồm: ung thư bạch cầu (myeloid leukemia) (HL-60), ung thư biểu mô tế bào

gan (hepatocellular carcinoma) (SMMC-7721), ung thư tuyến tụy (pancreatic

cancer) (PANC-1), ung thư phổi (lung cancer) (A-549) và ung thư ruột kết (colon

cancer) (SW-480)[13].

Những hợp chất triterpen tirucallan được tách từ trái của cây Melia azedarach

như 3--tigloylmelianol, melianone, 21--acetoxy-melianone, methyl kulonate có

hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư phổi A549 [14].

16

Các hợp chất triterpen tirucallan của cây Amoora dasyclada cũng được thử

nghiệm cho thấy có hoạt tính kháng hai dòng tế bào ung thư phổi AGZY 83-a

(human lung cancer cells) và ung thư gan SMMC-7721 (human liver cancer cells)

[15].

Ba hợp chất triterpen tirucallan, brumollisols A-C, với 5 dạng đồng phân

(23R,24S)-23,24,25-trihydroxytirucall-7-ene-3,6-dione, piscidinol A, 24-

epipiscidinol A, 21α-methylmelianodiol và 21β-methylmelianodiol được tách từ

dịch chiết MeOH của rễ cây Brucea mollis. Trong thử nghiệm in vitro, hợp chất 24-

epipiscidinol A có hoạt tính gây độc tế bào khá mạnh kháng lại dòng tế bào ung thư

phổi A549 và dòng BGC-823 với giá trị IC50 tương ứng 1,16 và 3,01 μM [16].

Bốn triterpen tirucallan được tách từ vỏ rễ cây Dysoxylum binectariferum có

hoạt tính kháng viêm và kháng 8 dòng tế bào ung thư. Đặc biệt là ung thư gan

HepG2 với giá trị IC50 là 7.5–9.5 μM [17].

1.2.2.4. Hoạt tính sinh học của chi Paramignya

Hầu hết dược tính của chi Paramignya được biết đến thông qua các nghiên

cứu trên loài Paramignya monophylla vốn được biết là loài cây thuốc được sử dụng

trong dân gian ở nhiều nước châu Á [18].

Jayaweera (1982) đề cập đến loài P. monophylla như một loại thuốc bổ, lá

được nghiền sơ dùng đắp bên ngoài vết thương do rắn cắn và dùng cho vật nuôi ăn

khi bị chứng huyết niệu hoặc mất máu từ bụng [19].

Nghiên cứu của Kumar và cộng sự (1998) cho thấy trong vỏ rễ của loài này có

chứa các chất 5-methoxy-8,8-dimethyl-10-(7-hydroxy-3,7-dimethylocta-1,5-dien-3-

yl) pyranocoumarin và 5-hydroxy-8,8-dimethyl-10-(7-hydroxy-3,7-dimethyl octa-

1,5-dien-3-yl) pyranocoumarin [18]. Các hợp chất này thuộc nhóm coumarin

(những dẫn chất α- pyron có cấu trúc C6-C3) và nhóm hợp chất này có những hoạt

tính sinh học giá trị như đã nói ở trên. Niyaz (1995) khi nghiên cứu các hợp chất

hóa học của P. monophylla đã phân lập được một số hợp chất coumarin như

poncitrin, nordentatin, 5-hydroxy- và 5-methoxy-8,8-dimethyl-10-(3',7'-

dimethylocta-1',6'-dien-3'-yl)-2H,8H-benzo[1,2-b: 5,4-b']dipyran-2-one [20]. Ngoài

17

ra, quả của P. monophylla chứa flindissone, deoxyfiindissone và 4 hợp chất

tirucalladiene như 3-oxotirucalla-7,24-dien-23-ol, 3-oxotirucalla-7,24-diene-21,23-

diol cũng như dẫn xuất 3β-hydroxy của chúng nên cũng cho thấy hoạt tính sinh học

khá lý thú của loài này [21].

Wattanapiromsakul et al. (2000) khi nghiên cứu vỏ thân cây P. griffithii ở Thái

Lan đã phân lập được 5 hợp chất là: Amoradicin, 3’,4’-Dihydroxy-7-methoxy-8-(3-

methylbut-2-enyl)-furano (4”,5”:6,5)-flavanone, 3’,4’-Dihydroxy-7-methoxy-8-(3-

methylbut-2-enyl)-2’”-(1-hydroxy-1-methylethyl)-furano-(4”, 5”: 6, 5)-flavanone,

3-Oxo-tirucalla-7,24-diene-21-al, 6-(2-Hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzo-

pyran [22].

Ngoài ra, Wiart (2006) đề cập P. scandens có khả năng sinh tổng hợp các

prenylated flavanone như amoradicin. Cho đến nay, tính chất dược lý của nó vẫn

chưa được làm rõ. Tuy nhiên, flavonoid nói chung có khả năng kháng khuẩn hoặc

gây độc tế bào (cytotoxic). Ở Malaysia, rễ của loài này sắc uống có tác dụng làm

giảm đau bụng dưới, còn toàn bộ cây sắc uống để trị bệnh giang mai [23].

Theo Phạm Hoàng Hộ (2005), các loài thuộc chi Paramignya ở Việt Nam

được dùng trong y học cổ truyền như sau:

Paramignya armata Oliv. var. andamanica King - Cựa gà, Gai xanh, Quýt

gai. Lá và quả đun sôi uống chữa viêm phế quản, ho…[12]

Paramignya monophylla Wight - Xáo một hoa., chống siêu khuẩn R.D in

vitro, trị bạch đái hạ [11].

Với cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum.), Viện Dược

liệu (2012) đã phân tích bước đầu và thông báo cho thấy loài P. trimera có các

thành phần flavonoid, saponin, alkaloid và chủ yếu là coumarin và triterpenoid. Các

thí nghiệm cho thấy Xáo tam phân có tác dụng ức chế tốt viêm gan cấp ở thí nghiệm

trên chuột nhắt trắng; ức chế, tiêu diệt đối với 5 dòng tế bào ung thư: ung thư gan

Hep-G2, ung thư đại tràng HTC116, ung thư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng

OVCAR-8 và ung thư cổ tử cung Hela (mạnh nhất với ung thư gan Hep-G2 và ung

18

thư cổ tử cung). Thí nghiệm cũng cho thấy với độc tính thấp, Xáo tam phân khá an

toàn khi sử dụng [24].

1.3. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paramignya (Rutaceae)

1.3.1. Tổng quan các kết quả trong và ngoài nước

1.3.1.1. Các công trình đã công bố trên thế giới

Theo các tài liệu nghiên cứu trên thế giới chi Paramignya có 30 loài, tuy nhiên

các công trình công bố trên thế giới chỉ mới tập trung trên 2 loài

Paramignya griffithii Hook.f. và Paramignya monophylla Wight. Hiện nay chưa có

nhiều các công trình nghiên cứu được công bố về các loài thuộc chi Paramignya.

Một số nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy, thành phần hóa học chính là các hợp

chất flavonoid, coumarin và triterpen dạng khung tirucallan.

Kumar V. và cộng sự [21] đã phân lập từ quả của loài Paramignya

monophylla các hợp chất flindissone, deoxyflindissone và bốn hợp chất

tirucalladiene: 3-oxotirucalla-7,24-dien-23-ol, tirucalla-7,24-dien-3,23-diol, 3-

oxotirucalla-7,24-diene-21,23-diol, tirucalla-7,24-dien-3,21,23-triol.

O

O

OH

O

O

Flindissone Deoxyflindissone

O

OH

OH

OH

3-oxo-tirucalla-7,24-dien-23-ol Tirucalla-7,24-dien-3,23-diol

19

O

OH

OH

OH

OH

OH

3-oxo-tirucalla-7,24-dien-21,23-diol Tirucalla-7,24-dien-3,21,23-triol

Từ vỏ cây Paramignya monophylla, Kumar và cộng sự [20] đã phân lập các

hợp chất sitosterol, poncitrin (dentatin), nordentatin, hai hợp chất nhóm coumarin là

5-hydroxy-8,8-dimethyl-10-(3',7'-dimethyocta-l',6'-dien-3'-yl)pyranocoumarin và 5-

methoxy-8,8-dimethyl-10-(3',7'-dimethylocta-l',6'-dien-3’-yl)pyranocoumarin.

O O O

OCH3

O O O

OH

Poncitrin Nordentatin

O O O

OH

CH3 CH3

O O O

OCH3

CH3 CH3

5-methoxy-8,8-dimethyl-10-

(3',7'-dimethyocta-l',6'-dien-3'-

yl)pyranocoumarin

5-hydroxy-8,8-dimethyl-10-

(3',7'-dimethyocta-l',6'-dien-3'-

yl)pyranocoumarin

20

Kumar và cộng sự [18] đã phân lập từ vỏ rễ cây Paramignya monophylla hợp

chất xanthyletin, hai hợp chất coumarin 5-methoxy-8,8-dimethyl-10-(7-hydroxy-

3,7-dimethylocta-1,5-dien-3-yl)pyranocoumarin và 5-hydroxy-8,8-dimethyl-10-(7-

hydroxy-3,7-dimethylocta-1,5dien-3-yl) pyranocoumarin.

O O O

Xanthyletin

O O O

OCH3

OH

O O O

OH

OH

Chatchai W. và cộng sự [22] đã phân lập từ vỏ cây Paramignya griffithii năm

hợp chất bao gồm: Amoradicin, 3’,4’-dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methylbut-2-

enyl)-furano(4’’,5’’:6,5)-flavanone, 3’,4’-dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methylbut-2-

enyl)-2’’-(1-hydroxy-1-methylethyl)-furano(4’’,5’’:6,5)-flavanone, 3-oxo-tirucalla-

7,24-diene-21-al, 6-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran.

O

CH2OH

6-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran

5-hydroxy-8,8-dimethyl-10-(7-

hydroxy-3,7-dimethylocta-

1,5dien-3-yl)pyranocoumarin

5-methoxy-8,8-dimethyl-10-(7-

hydroxy-3,7-dimethylocta-1,5-

dien-3-yl)pyranocoumarin

21

O

O

OH

OH

OH

H3CO

O

OHC CH3

CH3

Amoradicin 3-oxo-tirucalla-7,24-diene-21-al

O

O

OH

OH

H3CO

O

O

O

OH

OH

H3CO

O

OH

Như vậy, có thể thấy các loài thuộc chi Paramignya đều có chứa các hợp chất

thuộc khung tirucallan. Đây là nhóm các hoạt chất có phổ hoạt tính sinh học tương

đối đa dạng cần được nghiên cứu.

1.3.1.2. Các công trình đã công bố trong nước:

Ở Việt Nam, chi Cựa gà (Paramignya Wight) thuộc họ Cam quýt (Rutaceae)

phân bố nhiều ở khu vực miền Trung, Trung bộ. Theo Phạm Hoàng Hộ [11] ở nước

ta chi Paramignya có 7 loài:

Paramignya armata Oliv. var. andamanica King. (Cựa gà, Gai xanh, Quýt

gai).

Paramignya griffithii Hook. F. (Xáo griffith).

Paramignya hispida Pierre ex Guillaum (Cựa gà nhám).

Paramignya monophylla Wight (Xáo một hoa).

3’,4’-dihydroxy-7-methoxy-8-

(3-methylbut-2-enyl)-2’’-(1-

hydroxy-1-methylethyl)-furano

(4’’,5’’:6,5)-flavanone

3’,4’-dihydroxy-7-methoxy-8-

(3-methylbut-2-enyl)-

furano(4’’,5’’:6,5)-flavanone

22

Paramignya petelotii Guillaum. (Xáo petelot).

Paramignya scandens (Griff.) Craib. (Xáo leo).

Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum (Xáo tam phân).

Các nghiên cứu về hóa học của các loài trên ở nước ta trong thời gian trước

còn rất hạn chế, chỉ trong những năm gần đây, do xuất hiện thông tin về khả năng

trị bệnh ung thư và một số bệnh khác từ cây xáo tam phân (Paramignya trimera

(Oliv.) Guillaum) nên loài này mới bắt đầu được nghiên cứu về hóa học, hoạt tính

sinh học, dược học tại Viện Dược liệu, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên…

Loài xáo tam phân là cây gỗ nhỏ, dạng dây trườn, vỏ màu nâu vàng; thân dài

trên 4 m; đường kính khoảng 10 cm; gỗ hơi cứng có màu vàng, phần rễ có màu

vàng đậm hơn. Thân và cành có nhiều gai nhọn, dài đến 7-8 cm. Lá đơn, mọc cách

hay chụm ba; phiến dày, mép cong xuống dưới, có hình thuôn hẹp, dài 8-12 cm,

rộng 1-3 cm; lá mọc ở gần gốc có phiến kích thước lớn hơn so với lá ở đoạn trên

thân và cành; đầu lá tù hoặc hơi lõm. Phiến lá có mặt trên xanh đậm, mặt dưới nhạt

hơn; bên trong có nhiều điểm dầu. Cuống lá ngắn khoảng 4-6 mm. Các bộ phận của

cây có tinh dầu, nhiều nhất ở rễ, có mùi thơm dịu rất đặc trưng. P. trimera đã được

phát hiện ở Bình Dương, Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận. Gần đây khi thực hiện

đề tài TN3/T14, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên cũng đã phát hiện loài này

ở tỉnh Lâm Đồng.

Các công bố gần đây cho thấy xáo tam phân có chứa các hợp chất thuộc nhóm

flavonoid, saponin, alcaloid và chủ yếu là coumarin và triterpenoid.

Từ rễ của P. trimera đã phân lập được 3 hợp chất coumarin là: Ostruthin, 8-

methoxyostruthin, xanthyletin cùng với hai hợp chất acridon alcaloid là oriciacridon

và citrusinin-I [25],[26],[27].

O OOH

CH3

CH3 CH3

Ostruthin

23

1.4. Các hợp chất Tirucallan [28],[29],[30],[31],[32]

Các hợp chất triterpenoid rất phổ biến và đa dạng trong các sản phẩm tự nhiên,

cấu trúc hóa học của chúng có thể xem như là dẫn xuất của squalene hoặc 3-

hydroxytriterpenoid, hay đồng phân 3S- của squalene 2,3-epoxide. Khi tiến hành

vòng hóa trans-squalene 2,3-epoxide tùy thuộc vào cấu hình mà tạo nên các dạng

cation trung gian khác nhau, chẳng hạn khi vòng hóa theo cấu hình ghế – thuyền –

ghế - thuyền sẽ tạo nên cation protostane; còn khi vòng hóa theo cấu hình ghế - ghế

- ghế - thuyền thì tạo ra cation dammarane. Các cation trung gian này sau đó sẽ

được sắp xếp lại cấu trúc để tạo ra nhiều khung cơ bản khác nhau của nhóm

triterpenoid.

CH3

Squalene

Squalene 2,3-epoxide

3019

29 28

H18

H

3019

28

H18

H

Protostane Fusidane

24

19

29 28

30

18

H 19

29 28

18

H

30

H

Lanostane Dammarane

19

29 28

30

18

H

20

H

19

29 28

30

18

H

20

22

23

24

25

26

27

21

H

Euphane Tirucallan

Quá trình chuyển vị cation dammarane trung gian tạo nên khung euphane và

tirucallan (là đồng phân cấu hình ở vị trí 20 của euphane). Do cấu trúc khung của

chúng gần tương tự nhau nên tirucallan cũng còn được gọi là 13,14,17,20S-

lanostane.

1.4.1. Phổ 1H-NMR của các hợp chất tirucallan

Do đặc điểm của khung tirucallan có chứa 7 nhóm methyl bậc 3 ở các vị trí:

18, 19, 26, 27, 28, 29, 30 và 1 nhóm methyl bậc hai ở vị trí 21 nên tín hiệu của các

nhóm methyl bậc 3 xuất hiện ở dạng singlet và nhóm methyl ở vị trí 21 xuất hiện ở

dạng doublet với hằng số ghép đôi trong khoảng 5,5 – 6,5 Hz phụ thuộc vào các

nhóm chức ở các vị trí 22, 23.

Thường trong cấu trúc của các hợp chất tirucallan có liên kết đôi C7=C8 nên

tín hiệu của proton ở C7 thường ở dạng doublet với hằng số ghép đôi khá nhỏ 3-4

Hz.

25

Bảng 1.1. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) của hợp chất 1-3

Vị trí H dạng pic

1 2 3

7 5,24 (1H, br s) 5,25 (d, J = 3,1 Hz) 5,23 (d, J = 3,2 Hz)

18 0,83 (3H, s) 0,79 s 0,79 s

19 0,72 (3H, s) 0,73 s 0,72 s

21 0,61 (3H, d, J = 6,6 Hz) 1,02 (d, J = 6,6 Hz) 0,84 (d, J = 5,9 Hz)

26 2,19 (3H, s) 1,22 s 1,30 s

27 1,95 (3H, s) 1,22 s 1,30 s

28 0,94 (3H, s) 0,95 s 0,94 s

29 0,83 (3H, s) 0,84 s 0,85 s

30 1,01 (3H, s) 0,97 s 0,94 s

Nhiều hợp chất tirucallan xuất hiện vòng 21,23-epoxy (vòng 5) dẫn đến độ

chuyển dịch của các proton H20H23 có sự thay đổi, còn các tín hiệu khác ít thay

đổi. Một dạng vòng 21,24-epoxy (vòng 6) khác cũng hay gặp trong quá trình phân

lập các hợp chất tự nhiên, khi đó độ dịch chuyển hóa học của các proton H20H24

có sự thay đổi nhiều.

26

6

Bảng 1.2. Một số dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 4-6

Vị trí H (CDCl3, 400 MHz) H (CDCl3, 500 MHz)

4 5 6

7 5,27 br s 5,23 br s 5,15 (br d 3,0)

18 0,85 s 0,86 s 0,77 s

19 0,78 s 0,77 s 0,66 s

20 1,96 m 2,15 m 2,01 m

21 4,71 br s 4,76 (d, J = 3,3 Hz) 5,25 (d, J = 2,2 Hz)

22 1,88 m 1,49 m 2,35 (dd, J = 16,6, 12,7 Hz)

2,23 (dd, J = 16,6, 5,0 Hz)

23 4,43 m 4,19 m

24 3,18 br d (J = 7,9 Hz) 3,22 d (J = 5,4 Hz) 3,96 s

26 1,28 s 1,27 s 1,14 s

27 1,28 s 1,30 s 1,10 s

28 0,94 s 0,93 s 0,79 s

29 0,92 s 0,91 s 0,80 s

30 1,00 s 0,98 s 0,88 s

Độ chuyển dịch hóa học của các proton khác phụ thuộc rất lớn vào các nhóm

chức gắn vào khung tirucallan cơ bản nên cần xác định rõ hơn khi sử dụng các kỹ

thuật phổ 2D NMR.

27

1.4.2. Phổ 13C-NMR của các hợp chất tirucallan

Tương tự như phân tích các đặc trưng chính của khung tirucallan, phổ 13C-

NMR xuất hiện các pic đặc trưng của 7 nhóm methyl bậc 3 ở các vị trí: 18, 19, 26,

27, 28, 29, 30 và 1 nhóm methyl bậc hai ở vị trí 21 với độ dịch chuyển hóa học khá

ổn định nên có thể dựa vào độ chuyển dịch hóa học của chúng để có thể dự đoán sơ

bộ khung tirucallan. Bên cạnh đó, do trong cấu trúc của các hợp chất tirucallan

thường có liên kết đôi C7=C8 và ít có nhóm chức ở các cacbon lân cận nên C7

117,5÷118,5 và C8 145÷146 ppm. Trong nhiều dẫn xuất từ khung tirucallan thì nối

đôi xuất hiện ở C8=C9 thay vì ở C7=C8 dẫn đến các độ dịch chuyển hóa học của các

cacbon methyl thay đổi và độ chuyển dịch hóa học của hai cacbon C8, C9 ở trong

vùng 133.2 – 134.5 ppm.

28

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Cây xáo leo có tên khoa học là Paramignya scandens (Griff.) Craib [11] thuộc

họ Cam quýt (Rutaceae).

Là dạng tiểu mộc leo; cành non có lông mịn, nâu; gai nhỏ cong, có lông. Lá có

phiến bầu dục, vào 7x3,5 cm, đầu tà hay có đuôi ngắn, đáy tròn, gân-phụ 9-11 cặp;

cuống 4-6 mm, có lông mịn. Hoa thường 1 ở nách lá, cọng 1 cm; lá dài nhỏ, rìa

lông; cánh hoa dài 7 mm; tiểu nhụy 10, bằng nhau, chi có lông; noãn sào có lông.

Trái không lông, xoan, dài đến 1,5 cm.

Dạng sống và sinh thái: Bụi leo, cành non có lông màu nâu [10].

Mẫu cây xáo leo - Paramignya scandens (Griff.) Craib, được thu thập tại Đà

Lạt, Lâm Đồng trong tháng 5 năm 2013. Tên khoa học được TS. Nông Văn Duy

giám định. Mẫu tiêu bản (số TN3/055) được lưu tại phòng mẫu của Viện Nghiên

cứu Khoa học Tây Nguyên.

Hình 2.1. Cây xáo leo - Paramignya scandens (Griff.) Craib

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai

29

bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được

phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G

F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng

254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4

10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng

chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết

tinh trong dung môi thích hợp.

2.2.3. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha

đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel

pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion

Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

2.3.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV)

Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện

tử của phân tử, sự hấp thụ ấy gây ra chuyển dịch các điện tử từ orbital ở trạng thái

cơ bản lên orbital có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích. Chỉ có môt số dạng

cấu trúc trong các hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên trên thực tế việc ứng

dụng phổ tử ngoại giới hạn trong một số hợp chất có cấu trúc nối đôi liên hợp.

2.3.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR)

Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ

10.000 đến 100 cm–1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử. Sự hấp thu ấy

có định lượng nhưng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành đường thẳng mà là các

dải hấp thụ với cường độ khác nhau, bởi vì sự biến đổi năng lượng dao động luôn đi

kèm với sự biến đổi của năng lượng quay. Như vậy, phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ

của 2 dạng năng lượng trong phân tử: năng lượng dao động và năng lượng quay.

Dựa vào sự hấp thu này, có thể chia phổ hồng ngoại thành 3 vùng:

30

Vùng sóng ngắn (4000-1300 cm-1) gọi là vùng các nhóm chức vì các băng hấp

thụ của các nhóm chức hữu cơ như OH, NH, CO... đều xuất hiện ở đây.

Vùng sóng dài (909-605 cm-1) đặc trưng cho các hấp thụ của dao động biến

dạng của vòng thơm và các hấp thụ biến dạng của CH ngoài mặt phẳng.

Vùng sóng trung bình (1300-909 cm-1) được gọi là vùng chỉ vân tay vì nó

được dùng để so sánh hình dạng các băng hấp thụ của các mẫu xem có đồng nhất

hay không về phương diện hóa học.

Phương pháp phân tích này cho ta xác định các nhóm chức, vòng benzen có

trong phân tử.

2.3.3. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Khi chúng ta đặt một chất có chứa nguyên tử 1H và 13C vào một từ trường rất

mạnh và đồng thời chiếu xạ nó với một năng lượng điện từ, những hạt nhân của các

nguyên tử đó có thể hấp thu năng lượng qua một quá trình gọi là cộng hưởng từ, sự

hấp thụ này được lượng tử hóa và cho ra một phổ đặc trưng của hợp chất.

Trong phân tử, các hạt nhân hydro ở trong những vùng có mật độ điện tử khác

nhau nên hấp thụ năng lượng ở từ trường có cường độ hơi khác nhau. Điều này dẫn

đến các tín hiệu ứng với các proton đó sẽ xuất hiện ở những vị trí khác nhau trên

phổ NMR. Ngoài ra còn có sự tương tác của từ trường của proton lân cận nhau gây

ra sự chẻ tín hiệu, vì vậy khi quan sát tín hiệu có các trường hợp chùm đôi 1:1

(doublet), chùm ba 1:3:3:1 (triplet), chùm bốn (quartlet), ...

Với phổ 13C-NMR, mỗi carbon trong một phân tử hữu cơ bình thường chỉ cho

một pic không có hiện tượng tương tác C-C làm chẻ tín hiệu thành nhiều pic.

Do vậy, khi nghiên cứu các kết quả phân tích của phổ này, cùng với các kỹ

thuật DEPT, COSY, HETCOR, HMBC, HSQC chúng tôi có thể xác định được số

lượng proton và carbon và vị trí của chúng trong phân tử.

2.3.4. Phương pháp khối phổ (MS)

Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng nhỏ chất thử,

phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương. Các mảnh ion này nhờ một bộ

phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với lượng khối

31

của mỗi ion, đó là khối phổ. Đa số ion phân tử (ion mẹ) bị phá rất nhanh từ 10-10

đến 10-3 giây để hình thành các mảnh ion mang điện dương, những ion này lại tiếp

tục bị phá thành những ion nhỏ hơn. Chỉ có một số ít ion phân tử chưa kịp bị bắn

phá di chuyển đến bộ phận tập hợp và thể hiện thành pic ion phân tử trên phổ, pic

này sẽ cho ta biết khối lượng phân tử của chất thử.

Giá trị lớn của khối phổ là việc ứng dụng các mảnh ion tạo nên để phân tích

cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, kết quả phân tích khối phổ cho chúng ta khối

lượng phân tử của hợp chất và cấu trúc sơ bộ của chúng.

2.3.5. Thiết bị phân tích

Phổ tử ngoại được ghi trên máy Agilent 8453 tại Viện Nghiên cứu Khoa học

Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ hồng ngoại được ghi bởi thiết bị JASCO FT-IR 4000 tại Viện Nghiên cứu

Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) với các kỹ thuật DEPT,

COSY, HMBC, HSQC được ghi trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội

TMS tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối được ghi trên máy Agilent 1260 series single quadrupole LC/MS tại

Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy MicroQ-TOF III

mass spectrometer tại Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.

2.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào

2.4.1. Mục tiêu và cơ sở lý thuyết

Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự phát

triển tế bào ung thư và không ung thư in vitro của các mẫu chiết, cũng như để kiểm

tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thư và không ung thư. Phép thử này

dựa vào khả năng SRB bám vào protein của tế bào đã được cố định bởi axit

trichloroaxetic (TCA). SRB là chất nhuộm aminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm

sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa amino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ,

32

và tách ra trong điều kiện kiềm. Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là

tương ứng với số lượng tế bào.

Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trên phiến vi

lượng 96 giếng. Phản ứng SRB được chứng minh là có tính ứng dụng bởi lớp tế bào

sau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài. Chất mầu

tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững. Với tính nhạy cao, sử dụng với phiến 96

giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sàng lọc lớn cũng

như trong nghiên cứu.

2.4.2. Vật liệu

Các dòng tế bào

Các dòng tế bào sử dụng trong thực nghiệm hoạt tính sinh học được lưu giữ tại

Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Hai dòng tế

bào đại diện để thử nghiệm hoạt tính của các mẫu chiết là:

Dòng RD: ung thư mô liên kết

Dòng Hep- G2: ung thư gan

Môi trường nuôi tế bào

Môi trường nuôi các dòng tế bào ung thư:

- Môi trường MEME (Minineal Essential Medium with Eagle’s salts), 7-10%

huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF (potassium penicillin - streptomycin -

fungizone), NAA (nonessential amino acid).

- Môi trường DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium),

10% huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF, NAA.

- Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penixilin/ml, 100 g streptomyxin

sunfat/ml, 0,25 g amphoterixin B/ml.

2.4.3. Phương pháp tiến hành

Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. Xác định hoạt tính gây độc các

dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs. đang được

tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Phương pháp này

33

đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên

nhiên áp dụng từ năm 1996. Phép xác định gồm hai bước như sau:

Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính

Chuẩn bị tế bào

- Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi

trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM.

- Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%; nhiệt

độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm tiến hành từ

18-24 giờ.

- Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào bằng

đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịch tế bào ở

nồng độ thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng loại tế bào thử

nghiệm).

Chuẩn bị mẫu thử

- Pha mẫu gốc (4 mg/mL) từ mẫu chiết thực vật trong dung môi dimethyl

sulphoxide (DMSO). Do DMSO biểu hiện độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa

loãng với môi trường ở nồng độ nhỏ.

Tiến hành thí nghiệm

- Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau:

+ Dãy đối chứng âm: DMSO 10%

+ Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (ellipithine

0,01mM trong DMSO)

+ Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào

- Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày.

Kết thúc thí nghiệm

- Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để

khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để loại

màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc ngang.

- Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515mm.

34

Tính kết quả

- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử,

mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính.

Giá trị CS(%) được tính theo công thức:

Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn

- Độ lệch σ được tính theo công thức:

Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i; : giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho thử

nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.

Bước 2: Tìm giá trị IC50

Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo

thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá

trị IC50. Các mẫu thô có giá trị IC50 ≤ 40 µg/ml được coi là có hoạt tính.

Các mẫu tinh có giá trị IC50 ≤ 20 µg/ml được coi là có hoạt tính.

2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kích hoạt enzym caspase 3/7

Được thực hiện dựa trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay

(Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Thực nghiệm được tiến hành tại

Phòng thử nghiệm Hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ sinh học.

Cho 50 µl hỗn dịch tế bào LU–1 ra đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào thích hợp.

Nồng độ tế bào được khuyến cáo sử dụng là 2.105 tế bào/ml.

Tiếp theo bổ sung 50 µl mẫu thử ở các nồng độ vào các giếng thí nghiệm, chất

đối chứng dương được sử dụng là Tamoxifen, đối chứng âm được bổ sung bằng 50

µl dung môi pha mẫu. Ủ mẫu 5h ở 37oC, 5% CO2.

35

Thêm 100 µl Apo-ONE® Caspase-3/7 Reagent cho tất cả các giếng thí

nghiệm. Để đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 1- 18 h. Đọc

kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader, đo cường độ huỳnh quang

(fluorescence – RFU) ở bước sóng: 485 ± 20 nm (excitation wavelength range) và

530 ± 25 nm (emission wavelength). Khả năng kích hoạt enzyme caspase 3 và 7 của

mẫu được đánh giá thông qua công thức:

Hoạt tính caspase (RFU) = Giá trị RFU của mẫu thử - Giá trị RFU của

đối chứng âm

2.6. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm:

2.6.1. Nuôi cấy tế bào

Tế bào đuôi gai từ tủy xương (BMDC) được phát triển từ chuột hoang dại

C57BL/6 của công ty Orient Bio Inc. như mô tả trong tài liệu [33]. Các quá trình

này được thực hiện theo hướng dẫn của Ban sử dụng và chăm sóc động vật của

Trường Đại học Quốc gia Jeju (Hàn Quốc) (#2010-0028). Trong một thời gian

ngắn, xương chày và xương đùi chuột được rửa với môi trường DMEM để thu được

các tế bào tủy xương. Các tế bào này được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640

chứa 10% huyết thanh bào thai bò (FBS; Gibco), 50 μM β-ME, 2 mM glutamin và

bổ sung 3% tế bào lai J558L chứa tác nhân kích thích bạch cầu hạt và đại thực bào.

Môi trường nuôi cấy được thay thế bởi môi trường mới hai ngày một lần. Vào ngày

thứ 6 của quá trình nuôi cấy, các tế bào không dính và các khối DC dính chặt với

nhau được thu, rửa và huyền phù lại trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 5%

FBS.

2.6.2. Đo Cytokine

BMDC được nuôi cấy trong đĩa 48 giếng 0,5 mL chứa 1×105 tế bào/giếng, và

xử lý với các hợp chất cần thử hoạt tính ở nồng độ xác định trong thời gian 1 giờ

trước khi được kích thích với 10 ng/mL LPS từ Salmonella minnesota (Alexis).

Dịch nổi được thu sau 18 giờ. Nồng độ TNF-α, IL-6, và IL-12 p40 của chuột được

xác định bằng cách đọc ELISA (BD PharMingen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình của ít nhất 3 lần lặp lại.

36

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Điều chế các dịch chiết từ Paramignya scandens:

Mẫu lá cây xáo leo P. scandens sau khi thu hái được tiến hành loại bỏ tạp bẩn,

phơi khô trong bóng râm và xay nhỏ thu được 2 kg bột khô. Bột này được tiến hành

ngâm với 5 lít MeOH và tiến hành chiết 3 lần trên thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 60

phút). Các dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp lại và cô quay đến khối lượng

không đổi trên thiết bị cô quay chân không thu được 200 g cặn chiết MeOH tổng.

Cặn này được hòa vào 2 lit nước cất và chiết phân bố lần lượt với n-hexan và

cloroform thu được các cặn chiết tương ứng PS-H (20g), PS-C (40g) và lớp nước

PS-W (hình 3.1).

Hình 3.1. Sơ đồ tạo các dịch chiết từ cây P. scandens

Cặn MeOH

200 g

Cặn hexan PS-H

20 g

Lớp nước

PS-W

Chiết phân bố Hexan/H2O

Cặn cloroform PS-C

40 g

Lớp nước

PS-W

Chiết phân bố CHCl3/H2O

37

3.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học dịch chiết

Cắn chiết MeOH tổng của cây xáo leo (P. scandens) đã được thử hoạt tính gây

độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 và RD. Kết quả thử hoạt tính được

trình bày trong bảng 3.1:

Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào

trên cao metanol toàn phần của cây Xáo leo

Mẫu Tỷ lệ (%) gây độc tế bào IC50 (g/ml)

Hep-G2 RD Hep-G2 RD

DMSO 100,0±0,0 100,0±0,0

Chứng (+) 0,2±0,0 2,5±0,2 0,23 0,19

Xáo leo (P. scandens) 6,1±0,9 23,8±0,06 6,45 13,88

Từ kết quả trên cho thấy cao metanol toàn phần của cây xáo leo có hoạt tính

kháng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro khá mạnh, đặc biệt trên dòng tế bào ung thư

gan Hep-G2.

3.3. Nghiên cứu hóa học cây P. scandens

3.3.1. Quy trình phân lập

Cặn chiết cloroform (40g) cho qua cột hấp phụ Silicagel dùng hệ dung môi

giải hấp CH2Cl2-MeOH tăng dần nồng độ MeOH từ 0 đến 100% cho 8 phân đoạn từ

C1-C8.

Phân đoạn C4 tiếp tục cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp

là MeOH-H2O=2/1 thu được 3 phân đoạn C4A (130 mg), C4B (400 mg), C4C (25

mg).

Phân đoạn C4B sau khi qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (2/1) thu

được các phân đoạn C4B1, C4B2, C4B3. Hợp chất PS01 (30 mg) được tinh chế từ

phân đoạn C4B3.

Từ phân đoạn C5 (4,7g) tiếp tục cho qua cột hấp phụ Silica gel dùng hệ dung

môi giải hấp CH2Cl2-MeOH gradient tỷ lệ tăng dần từ 25/1đến 0/100 cho 4 phân

đoạn từ C5A-C5D. Phân đoạn C5A (1,2 g) cho qua cột silica gel pha đảo với hệ

38

dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/1) thu được C5A2 tuy nhiên chất này trùng với

PS01. Phân đoạn C5B (2 g) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung

môi hexan-ethyl axetat (5/1) thu được 5 phân đoạn từ C5B1-C5B5. Phân đoạn

C5B1 (46 mg) cho qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (2/1) thu được

C5B1A (26 mg), tiếp tục qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là

MeOH-H2O (8/1) thu được hai chất PS15 (10 mg) và PS16 (5 mg). Tương tự hợp

chất PS18 (5 mg) thu được từ phân đoạn C5B5 (46 mg) sau khi qua cột silica gel

pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (15/1).

Phân đoạn C8 (2,5 g) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung

môi hexan-ethyl axetat (2/1) tiếp tục thu được 5 phân đoạn từ C8A-C8G. Phân

đoạn C8G (240 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi

CH2Cl2-MeOH (10/1) thu được hợp chất PS09 (4 mg).

Lớp nước được tiến hành phân tách thô trên cột sắc ký với chất nhồi là Diaion

HP-20 với hệ dung môi giải hấp tăng dần nồng độ MeOH trong nước cất (0%, 30%,

70% và 100%), loại bỏ phần rửa giải bằng nước 100% thu được ba phân đoạn ký

hiệu là W1-W3.

Phân đoạn W1 (9g) được phân tách thành 05 phân đoạn nhỏ ký hiệu là W1A-

W1E bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp bằng CHCl3/MeOH (20/1-0/1).

Phân đoạn W1B (350 mg) được cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung

môi giải hấp là MeOH-H2O (1/3) thu được 3 phân đoạn từ W1B1 - W1B3, phân

đoạn W1B3 (29 mg) tiếp tục cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung

môi CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS03 (6 mg).

Bằng phương pháp tương tự, phân đoạn W1C (1,3 g) được cho qua cột silica

gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH-H2O (1/4) thu được 4 phân đoạn từ

W1C1-W1C4, phân đoạn W1C2 (700 mg) tiếp tục cho qua cột Sephadex LH-20

MeOH-H2O (1/2) thu được 5 phân đoạn từ W1C2A-W1C2F, phân đoạn W1C2A

(85 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CHCl3/

MeOH/H2O (7/1/0,05) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS09 (5 mg). Từ phân

đoạn W1C2B (85 mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi

39

CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03) thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS02 (5 mg), hợp

chất PS05 (7mg) được tách từ phân đoạn W1C2C (120 mg) với hệ dung môi rửa

giải là CHCl3/MeOH/H2O (9/1/0,03). Hai hợp chất PS23, PS10 cũng được tách từ

hai phân đoạn W1C2D (95 mg) và W1C2F (90 mg) với hệ dung môi rửa giải là

CH2Cl2-MeOH (10/1).

Từ phân đoạn W1D (1,2 g), dùng cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải

hấp là MeOH- H2O (1/4) thu được 2 phân đoạn W1D1-W1D2, phân đoạn W1D1

(480 mg) qua cột Sephadex LH-20 với hệ MeOH-H2O (1/3) thu được W1D1A,

W1D1B, W1D1C. Từ phân đoạn W1D1B tiếp tục qua cột silica gel pha thường với

hệ dung môi giải hấp là CH2Cl2-MeOH (10/1) thu được hợp chất PS20 (4 mg).

Phân đoạn W2 được phân tách tiếp thành 08 phân đoạn nhỏ ký hiệu là W2A-

W2H bằng sắc ký cột silica gel pha thường sử dụng dung môi rửa giải tăng dần

nồng độ MeOH trong diclorometan (1/20-1/0). Tinh chế phân đoạn W2C (1g) bằng

sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp với sắc ký rây phân tử sử dụng sephadex

LH-20 thu được hợp chất sạch ký hiệu là PS18 (3 mg). Tương tự, phân đoạn W2D

(1,8 g) cho qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải hấp là MeOH- H2O (1/3)

thu được 8 phân đoạn từ W2D1-W2D8, phân đoạn W2D3 (120mg) cho qua cột

silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (7/1) thu được hợp

chất sạch ký hiệu là PS13 (6 mg), tương tự hợp chất PS21 (2 mg) được tinh chế từ

phân đoạn W2D4 bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi

CH2Cl2-MeOH (7/1) và hợp chất PS25 (3 mg) được tinh chế từ phân đoạn W2D5

bằng sắc ký cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi ethyl axetat-MeOH

(6/1).

Từ phân đoạn W2G (2,5g), sử dụng cột silica gel pha đảo với hệ dung môi giải

hấp là MeOH-H2O (1,5/1) thu được 5 phân đoạn từ W2G1-W2G5, phân đoạn

W2G3 (280mg) cho qua cột silica gel pha thường giải hấp với hệ dung môi

CH2Cl2-MeOH-H2O (4/1/0,1) thu được các hợp chất sạch ký hiệu là PS31 (5 mg),

PS32 (4mg), PS28 (3,5mg). Với phân đoạn W2G4 (450mg) dùng sắc ký cột silica

gel pha thường giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (3/1/0,1) kết hợp với

40

sắc ký rây phân tử sử dụng sephadex LH-20 thu được các hợp chất sạch ký hiệu là

PS29 (4,5 mg) và PS 30 (5mg).

3.3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được:

3.3.2.1. Hợp chất 01 (PS16): Paramignyol A (Chất mới)

C32H54O5, M = 518, HR-ESI-MS: m/z 541,3890 [M+Na]+, tính toán lý thuyết

541,3869 cho công thức C32H54O5Na+

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) : 1,38 (1H, m, Ha-1), 1,55 (1H, m, Hb-1), 1,60

(1H, m, Ha-2), 1,96 (1H, m, Hb-2), 3,41 (1H, br s, H-3), 1,82 (1H, dd, J = 6,5, 11, 0

Hz, H-5), 1,96 (1H, m, Ha-6), 2,06 (1H, m, Hb-6), 5,30 (1H, br d, J = 3,0, H-7),

2,43 (1H, m, H-9), 1,55 (1H, m, Ha-11), 1,65 (1H, m, Hb-11), 1,43 (1H, m, Ha-12),

1,92 (1H, m, Hb-12), 1,52 (1H, m, Ha-15), 1,61 (1H, m, Hb-15), 1,40 (1H, m, Ha-

16), 1,90 (1H, m, Hb-16), 2,04 (1H, m, H-17), 0,92 (3H, s, H-18), 0,83 (3H, s, H-

19), 2,02 (1H, m, H-20), 4,74 (1H, br d, J = 3,0 Hz, H-21), 1,74 (1H, m, Ha-22),

1,99 (1H, m, Hb-22), 4,35 (1H, m, H-23), 3,28 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-24), 1,19 (3H,

s, H-26), 1,24 (3H, s, H-27), 0,94 (6H, s, H-28, H-29), 1,03 (3H, s, H-30), 3,37 (3H,

s, 21-OMe), 3,25 (3H, s, 25-OMe);

13C-NMR (125MHz, CDCl3/CD3OD) : 32,44 (C-1), 26,43 (C-2), 76,98 (C-3),

38,34 (C-4), 45,80 (C-5), 25,02 (C-6), 119,53 (C-7), 147,16 (C-8), 49,82 (C-9),

35,86 (C-10), 18,63 (C-11), 32,54 (C-12), 44,71 (C-13), 52,97 (C-14), 35,31 (C-15),

28,25 (C-16), 46,41 (C-17), 23,54 (C-18), 13,54 (C-19), 47,92 (C-20), 105,99 (C-

21), 33,81 (C-22), 79,52 (C-23), 78,09 (C-24), 78,57 (C-25), 20,78 (C-26), 22,70

(C-27), 28,56 (C-28), 22,36 (C-29), 27,85 (C-30), 55,20 (21-OMe), 49,57 (25-

OMe).

3.3.2.2. Hợp chất 02 (PS15): Paramignyol B (Chất mới)




(1H, m, Ha-2), 1,97 (1H, m, Hb-2), 3,41 (1H, br s, H-3), 1,82 (1H, m, H-5), 1,98

(1H, m, Ha-6), 2,07 (1H, m, Hb-6), 5,30 (1H, br d, J = 3,5, H-7), 2,43 (1H, m, H-9),

41

1,57 (1H, m, Ha-11), 1,65 (1H, m, Hb-11), 1,62 (1H, m, Ha-12), 1,85 (1H, m, Hb-

12), 1,52 (1H, m, Ha-15), 1,62 (1H, m, Hb-15), 1,36 (1H, m, Ha-16), 1,95 (1H, m,

Hb-16), 1,86 (1H, m, H-17), 0,92 (3H, s, H-18), 0,83 (3H, s, H-19), 2,18 (1H, m, H-

20), 4,81 (1H, dd, J = 3,0, 6,5 Hz, H-21), 1,61 (1H, m, Ha-22), 1,99 (1H, m, Hb-

22), 4,17 (1H, m, H-23), 3,37 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-24), 1,20 (3H, s, H-26), 1,26

(3H, s, H-27), 0,93 (6H, s, H-28, H-29), 1,04 (3H, s, H-30), 3,35 (3H, s, 21-OMe),

3,25 (3H, s, 25-OMe);

13C-NMR (125MHz, CDCl3/CD3OD) : 32,45 (C-1), 26,46 (C-2), 76,98 (C-3),

38,35 (C-4), 45,78 (C-5), 25,02 (C-6), 119,53 (C-7), 147,13 (C-8), 49,86 (C-9),

35,88 (C-10), 18,63 (C-11), 32,98 (C-12), 44,85 (C-13), 52,17 (C-14), 34,96 (C-15),

28,40 (C-16), 51,18 (C-17), 23,04 (C-18), 13,54 (C-19), 49,00 (C-20), 110,19 (C-

21), 36,85 (C-22), 76,62 (C-23), 76,75 (C-24), 78,83 (C-25), 20,83 (C-26), 22,56

(C-27), 28,57 (C-28), 22,38 (C-29), 27,75 (C-30), 55,68 (21-OMe), 49,28 (25-

OMe).

3.3.2.3. Hợp chất 03 (PS31): Paramignyoside A (Chất mới)




(1H, m, Ha-2), 2,28 (1H, m, Hb-2), 4,10 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3), 2,06 (1H, m, H-

5), 2,20 (1H, m, Ha-6), 2,84 (1H, m, Hb-6), 5,31 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-7), 2,41 (1H,

m, H-9), 1,56 (1H, m, Ha-11), 1,69 (1H, m, Hb-11), 1,79 (2H, m, H-12), 1,57 (1H,

m, Ha-15), 1,64 (1H, m, Hb-15), 1,60 (1H, m, Ha-16), 1,82 (1H, m, Hb-16), 2,38

(1H, m, H-17), 0,91 (3H, s, H-18), 0,74 (3H, s, H-19), 2,83 (1H, m, H-20), 2,29

(1H, m, Ha-22), 2,31 (1H, m, Hb-22), 4,68 (1H, m, H-23), 3,63 (1H, d, J = 2,5 Hz,

H-24), 1,26 (3H, s, H-26), 1,24 (3H, s, H-27), 1,31 (3H, s, H-28), 1,07 (3H, s, H-

30), 5,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,58 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2), 3,64 (1H,

m, H-3), 3,52 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-43,44 (1Hm H-5), 3,74 (1H, dd, J = 4,5,

12,0 Hz, Ha-6), 3,86 (1H, br d, J = 12,0 Hz, Hb-6), 4,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1),

3,32 (1H, m, H-2), 3,41 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3), 3,31 (1H, m, H-4), 3,37 (1H,

42

m, H-5), 3,67 (1H, dd, J = 6,0, 12,0 Hz, Ha-6), 3,92 (1H, dd, J =1,5, 12,0 Hz, Ha-

6);

13C-NMR (125MHz, CD3OD) : 32,99 (C-1), 27,78 (C-2), 71,38 (C-3), 49,55

(C-4), 46,49 (C-5), 25,41 (C-6), 119,55 (C-7), 145,64 (C-8), 49,12 (C-9), 36,35 (C-

10), 18,88 (C-11), 32,44 (C-12), 44,80 (C-13), 51,74 (C-14), 34,94 (C-15), 24,77

(C-16), 48,66 (C-17), 23,85 (C-18), 12,80 (C-19), 42,02 (C-20), 181,35 (C-21),

29,41 (C-22), 80,21 (C-23), 78,10 (C-24), 72,77 (C-25), 26,75 (C-26), 26,41 (C-27),

24,29 (C-28), 176,64 (C-29), 27,94 (C-30), 94,96 (C-1), 73,42 (C-2), 88,19 (C-3),

69,48 (C-4), 78,48 (C-5), 62,28 (C-6), 105,06 (C-1), 75,39 (C-2), 77,78 (C-3),

71,52 (C-4), 78,15 (C-5), 62,58 (C-6).

3.3.2.4. Hợp chất 04 (PS32): Paramignyoside B (Chất mới)


907,4298 cho công thức C44H68O18Na+.




9), 1,57 (1H, m, Ha-11), 1,68 (1H, m, Hb-11), 1,79 (2H, m, H-12), 1,57 (1H, m, Ha-

15), 1,63 (1H, m, Hb-15), 1,60 (1H, m, Ha-16), 1,82 (1H, m, Hb-16), 2,38 (1H, m,

H-17), 0,91 (3H, s, H-18), 0,70 (3H, s, H-19), 2,83 (1H, m, H-20), 2,29 (1H, m, Ha-

22), 2,31 (1H, m, Hb-22), 4,68 (1H, m, H-23), 3,63 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-24), 1,25

(3H, s, H-26), 1,23 (3H, s, H-27), 1,23 (3H, s, H-28), 1,07 (3H, s, H-30), 5,69 (1H,

d, J = 8,0 Hz, H-1), 5,10 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2), 3,83 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-

3), 3,60 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-43,50 (1Hm H-5), 3,77 (1H, dd, J = 4,5, 12,0

Hz, Ha-6), 3,88 (1H, br d, J = 12,0 Hz, Hb-6), 2,10 (3H, s, OAc), 4,40 (1H, d, J =

8,0 Hz, H-1), 3,21 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2), 3,37 (1H, m, H-3), 3,31 (1H,

m, H-4), 3,37 (1H, m, H-5), 3,67 (1H, dd, J = 6,0, 12,0 Hz, Ha-6), 3,91 (1H, dd,

J =1,5, 12,0 Hz, Ha-6);

43

13C-NMR (125MHz, CD3OD) : 32,9 (C-1), 27,9 (C-2), 71,1 (C-3), 49,4 (C-

4), 46,3 (C-5), 25,3 (C-6), 119,5 (C-7), 145,6 (C-8), 49,1 (C-9), 36,3 (C-10), 18,9

(C-11), 32,4 (C-12), 44,8 (C-13), 51,7 (C-14), 34,9 (C-15), 24,7 (C-16), 48,6 (C-

17), 23,8 (C-18), 12,9 (C-19), 42,0 (C-20), 181,4 (C-21), 29,4 (C-22), 80,2 (C-23),

78,1 (C-24), 72,8 (C-25), 26,7 (C-26), 26,4 (C-27), 24,0 (C-28), 176,5 (C-29), 27,9

(C-30), 93,1 (C-1), 72,4 (C-2), 85,4 (C-3), 69,6 (C-4), 78,7 (C-5), 62,1 (C-6),

171,7 (OAc), 21,2 (OAc), 105,4 (C-1), 74,9 (C-2), 77,9 (C-3), 71,4 (C-4), 78,1

(C-5), 62,5 (C-6).

3.3.2.5. Hợp chất 05 (PS28): Paramignyoside C (Chất mới)






(1H, m, Ha-11), 1,69 (1H, m, Hb-11), 1,80 (2H, m, H-12), 1,57 (1H, m, Ha-15),

1,64 (1H, m, Hb-15), 1,60 (1H, m, Ha-16), 1,80 (1H, m, Hb-16), 2,38 (1H, m, H-

17), 0,93 (3H, s, H-18), 0,74 (3H, s, H-19), 2,81 (1H, m, H-20), 2,30 (1H, m, Ha-

22), 2,62 (1H, m, Hb-22), 4,77 (1H, m, H-23), 3,78 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-24), 1,36

(3H, s, H-26), 1,33 (3H, s, H-27), 1,31 (3H, s, H-28), 1,07 (3H, s, H-30), 5,50 (1H,

d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,38 (1H, m, H-2), 3,44 (1H, m, H-3), 3,40 (1H, m, H-

4m H-5), 3,67 (1H, m, Ha-6), 3,89 (1H, m, Hb-6), 4,52 (1H, d, J =

7,5 Hz, H-1), 3,16 (1H, m, H-2), 3,39 (1H, m, H-3), 3,29 (1H, m, H-4), 3,39

(1H, m, H-5), 3,70 (1H, m, Ha-6), 3,85 (1H, m, Ha-6);

13C-NMR (125MHz, CD3OD) : 33,01 (C-1), 28,00 (C-2), 71,46 (C-3), 49,62

(C-4), 46,52 (C-5), 25,48 (C-6), 119,60 (C-7), 145,70 (C-8), 49,59 (C-9), 36,37 (C-

10), 18,90 (C-11), 32,46 (C-12), 44,84 (C-13), 51,75 (C-14), 34,95 (C-15), 25,00

(C-16), 49,45 (C-17), 23,88 (C-18), 12,90 (C-19), 41,98 (C-20), 181,36 (C-21),

29,60 (C-22), 80,09 (C-23), 77,71 (C-24), 80,18 (C-25), 24,48 (C-26), 23,44 (C-27),

44

24,24 (C-28), 176,93 (C-29), 27,93 (C-30), 95,48 (C-1), 74,11 (C-2), 78,52 (C-3),

71,17 (C-4), 78,00 (C-5), 62,83 (C-6), 98,42 (C-1), 75,38 (C-2), 78,80 (C-3),

71,72 (C-4), 78,00 (C-5), 62,67 (C-6).

3.3.2.6. Hợp chất 06 (PS30): Paramignyoside D (Chất mới)

C48H76O22, M = 1004, HR-ESI-MS: m/z 1027,4787 [M+Na]+, tính toán lý

thuyết 1027,4826 cho công thức C48H76O22Na+





15), 1,63 (1H, m, Hb-15), 1,66 (1H, m, Ha-16), 2,28 (1H, m, Hb-16), 2,40 (1H, m,

H-17), 0,91 (3H, s, H-18), 0,75 (3H, s, H-19), 2,80 (1H, m, H-20), 2,27 (1H, m, Ha-

22), 2,33 (1H, m, Hb-22), 4,78 (1H, m, H-23), 3,50 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-24), 1,38

(3H, s, H-26), 1,34 (3H, s, H-27), 1,31 (3H, s, H-28), 1,07 (3H, s, H-30), 5,58 (1H,


3), 3,52 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4m H-5), 3,75 (1H, dd, J = 4,5, 12,0

Hz, Ha-6), 3,87 (1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, Hb-6), 4,58 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1),

3,32 (1H, m, H-2), 3,37 (1H, m, H-3), 3,31 (1H, m, H-4), 3,28 (1H, m, H-5),

3,67 (1H, m, Ha-6), 3,85 (1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, Ha-6), 4,55 (1H, d, J = 7,5

Hz, H-1), 3,18 (1H, dd, J = 7,5, 9,0 Hz, H-2), 3,41 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3),

3,30 (1H, m, H-4), 3,37 (1H, m, H-5), 3,67 (1H, m, Ha-6), 3,91 (1H, dd, J =

2,5, 12,0 Hz, Ha-6);

13C-NMR (125MHz, CD3OD) : 32,99 (C-1), 27,77 (C-2), 71,31 (C-3), 49,55

(C-4), 46,65 (C-5), 25,41 (C-6), 119,56 (C-7), 145,64 (C-8), 48,83 (C-9), 36,35 (C-

10), 18,87 (C-11), 32,40 (C-12), 44,81 (C-13), 51,71 (C-14), 34,95 (C-15), 24,67

(C-16), 48,49 (C-17), 23,90 (C-18), 12,79 (C-19), 41,62 (C-20), 181,55 (C-21),

31,65 (C-22), 78,47 (C-23), 77,72 (C-24), 81,11 (C-25), 23,65 (C-26), 23,30 (C-27),

24,29 (C-28), 176,65 (C-29), 27,94 (C-30), 94,97 (C-1), 73,43 (C-2), 88,15 (C-3),

45

69,50 (C-4), 78,40 (C-5), 62,30 (C-6), 105,06 (C-1), 75,38 (C-2), 78,14 (C-3),

71,52 (C-4), 77,60 (C-5), 62,57 (C-6), 98,47 (C-1), 75,16 (C-2), 77,77 (C-

3), 71,67 (C-4), 78,14 (C-5), 62,72 (C-6).

3.3.2.7. Hợp chất 07 (PS29): Paramignyoside E (Chất mới)

C50H78O23, M = 1046, HR-ESI-MS: m/z 1069,4901 [M+Na]+, tính toán lý

thuyết 1069,4826 cho công thức C50H78O23Na+





15), 1,68 (1H, m, Hb-15), 1,60 (1H, m, Ha-16), 1,82 (1H, m, Hb-16), 2,40 (1H, m,

H-17), 0,91 (3H, s, H-18), 0,70 (3H, s, H-19), 2,80 (1H, m, H-20), 2,27 (1H, m, Ha-

22), 2,33 (1H, m, Hb-22), 4,77 (1H, m, H-23), 3,50 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-24), 1,35

(3H, s, H-26), 1,35 (3H, s, H-27), 1,23 (3H, s, H-28), 1,08 (3H, s, H-30), 5,69 (1H,


3), 3,60 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4m H-5), 3,77 (1H, dd, J = 4,5, 12,0

Hz, Ha-6), 3,88 (1H, m, Hb-6), 2,09 (3H, s, H-8), 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1),

3,21 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2), 3,37 (1H, m, H-3), 3,31 (1H, m, H-4), 3,27

(1H, m, H-5), 3,66 (1H, m, Ha-6), 3,85 (1H, m, Ha-6), 4,55 (1H, d, J = 7,5 Hz,

H-1), 3,17 (1H, dd, J = 7,5, 9,0 Hz, H-2), 3,39 (1H, m, H-3), 3,34 (1H, m, H-

4), 3,35 (1H, m, H-5), 3,67 (1H, m, Ha-6), 3,90 (1H, m, Ha-6) ;

13C-NMR (125MHz, CD3OD) : 32,92 (C-1), 27,90 (C-2), 71,12 (C-3), 49,66

(C-4), 46,27 (C-5), 25,37 (C-6), 119,59 (C-7), 145,59 (C-8), 49,45 (C-9), 36,32 (C-

10), 18,88 (C-11), 32,40 (C-12), 44,82 (C-13), 51,72 (C-14), 34,95 (C-15), 24,69

(C-16), 49,28 (C-17), 23,90 (C-18), 12,91 (C-19), 41,64 (C-20), 181,54 (C-21),

31,67 (C-22), 78,42 (C-23), 77,76 (C-24), 81,11 (C-25), 23,67 (C-26), 23,26 (C-27),

24,02 (C-28), 176,42 (C-29), 27,94 (C-30), 93,15 (C-1), 72,42 (C-2), 82,45 (C-3),

69,6 (C-4), 78,70 (C-5), 62,11 (C-6), 171,59 (C-7), 21,24 (C-8), 105,41 (C-1),

46

74,67 (C-2), 78,02 (C-3), 71,39 (C-4), 77,63 (C-5), 62,74 (C-6), 98,49 (C-

1), 75,19 (C-2), 78,15 (C-3), 71,69 (C-4), 78,09 (C-5), 62,51 (C-6).

3.3.2.8. Hợp chất 08 (PS01): Methyl isolimonate

Chất bột màu trắng; []D25 -35o (c, 0,1 MeOH); APCI-MS: m/z 503 [M+H]+

(C27H34O9, M = 502).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) : 4,19 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-1), 2,50/2,64 (2H,

m, H-2), 2,20 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-5), 2,45/2,60 (2H, m, H-6), 3,00 (1H, m, H-9),

1,70/2,18 (2H, m, H-11), 1,52/1,75 (2H, m, H-12), 3,94 (1H, s, H-15), 5,60 (1H, s,

H-17), 1,20 (3H, s, H-18), 3,75 (1H, m, Ha-19)/4,02 (1H, d, J = 5,5 Hz, Hb-19),

7,42 (1H, br s, H-21), 6,33 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-22), 7,40 (1H, t, J = 1,0 Hz, H-

23), 1,13 (3H, s, H-28), 1,26 (3H, s, H-29), 1,42 (3H, s, H-30), 3,75 (3H, s, OMe);

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) : 75,00 (C-1), 36,99 (C-2), 173,64 (C-3), 83,80

(C-4), 48,66 (C-5), 39,57 (C-6), 211,76 (C-7), 48,66 (C-8), 35,67 (C-9), 52,31 (C-

10), 18,57 (C-11), 27,87 (C-12), 39,31 (C-13), 69,01 (C-14), 55,38 (C-15), 167,45

(C-16), 78,14 (C-17), 19,60 (C-18), 68,73 (C-19), 120,34 (C-20), 141,16 (C-21),

109,79 (C-22), 143,07 (C-23), 24,23 (C-28), 28,92 (C-29), 16,86 (C-30), 52,25

(OMe).

3.3.2.9. Hợp chất 09 (PS02): (6R,9S)-roseoside

Chất bột màu trắng, []D20 + 65 (c, 0,15 trong MeOH); ESI-MS: m/z 409

[M+Na]+ (C19H30O8, M= 386);

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) : 2,61 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-2a)/2,20 (1H, d,

J = 17,0 Hz, H-2b), 5,89 (1H, br s, H-4), 5,98 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7), 5,75 (1H,

dd, J = 7,0, 15,5 Hz, H-8), 4,55 (1H, m, H-9), 1,31 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-10), 1,06

(3H, br s, H-11), 1,03 (3H, br s, H-12), 1,96 (3H, br s, H-13), 4,30 (1H, d, J =7,5,

H-1), 3,22 (1H, m, H-2), 3,32 (1H, m, H-3), 3,29 (1H, m, H-4), 3,18 (1H, m, H-

5), 3,65 (1H, dd, J = 6,0, 12,0 Hz, Ha-6)/3,87 (1H, dd, J = 2,0, 12,0 Hz, Hb-6);

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) : 42,41 (C-1), 50,72 (C-2), 201,28 (C-3),

127,12 (C-4), 167,10 (C-5), 80,01 (C-6), 133,72 (C-7), 133,70 (C-8), 74,67 (C-9),

47

21,99 (C-10), 23,48 (C-11), 24,69 (C-12), 19,56 (C-13), 101,25 (C-1), 74,94 (C-2),

78,34 (C-3), 71,66 (C-4), 78,16 (C-5), 62,82 (C-6).

3.3.2.10. Hợp chất 10 (PS03): -D-glucopyranoside methyl salicylate

Chất bột màu trắng;

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7,69 (1H, br d, J = 8,0 Hz, H-3), 7,01 (1H, br

t, J = 8,0 Hz, H-4), 7,40 (1H, dt, J = 8,0, 1,0 Hz, H-5), 7,22 (1H, br d, J = 8,0 Hz,

H-6), 3,78 (3H, s, OMe), 4,78 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′), 3,69 (1H, H-2′), 3,68 (1H,

H-3′), 3,71 (1H, H-4′), 3,50 (1H, m, H-5′), 3,88 (1H, m, Ha-6′) và 3,92 (1H, m, Hb-

6′);

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 157,79 (C-1), 120,84 (C-2), 131,24 (C-3),

122,95 (C-4), 134,23 (C-5), 118,52 (C-6), 166,68 (C-7), 52,40 (OMe), 103,70 (C-

1′), 73,48 (C-2′), 75,86 (C-3′), 69,70 (C-4′), 76,28 (C-5′) và 61,88 (C-6′).

3.3.2.11. Hợp chất 11 (PS05): Adenosine

Tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 234-235oC; ESI-MS: m/z 290

[M+Na]+ (C10H13N5O4, M = 267);

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) : 8,13 (1H, s, H-2), 8,34 (1H, s, H-8), 5,88

(1H, d, J = 6,5 Hz, H-1), 4,61 (1H, dd, J = 4,5, 6,5 Hz, H-2), 4,14 (1H, dd, J = 4,5,

7,5 Hz, H-3) 3,96 (1H, dd, J = 3,0, 7,5 Hz, H-4), 3,55 (1H, m, Ha-5), 3,67 (1H, m,

Hb-5), 7,31 (2H, s, NH2);

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) : 152,34 (C-2), 149,05 (C-4), 119,32 (C-5),

156,12 (C-6), 139,85 (C-8), 87,90 (C-1), 73,44 (C-2), 70,60 (C-3), 85,85 (C-4) và

61,64 (C-5).

3.3.2.12. Hợp chất 12 (PS09): 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-

glucopyranoside

Chất dầu không màu;

1H-NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD) : 6,06 (1H, dd, J = 11,0, 18,0 Hz, H-2),

5,23 (1H, dd, J = 1,5, 18,0 Hz, Ha-3), 5,13 (1H, dd, J = 1,5, 11,0 Hz, Hb-3), 1,35

(3H, s, H-4), 1,39 (3H, s, H-5), 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 3,16 (1H, dd, J = 7,5,

48

9,0 Hz, H-2), 3,35 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3) 3,30 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4), 3,20 (1H,

m, H-5), 3,65 (1H, dd, J = 5,5, 12,0 Hz, Ha-6), 3,82 (1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, Hb-

6);

13C-NMR (125MHz, CDCl3/CD3OD) : 79,07 (C-1), 145,40 (C-2), 114,27 (C-

3), 27,87 (C-4), 26,67 (C-5), 99,56 (C-1), 75,13 (C-2), 78,02 (C-3), 71,78 (C-4),

77,63 (C-5), 62,84 (C-6).

3.3.2.13. Hợp chất 13 (PS10): Syrigin

Chất bột màu trắng;

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) : 6,77 (2H, br s, H-3 và H-5), 6,57 (1H, d, J =

16,0 Hz, H-7), 6,35 (1H, dt, J = 16,0, 6,0 Hz, H-8), 4,24 (2H, dd, J = 5,5, 1,5 Hz, H-

9), 3,88 (6H, s, OMe), 4,90 (1H, m, H-1), 3,50 (1H, dd, J = 7,5, 9,0 Hz, H-2), 3,44

(1H, m, H-3) 3,44 (1H, m, H-4), 3,23 (1H, m, H-5), 3,69 (1H, dd, J = 5,0, 12,0

Hz, Ha-6), 3,81 (1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, Hb-6);

13C-NMR (125MHz, CD3OD) : 135,95 (C-1), 154,36 (C-2, C-6), 105,55 (C-

3, C-5), 135,31 (C-4), 131,27 (C-7), 130,09 (C-8), 63,57 (C-9), 57,07 (OMe),

105,39 (C-1), 75,75 (C-2), 77,85 (C-3), 71,38 (C-4), 78,37 (C-5), 62,61 (C-6).

3.3.2.14. Hợp chất 14 (PS13): Atripliside B

Chất bột màu vàng nhạt, []D25 45o (c, 0,15 MeOH); APCI-MS: m/z 609

[MH] (C28H34O15, M = 610);

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) : 5,49 (1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, H-2), 2,78

(1H, dd, J = 2,5, 17,0 Hz, Ha-3), 3,27 (1H, dd, J = 12,0, 17,0 Hz, Hb-3), 6,11 (1H,

d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,13 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,93 (1H, br s, H-2), 6,94 (1H, d,

J = 8,5 Hz, H-5), 6,90 (1H, br d, J = 8,5 Hz, H-6), 3,77 (3H, s, OMe), 4,96 (1H, d,

J = 7,5 Hz, H-1), 3,23 (1H, m, H-2), 3,54 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-3), 3,24 (1H, m,

H-4), 3,27 (1H, m, H-5), 3,43 (1H, m, Ha-6), 3,80 (1H, m, Hb-6), 4,52 (1H, s,

H-1), 3,63 (1H, br s, H-2), 3,43 (1H, m H-3), 3,15 (1H, m, H-4), 3,40 (1H,

m, H-5), 1,08 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6);

49

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) : 78,41 (C-2), 42,07 (C-3), 197,05 (C-4),

162,53 (C-5), 95,61 (C-6), 165,18 (C-7), 96,43 (C-8), 163,07 (C-9), 103,07 (C-10),

130,93 (C-1), 114,17 (C-2), 146,49 (C-3), 148,02 (C-4), 112,10 (C-5), 118,02

(C-6), 55,74 (OMe), 99,51 (C-1), 73,03 (C-2), 75,56 (C-3), 69,95 (C-4), 76,30

(C-5), 66,06 (C-6), 100,63 (C-1), 70,31 (C-2), 70,74 (C-3), 72,12 (C-4),

68,36 (C-5), 17,85 (C-6).

3.3.2.15. Hợp chất 15 (PS18): trans-N-p-coumaroyl tyramine

Chất bột màu trắng; ESI-MS: m/z 282 [MH] (C17H17NO3, M = 283);

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) : 7,41 (2H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-2 và H-6),

6,80 (2H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-3 và H-5), 7,46 (1H, dd, J = 1,5, 15,5 Hz, H-7),

6,40 (1H, dd, J = 1,5, 15,5 Hz, H-8), 7,07 (2H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-2 và H-6),

6,74 (2H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-3 và H-5), 2,77 (2H, br d, J = 7,5 Hz, H-7), 3,48

(2H, dt, J = 1,5, 7,5 Hz, H-8);

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) : 127,73 (C-1), 130,57 (C-2 và C-6), 116,72

(C-3 và C-5), 160,49 (C-4), 141,79 (C-7), 118,42 (C-8), 169,26 (C-9), 131,34 (C-

1), 130,74 (C-2 và C-6), 116,17 (C-3 và C-5), 156,89 (C-4), 35,80 (C-7) và

42,55 (C-8).

3.3.2.16. Hợp chất 16 (PS20): 2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O-

-L-rhamnopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside

Chất bột màu trắng, []D = 45 (c = 0.25, MeOH);

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) : 6,68 (2H, s, H-3, H-5), 6,36 (1H, dd, J = 1,5,

16,0 Hz, H-7), 6,23 (1H, m, H-8), 1,87 (1H, dd, J = 1,5, 6,5 Hz, H-9), 3,87 (3H, s,

OMe), 4,78 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 3,50 (1H, dd, J = 7,5, 9,0 Hz, H-2), 3,42 (1H,

t, J = 9,0 Hz, H-3), 3,34 (1H, m, H-4), 3,35 (1H, m, H-5), 3,58 (1H, m, Ha-6),

3,93 (1H, dd, J = 1,0, 11,0 Hz, Hb-6), 4,69 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1), 3,71 (1H, dd,

J = 1,5, 3,5 Hz, H-2), 3,61 (1H, dd, J = 3,5, 9,0 Hz, H-3), 3,34 (1H, m, H-4),

3,56 (1H, m, H-5), 1,21 (1H, m, H-6);

50

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) : 135,24 (C-1), 154,35 (C-2, C-6), 104,78 (C-3,

C-5), 136,29 (C-4), 132,09 (C-7), 126,41 (C-8), 18,48 (C-9), 57,01 (OMe), 105,51

(C-1), 75,63 (C-2), 77,85 (C-3), 71,76 (C-4), 77,28 (C-5), 68,00 (C-6), 102,14

(C-1), 72,11 (C-2), 72,32 (C-3), 74,02 (C-4), 69,73 (C-5), 17,99 (C-6).

3.3.2.17. Hợp chất 17 (PS21): Gusanlungionoside C

Chất bột màu trắng, []D25 9o (c = 0,15, MeOH); APCI-MS: m/z 519 [M+H]+

(C25H42O11, M = 518);

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) : 2,00 (1H, d, J = 17,0 Hz, Ha-2), 2,50 (1H, d,

J = 17,0 Hz, Hb-2), 5,82 (1H, s, H-4), 2,02 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 1,54 (1H, m,

Ha-7), 1,99 (1H, m, Hb-7), 1,65 (2H, m, H-8), 3,92 (1H, m, H-9), 1,22 (3H, d, J =

5,0 Hz, H-10), 1,03 (3H, s, H-11), 1,12 (3H, s, H-12), 2,07 (3H, d, J = 1,0 Hz, H-

13), 4,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,39 (1H, m, H-2), 3,49 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-

3), 3,27 (2H, m, H-4 H-5), 3,67 (1H, m, Ha-6), 3,88 (1H, m, Hb-6), 5,25 (1H, d,

J = 1,5 Hz, H-1), 3,91 (1H, m, H-2), 3,67 (1H, m, H-3), 3,40 (1H, m, H-4),

4,11 (1H, m, H-5), 1,22 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6);

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) : 37,32 (C-1), 48,12 (C-2), 202,43 (C-3),

125,44 (C-4), 170,00 (C-5), 52,37 (C-6), 26,74 (C-7), 37,83 (C-8), 74,95 (C-9),

19,17 (C-10), 27,59 (C-11), 29,08 (C-12), 25,00 (C-13), 100,36 (C-1), 78,29 (C-2),

79,61 (C-3), 72,05 (C-4), 77,80 (C-5), 62,93 (C-6), 101,85 (C-1), 72,27 (C-2),

73,32 (C-3), 73,96 (C-4), 69,58 (C-5), 18,10 (C-6).

3.3.2.18. Hợp chất 18 (PS23): Betulalbuside B

Chất dầu không màu;

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) : 5,04 (1H, dd, J = 1,0, 10,5 Hz, Ha-1), 5,21

(1H, dd, J = 1,0, 17,0 Hz, Hb-1), 5,93 (1H, ddd, J = 1,0, 10,5, 17,0 Hz, H-2), 1,54

(2H, m, H-4), 2,13 (2H, m, H-5), 5,42 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-6), 4,35 (1H, dd, J =

2,5, 11,5 Hz, Ha-8), 4,21 (1H, dd J = 4,5, 11,5 Hz, Hb-8), 1,27 (3H, br s, H-9), 1,79

(3H, d, J = 1,0 Hz, H-10), 4,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,21 (1H, dd, J = 8,0, 9,0

51

Hz, H-2), 3,36 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3), 3,33 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4m

H-5), 3,71 (1H, dd, J = 5,5, 12,0 Hz, Ha-6), 3,90 (1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, Hb-6);

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) : 112,10 (C-1), 146,22 (C-2), 73,78 (C-3),

43,60 (C-4), 23,46 (C-5), 131,45 (C-6), 132,60 (C-7), 67,77 (C-8), 27,73 (C-9),

21,84 (C-10), 102,39 (C-1), 75,03 (C-2), 78,15 (C-3), 71,69 (C-4), 77,86 (C-5),

62,76 (C-6).

3.3.2.19. Hợp chất 19 (PS25): Syringaresinol di-O--D-glucopyranoside

Chất bột màu trắng; ESI-MS: m/z 765 [M+Na]+ (C34H46O18, M = 742);

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H: 3,09 (2H, m, H-1 và H-5), 4,67 (2H, d, J

= 3,5 Hz, H-2 và H-6), 3,83 (2H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz, Ha-4 và Ha-8), 4,20 (2H, dd, J

= 7,0, 9,0 Hz, Hb-4 và Hb-8), 6,66 (4H, s, H-2, H-6, H-2 và H-6), 3,76 (12H, s,

3,5,3,5-OMe), 4,88 (2H, d J = 7,5 Hz, H-1 và H-1), 3,20 (4H, H-2, H-3,

H-2 và H-3), 3,13 (2H, H-4 và H-4), 3,04 (2H, m, H-5 và H-5), 3,41

(2H, dd, J = 4,5, 12,0 Hz, H-6 và H-6) và 3,60 (2H, dd, J = 1,5, 12,0 Hz, H-6

và H-6);

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 53,58 (C-1 và C-5), 85,03 (C-2 và C-6),

71,32 (C-4 và C-8), 133,72 (C-1 và 1), 104,22 (C-2, C-6, C-2 và C-6), 152,60

(C-3, C-5, C-3 và C-5), 137,08 (C-4 và C-4), 56,41 (3,5,3,5-OMe), 102,65

(C-1 và C-1), 74,14 (C-2 và C-2), 76,48 (C-3 và C-3), 69,91 (C-4 và

C-4), 77,16 (C-5 và C-5) và 60,89 (C-6 và C-6).

52

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Quy trình phân lập

Mẫu khô của P. scandens (2 kg) được chiết với MeOH bằng máy siêu âm

Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-50oC trong vòng 30 phút. Dịch chiết sau đó được cô

đặc bằng máy cất quay với áp suất giảm thu được 20 g cặn chiết MeOH. Cặn

MeOH được hòa vào nước và phân lớp lần lượt với n-hexan và cloroform để thu

được các dịch cô PS-H (20 g) và PS-C (40 g). Phần dịch nước PS-W sau chiết được

cho qua cột dianion sử dụng hệ dung môi gradient MeOH-H2O (từ 0:100 đến 100:0)

thu được các dịch cô W1 (9 g), W2 (22 g) và W3 (8,6 g).

Cặn chiết cloroform (40g) bằng các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, pha đảo đã

phân lập được các hợp chất 01, 02 và 08, quy trình chi tiết được mô tả trong hình

4.1.

Hình 4.1. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết CHCl3 của cây P. scandens

53

Lớp nước được tiến hành phân tách thô trên cột sắc ký với chất nhồi là Diaion

HP-20 với hệ dung môi giải hấp tăng dần nồng độ MeOH trong nước cất (0%, 30%,

70% và 100%), loại bỏ phần rửa giải bằng nước 100% thu được ba phân đoạn ký

hiệu là W1-W3.

Hình 4.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước W1 của cây P. scandens

Hình 4.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước W2 của cây P. scandens

54

Phân đoạn W1 được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo

thu được các hợp chất 09, 10, 11, 12, 13, 16 và 18. Tương tự, từ phân đoạn W2 đã

tách được các hợp chất 03, 04, 05, 06, 07, 14, 15, 17 và 19. Sơ đồ phân lập chi tiết

các hợp chất từ phân đoạn W1 và W2 được trình bày trong hình 4.2 và 4.3.

4.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất

4.2.1. Hợp chất 01: Paramignyol A (Chất mới)

Hợp chất 01 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử

của nó được xác định là C32H54O5 (M = 518) bằng kết quả phổ khối lượng phân giải

cao HR-ESI-MS tại m/z 541,3890 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

C32H54O5Na là 541,3869) và cho thấy trong cấu trúc có 6 đơn vị bất bão hòa (Hình

PL1).

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất 01

Trên phổ 1H-NMR (hình 4.4) của hợp chất 01 xuất hiện tín hiệu pic đơn của 7

nhóm metyl tại H 0,92 (H-18), 0,83 (H-19), 1,19 (H-26), 1,24 (H-27), 0,94 (H-28),

0,94 (H-29) và 1,03 (H-30) cùng với tín hiệu pic đôi của 1 proton metin olefin với

55

hằng số ghép đôi nhỏ tại H 5,30 (d, J = 3,0 Hz, H-7) cho thấy dạng khung

tirucallan tương tự các hợp chất đã phân lập trước đây từ một số loài thuộc chi

Paramignya [21, 22, 34]. Ngoài ra còn có pic đơn của 2 nhóm metoxy ở H 3,37

(3H, s, 21-OMe) và 3,25 (3H, s, 25-OMe).

Hình 4.5. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất 01

Phổ 13C-NMR (hình 4.5) của hợp chất 01 xuất hiện tín hiệu của 32 cacbon

trong đó có tín hiệu đặc trưng của 7 nhóm metyl bậc 3 tại C 23,5 (C-18), 13,5 (C-

19), 20,8 (C-26), 22,7 (C-27), 28,6 (C-28), 22,4 (C-29) và 27,8 (C-30); tín hiệu của

1 liên kết đôi tại C 119,5 (C-7) và 147,2 (C-8); tín hiệu của 1 cacbon bậc 4 nối với

nguyên tử ôxy ở C 78,6 (C-25); 1 nhóm metin nối với 2 nguyên tử ôxy tại C 106,0

(C-21); tín hiệu của 3 nhóm oxymetin ở C 77,0 (C-3), 79,5 (C-23), 78,1 (C-24)

cùng với tín hiệu của 2 nhóm metoxy C 55,2 (21-OMe) và 49,6 (25-OMe). Kết hợp

với nhận xét từ phổ khối trong cấu trúc có 6 đơn vị bất bão hòa, còn trên phổ

cacbon thấy xuất hiện tín hiệu của một nối đôi nên trong cấu trúc của hợp chất 01 sẽ

có 5 vòng.

56

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của 01 tương tự với phổ NMR của agladupol D

[31] chỉ khác là xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm metoxy trong 01. Tương tác

của các proton trên các cacbon đứng cạnh nhau được thể hiện trên phổ COSY (hình

PL2) cho thấy liên kết đôi ở vị trí C7=C8 thể hiện qua tương tác giữa H2-6 (H

1,96/2,06)/H-7 (H 5,30); vòng 21,23-epoxy thể hiện qua các tương tác H-17 (H

2,04)/H-20 (H 2,02), H-20/H-21 (H 4,74), H-20/H2-22 (H 1,74/1,99), H-22/H-23

(H 4,35), H-23/H-24 (H 3,28).

Tương tác trên phổ HMBC (hình PL4) của proton trong 2 nhóm metyl H3-26

(H 1,19)/H3-27 (H 1,24) với C-25 (C 78,6) cũng như của proton trong nhóm

metoxy ở H 3,25 với C-25 (C 78,6) khẳng định nhóm metoxy này nối với C-25.

Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HMBC và COSY (hình 4.7) cho phép xác

định cấu trúc phẳng của 01.

Độ chuyển dời hóa học của C-3 trên phổ 13C-NMR ở C 77,0 tương tự với

agladupol D [31] ở C 76,1, nhưng khác với C-3 của hợp chất 21,23-epoxy-21-

methoxytirucall-7-ene-3,24,25-triol [29] với C 79,2 cho thấy nhóm hydroxy nối

với C-3 theo cấu hình . Điều này cũng được xác định thêm khi thấy tín hiệu của

proton H-3 xuất hiện ở dạng pic đơn rộng, ngược lại với đa pic trong trường hợp

nhóm hydroxy nối với C-3 theo cấu hình [29]. Tương tự, cấu hình của nhóm

metoxy ở C-21 (C 106,0) cũng giống như trong hợp chất agladupol D [31] với C

104,8 và khác với agladupol E ở C 108,9. Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR

cùng với phổ HSQC (hình PL3) của đoạn cấu trúc từ C-23 đến C-27 trong 01 tương

tự với agladoral E [35] cho thấy hai hợp chất này có cùng cấu hình ở C-23 và C-24.

Thêm vào đó, cấu hình tương đối của 01 cũng được khẳng định thêm thông

qua phổ NOESY (hình 4.6). Proton H-20 (H 2,02) có tương tác NOE với H-21 (H

4,74) và H-23 (H 4,35) khẳng định rằng H-20, H-21 và H-23 đều có cấu hình .

Các tương tác NOESY chính của hợp chất 01 được thể hiện trên hình 4.8. Do đó

cấu trúc của 01 được khẳng định là 21,23-epoxy-21,25-dimethoxytirucall-7-ene-

3,24-diol, đây là hợp chất mới và được đặt tên là paramignyol A.

57

Hình 4.6. Phổ NOESY của hợp chất 01

HMBC COSY

Hình 4.7. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 01

Hình 4.8. Tương tác NOESY chính của hợp chất 01

Cấu trúc hóa học của hợp chất 01 được thể hiện trên hình 4.9 và độ dịch

chuyển hóa học chi tiết của cacbon và proton được thể hiện trên bảng 4.1.

58

Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 01

C aC bC

cC Cd,e

Hd,f

dạng pic

(J, Hz)

HMBC

(H C)

1 37,2 31,6 32,44 1,38 m/1,55 m

2 27,7 25,3 26,43 1,60 m/1,96 m

3 79,2 76,1 76,98 3,41 br s 1, 5

4 39,0 37,3 38,34 -

5 50,7 44,5 45,80 1,82 dd (6,5, 11,0)

6 24,0 23,8 25,02 1,96 m/2,06 m

7 118,2 118,1 119,53 5,30 br d (3,0)

8 145,4 145,6 147,16 -

9 48,8 48,3 49,82 2,43 m

10 35,0 34,7 35,86 -

11 17,7 17,4 18,63 1,55 m/1,65 m 8

12 31,2 31,1 32,54 1,43 m/1,92 m

13 43,5 43,5 44,71 -

14 50,7 50,9 52,97 -

15 34,2 34,3 35,31 1,52 m/1,61 m

16 27,3 27,3 28,25 1,40 m/1,90 m

17 45,0 50,2 46,41 2,04 m 21

18 23,2 22,5 23,54 0,92 s 12, 13, 14, 17

19 13,1 12,9 13,54 0,83 s 1, 5, 9, 10

20 46,2 46,3 47,7 47,92 2,02 m

21 109,2 104,9 108,9 105,99 4,74 br d (3,0) 17, 23, OMe

22 35,5 31,6 33,7 33,81 1,74 m/1,99 m

23 75,0 78,8 76,6 79,52 4,35 m

24 76,2 76,6 75,4 78,09 3,28 d (3,5)

25 77,0 72,9 73,0 78,57 -

26 20,1 26,4 26,4 20,78 1,19 s 24, 25, 27

27 21,6 26,3 26,3 22,70 1,24 s 24, 25, 26

28 27,6 27,7 28,56 0,94 s 3, 4, 5, 29

29 14,7 21,7 22,36 0,94 s 3, 4, 5, 28

30 27,3 27,1 27,85 1,03 s 8, 13, 14,15

21-OMe 55,4 55,2 55,6 55,20 3,37 s 21

25-OMe 49,1 49,57 3,25 s 25

aC của agladoral E [35], bC của 21,23-epoxy-21-methoxytirucall-7-ene-3,24,25-triol

[29], cC của agladupol E [31], d đo trong CD3OD, e125 MHz, f500 MHz.

59

Hình 4.9. Cấu trúc hóa học của hợp chất 01

4.2.2. Hợp chất 02: Paramignyol B (Chất mới)

Hợp chất 02 được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Công

thức phân tử của nó được xác định là C32H54O5 (M = 518) bằng kết quả phổ khối

lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 541,3883 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

công thức C32H54O5Na là 541,3869) và cho thấy trong cấu trúc có 6 đơn vị bất bão

hòa (Hình PL5).


Trên phổ 1H-NMR (hình 4.10) của hợp chất 02 xuất hiện các tín hiệu pic đơn

của 7 nhóm methyl tại H 0,92 (H-18), 0,83 (H-19), 1,20 (H-26), 1,26 (H-27), 0,93

60

(H-28), 0,93 (H-29) và 1,04 (H-30). Ngoài ra còn có pic đơn của 2 nhóm metoxy ở

H 3,35 (3H, s, 21-OMe) và 3,25 (3H, s, 25-OMe).


Khi so sánh với độ dịch chuyển hóa học của các proton trong hợp chất 01 đã

nêu ở trên, nhận thấy đa số các tín hiệu đều trùng khớp, ngoại trừ độ dịch chuyển

hóa học của các proton ở C-21 đến C-24 có sự thay đổi chứng tỏ vòng 21,23-epoxy

có sự thay đổi về cấu hình.

Phổ 13C-NMR của hợp chất 02 (hình 4.11) xuất hiện các tín hiệu trùng khớp

khi so sánh với độ dịch chuyển hóa học của các cacbon trong hợp chất 01 đã nêu ở

trên, ngoại trừ độ dịch chuyển hóa học của các cacbon 20, 21, 22 dịch chuyển về

trường thấp hơn và độ dịch chuyển hóa học của các cacbon 23, 24 dịch chuyển về

trường cao hơn chứng tỏ vòng 21,23-epoxy có sự thay đổi về cấu hình. Có lẽ ở

nhóm methoxy nối với C-21 theo cấu hình vì độ chênh lệch khoảng 4 ppm.

Phổ COSY (hình PL6), HSQC (hình PL7), HMBC (hình PL8) của 02 tương tự

với các phổ NMR của hợp chất 01, phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HMBC

và COSY (hình 4.13) cho phép xác định cấu trúc phẳng của 02.

61

Thêm vào đó, cấu hình tương đối của 02 cũng được khẳng định thêm thông

qua phổ NOESY (hình 4.12). Proton H-21 (H 4,81) có tương tác NOE với H-17 (H

1,86) nhưng không có tương tác với H-20 (H 2,18) khẳng định cấu hình của H-

21. Các tương tác NOESY chính của hợp chất 02 thể hiện trên hình 4.14.

Hình 4.12. Phổ NOESY của hợp chất 02

HMBC COSY

Hình 4.13. Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 02

Hình 4.14. Tương tác NOESY chính của hợp chất 02

62

Do đó cấu trúc của 02 được khẳng định là 21,23-epoxy-21,25-

dimethoxytirucall-7-ene-3,24-diol, đây là hợp chất mới và được đặt tên là

paramignyol B (hình 4.15). Các dữ liệu NMR của 02 được trình bày trong bảng 4.2.


C aC bC

cC Cd,e H

d,f dạng pic

(J, Hz)

HMBC

(H C)

1 37,2 31,6 32,45 1,38 m/1,57 m

2 27,7 25,3 26,46 1,60 m/1,97 m

3 79,2 76,1 76,98 3,41 br s 1, 5

4 39,0 37,3 38,35 -

5 50,7 44,5 45,78 1,82 m

6 24,0 23,8 25,02 1,98 m/2,07 m

7 118,2 118,1 119,53 5,30 br d (3,5)

8 145,4 145,6 147,13 -

9 48,8 48,3 49,86 2,43 m

10 35,0 34,7 35,88 -

11 17,7 17,4 18,63 1,57 m/1,65 m 8

12 31,2 31,1 32,98 1,62 m/1,85 m

13 43,5 43,5 44,85 -

14 50,7 50,9 52,17 -

15 34,2 34,3 34,96 1,52 m/1,62 m

16 27,3 27,3 28,40 1,36 m/1,95 m

17 45,0 50,2 51,18 1,86 m 21

18 23,2 22,5 23,04 0,92 s 12, 13, 14, 17

19 13,1 12,9 13,54 0,83 s 1, 5, 9, 10

20 46,2 46,3 47,7 49,00 2,18 m

21 109,2 104,9 108,9 110,19 4,81 dd (3,0, 6,5) 17, 23, OMe

22 35,5 31,6 33,7 36,85 1,61 m/1,99 m

23 75,0 78,8 76,6 76,62 4,17 m

24 76,2 76,6 75,4 76,75 3,37 d (3,5)

25 77,0 72,9 73,0 78,73 -

26 20,1 26,4 26,4 20,83 1,20 s 24, 25, 27

27 21,6 26,3 26,3 22,56 1,26 s 24, 25, 26

28 27,6 27,7 28,57 0,93 s 3, 4, 5, 29

29 14,7 21,7 22,38 0,93 s 3, 4, 5, 28

30 27,3 27,1 27,75 1,04 s 8, 13, 14,15

21-OMe 55,4 55,2 55,6 55,68 3,35 s 21

25-OMe 49,1 49,28 3,25 s 25

aC của agladoral E [35], bC của 21,23-epoxy-21-methoxytirucall-7-ene-3,24,25-triol

[29], cC của agladupol E [31], d đo trong CD3OD, e 125 MHz, f 500 MHz

63

Hình 4.15. Cấu trúc hóa học của hợp chất PS15

4.2.3. Hợp chất 03: Paramignyoside A (Chất mới)


của nó được xác định là C42H66O17 (M = 842) bằng kết quả phổ khối lượng phân

giải cao HR-ESI-MS (hình PL9) tại m/z 865,4233 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho

công thức C42H66O17Na+ là 865,4192).


64

Trên phổ 1H-NMR (hình 4.16) của hợp chất 03 xuất hiện tín hiệu pic đơn của

6 nhóm metyl tại H 0,91 (H-18), 0,74 (H-19), 1,26 (H-26), 1,24 (H-27), 1,31 (H-

28) và 1,03 (H-30) cùng với tín hiệu pic đôi của 1 proton metin olefin với hằng số

ghép đôi nhỏ tại H 5,30 (d, J = 2,5 Hz, H-7) cho thấy dạng khung tirucallan tương

tự hợp chất paramignyol đã phân tích ở trên, ngoại trừ không có tín hiệu của nhóm

metyl ở C-29. Ngoài ra còn có pic đơn của 2 nhóm metoxy ở H 3,37 (3H, s, 21-

OMe) và 3,25 (3H, s, 25-OMe). Hai proton anome ở H 5,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-

1) và 4,59 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1) có tương tác với 2 cacbon anome ở C 95,0 (C-

1) và 105,1 (C-1) trên phổ HSQC (hình PL10).


Phổ 13C-NMR (hình 4.17) của hợp chất 03 xuất hiện tín hiệu của 42 cacbon

của khung triterpen và gốc đường. So sánh các giá trị chuyển dịch hóa học 13C-

NMR của gốc đường (bảng 4.3) với các giá trị tương ứng của hợp chất ()-4-[β-D-

glucopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyloxy]benzyl alcohol [36] và kết hợp với

65

việc thủy phân axit cũng như phân tích phổ COSY (hình 4.18) và HMBC (hình PL

11) cấu trúc của phần đường là β-D-glucopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranoside.

Phổ 13C-NMR của phần aglycon cho tín hiệu đặc trưng của 6 nhóm metyl bậc

3 tại C 23,8 (C-18), 12,8 (C-19), 26,7 (C-26), 26,4 (C-27), 24,3 (C-28) và 27,9 (C-

30); tín hiệu của 1 liên kết đôi 3 lần thế tại C 119,5 (C-7) và 145,6 (C-8); tín hiệu

của 1 cacbon bậc 4 nối với nguyên tử ôxy ở C 72,8 (C-25); 2 cacbon carbonyl tại

C 181,3 (C-21) và 176,6 (C-29); tín hiệu của 3 nhóm oxymetin ở C 71,4 (C-3),

80,2 (C-23), 78,1 (C-24). Dữ liệu phổ NMR của 03 tương tự với dữ liệu phổ của

mesendanin M [37] ngoại trừ việc thay thế nhóm oximetilen trong mesendanin M

bằng nhóm cacbonyl trong 03. Vị trí của nhóm cacbonyl thay thế ở C-29 được xác

nhận bởi tương tác HMBC của H-5 (H 2,06) và H-28 (H 1,31) với C-29 (C

176,6). Ngoài ra, tương tác mạnh giữa proton anome H-1 (H 5,88) với C-29 (C

176,6) cho thấy chuỗi hai gốc đường gắn vào cacbon này. Phân tích chi tiết các

tương tác COSY và HMBC được trình bày trong hình 4.20.

Hình 4.18. Phổ COSY của hợp chất 03

66

Cấu hình không gian của 03 được thiết lập khi so sánh các giá trị phổ NMR và

hằng số ghép đôi với các hợp chất tương tự [37-39] cùng với phân tích trên phổ

ROESY (hình 4.19). Tương tác ROESY của proton H-3 ở H 4,10 (1H, d, J = 2,5

Hz) và cacbon C-3 ở C 71,4 cho thấy cấu hình của H-3 [37, 38]. Cấu hình của

nhóm metyl C-28 ở C 24,3 khác với cấu hình β của nhóm metyl C-28 trong hợp

chất so sánh [39] ở C 17,5 cũng như khi quan sát tương tác của H-28 (H 1,31) với

H-5 (H 2,06)/Hα-6 (H 2,20) và tương tác của Hβ-6 (H 2,84) với H-19 (H 0,74)

trên phổ ROESY.

Do đó cấu trúc của 03 đã được khẳng định, đây là hợp chất mới và được đặt

tên là Paramignyoside A.

Hình 4.19. Phổ ROESY của hợp chất 03

67

Hình 4.20. Cấu trúc hóa học và tương tác COSY, HMBC và ROESY chính

của hợp chất 03




C aC bC C

c,d Hc,e

Dạng pic (J = Hz)

HMBC

(H C)

1 32,4 32,99 1,42 m/1,54 m

2 26,2 27,78 1,67 m/2,28 m

3 71,1 71,38 4,10 d (2,5) 1, 4, 5

4 43,5 49,55 -

5 46,7 46,49 2,06 m 4, 6, 10, 19, 29

6 24,7 25,41 2,20 m/2,84 m

7 119,5 119,55 5,31 d (2,5)

8 146,9 145,64 -

68

9 50,0 49,12 2,41 m

10 35,7 36,35 -

11 32,4 18,88 1,56 m/1,69 m 8

12 32,3 32,44 1,79 m

13 44,8 44,80 -

14 51,7 51,74 -

15 35,0 34,94 1,57 m/1,64 m

16 24,7 24,77 1,60 m/1,82 m 20

17 48,6 48,66 2,38 m 21

18 23,9 23,85 0,91 s 12, 13, 14, 17

19 14,3 12,80 0,74 s 1, 5, 9, 10

20 42,0 42,02 2,83 m 13, 16, 17, 21, 22

21 181,4 181,35 -

22 29,3 29,41 2,29 m/2,31 m 21, 20, 24

23 80,3 80,21 4,68 m

24 78,1 78,10 3,63 d (2,5)

25 72,8 72,77 -

26 26,8 26,75 1,26 s 24, 25, 27

27 26,4 26,41 1,24 s 24, 25, 26

28 22,4 24,29 1,31 s 3, 4, 5, 29

29 65,6 176,64 -

30 27,9 27,94 1,07 s 8, 13, 14,15

Glc I

1 99,8 94,96 5,88 d (8,0) 28

2 71,9 73,42 3,58 dd (8,0, 9,0) 1, 3, 4, 7

3 87,7 88,19 3,64 2, 4, 1

4 68,1 69,48 3,52 t (9,0)

5 76,4 78,48 3,44 m

6 60,4 62,28 3,74 dd (4,5, 12,0)

3,86 br d (12,0)

Glc II

1 104,0 105,06 4,59 d (8,0) 3

2 73,8 75,39 3,32f 1

3 76,0 77,78 3,41 t (9,0)

4 70,1 71,52 3,31f

5 76,9 78,15 3,37 m

6 61,1 62,58 3,67 dd (6,0, 12,0)

3,92 dd (1,5, 12,0)

aC của gốc đường trong DMSO-d6 của ()-4-[β-D-Glucopyranosyl-(13)-β-D-

glucopyranosyloxy]benzyl alcohol [36], bC của mesendanin M [37], c đo trong CD3OD, d125 MHz, e500 MHz, ftín hiệu bị chồng lấp.

69

4.2.4. Hợp chất 04: Paramignyoside B (Chất mới)



giải cao HR-ESI-MS (hình PL12) tại m/z 907,4315 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết

cho công thức C44H68O18Na+ là 907,4298).


Phổ 1H-NMR (hình 4.21) và phổ 13C-NMR (hình 4.22) tương tự với các phổ

NMR của hợp chất 03 đã phân tích ở trên chỉ khác ở chỗ có thêm nhóm acetyl tại C

171,7 và C 21,2 (q)/H 2,10 (3H, s). Độ chuyển dịch hóa học của proton H-2 dịch

chuyển mạnh về trường thấp ở H 5,10 gợi ý cho việc xuất hiện một nhóm este ở C-

2 [40] và được xác nhận bởi tương tác của proton H-2 (H 5,10) với cacbon

cacbonyl ở C 171,7 trên phổ HMBC (hình PL15).

Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ COSY (hình PL13), phổ HSQC (hình

PL14) và phổ HMBC cho phép xác định cấu trúc phẳng của hợp chất 04. Cấu hình

không gian của hợp chất 04 còn được chứng minh qua phổ ROESY (hình PL16).

70






71


tên là Paramignyoside B.

Bảng 4.4. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PS32

C aC bC C

c,d Hc,e

dạng pic (J = Hz)

HMBC

(H C)

1 32,4 32,9 1,41 m/1,52 m

2 26,2 27,9 1,62 m/2,00 m

3 71,1 71,1 4,02 br s 1, 4, 5

4 43,5 49,4 -

5 46,7 46,3 2,03 m 4, 6, 10, 19, 29

6 24,7 25,3 2,26 m/2,78 m

7 119,5 119,5 5,30 d (2,5)

8 146,9 145,6 -

9 50,0 49,1 2,41 m

10 35,7 36,3 -

11 32,4 18,9 1,57 m/1,68 m 8

12 32,3 32,4 1,79 m

13 44,8 44,8 -

14 51,7 51,7 -

15 35,0 34,9 1,57 m/1,63 m

16 24,7 24,7 1,60 m/1,82 m 20

17 48,6 48,6 2,38 m 21

18 23,9 23,8 0,91 s 12, 13, 14, 17

19 14,3 12,9 0,70 s 1, 5, 9, 10

20 42,0 42,0 2,83 m 13, 16, 17, 21, 22

21 181,4 181,4 -

22 29,3 29,4 2,29 m/2,31 m 21, 20, 24

23 80,3 80,2 4,68 m

24 78,1 78,1 3,63 d (3,5)

25 72,8 72,8 -

26 26,8 26,7 1,25 s 24, 25, 27

27 26,4 26,4 1,23 s 24, 25, 26

28 22,4 24,0 1,23 s 3, 4, 5, 29

29 65,6 176,5 -

30 27,9 27,9 1,07 s 8, 13, 14,15

Glc I

1 98,3 93,1 5,69 d (8,0) 28

2 71,8 72,4 5,10 dd (8,0, 9,0) 1, 3, 4, 7

3 83,8 85,4 3,83 t (9,0) 2, 4, 1

4 68,3 69,6 3,60 t (9,0)

72

5 77,3 78,7 3,50 m

6 60,3 62,1 3,77 dd (4,5, 12,0)

3,88 br d (12,0)

OAc 170,2 171,7

OAc 20,8 21,2 2,10 s

Glc II

1 104,1 105,4 4,40 d (8,0) 3

2 73,3 74,9 3,21 dd (8,0, 9,0) 1

3 76,8 77,9 3,37f

4 70,2 71,4 3,31f

5 77,1 78,1 3,37 m

6 61,2 62,5 3,67 dd (6,0, 12,0)

3,9 dd (1,5, 12,0)

aC phần gốc đường trong DMSO-d6 + CF3COOD của luteolinidin 5-O-β-D-[3-O-β-D-

glucopyranosyl-2-O-acetylglucopyranoside] [40], bC của mesendanin M [37], c đo trong

CD3OD, d125 MHz, e500 MHz, ftín hiệu bị chồng lấp.

4.2.5. Hợp chất 05: Paramignyoside C (Chất mới)




cho công thức C42H66O17Na+ là 865,4192) tương tự như hợp chất Paramignyoside

A.


73



NMR của hợp chất 04 đã phân tích ở trên chỉ khác nhau ở mạch nhánh và gốc

đường. Độ chuyển dịch hóa học của cacbon nối với ôxi C-25 dịch chuyển mạnh về

trường thấp ở C 80,2 gợi ý cho việc glycosyl hóa ở cacbon này và được xác nhận

bởi tương tác của proton H-1 (H 4,52) với C-25 (C 80,2) trên phổ HMBC (hình

PL20). Bên cạnh đó, gốc đường glucozơ còn lại ở C-29 cũng được khẳng định qua

tương tác giữa H-1 (H 5,50) với C-29 (C 176,9) trên phổ HMBC.







tên là Paramignyoside C.

74




C aC Cb,c H

b,d Dạng pic

(J = Hz)

HMBC

(H C)

1 37,3 33,01 1,42 m/1,55 m

2 27,8 28,00 1,66 m/2,29 m

3 79,3 71,46 4,10 br s 1, 5

4 39,1 49,62 -

5 50,9 46,52 2,05 m 4, 6, 10

6 24,1 25,48 2,10 m/2,85 m

7 118,4 119,60 5,30 br s

8 145,3 145,70 -

9 49,0 49,59 2,41

10 35,2 36,37 -

11 17,6 18,90 1,58 m/1,69 m 8

12 31,3 32,46 1,80 m

13 43,9 44,84 -

14 50,6 51,75 -

15 34,0 34,95 1,57 m/1,64 m

16 24,0 25,00 1,60 m/1,80 m 20

17 47,3 49,45 2,38 m

18 23,6 23,88 0,93 s 12, 13, 14, 17

19 13,2 12,90 0,74 s 1, 5, 9, 10

20 40,4 41,98 2,81 m 21

21 178,2 181,36 -

75

22 29,7 29,60 2,32 m/2,60 m 21, 20, 24

23 77,4 80,09 4,77 m

24 76,3 77,71 3,78 d (3,0) 21

25 72,7 80,18 -

26 26,7 24,48 1,36 s 24, 25, 27

27 26,7 23,44 1,33 s 24, 25, 26

28 27,7 24,24 1,31 s 3, 4, 5, 29

29 14,8 176,93 -

30 27,5 27,93 1,07 s 8, 13, 14,15

Glc I

1 95,48 5,50 (d, 8,0) 28

2 74,11 3,38

3 78,52 3,44

4 71,17 3,40

5 78,00 3,29

6 62,83 3,67/3,89

Glc II

1 98,42 4,52 d (7,5) 25

2 75,38 3,16

3 78,80 3,39

4 71,72 3,29

5 78,00 3,39

6 62,67 3,70/3,85

aC của cochinchinoid K [41], bđo trong CD3OD, c125 MHz, d500 MHz.

4.2.6. Hợp chất 06: Paramignyoside D (Chất mới)






NMR của hợp chất Paramignyoside A đã phân tích ở trên chỉ khác nhau do xuất

hiện thêm một gốc đường glucozơ. Độ chuyển dịch hóa học của cacbon nối với ôxi

C-25 dịch chuyển mạnh về trường thấp ở C 81,1 gợi ý cho việc glycosyl hóa ở

cacbon này tương tự như Paramignyoside C và được xác nhận bởi tương tác của

proton H-1 (H 4,55) với C-25 (C 81,1) trên phổ HMBC (hình PL25).

76


Hình 4.28. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất PS30




Cấu trúc hóa học của hợp chất 06 được thể hiện trên hình 4.29 và độ dịch chuyển

77

hóa học chi tiết của cacbon và proton được thể hiện trên bảng 4.6. Do đó cấu trúc

của 06 đã được khẳng định, đây là hợp chất mới và được đặt tên là Paramignyoside

D.



Bảng 4.6. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PS30

C aC bC C

c,d Hc,e

Dang pic (J = Hz)

HMBC

(H C)

1 32,4 32,99 1,42 m/1,55 m

2 26,2 27,77 1,66 m/2,28 m

3 71,1 71,31 4,11 br s 1, 5

4 43,5 49,55 -

5 46,7 46,65 2,06 m 4, 6, 10

6 24,7 25,41 2,20 m/2,85 m

7 119,5 119,56 5,30 d (3,0)

8 146,9 145,64 -

9 50,0 48,83 2,41 m

10 35,7 36,35 -

11 32,4 18,87 1,57 m/1,70 m 8

12 32,3 32,40 1,79 m

13 44,8 44,81 -

14 51,7 51,71 -

78

15 35,0 34,95 1,58 m/1,63 m

16 24,7 24,67 1,66 m/2,28 m 20

17 48,6 48,49 2,40 m

18 23,9 23,90 0,91 s 12, 13, 14, 17

19 14,3 12,79 0,75 s 1, 5, 9, 10

20 42,0 41,62 2,80 m 21

21 181,4 181,55 -

22 29,3 31,65 2,27 m/2,33 m 21, 20, 24

23 80,3 78,47 4,78 m

24 78,1 77,72 3,50 d (2,0) 21

25 72,8 81,11 -

26 26,8 23,65 1,38 s 24, 25, 27

27 26,4 23,30 1,34 s 24, 25, 26

28 22,4 24,29 1,31 s 3, 4, 5, 29

29 65,6 176,65 -

30 27,9 27,94 1,07 s 8, 13, 14,15

Glc I

1 99,8 94,97 5,58 d (8,0) 28

2 71,9 73,43 3,58 dd (8,0, 9,0)

3 87,7 88,15 3,64 t (9,0)

4 68,1 69,50 3,52 t (9,0)

5 76,4 78,40 3,43 m

6 60,4 62,30 3,75 dd (4,5, 12,0)

3,87 dd (2,5, 12,0)

Glc II

1 104,0 105,06 4,58 d (8,0) 3

2 73,8 75,38 3,32

3 76,0 78,14 3,37

4 70,1 71,52 3,31

5 76,9 77,60 3,28 m

6 61,1 62,57 3,67/3,85 dd (2,5, 12,0)

Glc III

1 98,47 4,55 d (7,5) 25

2 75,16 3,18 dd (7,5, 9,0)

3 77,77 3,41 t (9,0)

4 71,67 3,30

5 78,14 3,37

6 62,72 3,67/3,91 dd (2,5, 12,0)

aC phần đường của()-4-[β-D-Glucopyranosyl-(13)-β-D-glucopyranosyloxy]benzyl

alcohol [36], bC của mesendanin M [37], c đo trong CD3OD, d125 MHz, e500 MHz

79

4.2.7. Hợp chất 07: Paramignyoside E (Chất mới)







NMR của hợp chất Paramignyoside D đã phân tích ở trên chỉ khác nhau do xuất

hiện thêm một nhóm acetyl [C 171,7 và C 21,2 (q)/H 2,09 (3H, s)]. Tương tác

mạnh của proton H-2 (H 5,10) với cacbon cacbonyl ở C 171,7 cho thấy nhóm

acetyl nối vào C-2 trên phổ HMBC (hình PL30).


PL29) và phổ HMBC cho phép xác định cấu trúc phẳng của hợp chất PS30. Cấu

hình không gian của hợp chất PS30 còn được chứng minh qua phổ NOESY (hình

PL31).

80





tên là Paramignyoside E.



81


C aC bC C

c,d Hc,e

Dạng pic (J = Hz)

HMBC

(H C)

1 37,3 32,92 1,41 m/1,53 m

2 27,8 27,90 1,62 m/2,00 m

3 79,3 71,12 4,02 br s 1, 5

4 39,1 49,66 -

5 50,9 46,27 2,03 m 4, 6, 10

6 24,1 25,37 2,15 m/2,80 m

7 118,4 119,59 5,31 d (3,0)

8 145,3 145,59 -

9 49,0 49,45 2,41

10 35,2 36,32 -

11 17,6 18,88 1,58 m/1,68 m 8

12 31,3 32,40 1,79 m

13 43,9 44,82 -

14 50,6 51,72 -

15 34,0 34,95 1,58 m/1,63 m

16 24,0 24,69 1,60 m/1,82 m 20

17 47,3 49,28 2,40 m

18 23,6 23,90 0,91 s 12, 13, 14, 17

19 13,2 12,91 0,70 s 1, 5, 9, 10

20 40,4 41,64 2,80 m 21

21 178,2 181,54 -

22 29,7 31,67 2,27 m/2,33 m 21, 20, 24

23 77,4 78,42 4,77 m

24 76,3 77,76 3,50 d (2,0) 21

25 72,7 81,11 -

26 26,7 23,67 1,35 s 24, 25, 27

27 26,7 23,26 1,35 s 24, 25, 26

28 27,7 24,02 1,23 s 3, 4, 5, 29

29 14,8 176,42 -

30 27,5 27,94 1,08 s 8, 13, 14,15

Ac-Glc

1 99,8 93,15 5,69 d (8,0) 28

2 73,6 72,42 5,10 dd (8,0, 9,0) 1, 3, 4, 7

3 84,7 85,45 3,83 t (9,0) 2, 4, 1

82

4 69,8 69,60 3,60 t (9,0)

5 78,2 78,70 3,49 m

6 62,3 62,11 3,77 dd (4,5, 12,0)

3,88

7 171,59 -

8 21,24 2,09 s 7

Glc I

1 105,0 105,41 4,39 d (8,0) 3

2 74,7 74,67 3,21 dd (8,0, 9,0) 1

3 77,7 78,02 3,37

4 71,3 71,39 3,31

5 78,2 77,63 3,27

6 62,5 62,74 3,66/3,85

Glc II

1 98,49 4,55 d (7,5) 25

2 75,19 3,17 dd (7,5, 9,0) 1, 3

3 78,15 3,39

4 71,69 3,34

5 78,09 3,35

6 62,51 3,67/3,90

aC phần đường của kaempferol 3-O-[2-O-(trans-p-coumaroyl)-3-O-β-D-glucopyranosyl]-

β-D-glucopyranoside [42], bC của cochinchinoid K [41], cđo trong CD3OD, d125 MHz, e500 MHz

4.2.8. Hợp chất 08: Methyl isolimonate

Hợp chất 08 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H và 13C-NMR của

nó đặc trưng cho một hợp chất nortritecpen dạng khung limonoit, một lớp chất

chính đã được phân lập từ nhiều loài thực vật thuộc họ cam - Rutaceae. Trên phổ

1H-NMR (hình 4.33) của nó xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của một nhóm metoxi

[H 3,75 (3H, s, OMe)] và bốn nhóm metyl gắn với cacbon bậc 4 [H 1,20 (H-18),

1,13 (H-28), 1,26 (H-29) và 1,42 (H-30), tương ứng mỗi tín hiệu 3H, s]. Ngoài ra,

ba tín hiệu xuất hiện ở vùng trường thấp tại H 7,41 (1H, br s, H-21), 6,33 (1H, d, J

= 1,0 Hz, H-22) và 7,40 (1H, t, J = 1,0 Hz, H-23) gợi ý cho cấu trúc mạch bên dạng

vòng furan. Dự đoán này được khẳng định bởi sự xuất hiện 04 tín hiệu của một

vòng furan tại C 120,34 (s, C-20), 141,16 (d, C-21), 109,79 (d, C-22) và 143,07 (d,

83

C-23) trên phổ 13C-NMR (hình 4.34) của 08. Ngoài ra, các tín hiệu cacbon của một

nhóm metoxi [C 52,25 (OMe)], bốn nhóm metyl [C 19,60 (C-18), 24,23 (C-28),

28,92 (C-29) và 16,86 (C-30)], một nhóm oximetilen [C 68,73 (C-19)], ba nhóm

oximetin [C 75,00 (C-1), 55,38 (C-15) và 78,14 (C-17)], hai cacbon bậc 4 mang ôxi

[C 83,80 (C-4) và 69,01 (C-14)] và ba nhóm cacbonyl [C 173,64 (C-3), 211,76 (C-

7) và 167,45 (C-16)] cũng được xác định trên cơ sở kết hợp với phân tích phổ

HSQC (hình PL32).

Hình 4.33. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 08

Từ các dữ kiện thu được, số liệu phổ 13C-NMR của 08 được so sánh với các số

liệu tương ứng đã được công bố của methyl uguenenoate [43] và nhận được sự phù

hợp hoàn toàn ở tất cả các vị trí tương ứng (bảng 4.8).

84

Hình 4.34. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất 08

Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HMBC (hình PL33) cho phép xác

định hai hợp chất 08 và methyl uguenenoate có cùng cấu trúc của vòng C, D và E.

Tuy nhiên, xem xét cấu trúc của methyl uguenenoate cho thấy tín hiệu oximetilen

C-19 bị dịch chuyển rất mạnh về phía vùng trường thấp tại C 68,73 là dấu hiệu

không bình thường cho một nhóm oximetilen tự do. Điều này cho phép dự đoán cấu

trúc vòng A của 08 không phải được tạo ra do sự tạo cầu epoxi giữa C-1/C-4 mà

giữa C-19/C-4. Tiếp tục so sánh số liệu phổ 13C-NMR của 08 với các số liệu tương

ứng của methyl isolimonate [44] thì cũng nhận được sự phù hợp hoàn toàn ở hầu

hết các vị trí. Điều này, cùng với tương tác HMBC rất mạnh giữa H-19 (H 4,02) và

C-4 (C 83,80) cho phép khẳng định sự tạo cầu epoxi giữa C-19/C-4. Phân tích chi

tiết các tương tác HMBC khác (hình 4.35) cho phép khẳng định hợp chất 08 chính

là methyl isolimonate với công thức cấu tạo được trình bày trên hình 4.35.

85

Hình 4.35. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất 08


C aC bC C

c Hc Dạng pic

(J = Hz)

HMBC

(H C)

1 74,7 74,9 75,00 4,19 d (10,5) 3, 4, 5, 9, 10

2 36,9 37,2 36,99 2,50 m/2,64 m 1, 3, 10

3 173,6 173,4 173,64 -

4 83,8 83,7 83,80 -

5 48,4 48,66 2,20 d (5,0) 7

6 39,5 39,5 39,57 2,45 m/2,60 m 4, 5, 7

7 211,8 211,8 211,76 -

8 48,3 52,4 48,66 -

9 35,6 35,8 35,67 3,00 m

10 48,7 52,31 -

11 18,5 18,6 18,57 1,70 m/2,18 m

12 27,8 28,0 27,87 1,52 m/1,75 m

13 39,3 39,2 39,31 -

14 69,5 69,0 69,01 -

15 55,4 55,3 55,38 3,94 s 14, 16

16 167,5 167,4 167,45 -

17 78,1 78,1 78,14 5,60 s 12, 14, 20, 21, 22

18 19,6 19,5 19,60 1,20 s 12, 13, 14, 17

19 68,7 68,7 68,73 3,75/4,02 d (6,0) 1, 5, 9, 10

20 120,3 120,3 120,34 -

21 141,1 141,1 141,16 7,41 20, 23

22 109,8 109,7 109,79 6,33 d (1,0) 20, 21, 23

23 143,1 143,0 143,07 7,40 20, 21, 22

28 24,2 24,2 24,23 1,13 s 4, 5, 29

29 28,9 28,9 28,92 1,26 s 4, 5, 28

30 16,9 16,8 16,86 1,42 s 7, 8, 9, 14

OMe 52,3 52,1 52,25 3,75 s 3 aC của methyl uguenenoate [43]; bC của methyl isolimonate [44], cđo trong CDCl3.

86

4.2.9. Hợp chất 09: (6R,9S)-roseoside

Hợp chất 09 thu được từ cặn nước của dịch chiết tổng MeOH của P. scandens

dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của 09 (hình 4.36) cho thấy các vạch tín

hiệu của một nối đôi nội vòng tại H 5,89 (s); các tín hiệu của một nối đôi ở H 5,98

(d, J = 15,5 Hz) và 5,75 (dd, J = 7,0, 15,5 Hz) với hằng số ghép đôi lớn cho thấy 2

proton này ở vị trí trans với nhau; tín hiệu của một proton anome tại H 4,30 (d, J =

7,5 Hz), bốn proton ôxy metylen của phân tử đường trong vùng H 3,18 ÷ 3,32 và

hai proton ôxy metylen khác ở H 3,87 (dd, J = 2,0, 12,0 Hz), 3,65 (dd, J = 6,0,

12,0 Hz) cho thấy trong phân tử có 1 gốc đường -D-glucopyranosyl; cùng với các

tín hiệu của bốn nhóm metyl tại H 1,03 (s), 1,06 (s), 1,31 (d, J = 6,5 Hz) và 1,96 (s)

ppm.


87


Phổ 13C-NMR (hình 4.37) của hợp chất 09 cho tín hiệu của 19 cacbon, trong

đó có 6 cacbon của một gốc đường và 13 cacbon của phần aglycon. Trong đó có 1

cacbon cacbonyl ở C 201,28, 1 cacbon anome của gốc đường tại C 101,25, 4 nhóm

metyl ở C 19,56 ÷ 24,69 và các vạch tín hiệu của hai liên kết đôi ở C 121,12 ÷

167,10. Phân tích các tương tác trên phổ HSQC (hình PL34) và HMBC (hình PL35)

cho thấy phần aglycon của hợp chất 09 có khung 3-oxo-6-hydroxy--ionol với sự

xuất hiện của các tương tác giữa H-2 [H 2,61 (d, J = 17,0 Hz)/2,20 (d, J= 17,0 Hz)]

với C-1 (C 42,41), C-3 (C 201,28), C-6 (C 80,01), C-11 (C 23,48), C-12 (C

24,69); giữa H-4 (H 5,89, s) với C-2 (C 50,72), C-6 (C 80,01), C-13 (C 19,56);

giữa H-7 [H 5,98 (d, J = 15,5 Hz)] với C-5 (C 167,10), C-6 (C 80,01), C-9 (C

74,67); giữa H-9 (H 4,55, m) với C-7 (C 133,72), C-8 (C 133,70), C-10 (C

21,99), C-1’ (C 101,25). Kết hợp với tương tác giữa proton anomer H-1’ [(H 4,30

(d, J = 7,5 Hz)] với C-2’ (C 74,94), C-3’ (C 78,34) và C-9 (C 74,67) cho thấy gốc

đường -D-glucopyranosyl nối với phần agycon qua nhóm hydroxyl của C-9. Như

vậy hợp chất 09 được xác định là roseoside. Do trong cấu trúc của roseoside có 2

88

tâm bất đối ở C-6 và C-9 nên cấu hình chính xác của 09 được khẳng định khi so

sánh với giá trị phổ 13C-NMR của 4 đồng phân (6S, 9S), (6R, 9S), (6S, 9R) và (6R,

9R)-roseoside [45] cho thấy cấu hình của PS02 là (6R,9S)-roseoside (hình 4.38) và

các giá trị phổ NMR thể hiện trong bảng 4.9.

Hình 4.38. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất 09


C δCa δC

b,c δH

b,d dạng pic

(J = Hz)

HMBC

(HC)

1 42,36 42,41 -

2 50,66 50,72 2,61 d (17,0)

2,20 d (17,0)

1, 3, 6, 11, 12

3 201,09 201,28 -

4 127,20 127,12 5,89 br s 2, 6, 13

5 166,90 167,10 -

6 79,98 80,01 -

7 134,12 133,72 5,98 d (15,5) 5, 6, 9

8 133,80 133,70 5,75 dd (7,0, 15,5) 7, 9

9 74,70 74,67 4,55 m 7, 8, 10, 1'

10 22,22 21,99 1,31 d (6,5) 8, 9

11 23,47 23,48 1,06 br s 1, 2

12 24,84 24,69 1,03 br s 1, 6

13 19,39 19,56 1,96 br s 4, 5, 6

1' 100,91 101,25 4,30 d (7,5) 9, 2', 3'

2' 75,00 74,94 3,22*

3' 78,25 78,34 3,32* 2', 4'

4' 71,76 71,66 3,29* 5'

5' 78,12 78,16 3,18 m

6' 62,90 62,82 3,65 dd (6,0, 12,0)

3,87 dd (2,0, 12,0)

aδC của (6R,9S)-roseoside [45], bđo trong CD3OD, c125 MHz, d500 MHz.

89

4.2.10. Hợp chất 10: -D-glucopyranoside methyl salicylate

Hợp chất 10 được phân lập từ cặn nước ở dạng bột màu trắng.

Hình 4.39. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) của hợp chất 10

Phổ 1H-NMR (hình 4.39) của 10 đặc trưng cho một dẫn xuất glycosit với sự

xuất hiện của tín hiệu proton anome tại H 4,78 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1') và các tín

hiệu của các proton gắn với cacbon mang ôxi tại H 3,48÷3,91. Các tín hiệu còn lại

bao gồm tín hiệu của 4 proton trong vòng thơm thể hiện ở H 7,69 (1H, br d, J = 8,0

Hz), 7,40 (1H, dt, J = 8,0, 1,0 Hz), 7,22 (1H, br d, J = 8,0 Hz), 7,01 (1H, br t, J =

8,0 Hz) và tín hiệu của một nhóm methoxy tại H 3,78 (3H, s, OMe).

Phân tích các tương tác trên phổ HSQC (hình PL36) và HMBC (hình PL37)

cho thấy phần aglycon của hợp chất 10 có khung methyl salicylate với sự xuất hiện

của các tương tác giữa H-3 (H 7,69) với C-1 (C 157,79), C-5 (C 134,23), C-6 (C

118,52), C-7 (C 166,68); giữa H-6 (H 7,22) với C-1 (C 157,79), C-2 (C 120,84),

C-4 (C 122,95), C-5 (C 134,23), C-7 (C 166,68). Tương tác giữa H-1’ (H 4,78)

với C-1 (C 157,79) cho thấy gốc đường nối với methyl salicylate qua C-1. Các giá

trị phổ NMR của 10 thể hiện trong bảng 4.10 phù hợp với các giá trị của hợp chất -

90

D-glucopyranoside methyl salicylate đã được công bố [46] nên hợp chất 10 được

xác định là -D-glucopyranoside methyl salicylate với công thức cấu tạo như trong

hình 4.11.


C aC Cb,c H

b,d Dạng pic

(J = Hz)

HMBC

(H C)

Aglycon

1 156,2 157,79 -

2 121,7 120,84 -

3 131,8 131,24 7,69 br d (8,0) 1, 5, 6, 7

4 123,9 122,95 7,01 br t (8,0) 1, 2, 3, 5, 6

5 135,2 134,23 7,40 dt (8,0, 1,0) 1, 2, 3, 6

6 117,5 118,52 7,22 br d (8,0) 1, 2, 4, 5, 7

7 166,9 166,68 -

OMe 53,6 52,40 3,78 s 7

Glc

1 101,5 103,70 4,78 d (7,0) 1

2 73,7 73,48 3,69

3 76,4 75,86 3,68

4 70,1 69,70 3,71

5 76,9 76,28 3,50

6 61,3 61,88 3,88/3,92

aC của -D-glucopyranoside methyl salicylate [46], bđo trong CDCl3, c125MHz, d500MHz

Hình 4.40. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất 10

91


4.2.11. Hợp chất 11: Adenosine

Hợp chất 11 được phân lập từ cặn nước ở dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR

(hình 4.12) của 11 đặc trưng cho một dẫn xuất glycosit với sự xuất hiện của tín hiệu

proton anome tại H 5,88 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-1') và các tín hiệu của các proton

gắn với cacbon mang ôxi [H 4,61 (1H, dd, J = 4,5, 6,0 Hz, H-2'), H 4,14 (1H, dd, J

= 3,5, 7,5 Hz, H-3'), H 3,96 (1H, dd, J = 3,0, 7,5 Hz, H-4'), H 3,67 (1H, m, Ha-5'),

H 3,55 (1H, m, Hb-5')].

Hình 4.42. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất 11

92

Hình 4.43. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất 11

Kết hợp với các tín hiệu trên phổ 13C-NMR (hình 4.43) và phổ DEPT (hình

PL38) của hợp chất 11 tại C 87,90, 85,85, 73,44, 70,60 và 61,64 cho thấy gốc

đường là ribofuranose. Hai tín hiệu dạng pic đơn xuất hiện ở trường thấp H 8,34

(1H, s) và H 8,13 (1H, s) cùng với 1 pic đơn ở H 7,31 (2H, s, NH2) trên phổ 1H-

NMR cùng với các tín hiệu tương ứng trên phổ DEPT gợi ý cho thấy phần aglycon

của 11 là amino-purinyl. So sánh các giá trị phổ NMR của 11 và adenosine [47] trên

bảng 4.11 thấy trùng khớp nên 11 được xác định là adenosine với công thức cấu tạo

như trong hình 4.44.

Hình 4.44. Cấu trúc hoá học của hợp chất 11

93


C aδC δCb, c δH

b, d dạng pic (J = Hz)

2 152,5 152,34 8,13 s

4 149,1 149,05 -

5 119,5 119,32 -

6 156,2 156,12 -

8 140,0 139,85 8,34 s

1 88,1 87,90 5,88 d (6,0)

2 73,6 73,44 4,61 dd (4,5, 6,0)

3 70,9 70,60 4,14 dd (4,5, 7,5)

4 86,1 85,85 3,96 dd (3,0, 7,5)

5 61,9 61,64 3,67 m/3,55 m

NH2 7,31 brs

aC của adenosine [47], bđo trong DMSO-d6, c125 MHz, d500 MHz

4.2.12. Hợp chất 12: 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-glucopyranoside

Hợp chất 12 được phân lập dưới dạng dầu không màu. Phổ 1H-NMR của 12

(hình 4.45) đặc trưng cho một dẫn xuất glycosit với sự xuất hiện của tín hiệu proton

anome tại H 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1') và các tín hiệu của các proton gắn với

cacbon mang ôxi tại H 3,16-3,82 ppm. Phân tích chi tiết sự tách vạch và giá trị

hằng số tương tác (J1′-2′ = 7,5 Hz, J2′-3′ = 9,0 Hz, and J3′-4′ = 9,0 Hz) của các proton

của đơn vị đường cùng với số liệu phổ 13C NMR (bảng 4.12) chứng minh cho sự có

mặt của một đường β-D-glucopyranose [48].

Các tín hiệu còn lại của 12 trên phổ proton và phổ 13C-NMR (hình 4.46) gồm

có hai nhóm metyl [C 27,87 (q, C-4)/H 1,35 (3H, s, H-4) và C 26,67 (q, C-5)/H

1,39 (3H, s, H-5)], một cacbon bậc 4 mang ôxi [C 79,07 (s, C-1)], một cacbon

metin olefin [C 145,40 (d, C-2)/H 6,06 (1H, dd, J = 11,0, 18,0 Hz, H-2)] và một

cacbon metilen olefin [C 114,27 (t, C-3)/H 5,23 (1H, dd, J = 1,5, 18,0 Hz, Ha-3 và

5,13 (1H, dd, J = 1,5, 11,0 Hz, Hb-3)]. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của 12 với các

số liệu đã được công bố (bảng 4.12) kết hợp với phân tích các tương tác trên phổ

HSQC (hình PL39) và phổ HMBC (hình PL40) cho phép khẳng định hợp chất 12 là

1,1-dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-glucopyranoside [49] với công thức cấu tạo được

trình bày trong hình 4.47.

94




95


C aC Cb,c H

b,d dạng pic

(J = Hz)

HMBC

(H C)

Aglycon

1 79,0 79,07 -

2 142,4 145,40 6,06 dd (11,0, 18,0) 4, 5

3 114,4 114,27 5,23 dd (1,5, 18,0)

5,13 dd (1,5, 11,0)

1, 2

4 26,1 27,87 1,35 s 1, 2, 5

5 24,9 26,67 1,39 s 1, 2, 4

Glc

1 97,1 99,56 4,34 d (7,5) 1

2 73,0 75,13 3,16 dd (7,5, 9,0) 1

3 75,6 78,02 3,35 t (9,0)

4 69,7 71,78 3,30 t (9,0)

5 75,4 77,63 3,20 m

6 60,7 62,84 3,65 dd (5,5, 12,0)

3,82 dd (2,5, 12,0) 4, 5

aC của 1,1-dimethylprop-2-enyl 1-O--D-glucopyranoside [49], bđo trong CD3OD, c125 MHz, d500 MHz

4.2.13. Hợp chất 13: Syrigin

Hợp chất 13 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của

13 (hình 4.48) cho thấy tồn tại một gốc đường với sự xuất hiện của bốn proton ôxy

metylen của phân tử đường trong vùng H 3,23 ÷ 3,50 và hai proton ôxy metylen

khác ở H 3,81 (dd, J = 2,5, 12,0 Hz), 3,69 (dd, J = 5,0, 12,0 Hz) cùng với tín hiệu

proton anome bị chồng lấp với tín hiệu của dung môi tại H 4,90 (1H, H-1') nhưng

được xác định rõ khi quan sát trên phổ HSQC (hình PL41) cho thấy trong phân tử

có 1 gốc đường -D-glucopyranosyl. Ngoài ra, còn xuất hiện các tín hiệu của một

liên kết đôi với cấu hình trans tại H 6,57 (1H, d, J = 16,0 Hz) và 6,35 (1H, dt, J =

16,0, 5,5 Hz); tín hiệu của 2 proton xuất hiện ở H 6,77 và tín hiệu của 2 nhóm

metoxy ở H 3,88 (6H, s, OMe).

Các tín hiệu trên phổ proton và phổ 13C-NMR (hình 4.49) cho thấy phần

aglycon của hợp chất 13 có một cacbon bậc bốn [C 135,31 (C-4)], ba cacbon bậc

bốn mang ôxi [C 135,95 (C-1), C 154,36 (C-2, C-6)], hai cacbon metin olefin [C

96

131,27 (C-7)/H 6,57 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7) và 130,09 (C-8)/H 6,35 (1H, dt, J =

16,0, 5,5 Hz, H-8)] cùng với hai cacbon metin của nhân thơm [C 105,55 (C-3, C-

5)/H 6,77 (2H, s, H-3, H-5)] và một cacbon metilen mang ôxi [C 63,57 (C-9)/H

4,54 (2H, dd, J = 5,5, 1,5 Hz, H-9)].



97

So sánh số liệu phổ 13C-NMR của 13 với các số liệu đã được công bố (bảng

4.13) kết hợp với phân tích các tương tác trên phổ HSQC (hình PL41) và phổ

HMBC (hình PL42) cho phép khẳng định hợp chất 13 là syrigin [50] với công thức

cấu tạo được trình bày trong hình 4.50.



C aC Cb,c H

b,d dạng pic (J = Hz) HMBC

HC

Aglycon

1 135,9 135,95 -

2, 6 154,4 154,36 -

3, 5 105,5 105,55 6,77 br s 1

4 135,3 135,31 -

7 131,3 131,27 6,57 d, 16,0 3, 4

8 130,1 130,09 6,35 dt (16,0, 5,5) 4

9 63,6 63,57 4,24 dd (5,5, 1,5) 7, 8

OMe 57,1 57,07 3,88 s

Glc

1 105,4 105,39 4,90f 1

2 75,8 75,75 3,50 dd (7,5, 9,0)

3 77,9 77,85 3,44f

4 71,4 71,38 3,44f

5 78,4 78,37 3,23 m

6 62,6 62,61

3,69 (dd, 12,0, 5,0)

3,81 (dd, 12,0, 2,5)

aC của syringin [50], bđo trong CD3OD, c125 MHz, d500 MHz, ftín hiệu bị chồng lấp

4.2.14. Hợp chất 14: Atripliside B

Hợp chất 14 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng nhạt. Các phổ 1H-

NMR (hình 4.51) và 13C-NMR (hình 4.52) của 14 đặc trưng cho một hợp chất

flavonon diglycosit. Số liệu phổ NMR của chuỗi diglycosit tại C 99,51 (C-1),

98

73,03 (C-2), 75,56 (C-3), 69,65 (C-4), 76,30 (C-5), 66,06 (C-6), 100,63 (C-

1), 70,31 (C-2), 70,74 (C-3), 72,12 (C-4), 68,36 (C-5) và 17,85 (C-6)

minh chứng cho sự xuất hiện của chuỗi đường rutinoside, một chuỗi đường khá phổ

biến trong thiên nhiên. Các tín hiệu của một nhóm oximetin [C 78,41 (C-2)/H 5,49

(1H, dd, J = 2,5, 12,0 Hz, H-2)], một nhóm metilen [C 42,07 (C-3)/H 2,78 (1H, dd,

J = 2,5, 17,0 Hz, Ha-3) và 3,27 (1H, dd, J = 12,0, 17,0 Hz, Hb-3)] và một nhóm

keton [C 197,05] đặc trưng cho khung flavonon cũng được xác định. Ba tín hiệu

proton thuộc vòng thơm có tương tác hệ ABX tại H 6,93 (1H, br s, H-2), 6,94 (1H,

d, J = 8,5 Hz, H-5) và 6,90 (1H, br d, J = 8,5 Hz, H-6) gợi ý cho sự có mặt của

vòng B của dạng khung quercetin. Các tín hiệu proton lại còn của phần aglycon

chứng minh sự có mặt của hai proton thuộc vòng thơm tương tác ở vị trí meta với

nhau [H 6,11 (H-6) và 6,13 (H-8), tương ứng mỗi tín hiệu 1H, d, J = 2,0 Hz] và

một nhóm metoxi [H 3,77 (3H, s, OMe)].


Từ các dữ kiện thu được, số liệu phổ 13C-NMR của 14 được so sánh với các số

liệu tương ứng của atripliside B [51] và nhận được sự phù hợp tại tất cả các vị trí

tương ứng (bảng 4.14). Ngoài ra, phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HSQC

99

(hình PL43) và phổ HMBC (hình PL44) cho phép xác định hợp chất 14 chính là

atripliside B với công thức cấu tạo trong hình 4.53.




C aC Cb,c H

b,d dạng pic

(J = Hz)

HMBC

(H C)

2 79,8 78,41 5,49 dd (2,5, 12,0) 4, 1

3 43,1 42,07 2,78 dd (2,5, 17,0)

3,27 dd (12,0, 17,0) 2, 4, 1

4 197,0 197,05 -

5 163,4 162,53 -

6 96,4 95,61 6,11 d (2,0)

7 166,4 165,18 -

8 97,7 96,43 6,13 d (2,0)

9 164,4 163,07 -

100

10 104,3 103,37 -

1 132,1 130,93 -

2 115,3 114,17 6,93 br s

3 148,4 146,49 -

4 149,1 148,02 -

5 112,3 112,10 6,94 d (8,5)

6 118,1 118,02 6,90 br d (8,5)

OMe 55,8 55,74 3,77 s

1 101,5 99,51 4,96 d (7,5)

2 74,5 73,03 3,23e

3 78,4 75,56 3,54 t (8,5)

4 71,2 69,65 3,24e

5 77,5 76,30 3,27e

6 67,4 66,06 3,43/3,80e

1 102,4 100,63 4,52 s

2 72,1 70,31 3,63 br s

3 72,7 70,74 3,43e

4 74,0 72,12 3,15e

5 69,8 68,36 3,40e

6 18,6 17,85 1,08 d (6,0) 4, 5

aC của Atripliside B [51], bđo trong DMSO-d6, c125 MHz, d500 MHz,

etín hiệu bị chồng lấp

4.2.15. Hợp chất 15: trans-N-p-coumaroyl tyramine

Hợp chất 15 thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của 15 (hình

4.54) cho thấy các tín hiệu của một nối đôi ở H 7,46 (dd, J = 1,5, 15,5 Hz) và 6,40

(dd, J = 1,5, 15,5 Hz) với hằng số ghép đôi lớn cho thấy 2 proton này ở vị trí trans

với nhau; các cặp tín hiệu xuất hiện ở trường thấp ở H 7,41 (2H, dd, J = 2,0, 8,5

Hz), 7,07 (2H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz), 6,80 (2H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz), 6,74 (2H, dd, J =

2,0, 8,5 Hz) cho thấy trong cấu trúc có thể tồn tại hai vòng thơm đã thế hai vị trí

para.


đó có 1 cacbon cacbonyl este ở C 169,26 (C-9), 2 cacbon metin anken ở C 141,79

(C-7) và 118,42 (C-8), 2 nhóm metilen ở C 42,55 (C-8) và 35,80 (C-7). Phân tích

các tương tác trên phổ HSQC (hình PL45) và HMBC (hình PL46) cho thấy hợp chất

15 là trans-N-p-coumaroyl tyramine với sự xuất hiện của các tương tác giữa H-3/H-

101

5 [H 6,80 (dd, J = 2,0, 8,5 Hz)] với C-4 (C 160,49), C-1 (C 127,73); giữa H-7 [H

7,46 (dd, J = 1,5, 15,5 Hz)] với C-2/C-6 (C 130,57), C-9 (C 169,26); giữa H-8 [H

3,48 (dt, J = 1,5, 7,5 Hz)] với C-9, C-1 (C 131,34). Các tương tác HMBC khác

được thể hiện trên hình 4.56 và các giá trị phổ NMR thể hiện trong bảng 4.15.



102


C *Ca,b C

a,c Ha,d dạng pic (J = Hz)

HMBC

(H C)

Aglycon

1 127,6 127,73 -

2, 6 130,6 130,57 7,41 dd (2,0, 8,5)

3, 5 116,3 116,72 6,80 dd (2,0, 8,5) 1, 4

4 160,6 160,49 -

7 141,8 141,79 7,46 dd (1,5, 15,5) 2, 6, 9

8 118,3 118,42 6,40 dd (1,5, 15,5) 1, 9

9 169,2 169,26 -

1 131,3 131,34 -

2, 6 130,7 130,74 7,07 dd (2,0, 8,5) 4, 7

3, 5 116,7 116,17 6,74 dd (2,0, 8,5) 1, 4

4 156,9 156,89 -

7 35,8 35,80 2,77 br d (7,5) 8

8 42,6 42,55 3,48 dt (1,5, 7,5) 9, 1, 7

*C của trans-N-p-coumaroyl tyramine [52], ađo trong CD3OD, b100 MHz,

c125 MHz, d500 MHz.


4.2.16. Hợp chất 16: 2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--L-

rhamnopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside

Hợp chất 16 thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của 16 (hình

4.57) cho thấy các tín hiệu của một nối đôi ở H 6,36 (dd, J = 1,5, 16,0 Hz) và 6,40

(dd, J = 1,5, 15,5 Hz) với hằng số ghép đôi lớn cho thấy 2 proton này ở vị trí trans

với nhau; các tín hiệu của 2 gốc đường xuất hiện trong vùng 3,33 ÷ 4,78 ppm với

proton anome của gốc đường thứ nhất ở H 4,78 (d, J = 7,5 Hz) cho thấy có cấu

hình và proton anome của gốc đường thứ hai ở H 4,69 (d, J = 1,5 Hz) cho thấy có

cấu hình .

103



104


đó tín hiệu của 2 cacbon anome của 2 gốc đường xuất hiện ở C 105,51 (C-1),

102,14 (C-1). Kết hợp với phân tích trên phổ HSQC (hình PL47) và phổ HMBC

(hình PL48) cho thấy hai cacbon metin trong nhân phenyl mang 4 nhóm thế ở C

104,78 (C-3, C-5)/H (2H, 6,68, s) cùng với các tương tác giữa H-3/H-5 với C-1 (C

135,24), C-7 (C 132,09); tương tác giữa 2 nhóm metoxi H (6H, 3,87, s) với C-2/C-

6 (C 57,01) cho thấy chúng gắn vào nhân thơm ở vị trí C-2 và C-6. Phân tích các

tương tác giữa H-7 [H 6,36 (dd, J = 1,5, 16,0 Hz)] với C-3/C-5, C-4 (C 136,29);

giữa H-8 [H 6,23 (dd, J = 6,5, 16,0 Hz)] với C-4, C-7, C-9 (C 18,48) và giữa H-9

[H 1,87 (dd, J = 1,5, 6,5 Hz)] với C-7, C-8 cho thấy mạch nhánh CH3-CH=CH- nối

vào gốc phenyl ở vị trí C-4.

Phân tích kỹ các tương tác giữa các proton oximetin cho thấy hợp chất 16 có 2

gốc đường -D-glucopyranosyl và -L-rhamnopyranosyl trong đó gốc đường -D-

glucopyranosyl gắn vào C-1 thể hiện qua tương tác giữa H-1 [H 4,78 (d, J = 7,5

Hz)] với C-1 (C 135,24) và gốc đường -L-rhamnopyranosyl nối với gốc đường -

D-glucopyranosyl qua liên kết C-1-O-C-6 thể hiện qua tương tác giữa H-1 [H

4,69 (d, J = 1,5 Hz)] với C-6 (C 68,00). Các tương tác HMBC khác được thể hiện

trên hình 4.59 và các giá trị phổ NMR thể hiện trong bảng 4.16. So sánh với các giá

trị phổ NMR đã được công bố [53] cho phép khẳng định hợp chất 16 là 2,6-

dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--L-rhamnopyranosyl-(16)--D-

glucopyranoside.


105


C aC Cb,c H

b,d dạng pic (J = Hz) HMBC

(H C)

Aglycon

1 135,3 135,24 -

2, 6 154,5 154,35 -

3, 5 104,8 104,78 6,68 s 1, 7

4 136,4 136,29 -

7 132,2 132,09 6,36 dd (1,5, 16,0) 3, 4, 5

8 126,5 126,41 6,23 dd (6,5, 16,0) 4,7,9

9 18,7 18,48 1,87 dd (1,5, 6,5) 7, 8

OMe 57,1 57,01 3,87 s 2, 6

Glc

1 105,6 105,51 4,78 d (7,5) 1

2 75,7 75,63 3,50 dd (7,5, 9,0)

3 77,9 77,85 3,42 t (9,0)

4 71,8 71,76 3,34 m

5 77,4 77,28 3,35 m

6 68,1 68,00 3,58/3,93 dd (1,0, 11,0)

Rha

1 102,2 102,14 4,69 d (1,5) 6

2 72,4 72,11 3,71 dd (1,5, 3,5)

3 72,2 72,32 3,61 dd (3,5, 9,0)

4 74,1 74,02 3,34 m

5 69,8 69,73 3,56 m

6 18,2 17,99 1,21 d (6,5) 4, 5 aC của 2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--L-rhamnopyranosyl-(16)--D-

glucopyranoside [53], bđo trong MeOD-d4, c125 MHz, d500 MHz

4.2.17. Hợp chất 17: Gusanlungionoside C


dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của 17 (hình 4.60) cho thấy các vạch tín

hiệu của một nối đôi nội vòng tại H 5,89 (s); các tín hiệu của hai gốc đường, trong

đó tín hiệu của một proton anome thuộc gốc đường thứ nhất tại H 4,42 (d, J = 8,0

Hz) và tín hiệu proton anome khác tại H 5,25 (d, J = 1,5 Hz) cho thấy trong phân

tử có 2 gốc đường -D-glucopyranosyl và-L-rhamnopyranosyl; cùng với các tín

106

hiệu của bốn nhóm metyl tại H 1,03 (s), 1,12 (s), 1,22 (d, J = 5,0 Hz) và 2,07 (d, J

= 1,0 Hz).



107


đó có 12 cacbon của hai gốc đường và 13 cacbon của phần aglycon. Trong đó có 1

cacbon cacbonyl ở C 202,43, 2 cacbon anome của hai gốc đường tại C 100,36 và

101,85 ppm, 4 nhóm metyl ở C 19,17 ÷ 25,00 và các vạch tín hiệu của hai gốc

đường. Phân tích các tương tác trên phổ HSQC (hình PL49) và HMBC (hình PL50)

cho thấy phần aglycon của hợp chất 17 có khung 9-hydroxymegastigman-4-en-3-on

gần giống với khung alycon của hợp chất 09 đã phân tích ở trên chỉ khác do không

có nối đôi C7=C8 và không có nhóm hydroxyl ở C-6. Kết hợp với tương tác giữa

proton anomer H-1 [(H 4,42 (d, J = 8,0 Hz)] với C-9 (C 74,95) cho thấy gốc

đường -D-glucopyranosyl nối với phần aglycon qua nhóm hydroxyl của C-9.

Tương tự, tương tác giữa proton anomer H-1 [(H 5,25 (d, J = 1,5 Hz)] với C-2

(C 78,29) cho thấy gốc đường -L-rhamnopyranosyl nối với gốc đường-D-

glucopyranosyl qua liên kết 12. Như vậy hợp chất 17 được xác định là 9-

hydroxymegastigman-4-en-3-on 9-O--L-rhamnopyranosyl-(12-D-glucopy-

ranoside. Do trong cấu trúc có 2 tâm bất đối ở C-6 và C-9 nên cấu hình chính xác

của 17 được khẳng định khi so sánh với giá trị phổ 13C-NMR của

gusanlungionoside C [54]. Sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR cho thấy

cấu hình của 17 là 9-hydroxymegastigman-4-en-3-on 9-O--L-rhamnopyranosyl-

(12-D-glucopy-ranoside (gusanlungionoside C) (hình 4.62) và các giá trị

phổ NMR thể hiện trong bảng 4.17.

Hình 4.62. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất PS21

108


C aC Cb,c H

b,d

mult. (J = Hz)

HMBC

(H C)

1 37,6 37,32 -

2 48,3 48,12 2,00 d (17,0)

2,50 d (17,0)

3 202,6 202,43 -

4 125,7 125,44 5,82 s

5 170,2 170,00 -

6 52,7 52,37 2,02

7 27,3 26,74 1,54 m/1,99 m

8 38,3 37,83 1,65 m

9 75,3 74,95 3,92 m

10 20,0 19,17 1,22 d (5,0)

11 27,8 27,59 1,12 s

12 29,2 29,08 1,03 s

13 25,3 25,00 2,07 d (1,0)

1 100,5 100,36 4,42 d (8,0) 9

2 78,6 78,29 3,39

3 79,8 79,61 3,49 t (9,0)

4 72,2 72,05 3,27

5 77,9 77,80 3,27

6 63,2 62,93 3,67/3,88

1 102,1 101,85 5,25 d (1,5) 2

2 72,5 72,27 3,91

3 72,5 73,32 3,67

4 74,2 73,96 3,40

5 69,8 69,58 4,11 m

6 18,3 18,10 1,22 d (5,0) 4, 5 aδC của gusanlungionoside C [54], bđo trong CD3OD, c125 MHz, d500 MHz.

4.2.18. Hợp chất 18: Betulalbuside B


dưới dạng bột màu trắng.

Phổ 1H-NMR của 18 (hình 4.63) đặc trưng cho một dẫn xuất glycosit với sự

xuất hiện của tín hiệu proton anome tại H 4,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1') và các tín

hiệu của các proton gắn với cacbon mang ôxi tại H 3,21-3,90. Phân tích chi tiết sự

tách vạch và giá trị hằng số tương tác (J1′-2′ = 8,0 Hz, J2′-3′ = 9,0 Hz và J3′-4′ = 9,0

109

Hz) của các proton của đơn vị đường cùng với số liệu phổ 13C-NMR (bảng 4.18)

chứng minh cho sự có mặt của một đường β-D-glucopyranose [48].



110

Phổ 13C-NMR (hình 4.64) kết hợp với phổ HSQC (hình PL51) của hợp chất 18

cho tín hiệu của 16 cacbon, trong đó có 6 cacbon của gốc đường và 10 cacbon của

phần aglycon. Các tín hiệu của phần aglycon bao gồm tín hiệu của hai nhóm metyl

[C 27,73 (CH3, C-9)/H 1,27 (3H, br s, H-9) và C 21,84 (CH3, C-10)/H 1,79 (3H,

d, J = 1,0 Hz, H-10)]; một cacbon bậc bốn mang ôxi [C 73,78 (C, C-3)]; một liên

kết đôi đầu mạch [C 146,22 (CH, C-2)/H 5,93 (1H, ddd, J = 1,0, 10,5, 17,0 Hz, H-

2)] và C 112,10 (CH2, C-1)/H 5,04 (1H, dd, J = 1,5, 10,5 Hz, Ha-1 và 5,21 (1H,

dd, J = 1,5, 17,0 Hz, Hb-1)]; một liên kết đôi bị thế hai vị trí [C 131,45 (CH, C-

6)/H 5,42 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6) và C 132,60 (C, C-7)]; hai nhóm metilen [C

43,60 (CH2, C-4)/H 1,54 (2H, m, H-4) và C 23,46 (CH2, C-5)/H 2,13 (2H, H-5)]

và một nhóm oximetilen [C 67,77 (CH2, C-8)/H 4,35 (1H, dd, J = 2,5, 11,5 Hz,

Ha-8) và 4,21 (1H, dd, J = 4,5, 11,5 Hz, Hb-8)]. Tín hiệu proton của một nhóm

metyl bị dịch chuyển rất mạnh về phía vùng trường thấp tại H 1,79 ppm cho phép

dự đoán nhóm metyl này đính vào liên kết đôi. Ngoài ra, tín hiệu cacbon oximetilen

cũng bị dịch chuyển rất mạnh về phía vùng trường thấp cho phép dự doán vị trí thế

của đơn vị đường glucose tại cacbon này. Từ các dữ kiện thu được, số liệu phổ 13C-

NMR của 18 được so sánh với các số liệu đã được công bố của hợp chất

betulalbuside A [55] và nhận được sự phù hợp hoàn toàn ở hầu hết các vị trí tương

ứng. Tuy nhiên, có một sự thay đổi rất lớn ở giá trị độ dịch chuyển hóa học 13C-

NMR tại hai vị trí C-8 và C-10 (bảng 4.18). Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ

HMBC (hình PL52) cho phép xác định hợp chất 18 và betulalbuside A có cùng cấu

trúc phẳng. Như vậy, sự thay đổi số liệu phổ 13C-NMR giữa hai hợp chất tại C-8 và

C-10 chỉ có thể là do sự thay đổi cấu hình của liên kết đôi tại C-6/C-7. Sự phù hợp

hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR của 18 so với các số liệu đã được công bố cho

phép khẳng định cấu hình Z của liên kết đôi tại C-6/C-7 và hợp chất 18 chính là

betulalbuside B [56] với cấu trúc hóa học như trong hình 4.65 và các giá trị phổ

NMR thể hiện trong bảng 4.18.

111


C aC bC C

c,d Hc,e dạng pic (J = Hz)

HMBC

(H C)

Aglycon

1 112,2 112,3 112,10 5,04 dd (1,0, 10,5)

5,21 dd (1,0, 17,0)

2, 3

2 146,3 145,7 146,22 5,93 ddd (1,0, 10,5, 17,0)

3 73,8 75,7 73,78 -

4 43,0 42,3 43,60 1,54 m

5 23,5 22,3 23,46 2,13 m

6 130,2 131,5 131,45 5,42 t (7,5) 4, 5, 8, 10

7 132,9 131,1 132,60 -

8 76,0 67,2 67,77 4,35 dd (2,5, 11,5)

4,21 dd (4,5, 11,5)

9 27,7 27,95 27,73 1,27 br s 2, 3, 4

10 14,1 21,02 21,84 1,79 d (1,0) 6, 7, 8

Glc

1 102,7 102,39 4,24 d (8,0) 8

2 75,1 75,03 3,21 dd (8,0, 9,0)

3 78,2 78,15 3,36 t (9,0)

4 71,8 71,69 3,33 t (9,0)

5 77,9 77,86 3,26 m

6 62,9 62,76 3,71 dd (5,5, 12,0)

3,90 dd (2,5, 12,0)

aC của betulalbuside A [55], bC của betulalbuside B [56], cđo trong CD3OD, d125 MHz, e500 MHz

Hình 4.65. Cấu trúc hoá học và tương tác HMBC chính của hợp chất PS23

4.2.19. Hợp chất 19: syringaresinol di-O--D-glucopyranoside


dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của 19 (hình 4.66) cho thấy phân tử có tính

112

đối xứng cao với sự hiện diện của 2 cặp proton tương đương của vòng thơm (H

6,66), 4 nhóm metoxi gắn vào vòng thơm (H 3,76), 2 proton anome tại H 4,88 (d, J

= 7,5 Hz) của gốc đường -D-glucopyranosyl và vòng bis-tetrahydrofuran [57].


Phổ 13C-NMR (hình 4.67) kết hợp với phổ HSQC (hình PL53) của hợp chất 19

cho tín hiệu của 34 cacbon, trong đó có 12 cacbon của gốc đường và 22 cacbon của

phần aglycon. Cấu hỉnh của hợp chất được phân tích trên phổ HMBC (hình PL54)

chủ yếu với vòng bis-tetrahydrofuran dựa trên tương tác giữa H-2 (H 4,67, d, 3,5)

với C-1 (C 53,58), C-8 (C 71,32), C-2/C-6 (C 104,22); giữa Ha-8 [H 3,83 (dd, J

= 3,0, 9,0 Hz)]/Hb-8 [H 4,20 (dd, J = 7,0, 9,0 Hz)] với C-1, C-2 (C 85,03).

113


Sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR của 19 so với các số liệu đã

được công bố cho phép xác định hợp chất 19 chính là syringaresinol di-O--D-

glucopyranoside [58] với cấu trúc hóa học như trong hình 4.68 và các giá trị phổ

NMR thể hiện trong bảng 4.19.

Hình 4.68. Cấu trúc hoá học của hợp chất 19

114


C aδC δC

b,c δH

b,d

dạng pic (J = Hz)

Aglycon

1(5) 53,7 53,58 3,09 m

2(6) 85,1 85,03 4,67 d (3.5)

4(8) 71,4 71,32 3,83 dd (3,0, 9,0)

4,20 dd (7,0, 9,0)

1'(1'') 134,1 133,72 -

2'(2'') 104,5 104,22 6,66 s

3'(3'') 152,6 152,60 -

4'(4'') 137,2 137,08 -

5'(5'') 152,6 152,60 -

6'(6'') 104,5 104,22 6,66 s

3',5'(3'',5'')-OMe 56,6 56,41 3,76 s

Glucose

1'''(1'''') 102,9 102,65 4,88 d (7,5)

2'''(2'''') 74,3 74,14 3,20*

3'''(3'''') 76,7 76,48 3,20*

4'''(4'''') 70,0 69,91 3,13*

5'''(5'''') 77,2 77,16 3,04 m

6'''(6'''') 61,1 60,89 3,41 dd (4,5, 12,0)

3,60 dd (1,5, 12,0) aC của syringaresinol di-O--D-glucopyranoside [58], bđo trong DMSO-d6,

c125 MHz, d500 MHz, *tín hiệu bị chồng lấp

4.3. Kết quả thử hoạt tính

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Từ kết quả trên Bảng 3.1 cho thấy dịch chiết methanol của cây xáo leo (P.

scandens) có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 và RD

với IC50 lần lượt là 6,45 và 13,88 g/ml, đặc biệt trên dòng tế bào ung thư gan Hep-

G2 có hoạt tính mạnh hơn.

Kết quả thử hoạt tính diệt tế bào ung thư in vitro của hai hợp chất tirucallan

mới paramignyol A và paramignyol B bằng phương pháp thử SRB được thể hiện

trong bảng 4.20:

115

Bảng 4.20. Kết quả hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của

Paramignyol A và Paramignyol B

Dòng tế bào ung thư

người

Giá trị IC50 (µM)

Paramignyol A Paramignyol B Ellipticine

KB (biểu mô) 6,43±0,17 5,25±0,17 2,07±0,28

SK-Mel-2 (hắc tố) 6,02±0,17 3,55±0,15 1,09±0,24

LU-1 (phổi) 10,50±0,17 6,48±0,17 1,75±0,24

MCF7 (vú) 7,22±0,23 5,98±0,09 1,87±0,20

Như vậy hai hợp chất mới là Paramignyol A và Paramignyol B đều có hoạt

tính kháng tế bào ung thư trên cả 4 dòng ung thư biểu mô - KB, ung thư hắc tố SK-

Mel-2, ung thư phổi LU-1 và ung thư vú MCF7, trong đó hợp chất Paramignyol B

có hoạt tính mạnh hơn Paramignyol A.

Tuy nhiên, ở nồng độ 100 µg/ml, 05 dẫn xuất tirucallan glycosit mới,

Paramignyoside AE, không có biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 04 dòng tế

bào ung thư được thử nghiệm là KB, SK-Mel2, LU-1 và MCF7.

Trên cơ sở kết quả hoạt tính gây độc tế bào, hai hợp chất Paramignyol A và B

được lựa chọn để đánh giá tiếp theo về khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 trên

dòng tế bào ung thư LU-1.

1 2 3

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 02 0 g /m l

3 5 g /m l

7 .0 g /m l

1 .4 g /m l

0 .2 8 g /m l

T a m o x ife n P a ra m ig n y o l A P a g r a m ig n y o l B

Ca

sp

as

e a

cti

vit

y (

RF

U)

Hình 4.69. Khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của Paramignyol A và B

116

Kết quả thu được cho thấy, hợp chất Paramignyol A thể hiện khả năng kích

hoạt enzyme caspase 3/7 mạnh ở các nồng độ thử nghiệm so với chất đối chứng

dương Tamoxifen. Hợp chất Paramignyol B cũng thể hiện hoạt tính kích hoạt

enzyme caspase tuy nhiên khả năng này yếu hơn Paramignyol A và chỉ thể hiện rõ ở

nồng độ thử nghiệm là 7 µg/ml.

Apoptosis là một quá trình tự chết của tế bào được lập trình (programmed cell

death - PCD) xảy ra trong các sinh vật đa bào. Sự ức chế apoptosis có thể dẫn đến

nhiều loại bệnh ung thư, bệnh tự miễn dịch, bệnh sưng viêm và bệnh do nhiễm

virút. Ban đầu việc số lượng các tế bào tăng bất thường và tạo ra khối u được cho là

do việc sinh sôi nảy nở của tế bào tăng sinh mạnh; tuy nhiên hiện nay các nghiên

cứu cho thấy việc suy giảm tốc độ chết của tế bào cũng là nguyên nhân của hiện

tượng này. Loại bệnh phổ biến nhất trong nhóm này là ung thư, một căn bệnh trong

đó tế bào sản sinh quá mức, thông thường được mô tả như là sự biểu hiện quá mức

của họ protein ức chế apoptosis của tế bào (IAP). Do vậy các nhà khoa học hiện nay

cũng đang theo hướng sàng lọc các hoạt chất có khả năng điều trị ung thư theo cơ

chế cảm ứng và kích hoạt quá trình apoptosis.

Nhiều nghiên cứu cho thấy họ enzyme caspase đóng vai trò trung tâm trong

việc truyền tín hiệu apoptosis. Cho đến nay đã có 15 loại caspase được chia thành 2

nhóm chính là caspase gây viêm và caspase liên quan đến apoptosis (bao gồm

caspase 2, 3, 6, 7, 8, 10, 15). Trong đó caspase 3, 7 tham gia vào quá trình cắt các

protein khác trong tế bào, mở đầu cho quá trình apoptosis. Các caspase này sẽ thực

hiện quá trình chết tế bào theo chu trình apoptosis. Việc xác định khả năng kích

hoạt enzyme caspase có thể cho ta biết cơ chế tác động của một số hoạt chất có tiềm

năng điều trị ung thư.

Kết quả thu được cho thấy, hợp chất tirucallan mới Paramignyol A thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 04 dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là KB,

SK-Mel2, LU-1 và MCF7 đồng thời thể hiện khả năng kích thích mạnh enzyme

caspase 3/7 ở tế bào LU-1. Như vậy, hợp chất này có nhiều tiềm năng cho các

nghiên cứu tiếp tục theo định hướng kháng ung thư.

117

4.3.2. Hoạt tính kháng viêm

Năm hợp chất tirucallan glycosit mới Paramignyoside AE đã được thử hoạt

tính kháng viêm và thực nghiệm được tiến hành tại Khoa Dược, Đại học quốc gia

Chungnam, Hàn Quốc. Kết quả thể hiện trên Bảng 4.21.

Bảng 4.21. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất Paramignyoside A-E

Hợp chất Giá trị IC50 (µM)

IL-12 p40 IL-6 TNF-α

Paramignyoside A 48,68 >50 >50

Paramignyoside B 29,15 >50 >50

Paramignyoside C 5,03 >50 >50

Paramignyoside D 19,59 >50 >50

Paramignyoside E 14,09 >50 >50

Chứng dương SB203580 5,00 3,50 7,20

Từ kết quả trên cho thấy cả 5 hợp chất đều có hoạt tính ức chế quá trình tạo ra

IL-12 p40 trong đó hợp chất paramignyoside C có hoạt tính tương đương chất

chuẩn dương SB203580. Do đó cần nghiên cứu tiếp theo về cơ chế kháng viêm

cũng như hoạt tính in vivo trong thời gian tới của các hợp chất này, đặc biệt là hợp

chất paramignyoside C.

4.4. Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens

Bằng các phương pháp sắc ký, từ cây xáo leo – P. scandens đã phân lập được

19 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới và 12 hợp chất đã biết. Kết quả tổng hợp

cấu trúc và tên gọi của 19 hợp chất này được trình bày trong bảng 4.22.

Bảng 4.22. Tổng hợp các hợp chất phân lập từ cây xáo leo – P. scandens

Paramignyol A (01) (Chất mới)

Paramignyol B (02) (Chất mới)

118

Paramignyoside A (03) (Chất mới): R = H

Paramignyoside B (04) (Chất mới): R = Ac

Paramignyoside C (05) (Chất mới)

Paramignyoside D (06) (Chất mới): R = H

Paramignyoside E (07) (Chất mới): R = Ac

Methyl isolimonate (08)

6R,9S-Roseoside (09)

119

-D-glucopyranoside methyl salicylate

(10)

Adenosine (11)

1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-

glucopyranoside (12) Syringin (13)

Atripliside B (14)

trans-N-p-coumaroyl tyramine (15)

Gusanlungionoside C (17)

Betulalbuside B (18)

2,6-dimethoxy-4[(1E)-prop-1-

enyl]phenyl O--L-rhamno-pyranosyl-

(16)--D-glucopyranoside (16)

Syringaresinol di-O--D-

glucopyranoside (19)

120

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ cây xáo leo – Paramignya scandens (Griff.) Craib. (Rutaceae) thu ở Lâm

Đồng, bằng các phương pháp sắc ký đã tách chiết và xác định cấu trúc của 19 hợp

chất, trong đó có 7 hợp chất mới đều thuộc dạng khung tirucallan: Paramignyol A,

Paramignyol B, Paramignyoside A, Paramignyoside B, Paramignyoside C,

Paramignyoside D, Paramignyoside E và 12 hợp chất đã được phân lập từ các

loài thực vật khác: Methyl isolimonate, 6R,9S-Roseoside, -D-glucopyranoside

methyl salicylate, Adenosine, 1,1-Dimethylprop-2-enyl 1-O-β-D-glucopyranoside,

Syringin, Atripliside B, Betulalbuside B, trans-N-p-coumaroyl tyramine, 2,6-

dimethoxy-4[(1E)-prop-1-enyl]phenyl O--L-rhamno-pyranosyl-(16)--D-

glucopyranoside, Gusanlun-gionoside C, Syringaresinol di-O--D-glucopyranoside.

Hai hợp chất mới Paramignyol A và Paramignyol B có hoạt tính gây độc tế

bào trên 4 dòng ung thư biểu mô - KB, ung thư hắc tố SK-Mel-2, ung thư phổi LU-

1 và ung thư vú MCF7, trong đó hợp chất Paramignyol B có hoạt tính mạnh hơn

Paramignyol A. Ngoài ra, Paramignyol A thể hiện khả năng kích thích mạnh

enzyme caspase 3/7 ở tế bào LU-1.

Năm hợp chất mới Paramignyoside A-E có hoạt tính kháng viêm, trong đó

hợp chất Paramignyoside C có hoạt tính mạnh nhất.

Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

loài P. scandens ở Việt Nam và trên thế giới. Dựa trên các kết quả thu được cho

thấy cây Xáo leo có khả năng phát triển thành nguyên liệu cho ngành công nghiệp

dược ở nước ta. Cho nên cần có kế hoạch để bảo tồn và phát triển loài cây này.

121

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Pham Thi

Mai Huong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Van Thanh,

Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Chau Van Minh (2014), “Two tirucallane

derivatives from Paramignya scandens and their cytotoxic activity”,

Phytochemistry Letters, 9, pp. 78–81.

2. Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Nguyen

Phuong Thao, Sohyun Kim, Young Sang Koh, Nguyen Van Thanh, Nguyen

Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Young Ho Kim, Chau Van

Minh (2015), “Anti-inflammatory tirucallane saponins from Paramignya

scandens”, Chem. Pharm. Bull., 63(7), đang chờ in.

3. Nguyễn Thị Diệu Thuần, Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nông Văn Duy, Ninh Thị

Ngọc, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Phan

Văn Kiệm, Châu Văn Minh (2014), “Các hợp chất glycosit phân lập từ cây

Xáo leo Paramignya scandens”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 52(5A), tr.

69-75.

4. Nguyễn Thị Diệu Thuần, Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nông Văn Duy, Ninh Thị

Ngọc, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Phan

Văn Kiệm, Châu Văn Minh (2015), “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây

xáo leo - Paramignya scandens”, Tạp chí Hóa học, 53(1), tr. 84-89.

122

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phan Văn Đệ, Trần Công Luận, Điều tra, đánh giá nguồn tài nguyên dược liệu

tỉnh Lâm Đồng và định hướng phát triển một số loài đặc hữu có giá trị kinh tế

cao, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài KHCN, Sở KH-CN tỉnh Lâm Đồng,

2011, 60-62.

2. Đỗ Thị Thảo, Trịnh Thị Thanh Vân, Nguyễn Quyết Chiến, Nguyễn Văn Hùng,

Đỗ Khắc Hiếu, Nghiên cứu in vitro hoạt chất kháng ung thư của cây bán liên chi

(Scutellaria barbata D. Don), Tạp chí Dược học, 2005, 355 10-13.

3. Nam, N.H., H.M. Kim, K.H. Bae, and B.Z. Ahn, Inhibitory effects of

Vietnamese medicinal plants on tube-like formation of human umbilical venous

cells, Phytother Res, 2003, 17 (2), 107-111.

4. Giang, P.M., P.T. Son, Y. Hamada, and H. Otsuka, Cytotoxic Diterpenoids from

Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis Gagnep, Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, 2005, 53 (3), 296-300.

5. Nguyễn Hữu Toàn Phan, Nghiên cứu hoá học một số cây thuốc chọn lọc Việt

Nam có hoạt tính chống ung thư, 2009.

6. Sung, T.V., T.V. Loc, T.D. Quan, T.V. Chien, N.T. Anh, T.T. Thuy, N.T.H.

Anh, P.T. Ninh, N.H.T. Phan, and N.T.D. Thuan. Study on Taxol and Taxotere

synthesis using 10-deacetylbaccatin III isolated from Taxus wallichiana

growing in Lamdong province, Vietnam, in The First VAST - KOGI Workshop

on Science and Technology R&D Cooperation. 2007, NXB Khoa học và Công

nghệ, Hanoi.

7. Yang, Q.X. and C.R. Yang, Cytotoxic steroidal saponins from Polygonatum

punctatum, Chem Biodivers, 2006, 3 (12), 1349-1355.

8. Wu, J.J., K.W. Cheng, X.F. Zuo, M.F. Wang, P. Li, L.Y. Zhang, H. Wang, and

W.C. Ye, Steroidal saponins and ecdysterone from Asparagus filicinus and their

cytotoxic activities, Steroids, 2010, 75 (10), 734-739.

123

9. Zhang, D.X., T.G. Hartley, and D.J. Mabberley., Rutaceae, Flora of China,

2008, 11 88.

10. Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật – Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công

nghệ quốc gia, Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 2. 2003, Nxb Nông

nghiệp.

11. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 2. 2003, Nxb. Trẻ.

12. Võ Văn Chi, T.H., Cây cỏ có ích ở Việt Nam. 1999, Nxb. Giáo dục, Hà Nội.

13. Cheng, J.T., Y.Q. Han, J. He, X. De Wu, L.B. Dong, L.Y. Peng, Y. Li, and Q.S.

Zhao, Two new tirucallane triterpenoids from the leaves of Aquilaria sinensis,

Arch Pharm Res, 2013, 36 (9), 1084-1089.

14. Ntalli, N.G., F. Cottiglia, C.A. Bueno, L.E. Alche, M. Leonti, S. Vargiu, E.

Bifulco, U. Menkissoglu-Spiroudi, and P. Caboni, Cytotoxic tirucallane

triterpenoids from Melia azedarach fruits, Molecules, 2010, 15 (9), 5866-5877.

15. Yang, S.-M., Q.-S. Song, C. Qing, D.-G. Wu, and X.-K. Liu, Anticancer

Activity of Tirucallane Triterpenoids from Amoora dasyclada, Z. Naturforsch,

2006, 61c, 193-195.

16. Chen, H., S.G. Ma, Z.F. Fang, J. Bai, S.S. Yu, X.G. Chen, Q. Hou, S.P. Yuan,

and X. Chen, Tirucallane triterpenoids from the stems of Brucea mollis, Chem

Biodivers, 2013, 10 (4), 695-702.

17. Hu, J., Y. Song, H. Li, B. Yang, X. Mao, Y. Zhao, and X. Shi, Cytotoxic and

anti-inflammatory tirucallane triterpenoids from Dysoxylum binectariferum,

Fitoterapia, 2014, 99 86-91.

18. Kumar, V., N.M.M. Niyaz, S. Saminathan, and D.B.M. Wickramaratne,

Coumarins from Paramignya monophylla root bark, Phytochemistry, 1998, 49

(1), 215-218.

19. A., J.D.M., Medicinal Plants (Indigenous and Exotic) Used in Ceylon, Part V.

Colombo, A publication of the National Science Council of Sri Lanka, 1982.

20. Kumar, V., N.M.M. Niyaz, and D.B.M. Wickramaratne, Coumarins from stem

bark of Paramignya monophylla, Phytochemistry, 1995, 38 (3), 805-806.

124

21. Kumar, V., N.M.M. Niyaz, D.B.M. Wickramaratne, and S. Balasubramaniam,

Tirucallane derivatives from Paramignya monophylla fruits, Phytochemistry,

1991, 30 (4), 1231-1233.

22. Wattanapiromsakul, C. and P.G. Waterman, Flavanone, triterpene and chromene

derivatives from the stems of Paramignya griffithii, Phytochemistry, 2000, 55

(3), 269-273.

23. Wiart, C., Medicinal Plant of Asia-Pacific-Drugs for the Future. Vol. Library

Cataloguing-in-Publication Data, 2006, World Scientific Publishing Co. Pte.

Ltd., British, 380.

24. Nguyễn Minh Khởi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phương, Nghiên cứu độc

tính cấp tác dụng bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ung thư của xáo tam

phân, Tạp chí Dược liệu, 2013, 18 (1), 14 - 20.

25. Phạm Huy Bích, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi, Phân lập và định

lượng Ostruthin trong dược liệu xáo tam phần thu hái tại Việt Nam, Tạp chí

Dược liệu, 2013, 18 (3), 173 - 179.

26. Trần Thị Thúy Quỳnh, Lê Thị Kim Thoa, Phạm Đông Phương, Phân lập một số

hợp chất coumarin trong rễ xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill),

Tạp chí Dược học, 2014, 457, 11.

27. Trần Thị Thúy Quỳnh, Nguyễn Trung Dũng, Phạm Đông Phương, Phân lập một

vài hợp chất acridon alkaloid trong rễ xáo tam phân (Paramignya trimera

(Oliv.) Burkill), Tạp chí Dược học, 2014, 458, 60-64.

28. Liu, Y. and P. Abreu, Tirucallane triterpenes from the roots of Ozoroa insignis,

Phytochemistry, 2006, 67 (13), 1309-1315.

29. Liu, H.B., C.R. Zhang, S.H. Dong, L. Dong, Y. Wu, and J.M. Yue, Limonoids

and triterpenoids from the seeds of Melia azedarach, Chem Pharm Bull (Tokyo),

2011, 59 (8), 1003-1007.

30. Luo, X.-D., S.-H. Wu, Y.-B. Ma, and D.-G. Wu, Tirucallane triterpenoids from

Dysoxylum hainanense, Phytochemistry, 2000, 54 (8), 801-805.

125

31. Xie, B.J., S.P. Yang, H.D. Chen, and J.M. Yue, Agladupols A-E, triterpenoids

from Aglaia duperreana, J Nat Prod, 2007, 70 (9), 1532-1535.

32. Yang, S.-M., L. Ding, Shao-HuaWu, Y.-B. Ma, X.-D. Luo, and Da-GangWu,

Two New Tirucallane Triterpenes with Six-Membered Hemiacetal from

Amoora dasyclada, Z. Naturforsch., 2004, 59b 1067-1069.

33. Koo, J.E., H.J. Hong, A. Dearth, K.S. Kobayashi, and Y.S. Koh, Intracellular

invasion of Orientia tsutsugamushi activates inflammasome in asc-dependent

manner, PLoS One, 2012, 7 (6), e39042.

34. Bowen, I.H. and Y.N. Patel, Phytochemical analysis of the leaves and stems of

Paramignya monophylla Wight (Rutaceae), Journal of Pharmacy and

Pharmacology, 1998, 50 (S9), 232-232.

35. Liu, J., S.P. Yang, G. Ni, Y.C. Gu, and J.M. Yue, Triterpenoids from Aglaia

odorata var. microphyllina, J Asian Nat Prod Res, 2012, 14 (10), 929-939.

36. Zi, J., S. Li, M. Liu, M. Gan, S. Lin, W. Song, Y. Zhang, X. Fan, Y. Yang, J.

Zhang, J. Shi, and D. Di, Glycosidic constituents of the tubers of Gymnadenia

conopsea, J Nat Prod, 2008, 71 (5), 799-805.

37. Yuan, C.M., Y. Zhang, G.H. Tang, Y. Li, H.P. He, S.F. Li, L. Hou, X.Y. Li,

Y.T. Di, S.L. Li, H.M. Hua, and X.J. Hao, Cytotoxic limonoids from Melia

azedarach, Planta Med, 2013, 79 (2), 163-168.

38. Kurimoto, S., Y. Takaishi, F.A. Ahmed, and Y. Kashiwada, Triterpenoids from

the fruits of Azadirachta indica (Meliaceae), Fitoterapia, 2014, 92 200-205.

39. O'Neill, M.J., J.A. Lewis, H.M. Noble, S. Holland, C. Mansat, J.E. Farthing, G.

Foster, D. Noble, S.J. Lane, P.J. Sidebottom, S.M. Lynn, M.V. Hayes, and C.J.

Dix, Isolation of translactone-containing triterpenes with thrombin inhibitory

activities from the leaves of Lantana camara, J Nat Prod, 1998, 61 (11), 1328-

1331.

40. Swinny, E.E., A novel acetylated 3-deoxyanthocyanidin laminaribioside from

the fern Blechnum novae-zelandiae, Z Naturforsch C, 2001, 56 (3-4), 177-180.

126

41. Han, M.L., Y. Shen, G.C. Wang, Y. Leng, H. Zhang, and J.M. Yue, 11beta-

HSD1 inhibitors from Walsura cochinchinensis, J Nat Prod, 2013, 76 (7), 1319-

1327.

42. Corea, G., E. Fattorusso, and V. Lanzotti, Saponins and flavonoids of Allium

triquetrum, J Nat Prod, 2003, 66 (11), 1405-1411.

43. Cheplogoi, P.K., D.A. Mulholland, P.H. Coombes, and M.

Randrianarivelojosia, An azole, an amide and a limonoid from Vepris

uguenensis (Rutaceae), Phytochemistry, 2008, 69 (6), 1384-1388.

44. Bennett, R.D. and S. Hasegawa, Isolimonic acid, a new citrus limonoid,

Phytochemistry, 1980, 19 (11), 2417-2419.

45. Yamano, Y. and M. Ito, Synthesis of optically active vomifoliol and roseoside

stereoisomers, Chem Pharm Bull (Tokyo), 2005, 53 (5), 541-546.

46. Chassagne, D., J. Crouzet, C.L. Bayonove, and R.L. Baumes, Glycosidically

Bound Eugenol and Methyl Salicylate in the Fruit of Edible Passiflora Species,

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45 (7), 2685-2689.

47. Domondon, D.L., W. He, N. De Kimpe, M. Hofte, and J. Poppe, Beta-

adenosine, a bioactive compound in grass chaff stimulating mushroom

production, Phytochemistry, 2004, 65 (2), 181-187.

48. Agrawal, P.K., NMR spectroscopy in the structural elucidation of

oligosaccharides and glycosides, Phytochemistry, 1992, 31 (10), 3307-3330.

49. Ahmed, A.A., M.H. Abd el-Razek, E.A. Abu Mostafa, H.J. Williams, A.I. Scott,

J.H. Reibenspies, and T.J. Mabry, A new derivative of glucose and 2-C-methyl-

D-erythritol from Ferula sinaica, J Nat Prod, 1996, 59 (12), 1171-1173.

50. Sugiyama, M., E. Nagayama, and M. Kikuchi, Lignan and phenylpropanoid

glycosides from Osmanthus asiaticus, Phytochemistry, 1993, 33 (5), 1215-1219.

51. Perveen, S., A. Malik, B. Tareen Rasool, N. Afza, and L. Iqbal, Atriplisides A

And B, Two New Glycosides From Perovskia Atriplicifolia, Zeitschrift für

Naturforschung B, 2007, 863.

127

52. Kim, D.K. and K. Lee, Inhibitory effect of trans-N-p-coumaroyl tryamine from

the twigs of Celtis chinensis on the acetylcholinesterase, Arch Pharm Res, 2003,

26 (9), 735-738.

53. Bai, H. and L. Hu, Study on the Chemical Constituents of Daphniphyllum

angustifolium, Helvetica Chimica Acta, 2006, 89 (5), 884-894.

54. Yu, L.L., W.C. Hu, G. Ding, R.T. Li, J.H. Wei, Z.M. Zou, and M.H. Wang,

Gusanlungionosides A-D, potential tyrosinase inhibitors from Arcangelisia

gusanlung, J Nat Prod, 2011, 74 (5), 1009-1014.

55. Morikawa, H., R. Kasai, H. Otsuka, E. Hirata, T. Shinzato, M. Aramoto, and Y.

Takeda, Terpenic and Phenolic Glycosides from Leaves of Breynia officinalis

Hemsl, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2004, 52 (9), 1086-1090.

56. Çaliş, I., A. Yürüker, H. Rüegger, A.D. Wright, and O. Sticher, Anatolioside E:

A New Acyclic Monoterpene Glycoside from Viburnum orientale, Helvetica

Chimica Acta, 1993, 76 (7), 2563-2569.

57. Wang, C. and Z. Jia, Lignan, phenylpropanoid and iridoid glycosides from

Pedicularis torta, Phytochemistry, 1997, 45 (1), 159-166.

58. Vermes, B., O. Seligmann, and H. Wagner, Synthesis of biologically active

tetrahydro-furofuranlignan-(syringin, pinoresinol)- mono- and bis-glucosides,

Phytochemistry, 1991, 30 (9), 3087-3089.

128

PHỤ LỤC

Hình PL1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 01 ......................................................... 130

Hình PL2. Phổ COSY của hợp chất 01 ................................................................... 130

Hình PL3. Phổ HSQC của hợp chất 01 ................................................................... 131

Hình PL4. Phổ HMBC của hợp chất 01 .................................................................. 132


Hình PL6. Phổ COSY của hợp chất 02 ................................................................... 133

Hình PL7. Phổ HSQC của hợp chất 02 ................................................................... 134

Hình PL8. Phổ HMBC của hợp chất 02 .................................................................. 135


Hình PL10. Phổ HSQC của hợp chất 03 ................................................................. 137

Hình PL11. Phổ HMBC của hợp chất 03 ................................................................ 138

Hình PL12. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 04 ....................................................... 139

Hình PL13. Phổ COSY của hợp chất 04 ................................................................. 139



Hình PL16. Phổ ROESY của hợp chất 04 .............................................................. 142












129











Hình PL38. Phổ DEPT của hợp chất 11 ................................................................. 161

















Documents

luận án