Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA H ỌC TỰ NHIÊN
*******
Tr ần Thị Hảo
ðÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG THÍCH GI ỮA PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
VI SINH V ẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ðO ATP
QUANG SINH HỌC TRONG QUÁ TRÌNH KI ỂM TRA V Ệ SINH CỦA
DÂY CHUYỀN SẢN XUẤT BIA Ở VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Hà Nội -2011
2
ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOA H ỌC TỰ NHIÊN
*******
Tr ần Thị Hảo
ðÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG THÍCH GI ỮA PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
VI SINH V ẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ðO ATP
QUANG SINH HỌC TRONG QUÁ TRÌNH KI ỂM TRA V Ệ SINH CỦA
DÂY CHUYỀN SẢN XUẤT BIA Ở VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 604240
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Phạm Văn Thành
Hà Nội -2011
1
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ATP: Adenozin triphotphat
CFU: Colony-forming units
CPP: Critical Control Point
E.coli: Escherichia coli
HACCP: Hazard Analytical Critical Control Point (Hệ thống phân tích và
kiểm soát các mối nguy trọng yếu trong quá trình sản xuất chế biến
thực phẩm)
GMP: Good Manufacturing Practice (tiểu chuẩn thực hành sản xuất tốt)
RLU: Relative light unit (ñơn vị ánh sáng tương ñối)
PCA: Plate count agar
QA: Quality assurance
UV-VIS: Ultraviolet visiable (vùng tử ngoại khả kiến)
2
MỤC LỤC
MỞ ðẦU ....................................................................................................... 8
Chương 1 ..................................................................................................... 10
TỔNG QUAN .............................................................................................. 10
1.1.Tình hình ngộ ñộc thực phẩm ở Việt Nam, thực trạng vệ sinh ở một số cơ
sở sản xuất chế biến thực phẩm và vi sinh vật gây ngộ ñộc thường gặp trong
thực phẩm .................................................................................................... 10
1.1.1. Tình hình ngộ ñộc thực phẩm và thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở
chế biến thực phẩm ở Việt Nam…………………………………………..10
1.1.2. Nguyên nhân khiến thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây bệnh ........... ..11
1.1.3. Một số vi sinh vật chủ yếu thường gây ngộ ñộc có trong thực phẩm
và vi khuẩn chỉ ñiểm trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm .......................... 12
1.1.3.1. Ngộ ñộc do E.coli……………………………………………...12
1.1.3.2. Ngộ ñộc do Clotridium perfringens……………………………12
1.1.3.3. Ngộ ñộc Salmonella……………………………………………12
1.1.3.4. Vi khuẩn chỉ ñiểm trong thực phẩm …………………………..13
1.2. Công nghệ sản xuất bia, những công ñoạn cần thiết phải kiểm tra vệ sinh
trong sản xuất ............................................................................................... 14
1.2.1.Quá trình nấu, ñường hóa................................................................. 14
1.2.2. Lên men .......................................................................................... 15
1.2.3. Vấn ñề vệ sinh thực phẩm nói chung và vệ sinh trong quá trình sản
xuất bia nói riêng ...................................................................................... 16
1.2.3.1. Vệ sinh thực phẩm ................................................................... 16
1.2.3.2. Vệ sinh trong quá trình sản xuất bia ......................................... 18
1.3. Các phương pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay ................... 19
1.3.1. Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường …………………………..19
3
1.3.2.Phương pháp ñánh giá thông qua việc giám sát các thông số của hệ
thống tự ñộng hoặc thông qua việc kiểm tra nống ñộ các chất tham gia vào
quá trình …………………………………………………………………..19
1.3.3. Phương pháp ñánh giá bằng nuôi cấy vi sinh vật truyền thống ……20
1.3.4. Phương pháp kiểm tra bằng phát quang sinh học…………………..20
1.4. Giới thiệu về phương pháp ATP quang sinh .......................................... 21
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp ATP quang sinh học ........................ 21
1.4.2. Ưu ñiểm của phương pháp ño ATP quang sinh trong ngành công
nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm ..................................................... 22
Chương II ..................................................................................................... 24
ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 24
2.1. ðối tượng nghiên cứu ............................................................................ 24
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu .............................. 24
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất ........................................................... 24
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 26
2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống .. 26
2.2.2.1.1. Phương pháp xác ñịnh tổng số Coliforms và E.coli ........... 27
2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc ...................................... 27
2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí ................................................... 28
2.2.2.2. Phương pháp xác ñịnh ñộ sạch bằng ATP quang sinh .............. 28
2.2.2.3. Ứng dụng máy ño quang UV-VIS U-1900 ............................... 30
Chương III ................................................................................................... 32
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 32 3.1. Phương pháp phân tích truyền thống ..................................................... 32
3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men .............................................................. 32
3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm .......................................................... 33
3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm ........................................................... 34
3.2. Phương pháp ATP quang sinh học ......................................................... 36
4
3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men .............................................................. 36
3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm .......................................................... 36
3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm ........................................................... 37
3.3. ðánh giá sự tương thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phương pháp
truyền thống và ño ATP quang sinh ............................................................. 37
3.3.1. Mẫu ñã biết trước nồng ñộ .............................................................. 37
3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia .................................................... 38
3.4. Khảo sát ứng dụng phương pháp tạo màu xác ñịnh tổng số Coliforms trên
máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre)................................. 43
Chương IV. .................................................................................................. 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 50 TÀI LI ỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52
Tiếng Việt ................................................................................................ 52
Tiếng Anh ................................................................................................ 53
5
DANH M ỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Thống kê tình hình ngộ ñộc thực phẩm của Bộ Y tế 2008-2010 .... 10
Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2 ....................................... 32
Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3 ....................................... 33
Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 1 ....................... 33
Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 2 ....................... 34
Bảng 6: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 3 ....................... 34
Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1 .................................. 34
Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 2 .................................. 35
Bảng 9: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 3 .................................. 35
Bảng 10: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở các tec lên men ............................................................................................................. 36
Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở máy lọc sản phẩm ..................................................................................................... 36
Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở các tec sản phẩm ........................................................................................................... 37
Bảng 13: Kết quả phân tích mẫu ñã biết trước nồng ñộ bằng cả phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh. .................................. 38
Bảng 14: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ................................................................ 38
Bảng 15: Kết quả phân tích ở tec lên men 2 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ................................................................ 39
Bảng 16: Kết quả phân tích ở tec lên men 3 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ................................................................ 39
Bảng 17: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ........................................... 40
Bảng 18: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 2 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ........................................... 40
Bảng 19: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 3 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ........................................... 41
6
Bảng 20: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ...................................................... 41
Bảng 21: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 2 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ...................................................... 42
Bảng 22: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 3 bằng phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh ...................................................... 42
Bảng 23: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 10-2 ở bước sóng 190 – 1100nm ....................................................................................................... 43
Bảng 24: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 10-1 ở bước sóng 190 – 1100nm ....................................................................................................... 44
Bảng 25: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 5-1 ở bước sóng 190 – 1100nm ....................................................................................................... 44
Bảng 26: Kết quả scan mẫu M ở bước sóng 400 – 800nm .......................... 46
Bảng 27: Kết quả scan mẫu M x 5-1 ở bước sóng 400 – 800nm .................. 47
Bảng 28: Kết quả scan mẫu M x 10-1 ở bước sóng 400 – 800nm ................. 47
Bảng 29: Kết quả scan mẫu M x 10-2ở bước sóng 400 – 800nm .................. 47
Bảng 30: Kết quả scan mẫu M x 10-3ở bước sóng 400 – 800nm .................. 47
Bảng 31: Kết quả phân tích mẫu lấy ở bể chứa nước thải sau khi vệ sinh bằng phương pháp truyền thống và ño bằng máy UV-VIS 1900 của Hitachi. ........ 48
7
DANH M ỤC HÌNH MINH H ỌA
Hình 1: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 190 – 1100 nm ............................. 45
Hình 2: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 200 – 800 nm ............................... 46
Hình 3: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 400 – 800 nm ............................... 48
8
MỞ ðẦU Thực phẩm là nhu cầu thiết yếu hàng ngày của mỗi con người. An toàn
thực phẩm ñã trở thành vấn ñề toàn cầu; trước những hiểm họa luôn rình rập,
ñe dọa ñời sống con người bởi các thực phẩm không an toàn, ñòi hỏi mỗi
quốc gia phải có những quốc sách ñể ñảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.
Trên thực tế, một thực trạng còn bức xúc trong ngành sản xuất chế biến
thực phẩm ở nước ta là chất lượng vệ sinh còn rất kém ở nhiều cơ sở sản xuất.
Những yêu cầu nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản xuất chưa
ñược quan tâm và ñầu tư thích ñáng. Mặt khác do lợi nhuận mà một số ít nhà
cung cấp ñã sử dụng các hóa chất ñộc hại ñể chế biến, nuôi trồng và sản xuất
các sản phẩm thực phẩm; gây ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe người tiêu
dùng. Việc sử dụng các thực phẩm không ñảm bảo chất lượng vệ sinh có thể
gây ngộ ñộc và gây ra các bệnh tiêu hóa cấp tính cho người sử dụng, nghiêm
trọng hơn có thể dẫn tới tử vong. Về lâu dài, nếu các ñộc tố tích lũy dần dần
tới một ngưỡng nhất ñịnh có thể sẽ phát sinh các bệnh nguy hiểm, làm biến
ñổi cấu trúc gen gây dị tật, dị dạng cho các thế hệ tiếp theo.
Trước thực trạng trên, ngoài việc khuyến khích các cơ sở sản xuất thực
hiện vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà nước và chính phủ còn chỉ thị về việc
tăng cường công tác bảo ñảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm ñể từng
bước nâng cao chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên phương thức quản lý kiểm tra
chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm dựa trên việc kiểm tra chất lượng sản
phẩm cuối cùng không ñảm bảo ñược chất lượng vệ sinh sản phẩm trong khi
sản xuất. ðiều này chỉ ñược ñảm bảo khi có sự kiểm soát chủ ñộng và hệ
thống các yếu tố chất lượng và ñiều kiện vệ sinh trong toàn bộ quá trình sản
xuất, chế biến, cung ứng mới có khả năng ñảm bảo an toàn thực phẩm. ðể
ñáp ứng ñược yêu cầu này không gì khác là phải áp dụng các phương pháp
kiểm tra nhanh mức ñộ vệ sinh trong các dây chuyền sản xuất, chế biến thực
phẩm .
Góp phần vào sự kiểm soát vệ sinh an toàn trong sản xuất ñồ uống nói
chung và sản xuất bia nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện kiểm tra vệ sinh
trong dây chuyền sản xuất bia, với ñề tài:
9
“ ðánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống
và phương pháp ño ATP quang sinh học trong quá trình kiểm tra vệ sinh của
dây chuyền sản xuất bia ở Viện công nghiệp thực phẩm”.
10
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 .Tình hình ngộ ñộc thực phẩm ở Việt nam, thực trạng vệ sinh ở một
số cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm và vi sinh vật gây ngộ ñộc
thường gặp trong thực phẩm
1.1.1. Tình hình ngộ ñộc thực phẩm và thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở chế biến thực phẩm ở Việt Nam.
Hàng năm ở Việt Nam xảy ra hàng trăm vụ ngộ ñộc thực phẩm, con số người mắc bệnh có năm lên tới chục ngàn người. Theo thống kê của Bộ Y tế, tình hình ngộ ñộc thực phẩm trong ba năm gần ñây như sau (11):
Bảng 1: Thống kê tình hình ngộ ñộc thực phẩm của Bộ Y tế 2008-2010
STT Chỉ số Năm thống kê
2008 2009 2010
1 Số vụ 205 152 132
2 Số người mắc 7.828 5.212 4.676
3 Số người chết 61 35 41
Trong số các nguyên nhân gây ngộ ñộc thực phẩm thì nguyên nhân chủ yếu do nhiễm vi sinh vật (thường chiếm tỷ lệ từ 50 ñến 58% số vụ). ðây là thực trạng ñáng báo ñộng về tình hình vệ sinh trong sản xuất, chế biến và lưu thông thực phẩm. Những nguy cơ gây ô nhiễm vi sinh vật có thể kể ñến gồm: nguồn nước, ñiều kiện môi trường sản xuất, trang thiết bị máy móc, bao bì, dụng cụ, người trực tiếp chế biến…
ðối với thực trạng vệ sinh của các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm, theo báo cáo ở một số ñịa phương thì cũng không mấy khả quan.
Theo báo cáo ñánh giá thực trạng tại các cơ sở sản xuất, chế biến rượu, bia, nước giải khát, kem, nước chấm… tại Hải Phòng của tác giả Trần Văn Thọ và cộng sự năm 2005 cho thấy có tới 76,4% mẫu không ñạt tiêu chuẩn vệ
11
sinh. Các mẫu thức ăn ñường phố có tỷ lệ ô nhiễm cao về vi sinh vật, trong ñó 100% không ñạt về chỉ tiêu nấm men, nấm mốc; 90,9% không ñạt về chỉ tiêu Coliforms. Ở tỉnh Bắc Giang, theo ñiều tra khảo sát một số cơ sở sản xuất nước giải khát, bia, rượu, bánh kẹo… của tác giả Ngô Thị Oanh và cộng sự năm 2005 cho thấy 33,3% cơ sở có mức vệ sinh kém, 40% ở mức trung bình, chỉ có 26,7% ñạt loại tốt.
Từ một vài số liệu trên cho thấy, vấn ñề vệ sinh và kiểm soát vệ sinh trong các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm rất ñáng ñể các nhà sản xuất và các nhà quản lý lưu tâm nhiều hơn nữa.
1.1.2. Nguyên nhân khiến thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây bệnh
Các yếu tố cơ hội có thể dẫn tới thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây
bệnh như:
+ Nhóm gây ô nhiễm thực phẩm: Quá trình sản xuất, chế biến, thu
hoạch không ñảm bảo các yêu cầu vệ sinh an toàn dẫn tới thực phẩm bị ô
nhiễm.
+ Nhóm các yếu tố gây ảnh hưởng tới sự tồn tại của mầm bệnh trong
thực phẩm như việc không ñun nấu kỹ, không xử lý ñầy ñủ các yêu cầu vệ
sinh chung
+ Nhóm các yếu tố gây tái nhiễm: Do quá trình bảo quản không ñảm
bảo, gây tái nhiễm từ người chế biến, phục vụ, môi trường hay từ dụng cụ
sang thực phẩm. Nếu người làm công tác thực phẩm bị ốm hay mang vi trùng
gây bệnh thì trong quá trình chế biến vi trùng sẽ vướng vào thực phẩm. Theo
cách này, trứng giun hay vi trùng lao, lỵ có thể bị nhiễm vào thực phẩm. Nguy
hiểm hơn nữa là những người mang sẵn vi trùng gây bệnh nhưng không có
biểu hiện của bệnh, như vi trùng thương hàn sống lâu trong gan người ñã khỏi
bệnh làm phân của họ bị nhiễm trùng, người mắc bệnh lỵ cũng mang vi trùng
trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh.
Ngoài ra, chuột gián hay ruồi là những sinh vật hay làm nhiễm trùng
thực phẩm. Người ta thấy rằng, trong một vùng có bệnh dịch tả thì hầu hết
ruồi ñều có vi trùng dịch tả. Trong phân và nước ñái của chuột rất dễ tìm thấy
vi trùng thương hàn. Chuột cũng rất hay truyền bệnh cho lợn, gà từ ñó vào
12
thực phẩm. Hay trên mình gián, người ta thấy có rất nhiều vi trùng ñường
ruột. Vi trùng ñường ruột thường có nhiều trong phân, phân lại ñược dùng
bón cho rau nên cũng có rất nhiều vi trùng nguy hiểm. Các loại tôm cua, ốc,
… sống trong nước bẩn cũng hay có trứng hoặc vi trùng gây bệnh. Có rất
nhiều trường hợp bị bệnh thương hàn nguyên nhân do người bệnh ăn phải hải
sản, tôm cua có vi trùng gây bệnh. Cuối cùng, yếu tố gây nhiễm trùng nữa là
dụng cụ chế biến không vệ sinh sạch sẽ, khu vực chế biến có ñiều kiện vệ sinh
kém.
1.1.3. Một số vi sinh vật chủ yếu thường gây ngộ ñộc có trong thực phẩm và
vi khuẩn chỉ ñiểm trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm
1.1.3.1. Ngộ ñộc do E.coli
E. coli sống trong tự nhiên thường không hay gây ngộ ñộc, nhưng ở một ñiều kiện nhất ñịnh sẽ gây bệnh (vi khuẩn gây ngộ ñộc có ñiều kiện). E. coli gây bệnh truyền nhiễm như bệnh tả ở các tiểu gia súc, bệnh ỉa chảy ở trẻ em, bệnh trúng ñộc nhiễm huyết ở trẻ sơ sinh.
Cấu trúc kháng nguyên E. coli chia ra ba loại: O, N và K. Vi khuẩn gây bệnh nặng nhất là loại có kháng nguyên K. Những vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên khác nhau thì gây bệnh cũng không giống nhau, trong gây bệnh thực nghiệm thì người nhạy hơn ñộng vật. Thời kỳ ủ bệnh thường từ 2 ñến 20 giờ. Bệnh phát ñột ngột, người bị bệnh thấy ñau bụng dữ dội, ít bị nôn mửa. Nhiệt ñộ cơ thể bình thường hoặc hơi sốt.
1.1.3.2. Ngộ ñộc do Clostridium perfringens
Clostridium perfringens sản sinh ra 6 tuýp ñộc tố: A, B, C, D, E, F. Trong 6 tuýp này thì ñộc tố A là ñộc tố chủ yếu gây ngộ ñộc sau ñó ñến tuýp F. Thời gian ủ bệnh trung bình 10 -12 giờ, có khi 6 ñến 8 giờ cũng có thể dài hơn. Bệnh xuất hiện với những triệu chứng viêm ruột, dạ dày, ñau bụng ỉa chảy, phân lỏng hoặc toàn nước; thỉnh thoảng có trường hợp nôn mửa, nhức ñầu, sốt.
1.1.3.3. Ngộ ñộc do Salmonella
Vi khuẩn gây ngộ ñộc thường là Salmonella typhymurium, Salmonella choleraesuls và salmonella enteritidis. Về cơ chế, các nhà khoa học cho rằng vi khuẩn Salmonella sinh ra ngoại tố chịu nhiệt, loại ñộc tố này gây bệnh cho
13
người và ñộng vật. Cũng có tác giả cho rằng ngộ ñộc Salmonella do ñường tiêu hóa hấp thụ phải một lượng lớn vi khuẩn Salmonella sống. Khi vào ñến máu vi khuẩn bị phá vỡ và tiết ra một lượng ñộc tố gây ñộc cho cơ thể. Tuy nhiên cùng ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella, không phải ai cũng bị ngộ ñộc. Ngoài số lượng vi khuẩn bị nhiễm, phản ứng của từng cơ thể là yếu tố quan trọng khiến người ñó có bị ngộ ñộc hay không. Ngộ ñộc Salmonella thường có các triệu chứng nôn mửa, ỉa chảy, sốt. Thời gian ủ bệnh trung bình từ 12 ñến 24 giờ. Trước khi phát bệnh thường có hiện tượng nhức ñầu, chán ăn, mặt tái nhợt, ra mồ hôi.
1.1.3.4. Vi khuẩn chỉ ñiểm trong thực phẩm
Vi khuẩn chỉ ñiểm trong thực phẩm ñược chia làm hai loại: Vi khuẩn
chỉ ñiểm vệ sinh và vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất.
� Vi khuẩn chỉ ñiểm vệ sinh (y tế)
Vi khuẩn chỉ ñiểm vệ sinh là những vi khuẩn mà sự có mặt của chúng
trong thực phẩm chứng tỏ thực phẩm ñã bị nhiễm phân.
Việc xác ñịnh trực tiếp những vi sinh vật gây bệnh gặp rất nhiều khó
khăn và mất nhiều thời gian. ðể ñơn giản hơn cho quá trình kiểm tra vệ sinh
thực phẩm, người ta xác ñịnh gián tiếp sự có mặt của vi sinh vật gây bệnh
bằng cách xác ñịnh các trực khuẩn ñường ruột E.coli, Clostridium Welchii,…
Vi khuẩn hiếu khí ưa nhiệt ñộ trung bình là một trong những chỉ ñiểm
có ích. Khi kiểm tra ta thấy sự có mặt của vi khuẩn sống, chứng tỏ nguyên
liệu ñã bị nhiễm bẩn, ñiều kiện vệ sinh không ñạt, ñiều kiện nhiệt ñộ sản xuất,
qui trình bảo quản không thích hợp báo hiệu thực phẩm có nguy cơ bị hư
hỏng.
Vi khuẩn kị khí ưa nhiệt ñộ trung bình ñược dùng như một vi khuẩn chỉ
ñiểm. C. Welchii thường hay có trong phân người và ñộng vật nên dễ bị
nhiễm vào thịt gia súc, gia cầm. Khi gặp ñiều kiện không thuận lợi các vi
khuẩn này chuyển thành dạng nha bào, chịu nhiệt khi ñun ở nhiệt ñộ thấp,
phát triển mạnh ở 20-30oC, mạnh nhất ở 43-47oC và chỉ trong ñiều kiện yếm
khí. Vi khuẩn này sinh ñộc tố trong ruột người và ñộng vật, gây ra bệnh ñau
dạ dày và ỉa chảy khi ăn phải một số lượng lớn vi khuẩn.
14
� Vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất
Vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất là những vi khuẩn mà sự có mặt của nó
chứng tỏ thực phẩm ñã bị kém phẩm chất, ảnh hưởng tới giá trị dinh dưỡng,
sức khỏe người sử dụng. Bao gồm các vi khuẩn thối rữa, Proteus, Clotridium
pefringer…
ðánh giá vệ sinh thực phẩm thường dựa vào các chỉ tiêu cảm quan, lý
hóa, vi sinh vật như: số lượng vi sinh vật hiếu khí trong một gam (hoặc 1 mL)
thực phẩm ở phạm vi cho phép. Phạm vi này do cơ quan kiểm soát vệ sinh qui
ñịnh, khác nhau tùy theo từng loại thực phẩm và tùy theo mức ñộ yêu cầu vệ
sinh của từng ñịa phương, từng nước, từng khu vực. Và ñiều quan trọng là
tuyệt ñối không có vi sinh vật gây bệnh vì phần lớn các vi sinh vật gây bệnh
có trong thực phẩm là vi sinh vật gây bệnh ñường ruột (tả, lỵ, thương hàn,…)
Do vậy vi sinh vật chỉ ñiểm có vai trò rất quan trọng trong ñánh giá vệ sinh
1.2. Công nghệ sản xuất bia, những công ñoạn cần thiết phải ki ểm tra vệ
sinh trong sản xuất
Quá trình sản xuất bia trải qua các công ñoạn: nấu, ñường hóa, lên men
(lên men chính, lên men phụ), lọc sản phẩm, bão hòa CO2, ñóng gói sản
phẩm. Quá trình sản xuất có thể tóm tắt như sau:
1.2.1. Quá trình nấu, ñường hóa
Quá trình nấu gồm một số bước sau: nghiền nguyên liệu, thủy phân
(ñường hóa), lọc nước nha, nấu hoa houblon, làm lạnh nhanh nước nha.
+ Nghiền nguyên liệu:
Nghiền nguyên liệu là quá trình nghiền nhỏ nguyên liệu nhằm phá vỡ
cấu trúc của hạt ñể tăng bề mặt tiếp xúc với nước, làm cho nước xâm nhập
vào các thành phần chất nội nhủ nhanh hơn, thúc ñẩy quá trình ñường hóa và
các quá trình thủy phân khác nhanh và triệt ñể hơn. Tạo ñiều kiện ñể tăng tốc
ñộ các quá trình lý học và hóa sinh học trong giai ñoạn nấu ñể nâng cao hiệu
suất và chất lượng dịch ñường
Nghiền có nhiều phương pháp: nghiền khô, nghiền ướt và nghiền ẩm.
Nghiền ướt, nghiền ẩm nhằm giữ nguyên vỏ malt ñể rút ngắn thời gian lọc.
15
Nhưng phương pháp này tốn năng lượng, thao tác phức tạp, còn nghiền khô
thì ñơn giản, dễ thực hiện và tiết kiệm năng lượng. Do vậy phương pháp
nghiền khô thường ñược chọn hơn.
+ Quá trình nấu: thực chất là quá trình thủy phân nhằm chuyển hóa các
thành phần chính trong malt và nguyên liệu thay thế ở nhiệt ñộ thích hợp
thành các chất hòa tan trong nước, trong ñó chủ yếu là các hydrat cacbon và
axit amin thủy phân nhờ enzym và sự thủy phân này phụ thuộc rất nhiều vào
nhiệt ñộ, pH, tỷ lệ nguyên liệu trong nước, tỷ lệ enzym.
+ Lọc dịch ñường (nước nha):
Dịch ñường gồm các chất hòa tan và không hòa tan, do ñó cần phải lọc
ñể tách hết các chất hòa tan ra khỏi các chất không hòa tan. Quá trình diễn ra
theo hai bước: lọc hỗn dịch thủy phân và thu ñược nước nha ban ñầu, dùng
nước nóng rửa bã rồi lọc thu nước nha cuối.
+ Nấu hoa houblon:
Mục ñích ñun sôi hoa houblon là ổn ñịnh thành phần dịch ñường hóa và
làm cho dịch ñường hóa có mùi thơm của hương chiết từ hoa houblon. ðun
sôi hoa nhằm trích ly và các chất thơm và chất ñắng, ñông tụ protein, thanh
trùng nước ñường hóa. Lượng hoa houblon sử dụng nhiều hay ít tùy thuộc
vào từng loại bia và vào thị hiếu người tiêu dùng.
+ Lạnh nhanh và lắng trong:
Mục ñích quan trọng này là giảm nhiệt ñộ nước nha xuống, ñưa oxy từ
không khí vào dịch thể và kết lắng các cặn bẩn, làm trong dịch ñường. Lạnh
nhanh và lắng trong thường tiến hành theo hai bước: giảm nhiệt ñộ xuống 60-
70oC, kết tủa nóng lắng xuống và bị loại hết khỏi nước nha. Khi nhiệt ñộ giảm
ñến 60oC, dịch nước nha ñược bơm qua thiết bị lạnh nhanh, dịch ñược ñưa
qua một thiết bị lọc ñể loại bỏ các cặn bẩn và kết tủa nóng. Tốc ñộ hạ nhiệt ñộ
của dịch ñường nhanh nên hạn chế ñược sự hoạt ñộng của vi sinh vật.
1.2.2. Lên men
Có hai kiểu lên men là lên men nổi và lên men chìm tùy thuộc vào việc
sử dụng hai loại nấm men khác nhau. Nấm men nổi lên men ở nhiệt ñộ cao,
16
nấm men chìm lên men ở nhiệt ñộ thấp. Lên men nổi hay chìm ñều trải qua
hai qua trình lên men, lên men phụ và lên men chính.
a. Lên men chính:
Mục ñích: nhờ tác dụng của enzym, vi sinh vật chuyển hóa ñường
thành rượu, CO2 và các sản phẩm khác góp phần tạo nên hương vị cho bia.
Sự tiêu hao cơ chất diễn ra mạnh mẽ, một lượng ñường khá lớn sẽ ñược
chuyển hóa thành cồn và CO2. Thời gian lên men chính tùy thuộc vào nồng
ñộ chất hòa tan ban ñầu của nước nha và tùy thuộc vào yêu cầu chất lượng
của các loại bia, thời gian có thể là 4-8 ngày. Sản phẩm chủ yếu của quá trình
lên men là etanol và khí CO2. Các sản phẩm thứ cấp ñược tích tụ trong dịch
nước nha ñã lên men là: glyxerin, axetaldehit, axit pyruvic, axit acetic, axit
lactic… các loại rượu bậc cao ñược hình thành từ axit amin.
b. Lên men phụ và ủ chín:
Là quá trình lên men diễn ra chậm. tiêu hao một lượng ñường không
ñáng kể, lắng trong và bảo hòa CO2. Quá trình lên men phụ và ủ chín bia
ñược tiến hành ở nhiệt ñộ từ 1-3oC.
Mục ñích của quá trình lên men phụ và ủ chín là lên men phần ñường
còn lại ñể bổ sung CO2 cho bia và hoàn thiện chất lượng bia, thu ñược một
loại nước uống bão hòa CO2 và có hương thơm dễ chịu.
1.2.3. Vấn ñề vệ sinh thực phẩm nói chung và vệ sinh trong quá trình sản
xuất bia nói riêng
1.2.3.1. Vệ sinh thực phẩm
Nói tới vệ sinh trong sản xuất thực phẩm người ta hay ñề cập tới hai
yêu cầu cần ñược thực hiện ñấy là GMP và HACCP.
� GMP (Good Manuafacturing Practice) - Tiêu chuẩn thực hành sản
xuất tốt.
GMP là hệ thống ñảm bảo ñiều kiện chất lượng áp dụng cho tất cả các
cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm, ñiều kiện vệ sinh tiên quyết của cơ sở
sản xuất và chế biến thực phẩm. ðối tượng của GMP là tất cả các yếu tố có
ảnh hưởng tới chất lượng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm.
17
Nội dung cơ bản của GMP: qui ñịnh các chuẩn mực về yêu cầu vệ sinh
với cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm như vị trí, xí nghiệp, thiết kế nhà
xưởng và các khu vực lân cận, yêu cầu lắp ñặt thiết bị cũng như phương tiện
sản xuất, yêu cầu về nguyên liệu, công nghệ chế biến, chế ñộ làm sạch, khử
trùng; yêu cầu về vệ sinh con người trực tiếp tham gia sản xuất, hệ thống an
toàn sản xuất và hệ thống quản lý chất lượng ở doanh nghiệp; thực hiện
nghiêm ngặt, luôn luôn duy trì, cải tiến và ñổi mới.
� HACCP (Hazards Analysia critical Control Point) - Hệ thống phân
tích và kiểm soát các mối nguy trọng yếu trong quá trình sản xuất
chế biến thực phẩm
HACCP là hệ thống ñảm bảo chất lượng ñược áp dụng ñối với các
doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm, ñặc biệt là các cơ sở sản xuất
chế biến sản phẩm thủy sản.
ðối tượng của HACCP tập trung vào các công ñoạn trong công nghệ
chế biến, nơi có thể có các mối nguy về vật lý, vi sinh vật và hóa học
Nội dung cơ bản của hệ thống HACCP: Phân tích các mối nguy hại,
xác ñịnh tầm quan trọng của các mối nguy ñó trong nguyên liệu cũng như
trong các công ñoạn, công nghệ chế biến. ðây là yếu tố hết sức quan trọng
trong quá trình HACCP; xác ñịnh các ngưỡng giới hạn và các ngưỡng vận
hành; xác ñịnh các biện pháp, phương thức quản lý, kiểm soát các ngưỡng tới
hạn ñó và ñề ra các hoạt ñộng nhằm khắc phục trong trường hợp các ngưỡng
trên vi phạm hoặc sai lệch; thiết lập hệ thống biểu mẫu trong việc thẩm ñịnh
và tính toán kết quả.
GMP và HACCP là hai hệ thống ñảm bảo chất lượng của sản phẩm
ñược áp dụng cho tất cả các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm cho dù qui mô
sản lượng nào. GMP và HACCP ñều có mục tiêu là ngăn chặn phòng ngừa sự
nhiễm bẩn trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm. Cả hai hệ thống ñều
yêu cầu ñòi hỏi các ñiều kiện với doanh nghiệp trong việc ñầu tư vật chất kỹ
thuật, thời gian, con người trong quá trình áp dụng. Tuy nhiên GMP là ñiều
kiện bắt buộc còn HACCP mang tính chất tự nguyện.
18
Trong quá trình sản xuất, tùy thuộc vào mỗi loại sản phẩm mà có
những nguy cơ nhiễm bẩn mà gây mất an toàn cho người sử dụng rất ña dạng
và khác nhau. Người ta chia các nguy cơ gây mất an toàn cho người sử dụng
ra làm ba nhóm:
+ Mối nguy hai có nguồn gốc sinh học như: vi sinh vật gây bệnh, kí
sinh trùng, nấm men, nấm mốc, hay các sản phẩm biến ñổi gen.
+ Mối nguy hại có nguồn gốc hóa học như: dư lượng thuốc trừ sâu,
thuốc thú y; các loại phụ gia phẩm màu thực phẩm; hàm lượng kim loại quá
giới hạn.
+ Mối nguy hại vật lý: tạp chất lạ, các mảnh kim loại, ñá thủy tinh.
Nguồn gây hại có thể sinh ra từ các cơ sở sản xuất hay các sản phẩm
phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, hoặc ñưa ñến ngẫu nhiên từ quá trình vận
chuyển, tiêu thụ.
1.2.3.2.Vệ sinh trong quá trình sản xuất bia
Trong quá trình sản xuất bia có các yêu cầu vệ sinh riêng như: vệ sinh
nhà xưởng, vệ sinh cá nhân của nhân viên, vệ sinh trong quá trình bảo quản,
vệ sinh về phương tiên vận chuyển, cơ sở phân phối và trong quá trình chế
biến.
+ Yêu cầu nhà xưởng: quá trình sản xuất ñi theo dây chuyền một chiều,
do ñó các kho, phân xưởng cũng phải thiết kế theo nguyên tắc ñó. Phân xưởng
sản xuất phải ñảm bảo thông thoáng, cao ráo, sạch sẽ, nguồn nước cung cấp
cho sản xuất phải ñầy ñủ ñảm bảo vệ sinh.
+ Yêu cầu vệ sinh trong quá trình sản xuất: qui trình sản xuất liên tục,
thời gian sản xuất càng ngắn càng tốt, tránh tiếp xúc trực tiếp của tay công
nhân với thực phẩm ñề phòng sự nhiễm bẩn, cần tự ñộng hóa qui trình sản
xuất. Nguyên liệu sản xuất không có mùi vị bất thường, không nhiễm bẩn, có
giá trị dinh dưỡng phù hợp. Dụng cụ thiết bị, vật liệu không thôi nhiễm ra
thực phẩm, dễ vệ sinh và tiệt khuẩn dễ dàng. Quá trình sản xuất nên theo qui
trình tự ñộng hóa và khép kín ñể tránh làm bẩn. Sản phẩm trước khi xuất
xưởng phải ñược kiểm tra theo lô, mẻ, ca, thành phẩm không ñạt yêu cầu vệ
19
sinh phải có biện pháp xử lý, không ñược xuất xưởng như sản phẩm bình
thường.
+ Vệ sinh cá nhân của nhân viên: Phải có khả năng tối thiểu về vệ sinh
thực phẩm, nâng cao ý thức vệ sinh, giữ vệ sinh cho bản thân trong quá trình
chế biến không mang bệnh truyền nhiễm.
+ Yêu cầu vệ sinh trong bảo quản: Kho chứa thực phẩm phải thông
thoáng, có cửa sổ và quạt gió, các bao túi chứa bia phải ñể trên các sàn cao,
sắp xếp trật tự, nhiệt ñộ bảo quản ổn ñịnh, phải có máy ghi nhiệt ñộ và ñộ ẩm
hàng ngày.
+ Phương tiện vận chuyển và cơ sở phân phối: Có phương tiện vận
chuyển riêng, có chế ñộ cọ rửa và sát khuẩn ñịnh kỳ các phương tiện. Cơ sở
phân phối phải ñạt yêu cầu vệ sinh, thông thoáng, sạch sẽ.
1.3. Các phương pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay
Hiện nay các phương pháp kiểm tra vệ sinh thường ñược áp dụng trong các cơ sở sản xuất bao gồm:
1.3.1. Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường
Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường là phương pháp chủ yếu dựa vào quan sát bằng mắt ñể phát hiện các vết bẩn, tồn dư của quá trình chế biến còn tồn ñọng trên dụng cụ thiết bị…
Ưu ñiểm:
- Cho kết quả nhanh, tức thời
- Kinh phí ñầu tư, chi phí ñánh giá thấp
- Tính cơ ñộng cao, có thể áp dụng cho nhiều loại hình sản xuất
Nhược ñiểm:
- ðộ nhạy rất thấp, chỉ cho phép nhận biết những sự mất vệ sinh lớn quá rõ
- Mang tính chủ quan, dễ gây tranh cãi
- Chỉ thực hiện ở những nơi mà con người có thể tiếp xúc ñược
Phương pháp này chỉ mang tính hỗ trợ ban ñầu.
20
1.3.2. Phương pháp ñánh giá thông qua việc giám sát các thông số của hệ thống tự ñộng hoặc thông qua việc kiểm tra nồng ñộ các chất tham gia vào quá trình
Ưu ñiểm:
- Cho kết quả nhanh, tức thời từ ñó có giải pháp xử lý kịp thời
- ðộ nhạy cao
- ðộ tin cậy lớn, mang tính khách quan.
Nhược ñiểm:
- Kinh phí ñầu tư cao, phải có trang thiết bị hiện ñại, ñồng bộ, cán bộ có chuyên môn cao
- Tính cơ ñộng thấp.
1.3.3. Phương pháp ñánh giá bằng nuôi cấy vi sinh vật truyền thống
ðây là phương pháp ñánh giá dựa trên việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trên dụng cụ, thiết bị sản xuất, sản phẩm, trên tay người vận hành…
Ưu ñiểm:
- Kết quả phân tích khách quan
- Xác ñịnh ñược số lượng và chủng loại vi sinh vật trong mẫu thử
Nhược ñiểm:
- Phải có trang bị phòng thí nghiệm, yêu cầu cán bộ có chuyên môn cao
- Tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm (từ 2 ñến 5 ngày) vì vậy không thể có giải pháp xử lý kịp thời
- Không ñánh giá ñược tồn dư các chất dinh dưỡng.
1.3.4. Phương pháp kiểm tra bằng phát quang sinh học
Phương pháp này dựa trên phép ño ATP- nguồn năng lượng dùng cho mọi tế bào ñộng, thực vật, vi khuẩn, nấm men, nấm mốc… Từ kết quả ño ATP ta sẽ
21
phát hiện ñược không chỉ số lượng vi sinh vật mà còn kiểm tra ñược cả tồn dư các chất dinh dưỡng làm môi trường cho vi sinh vật phát triển.
ðây là phương pháp mới, tiên tiến ñang ñược nhiều nước trên thế giới áp dụng cho các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm.
1.4. Giới thi ệu về phương pháp ATP quang sinh
ATP- Adenozin triphotphat là một dạng liên kết cao năng trong các tế
bào sinh vật. Năng lượng ở dạng liên kết này có tính chất linh ñộng, cho phép
chuyển hóa dễ dàng sang các dạng năng lượng khác: hóa năng, nhiệt năng, cơ
năng cần cho hoạt ñộng sống của tế bào.
ATP chiếm vị trí ñặc biệt trong số các hợp chất cao năng. Sự tạo thành
hợp chất cao năng ATP luôn là giai ñoạn thu năng lượng cuối cùng của các
quá trình oxy hóa khử. ATP cũng là chất cho năng lượng trực tiếp ñối với các
phản ứng thu nhiệt của sự trao ñổi chất. Các hợp chất trung gian khác chỉ là
sản phẩm trung gian ñể tạo ra ATP hoặc ñược tạo thành từ ATP. Như vậy
ATP có vai trò quan trọng bậc nhất trong các chuyển hóa năng lượng và là
mắt xích liên hợp giữa các phản ứng thu nhiệt và tỏa nhiệt. Do ñó ATP là chất
cho năng lượng vạn năng, tạo nguồn năng lượng dự trữ chung cho mọi tế bào,
lượng ATP có trong các tế bào khoảng từ 0.22-1.03 fg (1). Hợp chất cao năng
ATP có mặt trong tất cả các tế bào sống, ñặc biệt là trong tất cả các tế bào vi
khuẩn. Sự khác nhau về lượng ATP như một chức năng thuộc trạng thái sinh
học, như một chức năng quan trọng của loài.
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp ATP quang sinh học
ATP trong tế bào ñược giải phóng nhờ các tác nhân cation, dưới tác
dụng của enzym luciferin và sự có mặt của Mg2+ sẽ tạo ra phản ứng phát
quang. Dùng máy ño chuyên dụng có ñộ nhạy cao ñể ño cường ñộ sáng.
Cường ñộ này cao hay thấp tùy thuộc vào lượng ATP có trong mẫu.Từ ñó ta
xác ñịnh ñược lượng vi sinh vật và sự nhiễm bẩn trong mẫu hay dư lượng
thực phẩm có trong mẫu….
Sơ ñồ phương trình phản ứng:
ATP + Luciferin/luciferase → AMP + PP + light
22
1.4.2. Ưu ñiểm của phương pháp ño ATP quang sinh trong ngành công
nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm
Phương pháp kiểm tra vệ sinh truyền thống ñòi hỏi mất nhiều thời gian
từ 2 ñến 5 ngày, có khi còn lâu hơn nữa. Việc xử lý kết quả ngay khi có sự cố
là không ñáp ứng ñược. ðể khắc phục những hạn chế này, ngày nay người ta
sử dụng ATP quang sinh.
+ ATP quang sinh là phương pháp ño lường cho kết quả tức thì.
+ Kiểm tra có kết quả nhanh ñể có biện pháp khắc phục kịp thời trước
và trong sản xuất.
+ Giám sát vệ sinh toàn diện: Nhận dạng ñầy ñủ cả vệ sinh lẫn dư
lượng thực phẩm, nguồn môi trường cho vi sinh vật phát triển.
+ Có thể kiểm tra trực tiếp lượng vi sinh vật hoặc chỉ dư lượng thực
phẩm tồn dư.
Ngành công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu, người ta dùng hệ thống
kiểm tra nhanh ñể nhanh chóng xuất hàng trước khi bắt ñầu sản xuất ñợt hàng
mới, cũng như nhận dạng khu vực có vấn ñề về ñộ sạch vệ sinh, xây dựng chế
ñộ vệ sinh nghiêm ngặt, giảm thiểu tỷ lệ hàng hỏng/loại, hoàn thiện thiết kế
các dòng sản phẩm, huấn luyện và ñánh giá kỹ năng của các nhân viên vệ sinh
và giải quyết các trở ngại về vệ sinh. Qua việc sử dụng hệ thống này, các công
ty cũng giới thiệu ñược chất lượng và giá trị sản phẩm của mình ñúng với yêu
cầu người tiêu dùng và các cơ quan quản lý.
Phương pháp ATP quang sinh ñã phát huy mạnh mẽ tác dụng, hiệu quả
trong ngành chế biến thực phẩm và nước giải khát. Các công ty như Pepsi
Cola, Nestle, Cadburge, Campbell, Bass và nhiều công ty khác ñã ñưa ATP
vào chương trình QA (ñảm bảo chất lượng) của họ (16). Ưu ñiểm chính của
phương pháp ATP là cho kết quả tức thì, cho biết dây chuyền sản xuất của họ
là sạch hay không sạch, ñiều ñó có nghĩa là có thể sản xuất tiếp trên dây
chuyền ñấy ñược hay không. ðiều này sẽ giúp công ty giảm thiểu những tổn
thất về tài chính do sản phẩm bị nhiễm bẩn hoặc sản phẩm trên dây chuyền
không ñáp ứng chỉ tiêu vệ sinh. ATP là phương tiện diễn giải nhanh chóng,
24
Chương II
ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ðối tượng nghiên cứu
Kiểm tra quá trình vệ sinh trong dây chuyền công nghệ sản xuất bia ở
cơ sở sản xuất của Viện Công nghiệp thực phẩm. Các vị trí kiểm tra là các vị
trí trọng yếu của quá trình như các tec lên men và các tec sản phẩm, máy lọc
sản phẩm.
Chỉ tiêu lựa chọn kiểm tra là: tổng nấm men, nấm mốc, tổng Coliforms
và E.coli, tổng vi sinh vật hiếu khí
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất
a. Dụng cụ thiết bị
+ Máy ño ATP HY_LITE 2
+ Máy quang phổ UV-VIS U-1900
+ Nồi khử trùng
+ Tủ ấm
+ Tủ cấy
+ Máy ño pH
+ Pipet tự ñộng, ñầu hút
+ ðĩa petri, giấy nhôm, ñèn cồn, bình xịt cồn, ñũa thủy tinh,…
b. Hóa chất
+ Plate count agar ( Peptone từ Carein 5,0g; cao nấm men 2,5g; D+
gluco 1,0g; agar 14,0g)
Cách pha:
Hòa tan 22,5 g PCA trong 1000 mL nước cất. Hấp khử trùng ở 121oC,
15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,0 ± 0,2 ở 25 oC.
25
+ Lactose broth ( Peptone 10g; lactose 10g; beef extract 6g; nước cất
1000 mL).
Cách pha:
Môi trường ñơn: hòa tan 13g lactose broth trong 1000mL nước cất.
Môi trường kép: hòa tan 26g lactose broth trong 1000 mL nước cất.
Hòa tan môi trường, sau ñó ñem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử
trùng pH: 6,9 ± 0,2 ở 25 oC.
+ Brilliant-green lactose (bile) broth ( Peptone 10g; lactose 10g; OX
bile 20g; Brilliant – green 13 mL; nước cất 1000 mL).
Cách pha:
Môi trường ñơn: hòa tan 40g trong 1000 mL nước cất.
Môi trường kép: hòa tan 80g trong 1000 mL nước cất.
Hòa tan môi trường, sau ñó ñem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử
trùng pH: 7,2 ± 0,2 ở 25 oC.
+ Tryptone
Tryptone ( Peptone từ casein ): 20g.
NaCl: 5g.
Nước cất 1000 mL.
Cách pha:
Hòa tan môi trường, sau ñó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng
pH: 7,5 ± 0.2 ở 25 oC.
+ R2A agar (Yeast extract 0,5; proteose peptone 0,5; casein hydrolysat
0,5; glucose 0,5; starch soluble 0,5; natri pyruvat 0,3; K2HPO4 0,3; MgSO4
0,05; agar 12,0).
Cách pha:
Hòa tan 15.2 g trong 1000 mL nước cất. ðem hấp khử trùng ở 121oC trong
vòng 15 phút. Sau khử trùng pH 7,2 ± 0,2 ở 25 oC.
26
+ Kovacs
+ Oxidase
+ Fluoro cult (Tryptone 5,0; NaCl 5,0; Sorbit 1,0; Tryptophan 1,0; 4-
brom-4chlor-3 indoly –B-D- glactogyranoside (X-gal) 0,08; 4-
metylumbelliferyl –β-D-glucuronide (MGG) 0.05; 1-isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside 0.1 ).
Cách pha:
Môi trường ñơn: cân 17g/1000mL nước cất
Môi trường kép: cân 34g/1000mL nước cất
Hòa tan môi trường, sau ñó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng
pH: 6,8 ± 0,2 ở 25 oC.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống
Phương pháp truyền thống là phương pháp phổ biến nhất trong các
nghiên cứu vi sinh vật học. Trên môi trường ñặc mỗi vi sinh vật sẽ phát triển
thành khuẩn lạc hoặc sự sinh khí và biểu hiện ñục ở ống nghiệm. Dựa trên
ñấy có thể kiểm tra số lượng vi sinh vật trong mỗi ñơn vị thể tích của dịch
nghiên cứu. Phương pháp ñếm khuẩn lạc thường ñược sử dụng ñể kiểm tra số
lượng nấm men, nấm mốc.
+ Ưu ñiểm của phương pháp là không phát hiện nhầm các vi sinh vật
chết hoặc các mảnh xác hữu cơ, vì chỉ có bào tử hoặc các tế bào sống mới
phát triển thành khuẩn lạc hoặc cho phản ứng sinh khí.
+ Nhược ñiểm: Khi làm dịch pha loãng không phải mọi vi sinh vật ñều
có thể tách khỏi bề mặt chất rắn ñể hòa tan vào nước. Không có loại môi
trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển.
Các vi sinh vật phát triển trên mỗi loại môi trường chỉ tồn tại một nhóm sinh
lý nhất ñịnh.
ðối với vi sinh vật mà những bào tử thường dính chặt vào nhau thành
từng chuỗi, từng ñôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, thì mỗi
27
chuỗi, mỗi khối chỉ hình thành một khuẩn lạc. Vì vậy số khuẩn lạc chưa phản
ánh ñược chính xác số tế bào, bào tử trong dịch nghiên cứu.
Khi cấy dịch pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy ñược số
khuẩn lạc chênh nhau 10 lần. Vì vậy muốn kết quả phân tích có giá trị so sánh
tốt, chúng ta nên sử dụng một ñộ pha loãng thống nhất với từng nhóm vi sinh
vật.
2.2.2.1.1. Phương pháp xác ñịnh tổng số Coliforms và E.coli
Cấy vào 5 ống ñựng môi trường canh thang lỏng nồng ñộ kép với một
lượng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống ñều thả
ống duham lộn ngược. Tiếp theo, cấy vào 5 ống ñựng môi trường canh thang
lỏng nồng ñộ ñơn với một lượng 1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng),
trong mỗi ống ñều thả ống duham lộn ngược. Cấy vào 5 ống ñựng môi trường
canh thang lỏng nồng ñộ ñơn với một lượng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch
mẫu pha loãng), trong mỗi ống ñều thả ống duham lộn ngược.
Ủ các ống sau khi cho mẫu vào ở nhiệt ñộ 35oC trong 24 hoặc 48 h và
quan sát. Với những ống có biểu hiện ñục và sinh khí, chuyển tiếp lần lượt 10
mL , 1mL, 0.1mL vào 5 ống môi trường brilliant kép và 5; 5 ống môi trường
Brilliant ñơn, nuôi tiếp ở 35oC sau 48 h. sau ñấy quan sát và ñọc kết quả theo
bảng kết quả trong ISO 9308-phần II. Mẫu có Coliforms với biểu hiện ñục và
sinh khí ở ống.
Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào 5 ống môi trường tryptone kép
và 5; 5 ống môi trường Tryptone ñơn, nuôi tiếp ở 44oC sau 24 h. Cho vào mỗi
ống vài giot Kovacs, nếu biểu hiện màu hồng trong ống, chứng tỏ sự có mặt
của E.coli.
2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc
Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trường ñĩa thạch. Nấu từng loại môi
trường thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trường rồi phân phối
vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL
mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất ñịnh cho vào các hộp ñĩa thạch ñã ñược khử
trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 ñĩa thạch. Sau ñấy rót vào mỗi hộp ñĩa
khoảng 10 mL môi trường thạch sau khử trùng và ñể nguội ở 40-50oC. ðậy
28
nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, ñể nguội ñến khi mặt thạch ñông
lại, ghi số mẫu và nồng ñộ pha loãng lên mỗi ñáy hộp petri và bọc giấy báo
rồi ñem nuôi ở 35oC và ñọc kết quả sau 48h ± 3.
2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng môi trường R2A agar, hòa tan với lượng 15,2g/1000 mL, tiếp
theo ñem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu ñã pha loãng cho vào hộp petri ñã ñược khử
trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trường R2A agar ñã khử trùng, ñậy nắp và
xoay tròn ñều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, ñể nguội, ñợi khi mặt thạch ñông lại
hoàn toàn sau ñấy ghi tên mẫu và nồng ñộ pha loãng lên ñáy hộp petri, bao
giấy rồi ñem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi ñủ thời gian, ñem ra ñọc
kết quả bằng cách ñếm các khuẩn lạc trên ñĩa thạch. Sau ñấy báo cáo số
khuẩn lạc trên một ñơn vị thể tích mẫu tương ứng.
2.2.2.2. Phương pháp xác ñịnh ñộ sạch bằng ATP quang sinh
ðể nghiên cứu ứng dụng phương pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia bằng ño ATP quang sinh, các bước cần phải tiến hành như sau:
- Nhận dạng các ñiểm kiểm tra: Các ñiểm kiểm tra ñược coi là các ñiểm kiểm soát tới hạn (CCP), ñại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu ñược sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh.
Các ñiểm kiểm tra nói chung ñược chia làm hai nhóm:
Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm.
- Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ ñồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra.
- Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thường quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái ñã vệ sinh sạch sẽ.
29
- Xác ñịnh các giá trị giới hạn: Sau khi có ñủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thường sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh.
- ðo ATP quang sinh bằng thiết bị ño HY_LITE 2.
ðặc tính kỹ thuật của máy:
+ Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU
+ Có thể lưu hơn 2000 kết quả ño
+ Tín hiệu nền < 10 RLU
+ Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only
+ ðầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức năng bảo vệ quá tải
Trong phương pháp xác ñịnh bằng ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy
mẫu ñược sử dụng
+ Que lấy mẫu bề mặt:
Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu ra khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt
kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận ñặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống và
lắc ñể hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.
ðọc kết quả: ðặt dụng cụ Clean-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và ñợi
ñọc kết quả khoảng 10 giây sau ñấy.
+ Que lấy mẫu nước:
Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy
mẫu vào dung dịch kiểm tra
Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận ñặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc ñể hoạt
hóa mẫu trong vòng 10 giây.
ðọc kết quả: ðặt dụng cụ Aqua-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và ñợi
ñọc kết quả trong vòng 10 giây sau ñấy.
30
2.2.2.3. Ứng dụng máy ño quang UV-VIS U-1900
ðặc tính kỹ thuật
Hệ quang: Ratio beam
Bươc sóng: 190-1100nm
ðộ rộng dải quang phổ: 4 nm
Stray light: trong 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2)
ðộ chính xác bước sóng: ± 0.5 nm
ðộ tái lặp bước sóng: ± 0.3 nm
Dạng ño: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength
measurement
Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000)
% T (0 tới 300%T)
Nồng ñộ (0.000 tới 9999)
Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)
± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)
% 0.3 T
Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)
± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)
% 0.15 T
Tốc ñộ scan bước sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút
Baseline stability (ñộ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, 2 tiếng sau khi bật máy)
Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm)
Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm)
Nguồn sáng: WI và ñèn D2
Detector: Silicon photodiode
31
Tiến hành: Các mẫu môi trường phát quang ñược chuẩn bị. Sử dụng
cuvet 20 mm cho phép ño. Chọn dải quét bước sóng tà 190 nm - 1100 nm.
32
Chương III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chúng tôi thực hiện kiểm tra vệ sinh ở một số ñiểm trọng yếu trong dây
chuyền sản xuất bia như:
+ Các tec lên men
+ Máy lọc sản phẩm
+ Các tec sản phẩm
3.1. Phương pháp phân tích truyền thống
3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men
� Tec lên men 1
Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x106 5.8 x106 5.2 x104 1.5 x103
Tổng nấm men, nấm mốc 4.2 x 103 3.7 x103 3.2 x103 1.0 x 102
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 4 2,0 2,0 <2,0
� Tec lên men 2
Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 4.2 x106 3.7 x106 2.1 x104 1.0 x103
Tổng nấm men, nấm mốc 3.6 x103 3.7x103 1.9 x103 1.0 x102
33
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 2,0 4,0 2,0 2,0
� Tec lên men 3
Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.7 x106 5.5 x106 4.7 x104 1.8 x103
Tổng nấm men, nấm mốc 3.4 x103 3.3x103 2.6 x103 0.5 x 102
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 4,0 2,0 <2,0 2,0
3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm
� Máy lọc sản phẩm ñợt 1
Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.2 x103 5.9 x103 3.0 x102 0.5 x102
Tổng nấm men, nấm mốc 5.6 x102 5.7x102 2.0 x102 1.3 x 10
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 2,0 2,0 4,0 <2,0
34
� Máy lọc sản phẩm ñợt 2
Bảng 6: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.1 x103 6.0 x103 2.0 x102 5 x10
Tổng nấm men, nấm mốc 4.7 x102 4.8 x102 3.0 x102 12
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 4,0 <2,0 2,0 <2,0
� Máy lọc sản phẩm ñợt 3
Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm ñợt 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.9 x103 5.7 x103 1.0 x102 20
Tổng nấm men, nấm mốc 5.0 x102 4.7 x102 5.0 x10 12
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 2,0 2,0 2,0 <2,0
3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm
� Tec sản phẩm 1
Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
35
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.3 x103 6.2 x103 10 x102 20
Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.2 x102 3.0 x10 17
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 2,0 <2,0 2,0 <2,0
� Tec sản phẩm 2
Bảng 9: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 2
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.0 x103 6.1 x103 8.0 x102 12
Tổng nấm men, nấm mốc 5.7 x102 5.4 x102 6.2 x10 14
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
Tổng Coliforms (MPN) 2,0 <2,0 2,0 <2,0
� Tec sản phẩm 3
Bảng 10: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 3
Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4
Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x103 4.8 x103 9 x102 17
Tổng nấm men, nấm mốc 4.8 x102 4.5 x102 3.0 x10 11
Tổng E.coli (MPN) 0 0 0 0
36
Tổng Coliforms (MPN) 2,0 2,0 2,0 <2,0
3.2. Phương pháp ATP quang sinh học
3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men
Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở
các tec lên men
Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 6608 5500 6740
2 Vệ sinh lần 2 5460 4673 6580
3 Vệ sinh lần 3 520 510 495
4 Vệ sinh lần 4 295 297 285
Khi vệ sinh các tec lên men ở lần rửa thứ 1 và thứ 2 nước còn bẩn, ở
các tec ño ñược ñều ở khoảng 6000 RLU. Từ lần 3 trở ñi mức ñộ vệ sinh ñã
khá hơn, ở các tec ño ñược khoảng 500 RLU. Kết thúc quá trình kiểm tra (lần
4) mẫu ño ñược ñạt ở mức dưới 300 RLU ở cả 3 tec
3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm
Mẫu lấy ở máy lọc sản phẩm ñược tiến hành sau khi xả tháo vải lọc, xả
bỏ cặn lần ñầu tiên trên các bản lọc.
Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở
máy lọc sản phẩm
Số thứ tự Tên mẫu ðợt 1 (RLU) ðợt 2 (RLU) ðợt 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 790 795 787
2 Vệ sinh lần 2 792 620 690
37
3 Vệ sinh lần 3 254 265 235
4 Vệ sinh lần 4 150 120 137
Ở hai lần vệ sinh ñầu, máy lọc sản phẩm vẫn chưa ñược sạch, sau lần
thứ 3 vệ sinh kết quả RLU ở cả ba ñợt ñều nhỏ hơn 300 RLU. Ở máy lọc sản
phẩm chỉ sau 3 lần ñã có thể ñạt yêu cầu vệ sinh.
3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm
Bảng 13: Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ATP quang sinh ở
các tec sản phẩm
Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)
1 Vệ sinh lần 1 870 734 674
2 Vệ sinh lần 2 723 627 580
3 Vệ sinh lần 3 225 243 235
4 Vệ sinh lần 4 131 127 130
Sau lần 1 và lần 2, quá trình vệ sinh vẫn không thay ñổi ñáng kế. ðến
lần 3, ở tất cả các tec ñều ñạt kết quả dưới 300 RLU. Cũng như ở máy lọc sản
phẩm, tec sản phẩm cũng ñạt yêu cầu sau 3 lần vệ sinh.
3.3. ðánh giá sự tương thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phương pháp
truy ền thống và ño ATP quang sinh
3.3.1. Mẫu ñã biết trước nồng ñộ
ðể so sánh sự tương thích, chúng tôi chuẩn bị các mẫu thử ñã biết trước
nồng ñộ. Mẫu ñược chuẩn bị từ nấm men Saccharomyces carlbergensis dùng
trong sản xuất bia, với nồng ñộ ban ñầu là 3.5 x 106 tế bào/mL Các mẫu ñược
chuẩn bị với nhiều mức nồng ñộ khác nhau với hệ số pha loãng là 10-1, 10-2,
10-3, 10-4 kết quả ñược trình bày ở bảng dưới ñây.
38
Bảng 14: Kết quả phân tích mẫu ñã biết trước nồng ñộ bằng cả
phương pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh.
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
(CFU) ðo ATP (RLU)
Mẫu ban ñầu 3.5 x 106 2302
Mẫu 10-1 3.5 x 105 747
Mẫu 10-2 3.5 x 104 243
Mẫu 10-3 3.5 x 103 158
Mẫu 10-4 3.5 x 102 132
Qua bảng kết quả ta thấy kết quả ño ñược từ phương pháp ATP quang
sinh và tổng số tế bào nấm men ñếm ñược có sự tương thích, số ñơn vị RLU
tăng dần khi số lượng tế bào tăng dần. Ở giai ñoạn pha loãng giữa nồng ñộ
mẫu 10-4 và mẫu 10-3, kết quả thay ñổi không nhiều, nhưng có sự nhảy vọt
giữa mẫu 10-1 và 10-2 và ñặc biệt là từ mẫu ban ñầu so với mẫu ñã pha loãng
10 lần ( Mẫu 10-1).
3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia
a. Kiểm tra ở tec lên men
� Tec 1
Bảng 15: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phương pháp truyền
thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 5.8 x 106 6608
39
Rửa lần 2 5.4 x106 5460
Rửa lần 3 5.2 x 104 520
Rửa lần 4 1.5 x 103 295
� Tec 2
Bảng 16: Kết quả phân tích ở tec lên men 2 bằng phương pháp
truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 4.2 x 106 5500
Rửa lần 2 3.7 x106 4673
Rửa lần 3 2.1 x 104 510
Rửa lần 4 1.0 x 103 297
� Tec 3
Bảng 17: Kết quả phân tích ở tec lên men 3 bằng phương pháp
truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 5.7 x 106 6740
Rửa lần 2 5.5 x106 6580
Rửa lần 3 4.7 x 104 495
Rửa lần 4 1.8 x 103 285
Nhận xét:
40
Quá trình vệ sinh, rửa lần 1 và lần 2 chưa có sự thay ñổi nhiều thể hiện
ở cả phương pháp xác ñịnh truyền thống và phương pháp ATP quang sinh. Từ
lần rửa thứ 3, ở các tec lên men mới thấy biểu hiện rõ rệt sự thay ñổi vệ sinh,
và ñến lần rửa cuối (lần 4) cùng thì sự ñảm bảo vệ sinh mới ñược hoàn tất.
Nếu dùng phương phương kiểm tra nhanh bằng ATP quang sinh thì tec lên
men hoàn thành quá trình vệ sinh khi chỉ số RLU nhỏ hơn 300.
b. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm
� ðợt 1
Bảng 18: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 1 bằng phương
pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 6.2 x 103 790
Rửa lần 2 5.9 x103 792
Rửa lần 3 3.0 x 102 254
Rửa lần 4 0.5 x 102 150
� ðợt 2
Bảng 19: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 2 bằng phương
pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 6.1 x 103 795
Rửa lần 2 6.0 x103 620
Rửa lần 3 2.0 x 102 265
41
Rửa lần 4 0.4 x 102 120
� ðợt 3
Bảng 20: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm ñợt 3 bằng phương
pháp truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 5.9 x 103 787
Rửa lần 2 5.7 x103 690
Rửa lần 3 1.0 x 102 235
Rửa lần 4 2.0 x 10 117
Nhận xét: Ở máy lọc sản phẩm từ sau lần rửa thứ ba sự ñảm bảo vệ sinh
ñã ñược hoàn tất, ở cả ba ñợt chỉ số RLU ño ñược ñều nhỏ hơn 300.
c. Kiểm tra ở các tec sản phẩm
� Tec 1
Bảng 21: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phương pháp
truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
42
Rửa lần 1 6.3 x 103 870
Rửa lần 2 6.2 x103 723
Rửa lần 3 10 x 102 225
Rửa lần 4 2.0 x 10 131
� Tec 2
Bảng 22: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 2 bằng phương pháp
truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu
khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 6.0 x 103 734
Rửa lần 2 6.1 x103 627
Rửa lần 3 8.0 x 102 243
Rửa lần 4 1.2 x 10 127
� Tec 3
Bảng 23: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 3 bằng phương pháp
truyền thống và phương pháp ATP quang sinh
Tên mẫu Tổng vi sinh vật
hiếu khí (CFU) ðo ATP (RLU)
Rửa lần 1 5.4 x 103 674
43
Rửa lần 2 4.8 x103 580
Rửa lần 3 9.0 x 102 235
Rửa lần 4 1.7 x 10 130
Nhận xét: Ở các tec lên men sau lần rửa vệ sinh thứ 3, các tec ñã ñạt
yêu cầu về vệ sinh, các chỉ số RLU ño ñược ở cả 3 tec sau lần rửa thứ 3 ñều
nhỏ hơn 300.
3.4. Khảo sát ứng dụng phương pháp tạo màu xác ñịnh tổng số Coliforms
trên máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre)
Sử dụng nước thải sau vệ sinh của xưởng sản xuất ñể kiểm tra Coliformss. Từ nguồn nước thải ñã xác ñịnh ñược Coliformss tổng số (ký hiệu M) ñem pha loãng ra các nồng ñộ khác nhau M x 5 -1; M x 10 -1; M x 10 -2 ñược các mẫu có chứa Coliformss khác nhau ñể nuôi cấy, sau ñó ñem ño trên quang phổ UV-VIS.
Chúng tôi tiến hành scan bước sóng ở ba mức ñộ nồng ñộ ( M x 5 -1; M
x 10 -1; M x 10 -2). từ bước sóng 190nm -1100nm, tốc ñộ 100nm/phút. Kết quả
thu ñược như sau:
� Nồng ñộ M x 10-2mL
Bảng 24: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 10-2 ở bước sóng
190 – 1100nm
Peak Valley
Thứ tự WL Abs WL Abs
1 967 0.467 1078 0.265
2 655 0.930 908 0.322
3 614 0.957 644 0.897
44
4 284 3.587 559 0.830
5 243 3.776 277 3.551
� Nồng ñộ M x 10-1
Bảng 25: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 10-1 ở bước sóng
190 – 1100nm
Peak Valley
Thứ tự WL Abs WL Abs
1 972 0.409 1074 0.220
2 292 3.646 907 0.258
3 242 3.753 273 3.591
� Nồng ñộ M x 5-1
Bảng 26: Kết quả scan mẫu có nồng ñộ pha loãng 5-1 ở bước sóng
190 – 1100nm
Peak Valley
Thứ tự WL Abs WL Abs
45
1 970 0.447 910 0.306
2 655 0.951 644 0.914
3 614 0.979 558 0.840
4 292 3.637 276 3.587
5 241 3.793
Hình 1: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 190 – 1100 nm
46
Hình 2: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 200 – 800 nm
Ở cả 3 mức nồng ñộ, ñộ hấp thụ ñạt cao nhất ở bước sóng 241nm –
243nm. Tuy nhiên dung dịch tạo màu có màu xanh lục, là vùng nhìn thấy nằm
trong dải phổ từ 400 nm- 800nm. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo ở vùng
bước sóng từ 400 nm – 800 nm. Kết quả thu ñược như sau:
� Nồng ñộ ban ñầu M
Bảng 27: Kết quả scan mẫu M ở bước sóng 400 – 800nm
Peak Valley
Thứ tự WL Abs WL Abs
1 613.5 0.928 569.0 0.825
� Nồng ñộ M x 5 -1
47
Bảng 28: Kết quả scan mẫu M x 5-1 ở bước sóng 400 – 800nm
Peak Valley
Thứ tự WL Abs WL Abs
1 615 0.992 568 0.886
� Nồng ñộ M x 10 -1
Bảng 29: Kết quả scan mẫu M x 10-1 ở bước sóng 400 – 800nm
Peak Valley
Thứ tự WL Abs WL Abs
1 615 0.909 588.5 0.775
� Nồng ñộ M x 10 -2
Bảng 30: Kết quả scan mẫu M x 10-2ở bước sóng 400 – 800nm
Peak Valley
Thứ tự WL Abs WL Abs
1 656 1.301 640.5 1.272
2 617 1.301 565.5 1.089
� Nồng ñộ M x 10 -3
Bảng 31: Kết quả scan mẫu M x 10-3ở bước sóng 400 – 800nm
Peak Valley
48
Thứ tự WL Abs WL Abs
1 657 0.972 636.5 0.960
2 617.5 0.985 561 0.823
Hình 3: Hình ảnh phổ scan ở bước sóng 400 – 800 nm
Ở cả 5 mức nồng ñộ, scan từ bước sóng 400nm – 800nm, chúng tôi thu
ñược ñộ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 617 nm. Chúng tôi tiến hành ño mẫu
nước thải lấy ở bể chứa nước thải sau khi vệ sinh ở bước sóng 617 nm, thu
ñược kết quả như sau:
Bảng 32: Kết quả phân tích mẫu lấy ở bể chứa nước thải sau khi vệ
sinh bằng phương pháp truyền thống và ño bằng máy UV-VIS 1900
của Hitachi.
Tên mẫu ABS MPN
(Coliformss)
M 1.634 13 x 105
M x 10-1 1.442 80 x 104
49
M x 10-2 1.266 50 x 103
M x 10-3 1.223 40 x 102
M x 10-4 0.852 23 x 10
M x 10-5 0.074 40
Nhận xét:
Nhìn vào bảng kết quả trên chúng ta thấy có sự tương thích giữa ñộ hấp
thu ño ñược trên máy quang phổ UV-VIS 1900 và phương pháp xác ñịnh
Coliforms truyền thống (Phương pháp nhiều ống xác ñịnh Coliforms: ISO
9308-2). Sự khác nhau về ñộ hấp thụ ABS giữa các mức nồng ñộ khác nhau
rất rõ. Qua ñó, cho thấy ban ñầu có thể dùng thiết bị UV – VIS 1900 của
Hitachi vào xác ñịnh sự có mặt của Coliforms.
50
Chương IV.
KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ Từ kết quả nghiên cứu cử ñề tài cho chúng ta một số kết luận sau:
1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật truyền thống và phương pháp ño ATP
quang sinh học có sự tương thích nhất ñịnh.
2. Phương pháp ATP quang sinh có nhiều ưu ñiểm, dễ thực hiện và cho kết
quả nhanh, tương ñối chính xác ñể cho các phép thử nhanh về vệ sinh an
toàn thực phẩm.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, khi ño bằng phương pháp ATP quang
sinh có kết quả nhỏ hơn 300 RLU, thì một số khu vực vệ sinh trong dây
truyền sản xuất bia ñã ñạt yêu cầu về vệ sinh.
Phương pháp ATP quang sinh có những ưu ñiểm như sau:
+ Là phương pháp ño nhanh, ñơn giản, dễ thực hiện, dễ mang ñi hiện
trường.
+ Từ kết quả ño ñược bằng ATP quang sinh không chỉ phát hiện ñược số
lượng vi sinh vật sống mà còn kiểm tra ñược hàm lượng tồn dư các chất
dinh dưỡng làm môi trường cho vi sinh vật phát triển.
+ Nhờ vậy giúp các nhà máy, cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm khắc
phục ñược các sự cố vệ sinh tức thời.
Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số hạn chế:
+ Phương pháp chỉ kiểm tra ñược tổng số vi sinh vật mà chưa có phân loại
ñược từng loại vi sinh vật.
+ Giá thành của mỗi que thử lấy mẫu cũng tương ñối ñắt và mỗi que lấy
mẫu chỉ dùng ñược một lần duy nhất, nếu thao tác lấy mẫu không ñúng sẽ
khá tốn kém khi lấy ñi, lấy lại nhiều lần.
3. Ở trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử ứng dụng của máy quang
phổ UV-VIS 1900 Hitachi và thấy có sự tương thích khá chặt chẽ giữa ñộ
hấp thụ và tổng số Coliforms trong mẫu. Bước ñầu có thể ứng dụng máy
51
ño UV-VIS 1900 Hitachi vào việc xác ñịnh mức ñộ có mặt của Coliforms
một cách tương ñối.
3. Kiến nghị:
1. Phương pháp ño ATP quang sinh còn là phương pháp mới, ñể có thể ñem
ra ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả hơn, chúng ta cần phải ñầu tư thời
gian ñể nghiên cứu và tham khảo nhiều hơn nữa.
2. Có những nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của máy quang phổ UV-VIS
vào việc xác ñịnh tổng số vi sinh vật nói chung cũng như tổng số
Coliformss. Củng cố thêm mối tương quan giữa ñộ hấp thụ và nồng ñộ vi
sinh vật, từ ñó có thể cho ra một kết quả tương ñương giữa ñơn vị ñộ hấp
thụ ABS và ñơn vị của vi sinh vật tổng số cũng như tổng số Coliformss.
52
TÀI LI ỆU THAM KH ẢO Tiếng Việt
1. Kiều Hữu Ảnh (2010), Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm, Nhà xuất bản
giáo dục Việt Nam.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn ðăng ðức, ðặng Hồng Miên (1976), Một số
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất bản khoa học kỹ
thuật, tập3.
3. Nguyễn Lân Dũng (1971), Kiểm tra số lượng và phân lập các nhóm vi sinh
vật, Nhà xuất bản ñại học tổng hợp, tập 1
4. Nguyễn Văn ðạt (1974), Phân tích lương thực thực phẩm, Nhà xuất bản
khoa học kỹ thuật.
5. Nguyễn Quang Hào (1980), Thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo
dục.
6. Lưu Lâm, Nguyễn Yên, Trần Quang (1969), Vệ sinh thực phẩm, Vụ kỹ
thuật.
7. Hoàng Tích Mịch, Hà Huy Khôi (1977), Vệ sinh dinh dưỡng và vệ sinh
thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.
8. Vũ Văn Ngũ (1987), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Y
học.
9. ðào Thị Nguyện (1995), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y hoc.
10. Lương ðức Phẩm (2000), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm,
Nhà xuất bản Nông nghiệp.
11. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiến (1975), Vệ sinh
thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.
53
12. Phạm Văn Thành (2002), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích
nhanh ñể ñể kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm. Báo cáo ñề tài năm
2002. Bộ Công nghiệp
13. Văn Tình (1983), Kiểm tra chất lượng sản phẩm nông nghiệp, Nhà xuất
bản Thành phố Hồ Chí Minh.
14. Bùi Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh ðức (1991), Kiểm nghiệm
chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Y
học.
15. Ứng dụng các phương pháp phân tích công cụ trong kiểm soát môi trường
và thực phẩm (1999), Hội thảo khoa học Hà nội.
16. Ứng dụng các phương pháp phân tích công cụ hiện ñại trong môi trường
và an toàn lương thực thực phẩm (1994), Hội thảo khoa học Hà nội.
17. Phạm Thu Yến (2001), “Kiểm tra quá trình vệ sinh trong sản xuất thực
phẩm, ñánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra truyền
thống và phương pháp ño ATP quang sinh học”, khóa luận tốt nghiệp.
Tiếng Anh
18. Adam M.R anh Moss M.O (1995), “ Food Microbiology”, The Royal
Society Of Chemistry.
19. Claude Moreau (1974), “ Mousissures toxique dans Ladimentation
edition”, Pari.
20. Harry H (1962), “Practical food Microbiology and Technology Wesport”,
Connecticut.
21. R.D. Gonzalez. L.M. Tamagnini, P.D. Olmos, G.B. de Sousa (2003),
“Evalution of a chromogenic medium for total Coliformss and
Escherichia coli determination in ready-to-eat foods”, Food
Microbiology, 20, pp. 601-604.
22. Denis Byamukama, Frank Kansiime, Robert L. Mach, and Andreas H.
Farnleitner (200), “ Determination of Escherichia coli Cotamination
with Chromocult Coliforms Agar Showed a High Level of
Discrimination Efficiency for Differing Fecal Pollution Levels in
54
Tropical Waters of Kampala, Uganda “, Applied and Environmental
Microbiology, pp. 864-868
23. K. Geissler, M. Manafi, I. Amoros and J.L. Alonso (2000), Quantitative
detarmination of total Coliforms and Escherichia coli in marine waters
with chromogenic and flourogenic media, Joural of Applied
Microbiology, 88, pp. 280-285.
24. ICMSF (2005), Microorganisms in food, Second Edition, kluwer
Academic, Plenum Publishers
25. Jay, J.M. (2000), Modern food microbiology, Sixth edition, Aspen
Pushlisher
26. Manning, S.D., (2004), Escherichia coli infections, Chelsea House
Publishers.
27. Standard Method the Examination of Water and Wastewater 21th edition,
2005, 9215B.
28. Standard Method the Examination of Water and Wastewater 21th edition,
2005, 9215D
29. ISO 9308-2: First edition 1990-10-01