m k Z j gb yf I - ЦНБ НАН Беларусиcsl.bas-net.by/xfile/v_med/2010/4/j6uax.pdfРэдактар В. Г. К а л а с о ў с к а я Камп’ютаррстная

СЕРЫЯ МЕДЫЦЫНСКІХ НАВУК 2010 № 4

СЕРИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК 2010 № 4

ЗАСНАВАЛЬНIК – НАЦЫЯНАЛЬНАЯ АКАДЭМIЯ НАВУК БЕЛАРУСI

Часопіс выдаецца са студзеня 2004 г.

Выходзіць чатыры разы ў год

ЗМЕСТ

КЛІНІЧНАЯ І ЭКСПЕРЫМЕНТАЛЬНАЯ МЕДЫЦЫНА

Алейникова О. В., Лукашик С. П., Цыркунов В. М., Исайкина Я. И., Кравчук Р. И. Трансплантация аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга пациенту с хроническим гепатитом С на стадии цирроза печени . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Гончаров А. Е., Титов Л. П., Чиж К. А., Сорока Н. Ф. Иммунофенотип плазмацитоидных дендритных клеток пациентов с системной красной волчанкой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Висмонт А. Ф., Лобанок Л. М. Об участии мочевины и аргиназы печени в процессах терморегуляции при эндотоксиновой лихорадке . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Гайшун И. В., Манак Н. А., Гайшун Е. И., Пристром А. М. Методика построения индексов эластично-сти артериальных сосудов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Колб Е. Л., Кабак С. Л., Анищенко С. Л. Влияние метотрексата на течение апикального периодонтита у белой крысы: морфологическое исследование. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Мотузова Я. М., Федулов А. С., Нижегородова Д. Б., Гузов С. А., Багатка С. С., Юркевич М. Ю., Шпаковская М. А., Ламовская Н. В., Зафранская М. М. Эффективность и безопасность трансплантации стволовых клеток на модели экспериментального аутоимунного энцефаломиелита . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Вергун О. М., Сяхович В. Э., Хоменко А. И. Качественное определение наркотических веществ методом жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии в допинг-контроле. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Шуканова Н. А., Путырский Л. А., Пинчук С. В., Мартынова М. А., Путырский Ю. Л., Козловская Н. А. Эффективность действия химиопрепаратов на клетки рака молочной железы в первичной культуре с использо-ванием биохимических критериев . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

Сидоренко А. В., Овсянкина Г. И., Лыньков Л. М., Казека А. А., Леончик Ю. Л. Анализ электроэнцефа-лограмм на основе динамического хаоса при действии излучений мобильного телефона и защитных экранов . . . 57

1

Национальная

академия наук

Беларуси

Будюхина О. А., Барановская Е. И., Грицук А. И., Петренёв Д. Р. Роль факторов прооксидантно-антиоксидантной системы сыворотки крови и амниотической жидкости у беременных в патогенезе развития хронической плацентарной недостаточности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

Девина Е. А., Принькова Т. Ю., Таганович А. Д. Влияние N-ацетилцистеина на функциональную активность альвеолярных макрофагов, контактировавших с экстрактом сигаретного дыма, и показатели ме-таболизма активных форм кислорода и азота. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

Виноградов В. В., Туманов А. В., Голышко П. В., Мацюк Я. Р., Андреев В. П., Виноградов С. В., Яроцкий Ю. В. Влияние тироксина на пролиферацию тироцитов после субтотальной резекции щитовидной железы у крыс . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

Тропникова Г. К. Эффекты мелатонина на вызываемые гипоксией изменения содержания серотонина в мозге крыс с разным типом поведения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

Митюкова Т. А., Леонова Т. А., Тузова А. А., Платонова Т. Ю., Лущик М. Л. Влияние супрессивной терапии на биохимические показатели крови пациентов с избыточной массой тела, прооперированных по по-воду карциномы щитовидной железы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

АГЛЯДЫ

Шишло Л. М., Шамова Е. В., Александрова Е. Н., Прохорова В. И., Горудко И. В. Роль тромбоцитов в патогенезе метастазирования и роста опухоли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Мойсеёнок Е. А. Современные направления исследования витамина Е и Е-витаминный статус у женщин репродуктивного возраста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Илюкевич Г. В., Доценко Ю. Н., Илюкевич А. Г. Эпидемиология и методы диагностики грибковой инфекции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

ВУЧОНЫЯ БЕЛАРУСІ

Иосиф Викторович Залуцкий (К 60-летию со дня рождения) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

ИЗ ВЕСТ ИЯ НАЦ ИО НАЛЬ НОЙ АКА ДЕМИИ НАУК БЕ ЛА РУСИ 2010 № 4

Сер ия медицинских наук

на русском, бе ло русс ком и английском язы ках

Тэх ніч ны рэ дак тар М. В. С а в і ц к а яРэ дак тар В. Г. К а л а с о ў с к а я

Камп’ю тар ная вёрст ка В. А. Т о ў с т а я

Зда дзе на ў на бор 01.11.2010. Пад пі са на ў друк 25.11.2010. Выхад у свет 30.11.2010. Фар мат 60×841/8. Па пе ра аф сет ная. Ум. друк. арк. 14,88. Ул.-выд. арк. 16,4. Ты раж 62 экз. За каз 475.

Кошт нумару: індывідуальная падпіска – 17 780 руб., ведамасная падпіска – 44 110 руб.

Рэс пуб лі канс кае ўні тар нае прадп рыемст ва «Вы да вецкі дом «Бе ла рус кая на ву ка». ЛИ № 02330/0494405 ад 27.03.2009. Вул. Ф. Скарыны, 40, 220141, г. Мінск. Пасведчанне аб рэгістрацыі № 393 ад 18.05.2009.

Надрукавана ў РУП «Выдавецкі дом «Беларуская навука».

© Вы да вецкі дом «Бе ла рус кая на ву ка»Вес ці НАН Бе ла ру сі, се рыя медыцынскіх на вук, 2010



Беларуси

PROCEEDINGSOF THE NATIONAL ACADEMY

OF SCIENCES OF BELARUSMEDICINE SERIES 2010 N 4

FOUNDER IS THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF BELARUS

The Journal has been published since January 2004

Issued four times a year

CONTENTS

CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE

Aleinikova O. V., Lukashyk S. P., Tsyrkunov V. M., Isaikina Y. I., Krauchuk R. I. Transplantation of auto-loguos bone marrow mesenchymal stem cells to patient with HCV cirrhosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Hancharou A. Y., Titov L. P., Chyzh K. A., Soroka N. F. Immunophenotype of plasmacytoid dendritic cells derived from patients with systemic lupus erythematosus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Vismont А. F., Lobanok L. M. Participation of urea and liver arginase in the thermoregulation processes during endotoxin fever . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Gaishun I. V., Маnак N. А., Gaishun Е. I., Prystrom А. М. Methodology of creating arterial vessels elastici-ty indices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Kolb E. L., Kabak S. L., Anishchenko S. L. Methotrexate infl uence on the apical periodontitis course in white rat: morphological investigation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Motuzova Y. M., Fedulov A. S., Nizheharodova D. B., Guzov S. A., Bagatka S. S., Yurkevich M. Y., Shpakovskaya M. A., Lamovskaya N. V., Zafranskaya M. M. Effi cacy and safety of stem cell transplantation in the model of experimental autoimmune encephalomyelitis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Viarhun O. M., Syakhovich V. E., Khomenko A. I. Qualitative analysis of narcotics by liquid chromatography – mass spectrometry in doping control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Shukanovа N. A., Putyrski L. A., Pinchuk S. V., Martynova M. A., Putyrski Y. L., Kаzlovskaya N. A. Estimation of the chemotherapeutical drug infl uence on breast cancer cells in primary culture with the use of bio-chemical criteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

Sidorenko A. V. , Ovsyankina G. I., Lynkov L. M., Kazeka A. A., Leonchik Yu. L. Analysis of the electroencephalograms under the effect of mobile phone radiation and protection screens using the dyna-mic chaos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

Budjukhina O. A., Baranovskaja E. I., Gritsuk A. I., Petrenyov D. R. Role of factors of prooxidant-antioxi-dant systems of blood and amniotic fl uid in pregnant women in pathogenesis of development of chronic fetoplacental insuffi ciency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

Devina E. A., Prinkova T. Y., Tahanovich A. D. Effect of N-acetylcystein on the functional activity and me-tabolism of reactive species in alveolar macrophages exposed to cigarette smoke. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

Vinogradov V. V., Tumanov A. V., Golyshko P. V., Matsyuk Ya. R., Andreyev V. P., Vinogradov S. V., Yarotsky Yu. V. Thyroxine effect on thyrocyte proliferation after subtotal strumectomy of rat thyroid gland . . . . . . . . 80

Tropnikova G. K. Melatonin effects on hypoxia-induced changes of the serotonin content in the brain of rats with different pattern behavior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

Mityukova T. A., Leonova T. A., Tuzova A. A., Platonova T. Yu., Lushchuk M. L. Suppressive therapy infl uence on biochemical blood indices of overweight patients operated on account of thyroid gland carcinoma . . . . . . 94

3



Беларуси

SURVEYS

Shishlo L. M., Shamova E. V., Aleksandrova Е. N., Prokhorova V. I., Gorudko I. V. Role of platelets in patho-genesis of metastases and tumour growth . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Moiseenok E. A. Modern tendencies of vitamin E research and the vitamin E status in women of child-bearing age . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Ilukevich G. V., Dotsenko Y. N., Ilukevich A. G. Epidemiology and methods of diagnosis of fungal infection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

SCIENTISTS OF BELARUS

Iosif Viktorovich Zalutsky (To the 60th Anniversary of Birthday) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122



Беларуси

5

ВЕСЦI НА Ц ЫЯ НАЛЬ НАЙ АКА ДЭМII НА ВУК БЕ ЛА РУСI № 4 2010СЕ Р ЫЯ МЕДЫЦЫНСКІХ НА ВУК

КЛІНІЧНАЯ І ЭКСПЕРЫМЕНТАЛЬНАЯ МЕДЫЦЫНА

УДК 616.36-002.2-089.843-018.46-013.395-06:616.36-004

О. В. АЛЕЙНИКОВА1, С. П. ЛУКАШИК3, В. М. ЦЫРКУНОВ2, Я. И. ИСАЙКИНА1, Р. И. КРАВЧУК2

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ПАЦИЕНТУ

С ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С НА СТАДИИ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ

1Республиканский научно-практический центр детской онкогематологии, Минск, Беларусь, 2Гродненский государственный медицинский университет, Беларусь,

3Белорусский государственный медицинский университет, Минск

(Поступила в редакцию 30.06.2010)

Введение. Несмотря на достижения клинической гепатологии, проблема HCV-инфекции до конца не решена. Остаются мало изученными механизмы воздействия вируса на печеночные клетки, вопросы регенерации гепатоцитов, а также причины неблагоприятных исходов заболе-вания и низкой эффективности противовирусной терапии. До настоящего времени не найдено альтернативы применению рекомбинантных интерферонов и трансплантации печени при вирус-ных HCV-циррозах.

Цель исследования – разработать метод получения аутологичных мезенхимальных стволо-вых клеток (МСК) и изучить их влияние на патологический процесс в печени пациента с хрони-ческой HCV-инфекцией на стадии цирроза печени (ЦП).

Материалы и методы исследования. В работе приведены предварительные результаты проспективного пилотного исследования. На начальном этапе работы были проанализирова-ны литературные данные, определена и модифицирована технология получения аутотранс-плантата МСК из костного мозга пациента с ЦП, разработан протокол клинического иссле-дования, выбран способ трансплантации МСК и определены критерии оценки эффективно-сти терапии.

Для получения аутотрансплантата МСК из костного мозга пациента с ЦП применяли тех-нологию [1] после модификации, заключавшейся в трехкратном отмывании клеток через 48 ч после удаления неадгезированной фракции с целью минимизации возможной контаминации ви-русной инфекцией с клетками крови. Выполняли несколько пассажей, при которых МСК нара-щивали in vitro в среде IMDM с 10% ЭТС (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина и 10–4 М 2-меркап-тоэтанола до нужного объема в зависимости от массы тела пациента. Клетки, снятые с поверх-ности культуральных флаконов последнего пассажа, дважды отмывали в физиологическом растворе, переносили в шприц объемом 10 мл для дальнейшей инфузии пациенту. При над леж-ность полученных данным методом клеток к МСК подтверждали наличием поверхностных мар-керов CD105, CD90, CD44, CD140. Костный мозг забирали в объеме 40–60 мл посредством пунк-ции (под анестезией) за 35–45 дней до планируемой инфузии МСК. Обязательным тре бо ванием являлось исследование МСК из каждого пассажа на стерильность по всему спектру воз мож ной бактериальной и вирусной контаминации.

Иммунофенотипический анализ МСК. Окраску клеток моноклональными антителами (МКА) CD105, CD90, CD44, CD34, CD14, меченными фикоэритрином и CD45, меченными ФИТЦ



Беларуси

6

(Beckman Coulter), проводили по стандартной методике. Неспецифическое связывание МКА оце-нивали с помощью изотипического контроля. К образцу (100–200 тыс. клеток) добавляли 20 мкл специфических МКА и изотипического контроля и инкубировали в темноте при комнатной тем-пературе в течение 25–30 мин. После инкубации с антителами клетки дважды отмывали в фос-фатном буфере путем центрифугирования в течение 5 мин при 300 g. Анализ проводили на про-точном цитофлуориметре FACSCan Becton Dickinson в программе CellQuestPro. Для каждого об-разца анализировали не менее 10 тыс. клеток. Дополнительно к исследованию связывания МКА регистрировали параметры прямого и бокового светорассеяния клеток.

Оценка жизнеспособности МСК. Для анализа жизнеспособности клетки окрашивали 0,4%-ным раствором трипанового синего. При помощи светового микроскопа визуально подсчитывали в камере Горяева окрашенные (мертвые) и неокрашенные (живые) клетки в количестве не менее 100. Рассчитывали коэффициент жизнеспособности клеток (в процентах от общего числа под-считанных клеток).

Отбор больных. Одним из важных критериев включения пациента в программу клиническо-го исследования было наличие у него сформировавшегося ЦП, диагностированного по данным анамнеза, осмотра, исследования крови на маркеры вирусных гепатитов (HBsAg, anti-HCV, HCV RNA) и по результатам биопсии печени.

Выбор способа трансплантации. Известны клинические и экспериментальные исследова-ния, обосновывающие преимущества введения стволовых клеток. В экспериментах на живот-ных для стимуляции регенерации печени клетки вводили внутрибрюшинно или в селезенку [8]. Согласно протоколам клинических исследований, для лечения хронических гепатитов и с це-лью терапии после резекции печени стволовые клетки вводили в периферический кровоток, в воротную вену и в чревный ствол [6, 9]. Все способы наряду с преимуществами имели опре-деленные недостатки, что оказывало влияние на объективизацию результатов терапии. Нами предложен метод внутрипаренхимального введения МСК в ткань печени: эндоскопически или под контролем УЗИ вводится 5 мл взвеси МСК из расчета 1·106/кг массы тела – по 1 мл в 5 то-чек. Преимуществом предложенного способа, по нашему мнению, является его относительная безопасность и возможность воздействия МСК на определенные участки органа. Последнее важно с точки зрения объек тивизации результатов и точности интерпретации полученных при контрольном морфологическом исследовании биоптатов, забранных из того участка пече-ни, куда вводились МСК.

Критерии оценки эффективности трансплантации. Достоинством предложенного на ми протокола является метод оценки эффективности использования МСК в лечении хрониче-ского гепатита С на стадии ЦП. В шкалу оценки нами дополнительно введено морфологиче-ское исследование биоптата печени, которое до сих пор считается «золотым стандартом» диагностики хронических гепатитов и ЦП. Эффективность оценивали в динамике с интер-валом в 6 мес.

Методы диагностики и контроля эффективности трансплантации. Наряду с рутинным морфологическим определением степени активности и стадии хронизации использованы ме-тоды иммуногистохимической оценки изменений в печени, позволяющие оценить пролифера-тивную активность клеток печени по экспрессии Ki-67; активацию миофибробластов по экс-прессии альфа-гладкомышечного актина (α-SMA); феномен капилляризации синусоидов по экспрессии CD34+:

Ki-67 – показатель пролиферации: определение его уровня позволяет судить о выраженности регенераторного ответа гепатоцитов на повреждение и терапию МСК;

α-SMA – один из контрактильных белков гладкой мышцы, обнаруживаемый в здоровой пе-чени в мышечных клетках сосудов, а при повреждении – в фибробластах (маркер миофибробла-стов). Учитывая, что при ЦП наблюдается трансдифференцировка клеток Ито в миофибробла-сты, синтезирующие коллаген, появление α-SMA-позитивных миофибробластов может косвенно свидетельствовать об отложении волокон коллагена и прогрессировании фиброза;

CD34+ – гликопротеин, экспрессирующийся на наружной поверхности мембраны эндоте-лиальных и прогениторных кроветворных клеток. При исследовании биоптатов печени CD34+



Беларуси

7

представляет интерес как маркер эндотелия синусоидов. В норме на эндотелиальных клетках CD34+ не экспрессируется, а появляется только при капилляризации синусоидов.

Для проведения иммуногистохимического исследования биоптат печени фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина и заливали в парафин по стандартной методике. В последующем использовали коммерческие антитела к антигенам CD34, α-SMA, Ki-67, PCNA (Dako, Дания).

Для морфометрического исследования микропрепараты фотографировали в 5–6 полях зре-ния (×40), а также в 10 полях зрения (×100) с разрешением 1798 на 1438 пикселей при помощи микроскопа Leica c цифровой камерой Leica. Площадь исследуемых полей зрения составила 298,47×238,71 = 71247,77 μмІ (×40) и 113,53×98,29 = 11158,86 μмІ (×100) соответственно. Рас прост-раненность фиброзных изменений (CD34, α-SMA) оценивали полуколичественным способом: 1 балл – слабо выраженная (иммунореактивность клеток в единичных синусоидах долек), 2 балла – умеренно выраженная (иммунореактивность клеток приблизительно до половины си-нусоидов долек), 3 балла – выраженная (иммунореактивность клеток большинства синусоидов долек). Определение индекса пролиферативной активности (ИПА) при иммуногистохимических реакциях с моноклональными антителами к Кi-67 проводили путем подсчета общего числа кле-ток и количества иммунопозитивных клеток в 10 полях зрения (×400) с использованием про-граммного обеспечения для морфометрии ImageJ с последующим вычислением их процентного соотношения. Результаты определения ИПА оценивали следующим образом: до 20% – слабо вы-раженная активность, 20–50% – умеренно выраженная, 50–100% – выраженная.

Кроме того, впервые в шкалу оценки эффективности результатов терапии МСК нами введено электронномикроскопическое исследование биоптата, что позволило выявить многие процессы, происходящие в печени на ультраструктурном уровне. Электронномикроскопическое изучение проводили в биоптате печени, фиксированном 1%-ным раствором четырехокиси осмия на 0,1 М буфере Миллонига и 2,5%-ным раствором глутарового альдегида на 0,1 М буфере Миллонига [8]. Изготовленные ультратонкие срезы контрастировали 2%-ным раствором уранилацетата на 50%-ном метаноле [11] и цитратом свинца по E. S. Reynolds [9]. Электронномикроскопически препара-ты изучали в электронном микроскопе JEМ-1011 (Япония) при увеличении 10 000–40 000 при ускоряющем напряжении 80 кВт. Изображения фотографировали вмонтированной цифровой ка-мерой Olympus MegaView III (Германия).

Результаты и их обсуждение. В настоящее время полностью отслежена динамика терапии МСК 38-летнего больного с вирусным ЦП HCV-этиологии (anti-HCV+, РНК HCV=2,33·105, серо-тип 3), класс тяжести А по Чайлд-Пью, MELD 5. Портальная гипертензия. Спленомегалия. Тром-боцитопения. Сопутствующий диагноз: артериальная гипертензия 2-й степени, риск 2. В анам-незе – травматическая ампутация стопы. Предположительно инфицировался после гемотранс-фузии во время операции. Время от момента инфицирования до установления диагноза 23 года. За два года до введения МСК проведен курс противовирусной терапии. Через 1 мес. после отме-ны препаратов отмечены рецидив заболевания и его прогрессирование.

Аутотрансплантат МСК был получен из 35 мл костного мозга (несколько проколов подвздош-ной кости) пациента, забор которого проводили в асептических условиях, под местной анестези-ей. Из костного мозга было выделено 242·106 МНК. Для получения достаточного количества МСК проведено три пассажа, продолжительность культивирования клеток составила 42 дня. В результате экспансии клеток in vitro получено 113·106 МСК, что позволило получить аутотранс-плантат МСК в дозе в среднем 1,8·106/кг массы тела пациента. Получение такого количества МСК после трех пассажей свидетельствует о высокой пролиферативной активности клеток. Результаты иммунофенотипического анализа in vitro экспансированных МСК свидетельство-вали, что CD90 экспрессировали 98% клеток, CD105 – 96% и CD44 – 98% клеток. В то же вре-мя доля клеток, несущих на своей поверхности антигены CD45 и CD34, являющиеся гемопо-этическими маркерами, составляла менее 1%, а клеток, экспрессирующих CD14, не обнаруже-но. Это свидетельствовало о том, что полученный для инфузии биотрансплантат составляли МСК и контаминация миелоидными клетками отсутствовала. Жизнеспособность клеток в аутотрансплантате МСК составляла 99%. Для инфузии пациенту использовали только све-



Беларуси

8

жеприготовленную культуру МСК (трансплантат МСК изготавливали за 2 ч до введения). Трансплантация МСК проведена без осложнений. Посттрансплантационный мониторинг осу-ществляли в течение 6 мес.

Результаты клинико-лабораторного мониторинга. Ко 2-му месяцу наблюдения у больного исчезли признаки астеновегетативного синдрома. При динамическом наблюдении биохимиче-ских показателей отмечено уменьшение уровня АлАТ (с 234 до 71 МЕ/л), АсАТ (с 239,2 до 104 МЕ/л) и ГГТП (с 74 до 31,6 МЕ/л) к 6-му месяцу наблюдения (рис. 1).

Согласно протоколу, пациенту до трансплантации и через 6 мес. после нее проведена пунк-ционная биопсия печени. При исследовании биоптата под световым микроскопом установлено наличие микронодулярного ЦП с признаками умеренной активности. Через 6 мес. после транс-плантации изменений в ткани печени на световом уровне не наблюдалось, однако по результа-там иммуногистохимических исследований и данным электронной микроскопии выявлены су-щественные сдвиги исследуемых показателей.

Результаты иммуногистохимического исследования ткани печени. Как показала динамика изменений иммуногистохимических показателей, через 6 мес. после проведенной трансплан-тации МСК в ткань печени наблюдалась тенденция к снижению показателя пролиферативной активности гепатоцитов (Ki-67) с 7,5 до 5,2% и уменьшение экспрессии CD34 с 3 до 1 балла и α-SMA с 2 до 1,5 балла (рис. 2–4).

Рис. 1. Динамика показателей биохимического анализа крови (АлАТ, АсАТ, ГГТП) в течение 6 мес. после трансплантации МСК в ткань печени

Рис. 2. Иммунногистохимическа я реакция: CD34: а – выраженная капилляризация синусоидов; б – слабо выраженная капилляризация синусоидов преимушественно в перипортальных зонах

а б



Беларуси

9

Рис. 3. Иммунногистохимическая реакция: α-SMA: трансдифференцировка звездчатых клеток (клеток Ито) в мио-фибробласты: а – умеренно выраженная; б – слабо выраженная

Высокая пролиферативная активность кле-ток печени указывает на напряженность процес-сов регенерации. Такого рода изменения характе-ризуют процессы повреждения гепатоцитов в от-вет на уменьшение клеточной массы или на выраженное повреждение клеток [4]. Значимым морфологическим изменением было уменьшение соединительной ткани в пространствах Диссе через 6 мес. после трансплантации. Если до нача-ла терапии определялась капилляризация синусо-идов – регистрировалась иммунореактивность эндотелиальных клеток, экспрессирующих CD34, большинства синусоидов долек (см. рис. 2, а), то через 6 мес. данный показатель был слабо выра-жен и соответствовал иммунореактивности кле-ток в единичных синусоидах долек (рис. 2, б). Определенные изменения наблюдались и в экс-прессии α-SMA. До трансплантации у больного внутри долек присутствовали миофибробласты (рис. 3, а), что указывало на наличие продолжающегося синтеза компонентов экстрацеллюляр-ного матрикса и прогрессирование фиброза. После трансплантации количество миофибробластов уменьшилось (рис. 3, б). Поскольку миофибробласты являются основным источником соедини-тельной ткани в регенерирующей печени, уменьшение их количества можно интерпретировать как восстановление нормальной структуры синусоидов.

Результаты исследования биоптатов печени при электронной микроскопии. Обращал на себя внимание тот факт, что на профилях срезов ткани печени, полученных до начала тера-пии, выявлялись многочисленные пучки фибрилл коллагеновых волокон и участки некроза ге-патоцитов, что соответствовало данным, полученным при световой микроскопии. Между колла-геновыми волокнами располагались многочисленные фиброциты и разрушающиеся цитоплаз-матические структуры. Местами вдоль кровеносных капилляров выявлялось слабо выраженное отложение материала умеренной электронной плотности (феномен капилляризации синусоидов) (рис. 4). Липоциты в ткани печени не обнаруживались, что обусловлено, возможно, потерей ими липидных включений вследствие наступившей трансдифференцировки. В гепатоцитах, грани-чащих с фиброзно измененными участками ткани печени, регистрировали выраженные деструк-тивные изменения: дезорганизацию и разрушение цитоплазматических структур. Ядра были отечными, с маргинацией хроматина, локальным отслоением наружной ядерной мембраны с об-

Рис. 4. Отложение материала умеренной электронной плотности вдоль синусоидного капилляра (капилля-

ризация синусоидов). × 25 000

а б



Беларуси

10

разованием пузырей, содержали компактное ядрышко с преимущественно фибриллярным компо-нентом (рис. 5). В цитоплазме таких клеток наблюдалось формирование крупных вакуолей с электронносветлым содержимым за счет расширения цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума. Митохондрии характеризовались атипизмом формы, конденсированным матрик-сом, редукцией крист, интракристным расширением промежутков, нередко с отслоением наруж-ной мембраны и образованием вакуолей (рис. 6). Такая ультраструктурная характеристика со-ответствовала максимально энергизованному состоянию (возбуждению) органелл и их низкому биосинтетическому потенциалу. Гранулярная эндоплазматическая сеть в гепатоцитах характе-ризовалась расширенными цистернами, местами с многочисленными связанными рибосомами, и находилась в тесном контакте с митохондриями. Достаточно часто обнаруживались гепатоци-ты с ультраструктурными признаками апоптоза. Ядра их были фрагментированы, вокруг концен-трировались малочисленные, конформационно измененные митохондрии, отличающиеся элек-тронноплотным матриксом и небольшими размерами, что косвенно свидетельствовало о «мито-хондриальном» пути развития апоптоза.

На другом образце биоптата фиброзные изменения были менее выражены, однако выявлялись многочисленные очаги внутридольковой инфильтрации, в которых определялось множество фиб-робластов, фиброцитов, лимфоцитов, иногда плазматические клетки. Гепатоциты, граничившие с очагом инфильтрации, находились в состоянии выраженной мелко- и среднекапельной жиро-вой дистрофии. Ядра таких гепатоцитов отличались овальной формой, мелкогранулярным хро-матином, компактным или крупным ядрышком с преимущественно фибриллярным компо-нентом. Наблюдалось конформационное изменение митохондрий, которые характеризовались конденсированным матриксом, расширенными интракристными промежутками вплоть до раз-рушения органелл.

Таким образом, выявленные ультраструктурные изменения существенно дополняли резуль-таты, полученные с помощью световой микроскопии и иммуногистохимического исследования. Характерной ультраструктурной патоморфологической особенностью явилось наличие продви-нутого фиброза печени (многочисленные пучки фибрилл коллагеновых волокон) в сочетании с признаками продолжающегося воспаления и гибели гепатоцитов (внутридольковая инфиль-трация, ультраструктурные признаки некроза, апоптоза и высокого регенераторного напряже-ния гепатоцитов), а также с активными процессами продолжающегося фиброгенеза (капилляри-зация синусоидов, отсутствие покоящихся липоцитов, наличие многочисленных фиброцитов и фибробластов в участках инфильтрации).

На отдельных участках биоптата печени, исследованного через 6 мес. после трансплантации, выявлялись многочисленные пучки коллагеновых волокон, локализовавшиеся как перикапиллярно, так и перицеллюлярно и граничившие с участками некроза. Рядом с фиброзной тканью липоциты

Рис. 5. Ядра гепатоцитов с глубокими инвагинациями кариолеммы. Локальное отслоение наружной ядерной мембраны. Деструктивно измененные конденсированные митохондрии. Капилляризация синусоида. × 10 000

Рис. 6. Деструкция митохондрий: конденсация матрикса, расширение интракристных промежутков, отслоение наружной мембраны органелл с образованием пузырей.

× 2000



Беларуси

11

не обнаруживались. В то же время на участках ткани без признаков фиброзных изменений в гепато-цитах произошли существенные ультраструктурные изменения. Следует отметить, что во всех изу-ченных образцах ткани печени отсутствовали признаки феномена капилляризации синусоидов.

Гепатоциты отличались гетерогененностью как по плотности цитоплазматического матрик-са, так и по состоянию цитоплазматических органелл. Такой признак, как гетерогенность, свиде-тельствует о высокой дифференцировке популяции гепатоцитов и их регенераторной способно-сти в условиях патологического процесса, что предполагает возможность оценки их реакции на различные виды проводимой терапии. Это подтверждается результатами исследований других морфологов. Так, согласно литературным источникам, основным показателем, отражающим активность морфо- и цитогенеза при хронической HCV-инфекции, является соотношение альте-рированных и регенерирующих гепатоцитов [2].

Для многих клеток был характерен еще один важный морфологический признак – локальная «опустошенность» цитоплазмы при сохранности ядерного компартмента. В литературных источниках активно обсуждается вопрос интерпретации данного феномена. Считается, что такой тип изменений следует рассматривать либо как защитную реакцию клетки в условиях вирусной инфекции («превентивное клеточное торможение»), либо как период «санации» гепатоцитов от де-структивных органелл с последующим восстановлением ультраструктурной организации [2, 3]. В связи с этим представляется важным и в дальнейшем в посттрансплантационном периоде оце-нивать данный морфологический феномен.

Ядра в большинстве гепатоцитов имели овальную форму и характеризовались наличием мелкозернистого и мелкогранулярного хроматина, без формирования периферического конден-сированного хроматина. Ядрышко, как правило, было крупное, с центральной либо перифериче-ской локализацией в кариоплазме, с развитыми гранулярным и фибриллярным компонентами. Чаще, чем в первой биопсии, встречались двуядерные гепатоциты (рис. 7).

Наиболее существенные изменения были отмечены со стороны митохондрий. По сравнению с первичным биоптатом они были более гипертрофированными и характеризовались относи-тельной ультраструктурной нормализацией: умеренной электронной плотности матриксом, от-четливыми кристами, диффузной локализацией в цитоплазме, полиморфизмом (рис. 8). И хотя кристы были, как правило, дезориентированы, интракристные пространства не расширены. Достаточно часто выявлялись делящиеся, а также гипертрофированные, удлиненные формы ми-тохондрий. Такие морфологические особенности свидетельствуют о высокой функциональной активности органелл. Однако среди гепатоцитов встречались клетки и с деструктивно изменен-ными митохондриями – конденсированным, гомогенизированным матриксом и редуцированны-ми кристами, в некоторых – с расширенными интракристными промежутками.

Рис. 7. Ядро гепатоцита овальной формы. Ядрышко пре-иму щественно с гранулярным компонентом. × 15 000

Рис. 8. Многочисленные митохондрии в цитоплазме ге-патоцита с матриксом умеренной электронной плотно-сти и многочисленными кристами, ориентированными неупорядоченно. Хорошо развитая гранулярная эндо-

плазматическая сеть. × 20 000



Беларуси

12

В связи с этим нами был проведен сравнительный морфометрический анализ митохондрий в первичной и повторной биопсиях печени с определением площади и количества митохондрий на 100 мкм2 цитоплазмы, а также средней площади одной митохондрии (нм2) при увеличении 20 000 (см. таблицу).

Сравнительный морфометрический анализ митохондрий в первичной и повторной биопсиях

Показатель До трансплантации МСК Через 6 мес. после трансплантации МСК

Площадь митохондрий на 100 мкм2 9,008 24,76Количество митохондрий на 100 мкм2 67,40 66,52Средняя площадь одной митохондрии, нм2 133635,18 (0,134 мкм2) 372129,18 (0,372 мкм2)

Как видно из таблицы, через 6 мес. после проведенной трансплантации МСК в ткань печени значительно увеличилась относительная площадь митохондрий на единицу тестируемой площа-ди и средний размер одной митохондрии. При этом количество митохондрий на единицу площа-ди не изменялось.

Гранулярная эндоплазматическая сеть отличалась тем, что была хорошо развита, местами с расширенными цистернами, и находилась в тесном топографическом контакте с митохондрия-ми. Гладкая эндоплазматическая сеть в основном имела слабое развитие, но в отдельных гепато-цитах (преимущественно на билиарном полюсе) была развита умеренно. В большинстве клеток печени регистрировалась умеренно выраженная мелко-, средне- и крупнокапельная липидная инфильтрация, местами с образованием конгломератов. Нередко на билиарном полюсе или око-ло ядра выявлялись резидуальные тельца, вторичные лизосомы, в том числе липидолизосомы. Местами отмечалась дилатация синусоидных капилляров.

Таким образом, в результате проведенной терапии в ткани печени отмечены существенные ультраструктурные изменения, затрагивающие преимущественно паренхиматозный компарт-мент и характеризующие динамику патологического процесса. Несмотря на сохраняющиеся участки фиброзной ткани и немногочисленные очаговые цитолитические процессы, локальную липидную инфильтрацию гепатоцитов, появились признаки активации процессов внутрикле-точной регенерации. Об этом свидетельствуют хорошо развитая гранулярная эндоплазматиче-ская сеть, состояние ядерного и митохондриального аппаратов. Кроме того, отсутствие феноме-на капилляризации синусоидов можно трактовать как признак происходящего в печени процес-са фибролиза.

Заключение. Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что трансплан-тация аутологичных МСК в ткань печени является относительно безопасной процедурой. У па-циента с ЦП вирусной HCV-этиологии класса тяжести А по Чайлд-Пью через 6 мес. после лече-ния улучшились показатели функциональных проб печени, произошли положительные сдвиги в морфологических показателях, улучшилось самочувствие. Несмотря на локальное и достаточ-но обширное сохранение фибрилл коллагеновых волокон в биоптате, после воздействия МСК наблюдались следующие структурные изменения в паренхиматозном и непаренхиматозном ком-партментах печени, выявленные при иммуногистохимическом и электронномикроскопическом исследовании ткани печени:

1. Усиление процессов внутриклеточной регенерации гепатоцитов. К морфологическим особенностям такой реорганизации можно отнести следующие признаки: гетерогенность гепатоцитов; состояние ядерного аппарата (наличие в ядрах мелкозернистого и мелкогра-нулярного хроматина, без формирования периферического конденсированного хромати-на); наличие крупного ядрышка с периферической локализацией в кариоплазме, с разви-тым гранулярным и фибриллярным компонентами; увеличение числа двуядерных гепато-цитов; состояние гранулярной эндоплазматической сети (гиперплазия цистерн, тесный топографический контакт с митохондриями); состояние митохондрий (гипертрофия, отно-сительная ультраструктурная нормализация органелл – умеренно электронноплотный ма-трикс, отчетливые кристы, диффузная локализация в цитоплазме); появление липидных включений.



Беларуси

2. Активация процессов фибролиза: уменьшение признаков феномена капилляризации сину-соидов; уменьшение количества миофибробластов.

Обнаруженные иммуногистохимические и ультраструктурные признаки могут служить определяющими в отслеживании результатов терапии при дальнейших исследованиях. В то же время при планировании трансплантации и оценке результатов терапии после введения аутоло-гичных МСК в ткань печени клинико-эпидемиологические, вирусологические, биохимические методы исследования и результаты исследования биоптата печени при световой микроскопии могут использоваться, вероятнее всего, только в качестве скрининговых.

Для уточнения вклада аутологичных МСК в динамику процессов фиброгенеза и регенерации в ткани печени у пациентов с хронической HCV-инфекцией требуется проведение дальнейших исследований.

Литература

1. Способ экспансии мезенхимальных стволовых клеток: пат. 11560 Респ. Беларусь от 10.27.2008 / Я. И. Исайкина, О. В. Алейникова: заявитель Респ. науч.-практ. центр детской онкологии и гематологии. № а20070657; заяв. 31.05.2007; опубл. 25.02.2009 // Афiц. бюл. Нац. цэнтр iнтэлектуальнай уласнасцi. 2009. № 1. С. 93.

2. К и я с о в А. П. // Клин. трансплантол. и тканев. инженерия. 2008. Т. III, № 1. С. 70–75.3. Н е п о м н я щ и х Г. И., Т о л о к о н с к а я Н. П., Н е п о м н я щ и х Л. М. // Бюл. эксперим. биологии и меди-

цины. 1999. Т. 128, № 7. С. 583–587.4. Н е п о м н я щ и х Г. И., Т о л о к о н с к а я Н. П., Н е п о м н я щ и х Л. М. // Бюл. эксперим. биологии и меди-

цины. 1999. Т. 128, № 7. С. 101–105.5. Хронические вирусные гепатиты и циррозы печени / Под ред. А. Г. Рахмановой. СПб., 2006.6. E s c h J. S. // Stem Cells. 2005. Vol. 23, N 4. P. 463–470.7. G o r d o n M. Y. // Stem Cells. 2006. Vol. 24, N 7. P. 1822–1830.8. M i l l o n i g G. A. // J. Appl. Рhys. 1961. Vol. 32. P. 1637–1643.9. O y a g i S. // Hepatology. 2006. Vol. 44. Р. 742–748. 10. R e y n o l d s E. S. // J. Cell. Biol. 1963. Vol. 17. P. 208–212.11. T e r a i S. // Stem Cells. 2006. Vol. 24, N 10. P. 2292–2298.12. W a t s o n M. L. // J. Biophys. Biochem. Cyt. 1958. Vol. 4. P. 475–478.

O. V. ALEINIKOVA1, S. P. LUKASHYK3, V. M. TSYRKUNOV2, Y. I. ISAIKINA1, R. I. KRAUCHUK2

TRANSPLANTATION OF AUTOLOGUOS BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS TO PATIENT WITH HCV CIRRHOSIS

1Belarusian Center for Pediatric Hematology and Oncology, Minsk,2Grodno State Medical University, Belarus,3Belarusian State Medical University, Minsk

Summary

The fi rst experience of transplantation of autologuos bone marrow mesenchymal stem cells to the liver tissue of pa-tient with HCV cirrhosis is described. The method of getting autologuos bone marrow mesenchymal stem cells transplan-ted in the intraparenchimal way under ultrasound control is proposed. According to light microscopy after six-month mor-phological treatment, dynamics of the pathological process has demonstrated the absence of changes in the liver tissue. However, signifi cant positive changes have been detected using immunohistochemical methods and electron microscopy which characterize the activation of fi brolysis and intracellular regeneration processes.



Беларуси

14


УДК 616:612.017.1

А. Е. ГОНЧАРОВ1, Л. П. ТИТОВ1, К. А. ЧИЖ2, Н. Ф. СОРОКА2

ИММУНОФЕНОТИП ПЛАЗМАЦИТОИДНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ПАЦИЕНТОВ С СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ

1Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь,2Белорусский государственный медицинский университет, Минск


Введение. Системная красная волчанка (СКВ) – хроническое аутоиммунное заболевание, ха-рактеризующееся кожными, нефрологическими, гематологическими и иммунопатологическими (антинуклеарные и антифосфолипидные антитела, иммунные комплексы) нарушениями, обу-словленными участием генетических и гуморальных факторов регуляции [1]. СКВ возникает преимущественно у женщин в возрасте 15–45 лет с частотой 1:1000. Последние десять лет вни-мание исследователей в области клинической иммунологии сосредоточено на изучении роли дендритных клеток (ДК) в патогенезе СКВ и других аутоиммунных заболеваний. Установлено, что плазмацитоидные ДК (пДК) способны представлять аутоантигены субпопуляциям Т-лим-фоцитов, индуцируя тем самым их активацию и продукцию провоспалительных цитокинов, та-ких как интерферон (ИФН)-γ, интерлейкин (ИЛ)-17, ИЛ-18, которые, в свою очередь, прямо либо опосредованно повреждают собственные ткани. Активация Т-клеток и избыточная секреция клетками ИФН-α увеличивает продукцию аутоантител B-лимфоцитами, способствует формиро-ванию иммунных комплексов, усиливая клинические проявления заболевания [2–5].

Исследования последних лет указывают на возможную роль пДК в иммунопатогенезе таких аутоиммунных заболеваний, как СКВ, системная склеродермия, ревматоидный артрит и систем-ные васкулиты [2–6]. Аутоиммунное поражение почек является тяжелым осложнением многих системных воспалительных заболеваний соединительной ткани.

Целью настоящего исследования являлся анализ экспрессии ко-стимуляторных и адгезив-ных мембранных молекул пДК пациентов с СКВ, осложненной люпус-нефритом (ЛН), для уста-новления взаимосвязи этих параметров с поражением почек.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена в серии экспериментов in vitro, в кото-рых использовано 16 образцов периферической крови здоровых лиц, 29 образцов крови пациентов с СКВ (14 человек с СКВ и 15 человек с СКВ + ЛН). Среди больных СВК + ЛН было 14 женщин в воз-расте от 19 до 55 лет (30 (24–48) лет), а среди пациентов с СКВ – от 23 до 61 года (37,5 (29–51) года). Группа здоровых лиц была представлена 16 женщинами в возрасте от 19 до 39 лет (25,5 (22–29) года).

Перед забором крови у каждого пациента получали письменное информированное согласие. Забор периферической (венозной) крови в стерильные пробирки с антикоагулянтом осущест-влял средний медицинский персонал 9-й городской клинической больницы.

Пробоподготовку проводили по общепринятой методике в соответствии с рекомендация-ми фирмы – производителя антител (CD54 (Sigma-Aldrich, США); CD19, CD3, CD14, CD16, CD66b и CD123 (Becton-Dickinson, США); CD86 (Invitrogen, США); CD80 и HLA-DR (Beckman-Coulter, США)). Кровь инкубировали с моноклональными антителами 15 мин при 4 ºС. Затем эритроциты лизировали раствором хлорида аммония 15 мин при 18–25 ºС и проводили учет и анализ на проточном цитофлуориметре FACSCalibur с использованием программного обеспе-чения CellQuest 3.3 (Becton-Dickinson, США) [7].



Беларуси

15

Известно, что молекула CD123 экспрессируется преимущественно пДК крови и базофилами. Поскольку базофилы существенно отличаются от пДК по характеристикам светорассеяния и прак-тически не экспрессируют ГКС II класса, клетки, обладающие CD123+ HLA-DR+ фенотипом, являются пДК [6].

Количество исследуемых молекул на поверхности анализируемых клеток оценивали по свя-зыванию ими флуоресцирующих антител, регистрируя среднюю интенсивность флуоресценции клеток. Относительную интенсивность флуоресценции рассчитывали как соотношение средней интенсивности флуоресценции позитивных клеток и средней интенсивности флуоресценции от-рицательного контроля. Величину этих параметров выражали в условных единицах флуорес-ценции (усл. ед.) [8].

Пример анализа иммунофенотипа пДК в программе CellQuest продемонстрирован на рис. 1.Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного

обеспечения Statistica версии 8 (StatSoft, США) и StatPlus 4.9 (AnalystSoft, США). Значения пока-зателей представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха между 25-й и 75-й про-центилями. Нормальность распределения величин оценивали с использованием W-критерия Шапиро–Вилка. Учитывая отсутствие в большинстве исследованных выборок нормального рас-пределения, для сравнения групп данных и изучения корреляционных взаимосвязей использо-вали непараметрические методы. Для сравнения независимых выборок применяли метод ранго-вого анализа вариаций Краскела–Уоллиса (H-критерий) и U-критерий Манна–Уитни. Опре де ле-

Рис. 1. Анализ иммунофенотипа пДК: А – цитограмма светорассеяния в координатах FSC/SSC (регион R1 включает лейкоциты); B – цитограмма флуоресценции в координатах FL3/SSC (регион R3 создан для исключения из анализа lin+ клеток); С – цитограмма флуоресценции в координатах FL4/SSC (регион R4 содержит HLA-DR+ клетки); D – цито-грамма флуоресценции в координатах FL2/SSC (регион R5 включает CD123+ клетки, а регион R6 – CD123high клетки; для анализа экспрессии молекул CD80, CD86, CD54 на пДК созданы логические гейты G7 и G8, включающие только lin–HLA-DR+CD123+ и lin–HLA-DR+CD123high пДК соответственно); E – цитограмма светорассеяния, полученная методом обратного проецирования, на которой показана локализация пДК среди лейкоцитов; F – гистограмма флуо-

ресценции по каналу FL1 (анализировали события в логическом гейте G7)



Беларуси

16

ние зависимости между показателями осуществляли с помощью коэффициента корреляции Спир мана (R). В качестве критерия достоверности различий показателей принимали уровень зна чимости Р < 0,05.

Результаты и их обсуждение. Содержание пДК в периферической крови пациентов с СКВ. В серии экспериментов изучено относительное число пДК во фракции мононуклеаров перифе-рической крови (МПК) и абсолютное количество пДК в 1 мл венозной крови.

Методом рангового анализа вариаций Краскела–Уоллиса показано отсутствие статистически достоверных отличий (H = 4,186; Р = 0,123) в относительном содержании пДК во фракции МПК между пациентами опытных групп и лицами группы сравнения (рис. 2).

Абсолютное число пДК в периферической крови было статистически достоверно снижено у пациентов с СКВ и СКВ + ЛН по сравнению с лицами контрольной группы (Р = 0,016 и Р = 0,024 со-ответственно). Согласно U-тесту Манна–Уитни, достоверных различий между группами па-циентов с СКВ и СКВ + ЛН не выявлено (Р = 0,898). Уменьшение содержания пДК в перифериче-ской крови может указывать как на ускоренные процессы миграции пДК во внутренние органы и лимфоидную ткань, так и на нарушение процессов дифференцировки предшественников пДК.

Иммунофенотип пДК пациентов с СКВ. Функциональное состояние клеток иммунной си-стемы определяется степенью экспрессии различных молекул, опосредующих процессы адге-зии, распознавания чужеродных структур, а также ко-стимуляции и активации антигенспеци-фических Т-лимфоцитов. Важно не только наличие на мембране клетки тех или иных молекул, которые характеризуют функции клетки, но и их количество на клетку. Поэтому помимо отно-сительного числа клеток, несущих на поверхности мембраны различные молекулы (процент экспрессии), рассчитывали также относительную интенсивность флуоресценции. Значение данного параметра зависит от количества молекул моноклональных антител, связанных с клет-кой, а следовательно, может характеризовать относительное число молекул на клетку, т. е. интен-сивность экспрессии.

В данном исследовании на пДК периферической крови изучали экспрессию ко-стимуляторных молекул CD80 и CD86 и молекулы CD54, участвующей в процессах межклеточной адгезии. Известно, что ко-стимуляторные молекулы CD80 и CD86 опосредуют процессы ко-стимуляции лимфоцитов. Эти молекулы экспрессированы на всех антигенпредставляющих клетках (АПК), включая ДК, моноцитах/макрофагах, В-лимфоцитах и фиброцитах крови [1, 5, 9]. Взаи мо дей-ствие молекул ко-стимуляции АПК – CD80 и CD86 с комплементарными им молекулами лим-фоцитов – CD28 или CTLA-4 является чрезвычайно важным в процессе антигенпрезентации. Уменьшение числа ко-стимуляторных молекул на АПК негативно сказывается на процессе анти-генпрезентации, способствуя развитию анергии. В то же время увеличение показателей экспрес-

Рис. 2. Абсолютное количество пДК в периферической крови (×106/мл) и относительное содержание пДК в МПК пациентов с СКВ и лиц контрольной группы



Беларуси

17

сии ко-стимуляторных молекул, свидетельствующее об усилении антигенпредставляющих свойств клеток, является маркером активации и зрелости ДК [1, 5].

Учитывая доказанную патогенетическую роль пДК в развитии аутоиммунных заболеваний, представляет несомненный интерес изучение экспрессии вышеуказанных молекул на поверхно-сти пДК пациентов с СКВ, осложненной ЛН, и больных СКВ без признаков поражения почек.

Согласно результатам исследований, показатели экспрессии молекулы CD80 пДК у пациентов опытных групп статистически достоверно не отличались от таковых в группе здоровых лиц (рис. 3).

Известно, что молекула CD86 представлена на большинстве АПК независимо от состояния их активации, а молекула CD80 на неактивированных клетках практически отсутствует. Из всех

Рис. 3. Показатели экспрессии молекул CD80, CD86 и CD54 пДК периферической крови у пациентов с СКВ, СКВ+ЛН и у лиц контрольной группы



Беларуси

18

АПК лишь на ДК показана значительная экспрессия молекулы CD80 в неактивированном, «незре-лом» состоянии. По мере созревания АПК увеличивается как относительное число CD80+ клеток, так и число экспрессированных молекул на клетку. Поэтому можно предположить, что нарушения экспрессии вышеуказанной молекулы могут проявиться лишь в процессе активации клетки.

Таким образом, относительно низкое число пДК периферической крови, экспрессирующих молекулу CD80, как у пациентов опытной группы, так и у здоровых лиц свидетельствует о фено-типической и функциональной незрелости пДК.

Установлено достоверное увеличение относительного числа пДК, экспрессирующих молекулу CD86, у больных СКВ + ЛП и СКВ по сравнению с лицами контрольной группы (52,6 (27,9–60,4)%; 37,8 (25,4–46,5)%; 21,17 (6,71–33,43)% соответственно) (рис. 3).

В то же время различий в показателе относительного числа CD86+ пДК между группами СКВ и СКВ+ЛН не установлено (Р = 0,138). Интенсивность экспрессии молекулы CD86 пДК па-циентов с СКВ была существенно выше, чем таковая у пациентов с СКВ+ЛН и у лиц контроль-ной группы.

Выявлено достоверное увеличение числа CD54+ пДК в периферической крови больных СКВ (Р = 0,022) и тенденция к увеличению экспрессии CD86 пДК у пациентов с СКВ + ЛН (Р < 0,1) (рис. 3).

Интенсивность экспрессии молекулы CD54 была повышена у пациентов с СКВ и СКВ + ЛН по сравнению с данным показателем у лиц контрольной группы. Таким образом, увеличение от-носительного числа CD54 + пДК сопровождалось усилением интенсивности экспрессии этой мо-лекулы клетками. Различий в экспрессии молекулы CD54 между больными СКВ и СКВ + ЛН не выявлено, что указывает на сходное функциональное состояние пДК у пациентов с СКВ вне за-висимости от наличия осложнений.

Усиление экспрессии молекул CD86 и CD54 у больных СКВ и СКВ + ЛН свидетельствует о наличии в крови пациентов с СКВ фракции активированных пДК, способных стимулировать провоспалительный иммунный ответ.

Проведенный анализ данных показал наличие корреляционной связи высокой степени меж-ду экспрессией молекул CD86 и CD54 у пациентов с СКВ + ЛН (R = 0,764; Р = 0,0009). Корреляции между экспрессией молекул CD80 и CD56 (R = 0,075; Р = 0,791), а также CD80 и CD54 (R = 0,396; Р = 0,143) не установлено. Зависимости между показателями интенсивности экспрессии молекул CD80 и CD54 (R = 0,077; Р = 0,812), CD80 и CD86 (R = 0,140; Р = 0,665), CD86 и CD54 (R = 0,119; Р = 0,713) у больных СКВ + ЛН не выявлено. Имеется положительная корреляционная связь между эксп рес сией молекул CD80 и CD86 у пациентов с СКВ (R = 0,609; Р = 0,021). Корреляции между по казателем интенсивности экспрессии молекул CD80 и CD86 (R = 0,385; Р = 0,175), CD80 и CD54 (R = 0,433; Р = 0,122) и CD86 и CD54 (R = 0,336; Р =0,240) у больных СКВ не установлено. У здо-ровых лиц показано наличие корреляционной связи высокой степени между экспрессией моле-кул CD86 и CD54 (R = 0,855; Р = 0,0001) и CD80 и CD86 (R = 0,530; Р = 0,05) (рис. 4).

Рис. 4. Корреляционный анализ экспрессии молекул CD80, CD86 и CD54 пДК у здоровых лиц (контрольная группа)



Беларуси

Корреляция между экспрессией CD80 и CD54 на пДК здоровых лиц отсутствовала (R = 0,297; Р = 0,303). В то же время выявлена взаимосвязь между интенсивностью экспрессии молекул CD80 и CD54 (R = 0,635; Р = 0,015), CD86 и CD54 (R = 0,565; Р = 0,035), но не между CD80 и CD86 (R = 0,446; Р = 0,110). Наличие корреляции между экспрессией вышеуказанных молекул указы-вает на однонаправленность процессов регуляции экспрессии ко-стимуляторной молекулы CD86 и адгезивной молекулы CD54.

Заключение. В результате проведенных исследований установлено достоверное снижение абсолю тного числа пДК у больных СКВ и СКВ + ЛН, что может указывать как на нарушение дифференцировки предшественников пДК, так и на усиленную миграцию пДК во внутренние органы и лимфоидную ткань. Показано статистически достоверное усиление экспрессии моле-кул CD86 и CD54 у пациентов с СКВ и СКВ + ЛП по сравнению с таковой у лиц контрольной группы, что свидетельствует о наличии в крови больных СКВ фракции активированных пДК, способных поддерживать иммуновоспалительный процесс. Наличие корреляционной связи между экспрессией молекул CD80 и CD86 у пациентов с СКВ и у здоровых лиц, CD86 и CD54 у больных СКВ + ЛН и у здоровых лиц указывает на однонаправленность процессов, регулиру-ющих экспрессию на пДК ко-стимуляторных и адгезивных молекул. За исключением различной интенсивности экспрессии молекулы CD86, между группами больных СКВ и СКВ + ЛН не вы-явлено статистически достоверных различий в количестве пДК в периферической крови и экс-прессии этими клетками ряда поверхностных молекул. В этой связи для выявления особенно-стей функционального состояния иммунокомпетентных клеток, способных приводить к пора-жению почек у пациентов с СКВ, представляется необходимым проведение дальнейших исследований по изучению профиля активированных генов, регулирующих функцию иммун-ной системы, методом DNA-microarray.


1. Т и т о в Л. П. Иммунология: терминол. словарь. М., 2008. 2. B a e c h l e r E. C., G r e g a r s e n P. K., B e h r e n s T. W. // Curr. Opin. Immunol. 2004. Vol. 16. P. 801–807.3. B l a n c o P., P a l u c k a A. K., G i l l M. et al. // Science. 2001. Vol. 294. P. 1540–1543.4. Т и т о в Л. П. // Весці НАН Беларусі. Сер. мед.-біял. навук. 2003. № 1. С. 89–103.5. K o z y r o I., P e r a h u d I., S a d a l l a c h S. et al. // Pediatrics. 2006. Vol. 117, N 5. P. 1663–1668.6. S c h u u r h u i s D. H., F u N., O s s e n d o r p F. et al. // Int. Arch. Allergy. Immunol. 2006. Vol. 140. P. 53–72.7. П и н е г и н Б. В., Я р и л и н А. А., С и м о н о в а А. В. Применение проточной цитометрии для оценки функ-

циональной активности иммунной системы человека. М., 2001.8. N i k o l a e v a M. A., B a l y a s n i k o v a I. V., A l e x i n s k a y a M. A. et al. // Am. J. Reprod. Immunol. 2006.

Vol. 55. P. 54–68.9. C h e s n e y J., B a c h e r M., B e n d e r A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 6307–6312.

A. Y. HANCHAROU1, L. P. TITOV1, K. A. CHYZH2, N. F. SOROKA2

IMMUNOPHENOTYPE OF PLASMACYTOID DENDRITIC CELLS DERIVED FROM PATIENTS WITH SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS

1Republican Scientifi c and Practical Center for Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus,2Belarusian State Medical University, Minsk

Summary

The aim of the current investigation was to assess the expression of costimulatory and adhesive molecules on plasmacy-toid dendritic cells (pDC) derived from the blood of patients with systemic lupus erythematosus (SLE). The decrease of the absolute pDC count in the blood of patients with SLE was shown, supposing the accelerated migration of pDC into peripheral and lymphoid tissues. pDC from SLE patients were characterized by an increased expression of CD86 and CD54, therefore capable of maintaining the immunoinfl ammation. No differences in pDC count and immunophenotype between patients with SLE and patients with SLE and lupus nephritis were observed. Further investigations of gene expression by pDC derived from the both groups of patients using DNA-microarray are required to estimate its role in the immunopathogenesis of SLE and lupus nephritis.



Беларуси

20


УДК 616.91/.93:576.8.097.29:612.55:547.495:616.36

А. Ф. ВИСМОНТ, Л. М. ЛОБАНОК

ОБ УЧАСТИИ МОЧЕВИНЫ И АРГИНАЗЫ ПЕЧЕНИ В ПРОЦЕССАХ ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ ПРИ ЭНДОТОКСИНОВОЙ ЛИХОРАДКЕ

Белорусский государственный медицинский университет, Минск


Введение. В настоящее время накопилось достаточное количество фактов, свидетельству-ющих о значимости роли мочевины и важного фермента цикла мочевины – аргиназы печени [1] в процессах жизнедеятельности в норме и при патологии [2–4]. Имеются сведения, что между функциональным состоянием печени и процессами регуляции температуры тела существует тесная взаимосвязь [5–7]. В то же время данные о значимости аргиназы печени и мочевины в фор-мировании терморегуляторных реакций организма при бактериальной эндотоксинемии отсут-ствуют, хотя их участие в этих процессах вполне закономерно, учитывая, что активность арги-назы печени влияет на активность L-аргинин-NO системы печени – системы, играющей важную роль в регуляции физиологических и патологических процессов [8, 9], в механизмах терморегу-ляции, в патогенезе лихорадки [10, 11].

Цель работы – установить роль мочевины и аргиназы печени в регуляции температуры тела при эндотоксиновой лихорадке.

Материалы и методы исследования. Опыты выполнены на взрослых ненаркотизирован-ных белых крысах и кроликах обоего пола. Все наблюдения проводили в термонейтральных условиях (20–22 оС). Для создания общепринятой модели эндотоксиновой лихорадки использо-вали бактериальный липополисахарид (ЛПС) – пирогенал («МЕДГАМАЛ» НИИ эпидемиоло-гии и микробиологии РАМН) или эндотоксин E. coli (Sigma, США), который вводили однократ-но: крысам – внутрибрюшинно в дозе 5 мкг/кг, кроликам – в краевую вену уха в дозе 0,5 мкг/кг. Для выяснения роли аргиназы печени и монооксида азота (NO) в процессах регуляции темпера-туры тела использовали ингибитор аргиназы Nω-гидрокси-нор-L-аргинин (nor NOHA) фирмы BAChEM (Германия) и неселективный блокатор NO-синтазы – метиловый эфир NG-нитро-L-аргини-на (L-NAME). Ингибитор аргиназы в дозе 10 мг/кг вводили крысам внутрибрюшинно ежедневно в течение недели. L-NAME (Sigma, США) в дозе 25 мг/кг вводили однократно: кроликам – внутри-венно, крысам – внутрибрюшинно. У крыс и кроликов температуру кожи, как и ректальную тем-пературу (в прямой кишке на глубине 3,0 и 5,0 см соответственно), измеряли с помощью электро-термометров ТПЭМ-1 и Microlife (Швейцария).

Уровни нитратов и нитритов (NO3 /̄NO2¯) в плазме крови определяли с помощью реактива Грисса [12, 13]. Количественное содержание свободных аминокислот в плазме крови оценива-ли на автоматическом анализаторе аминокислот марки ААА-881. Уровни мочевины определя-ли колориметрически по цветной реакции с диацетилмонооксидом, а активность аргиназы в печени – спектрофотометрически по методике, описанной J. M. Geyer, D. Dabich [14]. Все по-лученные цифровые данные обработаны общепринятыми методами вариационной биологиче-ской статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. В опытах установлено, что внутрибрюшинное введение крысам (n = 12) ЛПС (5,0 мкг/кг) приводит к медленному повышению температуры тела и сла-



Беларуси

21

бо выраженной гипертермии. Температура тела повышалась на 1,3 ºС (Р < 0,05), 1,2 ºС (Р < 0,05), 1,8 ºС (Р < 0,05) и 0,7 ºС (Р < 0,05) через 120, 180, 240 и 330 мин после инъекции экзопирогена и составляла 38,9 ± 0,11; 38,8 ± 0,12; 39,4 ± 0,10 и 38,3 ± 0,12 ºС соответственно. Введение кро-ликам (n = 9) в кровоток ЛПС (0,5 мкг/кг) приводило к быстрому и значительному повышению ректальной температуры через 30, 60, 120 и 180 мин после введения бактериального эндоток-сина. Тем пе ратура тела у животных возрастала на 0,6 ºС (Р < 0,05), 1,3 ºС (Р < 0,05), 1,6 ºС (Р < 0,05) и 1,2 ºС (Р < 0,05) и составляла соответственно 39,2 ± 0,12; 39,9 ± 0,10; 40,2 ± 0,11 и 39,8 ± 0,12 ºС.

Опыты, выполненные на крысах, показали, что при эндотоксиновой лихорадке изменяются не только показатели теплообмена, но и активность аргиназы печени, а также уровни мочевины и конечных продуктов деградации NO, NO3 /̄NO2¯ в плазме крови. Действие ЛПС (5,0 мкг/кг) у крыс (n = 8) через 120, 180 и 330 мин после введения экзипирогена приводило к повышению активности аргиназы в печени на 53,1% (Р < 0,05), 39,2% (Р < 0,05) и 27,8% (Р < 0,05) соответ-ственно по сравнению с контролем. Активность аргиназы в печени крыс контрольной группы че-рез 120, 180 и 330 мин после внутрибрюшинного введения физраствора составляла 5,63 ± 0,27 (n = 8), 5,24 ± 0,22 (n = 7) и 5,38 ± 0,29 (n = 7) мкМоль мочевины/г ткани·ч.

Выявлено, что через 120, 180, 240 и 330 мин после внутрибрюшинного введения ЛПС концентрация мочевины в плазме крови крыс повышалась на 26,0% (n = 8; Р < 0,05), 30,7% (n = 8; Р < 0,05), 44,7% (n = 7; Р < 0,05) и 39,8% (n = 6; Р < 0,05) по сравнению с контролем (введение физраствора) и составляла 4,4 ± 0,50; 5,0 ± 0,57; 5,4 ± 0,47 и 5,2 ± 0,43 мМоль/л со-ответственно.

Содержание NO3 /̄NO2¯ в плазме крови у крыс в этих условиях по сравнению с контро-лем возрастала на 20,8% (n = 7; Р < 0,05), 21,5% (n = 7; Р < 0,05), 48,7% (n = 6; Р < 0,05) и 81,2% (n = 7; Р < 0,05) и составляло соответственно 8,7 ± 0,25; 9,0 ± 0,36; 10,6 ± 0,41 и 13,1 ± 0,52 мкМоль/л.

Внутривенное введение эндотоксина кроликам (n = 7) вызывало повышение температуры тела и концентрации мочевины, а также снижение уровня свободной аминокислоты аргинина в плазме крови. Так, через 60, 120 и 180 мин после введения в кровоток ЛПС (0,5 мкг/кг) на пике пирогеналовой гипертермии концентрация мочевины в плазме крови животных возрас-тала на 39,8% (Р < 0,05), 45,2% (Р < 0,05) и 77,8% (Р < 0,05) и составляла 4,0 ± 0,51; 4,6 ± 0,50 и 5,2 ± 0,63 мМоль/л. Уровень аргинина в плазме крови кроликов снижался на 57,7% (Р < 0,05), 42,3% (Р < 0,05) и 31,8% (Р < 0,05) соответственно, а концентрация аргинина в крови через 60 мин после внутривенного введения бидистилированной воды (в контроле) составляла 0,264 ± 0,0164 мМоль/л.

Исследования, выполненные на кроликах (n = 8) и крысах (n = 10) показали, что введение, соответственно в кровоток или внутрибрюшинно, интактным животным 30%-ного раствора мо-чевины (Carl Roth GmbH+Co.KG) не влияет на температуру тела. Установлено, что действие ЛПС (5 мкг/кг) в условиях предварительного введения животным мочевины в дозе 300 мг/кг (внутри-брюшинно один раз в сутки в течение трех дней) сопровождается ослаблением лихорадочной реакции. Так, через 120 и 180 мин после инъекции ректальная температура у крыс (n = 8), полу-чавших только ЛПС, повышалась на 1,2 и 1,1 ºС, в то время как у животных (n = 10), которые по-лучали ЛПС в условиях действия мочевины, наблюдалось повышение температуры тела в ука-занные промежутки времени после введения эндотоксина всего лишь на 0,6 и 0,4 ºС. В опытах на кроликах показано, что введение в кровоток мочевины (0,3 г/кг) на высоте подъема температуры тела при эндотоксиновой лихорадке (через 60 и 90 мин от момента инъекции ЛПС) приводит к значительному понижению температуры тела и ослаблению лихорадки. Так, через 15 и 30 мин после введения мочевины ректальная температура на пике лихорадки (60 мин) снижалась по сравнению с контролем на 0,9 ± 0,08 ºС (Р < 0,05) и 0,8 ± 0,10 оС (Р < 0,05). В опытах на кроликах (n = 7) показано, что лихорадочная реакция, вызванная введением ЛПС, также ослабляется после предварительного введения (за 30 мин до введения экзопирогена) в кровоток животных мочеви-ны (0,3 г/кг).



Беларуси

22

Учитывая, что гидролитическое расщепление аминокислоты L-аргинина является послед-ним этапом образования мочевины, на пике эндотоксиновой лихорадки у кроликов нами было изучено влияние на температуру тела L-аргинина солянокислого, введенного в кровоток в дозе 50 мг/кг (доза, не влияющая на температуру тела интактных животных). Опыты показали, что введение в краевую вену уха L-аргинина солянокислого (Carl Roth GmbH+Co.KG) в дозе 50 мг/кг при действии в организме ЛПС через 60 мин после инъекции эндотоксина приводит к ослабле-нию лихорадки. Так, ЛПС в дозе 0,5 мг/кг вызывал повышение температуры тела у кроликов (n = 10) на 1,2 ± 0,10 оС (Р < 0,05) через 60 мин после инъекции, а через 90 мин отклонение составляло 1,5 ± 0,09 оС (Р < 0,05). Внутривенное введение L-аргинина солянокислого в дозе 50 мг/кг спустя 60 и 90 мин после инъекции ЛПС оказывало выраженный антипиретический эффект. Снижение ректальной температуры у кроликов (n = 6) на высоте лихорадки (через 15 и 30 мин после введе-ния аминокислоты) составляло 0,8 и 0,7 оС (Р < 0,05).

Учитывая данные литературы о том, что действие в организме бактериальных эндотоксинов вызывает экспрессию индуцибельной NO-синтазы [8, 11] и приводит к повышению концентра-ции NO [8, 15], представляло интерес выяснить, как будет изменяться температура тела живот-ных при действии ЛПС в условиях предварительного введения в их организм веществ, угнетаю-щих активность L-аргинин-NO-системы.

В опытах на кроликах установлено, что лихорадочная реакция, вызываемая бактериальным эндотоксином, ослабляется при предварительном введении в кровоток L-NAME (25 мг/кг) – инги-битора NO-синтазы, существенно не влияющего в указанной дозе на температуру тела, но в нор-ме приводящего к повышению уровня мочевины в крови. Так, через 120 мин после введения в кровоток животных (n = 6) ЛПС в дозе 0,5 мкг/кг в условиях предварительного (за 30 мин до инъекции экзопирогена) введения в кровоток L-NAME ректальная температура у кроликов по-вышалась от 38,8 ± 0,12 до 39,3 ± 0,13 оС (Р < 0,05), в то время как у животных контрольной груп-пы (n = 7) – от 38,6 ± 0,10 до 40,3 ± 0,11 оС.

В опытах на крысах (n = 8) также установлено, что ежедневное внутрибрюшинное введение nor-NOHA в дозе 10 мг/кг в течение недели достоверно не сказывается на ректальной темпера-туре и приводит к снижению активности аргиназы печени на 71,2% (Р < 0,05), уровня мочеви-ны в крови – на 51,3% (Р < 0,05). У животных контрольной группы, получавших ежедневно внутрибрюшинно физраствор в течение недели, активность аргиназы печени и концентрация мочевины в крови составляла соответственно 5,7 ± 0,51 мкМоль мочевины/г ткани·ч (n = 7) и 3,6 ± 0,21 мМоль/л (n = 7).

В опытах на крысах установлено, что гипертермическая реакция на внутрибрюшинное вве-дение ЛПС (5,0 мкг/кг) предупреждалась предварительным ежедневным внутрибрюшинным введением (до инъекции ЛПС в течение 7 дней) раствора nor-NOHA в дозе 10 мг/кг. Так, тем-пература тела у крыс в контроле (через 7 дней после ежедневного внутрибрюшинного введе-ния 1,0 мл физраствора) под влиянием внутрибрюшинного введения ЛПС (5,0 мкг/кг) через 120 и 180 мин от начала инъекции эндотоксина повышалась на 1,2 ± 0,14 ºС (n = 10) и 1,1 ± 0,11 ºС (n = 10) соответственно, а в условиях действия nor-NOHA через 2 и 3 ч после введения ЛПС – на 0,3 ± 0,06 и 0,2 ± 0,02 ºС (n = 8). Температура кожи корня хвоста у крыс под влиянием внутрибрю-шинного введения ЛПС (5,0 мкг/кг через 120 мин) в условиях действия nor-NOHA снижалась с 22,9 ± 0,29 до 21,3 ± 0,31 ºС (n = 8), а у животных в контроле (ежедневное внутрибрюшинное введение физраствора в течение 7 дней и последующая однократная инъекция ЛПС) – с 23,1 ± 0,31 до 17,2 ± 0,37 ºС (n = 8) соответственно.

В опытах на крысах (n = 7) также установлено, что через 120 и 180 мин после внутри-брюшинного введения ЛПС в условиях действия в организме животных ингибитора арги-назы nor-NOHA содержание NO3 /̄NO2¯ в плазме крови повышалось по сравнению с кон-тролем (n = 7) (действие только одного эндотоксина) на 71,1% (Р < 0,05) и 102,5% (Р < 0,05) соответственно. Выявлено, что действие ЛПС в организме у крыс (n = 7), предварительно получавших внутрибрюшинно nor-NOHA, сопровождалась менее значимым повышением уровня мочевины в крови. Уста нов лено также, что через 120 и 180 мин после инъекции



Беларуси

23

ЛПС (5 мкг/кг) действие бактериального эндо токсина в организме животных сопровожда-лось повышением уровня мочевины на 19,1% (Р < 0,05) и 13,2% (Р < 0,05) соответственно. У животных контрольной группы, получавших один ЛПС, уровень мочевины в плазме кро-ви возрастал на 26,0% (Р < 0,05) и 30,7% (Р < 0,05) и состав лял соответственно 4,4 ± 0,50 и 5,0 ± 0,57 мМоль/л.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что функциональное состояние печени и, в частности, активность аргиназы печени имеют важное значение в механизмах фор-мирования терморегуляторных реакций организма на действие бактериального эндотоксина. Угнетение аргиназы печени нарушает развитие характерной терморегуляторной реакции орга-низма на эндотоксин и препятствует развитию лихорадочной реакции.

Заключение. Формирование терморегуляторных реакций при действии бактериальных эн-дотоксинов у крыс и кроликов зависит от активности аргиназы печени, состояния L-аргинин-NO-системы и уровня мочевины в крови. Есть основания полагать, что при бактериальной эндо-токсинемии, сопровождающейся лихорадкой, на ранних этапах ее развития имеет место уси-л енное использование аргинина в цикле мочевины. Это вносит существенный вклад в пул эндо генного аргинина [1], имеющегося в гепатоцитах и в крови, приводя к значительному сниже нию его уровня, а соответственно, к снижению активности L-аргинин-NO-системы, воз-никновению вазоконстрикции и снижению теплоотдачи. Очевидно, аргиназу печени, мочеви-ну плазмы кро ви и NO можно рассматривать как важнейшие взаимосвязанные факторы, уча-ствующие в регуляции теплообмена при бактериальной эндотоксинемии, сопровождающейся лихорадкой.

Полученные данные позволяют заключить, что динамика процессов теплообмена при эн-дотоксиновой лихорадке у крыс, их стадийность зависят от активности аргиназы печени, со-стояния L-аргинин-NO-системы и уровня мочевины в крови, которые и определяют их на-правленность и выраженность. Действие бактериального эндотоксина у животных приводит к повышению температуры тела, активности аргиназы печени и к снижению активности L-арги нин-NO-системы на начальных этапах лихорадки. В завершающей стадии, стадии сни-жения температуры тела и активности аргиназы печени, лихорадка сопровождается повыше-нием уровня мочевины в крови и активности L-аргинин-NO-системы. По-видимому, утечка L-аргинина в цикл мочевины и его активное использование в процессах мочевинообразова-ния играют важную роль в механизмах эндогенного антипереза, развитии компенсатор-но-адаптивных перестроек и метаболизме организма на завершающих этапах эндотоксиновой лихорадки.


1. S c i b i o r D., C z e c z o t H. // Postepy Hig. Med. Dosw. 2004. Vol. 58. Р. 321–332.2. Ш у г а л е й В. С., К о з и н а Л. С. // Физиол. журн. СССР им. И. М. Сеченова. 1977. Т. 63, № 8.

С. 1199–1202.3. B a g n o s t T., B e r t h e l o t A., B o u h a d d i M. еt al. // J. Hypertens. 2008. Vol. 26, N 6. P. 1110–1118.4. J o n e s P. G., K a u f f m a n C. A., P o r t F. K., K l u g e r M. J. // Ann. J. Kidney Dis. 1985. Vol. 6, N 4.

Р. 241–244.5. В и с м о н т Ф. И. // Нейрогуморальные механизмы регуляции функции в норме и патологии / Отв. ред. В. Н. Гу-

рин. Минск, 2007. С. 54–58.6. В и с м о н т Ф. И., В и с м о н т А. Ф. // Новости мед.-биол. наук. 2008. № 1–2. С. 41–46.7. S e c h i c E., H u n t e r W. S., U n g a r A. L., B l a t t e i s C. M. // Ann. of New York Acad. of Sci. Vol. 813:

Thermoregulation Tenth International symposium on the pharmacology of thermoregulation / Ed. by C. M. Blatteis. N. Y., 1997. P. 324–326.

8. Т э й л о р Б. С., А л а р с о н Л. Х., Б и л л и а р Т. Р. // Биохимия. 1998. Т. 63, № 7. С. 905–923.9. G e r s t b e r g e r R. // News Physiol. Sci. 1999. Vol. 14, N 2. P. 30–36.10. Г у р и н В. Н., Г у р и н А. В., М е л е н ч у к Е. В. и др. // Пурины и монооксид азота (регуляторная функция

в организме) / Под ред. В. Н. Гурина. Минск, 2003. С. 19–24.11. В и с м о н т Ф. И., С т е п а н е н к о Н. Н. // Весці НАН Беларусі. Сер. хім. навук. 1997. № 2. С. 102–106.12. B r y a n N. S., G r i s h a m M. B. // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 43, N 5. P. 645–657.



Беларуси

13. G u e v a r a I., I w a n e j k o J., D e m b i n s k a - K i e c A. et al. // Clin. Chim. Acta. 1998. Vol. 274, N 2. P. 177–188.

14. G e y e r J. W., D a b i c h D. // Anal. Biochem. 1971. Vol. 39, N 2. Р. 412–417.15. S c h u l z K., K e r b e r S., K e l m M. // Nitric Oxide. 1999. Vol. 3, N 3. P. 225–234.

А. F. VISMONT, L. M. LOBANOK

PARTICIPATION OF UREA AND LIVER ARGINASE IN THE THERMOREGULATION PROCESSES DURING ENDOTOXIN FEVER

Belаrusian State Medical University, Minsk

Summary

Dynamics of heat exchange processes during endotoxin fever in rats and rabbits and their staging depends on the liver arginase activity, the L-arginine-NO-system state and the blood urea level that determine their direction and intensity. Apparently, the L-arginine participation in the urea cycle and its active use in the urea formation processes during endo-toxinemia play a signifi cant role in the mechanisms of regulation of the L-arginine-NO-system activity, thermoregulation and endogenic antipyresis.



Беларуси

25


УДК 616-13-008.21

И. В. ГАЙШУН1, Н. А. МАНАК2, Е. И. ГАЙШУН3, А. М. ПРИСТРОМ4

МЕТОДИКА ПОСТРОЕНИЯ ИНДЕКСОВ ЭЛАСТИЧНОСТИ АРТЕРИАЛЬНЫХ СОСУДОВ

1Институт математики НАН Беларуси, Минск,2Высшая аттестационная комиссия Республики Беларусь, Минск,

31-я городская клиническая больница, Минск, Беларусь,4Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск


Введение. Развитию большинства сердечно-сосудистых заболеваний сопутствуют морфофунк-циональные изменения артериальных сосудов, которые характеризуются структурной перестрой-кой их стенок и прежде всего нарушением эластичности. Последнее обстоятельство, как правило, приводит к ухудшению непрерывности кровотока и повышению пульсового давления, что в свою очередь существенно увеличивает риск неблагоприятного течения болезни [1–4]. В связи с этим несомненно актуальной является проблема оценки эластичных свойств артериальных сосудов.

К настоящему времени нет какого-либо общепринятого метода получения таких оценок, а оби-лие характеристик и показателей (часто называемых одинаковыми терминами), которые исполь-зуются в литературе для описания эластичных свойств артериальных сосудов, сильно ограни-чивает возможности сопоставления результатов различных исследований (попытка привести существующие показатели в единую систему сделана в обзоре [5] и в работе [6]). К наиболее точным методам оценки эластичных свойств артериальных сосудов, по-видимому, следует от-нести регистрацию кривой объем–давление или диаметр–давление [7–9], однако процедура получения такой кривой достаточно сложна и не может быть использована в клинической практике. Среди относительно простых и широко применяемых методов следует в первую оче-редь назвать методы, основанные на измерении скорости распространения пульсовой волны, т. е. механической волны деформации упругих стенок сосуда, вызванной пульсовыми колебани-ями кровотока [10–15]. Считается, что данный метод обладает высокой точностью, достоверно-стью и воспроизводимостью результатов [16]. Клиническому значению скорости распростране-ния пульсовой волны посвящены обзоры [17, 18].

Кроме указанных методов оценки эластичных свойств артериальных сосудов существует большое количество различных показателей, коэффициентов, индексов, основанных на некото-рых идеях теории упругости. Их можно разделить на две группы: те, у которых изменение объе-ма (диаметра) сосуда линейно относительно пульсового давления, и те, где изменение объема (диаметра) нелинейно зависит от артериального давления (АД). К первой группе относятся та-кие известные показатели, как артериальная податливость, коэффициент растяжимости, модуль эластичности Петерсона, модуль Юнга, ко второй — коэффициент жесткости.

Основной недостаток линейных показателей — это то, что они не учитывают фактор роста модуля упругости стенок сосуда при увеличении давления, а это приводит к достаточно сильно-му разбросу их значений и, следовательно, к уменьшению надежности. Построение индексов с нелинейной зависимостью приращения объема от возрастания давления связано с большими трудностями в точном определении этой зависимости. Возможно, по этой причине существует всего лишь один такой показатель — индекс жесткости [19].



Беларуси

26

Отметим, что средние значения указанных показателей для общей сонной артерии практиче-ски здоровых людей приведены в монографии [20].

Цель исследования – разработать эффективную общую методику построения индексов эла-стичности артериальных сосудов, учитывающую нелинейную зависимость растяжимости сте-нок сосуда от изменения давления, и с ее помощью ввести новый показатель эластичности, рас-ширив тем самым возможности исследования упругих свойств артериальных сосудов.

Материалы и методы исследования. В работе использованы следующие обозначения: pd и ps – диастолическое и систолическое давление; Vd, Dd и Vs, Ds – соответствующие им объе-мы и диаметры сосудов; ∆p = ps – pd – пульсовое давление; ∆V = Vs – Vd и ∆D = Ds – Dd – прира-щения объема и диаметра сосуда.

Из классической теории упругости следует, что если в артериальном сосуде, находящемся под давлением p и имеющем объем V0, произошло увеличение давления на малую величину δp, то относительное приращение объема пропорционально δp, т. е.

0

0

V VV

rδp, (1)

где r – коэффициент растяжимости. Коэффициент r не является постоянным; хорошо известно, что он убывает вместе с ростом давления, т. е. растяжимость сосуда уменьшается при возраста-нии значения p. Если бы мы знали точную зависимость r от p, то имели бы исчерпывающую ха-рактеристику эластичности сосуда. Однако установить такую зависимость довольно затрудни-тельно, а в клинических условиях — практически невозможно. В этой ситуации заслуживает внимания следующий путь оценки эластичности артериальных сосудов.

Для достаточно широкой группы лиц, объединенных, например, какой-либо сердечно-со су-дистой патологией или определенными возрастными рамками, сначала устанавливаем (скажем, на основе изучения нескольких кривых объем–давление или диаметр–давление) некоторые ти-пичные свойства коэффициента r(p), затем подбираем простую невозрастающую функцию c(p), обладающую такими же или близкими свойствами. Функция c(p) в какой-то мере характеризует растяжимость артериальных сосудов всех лиц выбранной группы. Индивидуальные особенно-сти сосудов оцениваем некоторой константой α, предполагая, что индивидуальный коэффици-ент растяжимости равен αc(p).

Допустим, что требуемая функция c(p) выбрана, перейдем от равенства (1) к следующему его приближению:

( ) ( ) ( ),dV p p V p

V c pp

(2)

а затем неограниченно уменьшим величину δp. Тогда соотношение (2) преобразуется в диффе-ренциальное уравнение / ( ).ddV dp V c p Интегрируя это уравнение и принимая во внимание начальное условие ( ) ,d dV p V получим формулу

( ) 1 ( ) ,

d

p

pdV p V c p dp

(3)

приближенно описывающую зависимость объема сосуда от давления. Константу α найдем из ра-венства (3), положив в нем p = ps. Тогда

.( )

s

d

p

pd

V

V c p dp

(4)

Если давление p измеряется в мм рт. ст. или в Па, то величина α, очевидно, имеет размер-ность [мм рт. ст. c (мм рт. ст.)]–1 или [с(Па)Па]–1.



Беларуси

27

Подчеркнем, что функция c(p) выбирается сразу для всех лиц данной группы и обеспечивает описание типичных свойств растяжимости их артериальных сосудов, а величина (4) строится для каждого лица индивидуально на основании измерения пульсового давления и относитель-ного изменения объема ∆V/Vd.

Коэффициент α, представленный формулой (4), назовем индексом эластичности. Ясно, что чем больше индекс α, тем эластичнее сосуд.

Поскольку выбор функции c(p) не ограничен какими-либо строгими правилами, значение индекса α существенно зависит от удачного или неудачного построения этой функции. Поэтому всякий раз возникает проблема объективной оценки пригодности данного индекса для исследования эластичных свойств артериальных сосудов. По нашему мнению, такая оцен-ка должна проводиться по крайней мере по двум критериям: надежность (независимость от условий измерения, а именно от АД) и степень разрешения (способность различать сосуды с разной эластичностью), а кроме того, она должна базироваться на экспериментальных дан-ных. Важность второго критерия очевидна, а необходимость первого будет продемонстриро-вана далее.

Формула (4) обладает большой общностью, так как из нее путем конкретизации функции c(p) можно получить целую серию индексов эластичности, в той или иной мере оценивающих упругие свойства артериальных сосудов. Для демонстрации этого сначала выведем уже извест-ные показатели эластичности, а затем опишем методику построения функции c(p) для лиц по-жилого возраста и тем самым укажем новый индекс эластичности.

Пусть функция c(p) постоянна (в этом случае, без ограничения общности, ее можно считать равной единице). Это означает, что коэффициенты растяжимости сосудов не зависят от p (такое предположение, конечно же, не соответствует действительности, однако оно часто используется при оценке эластичности артериальных сосудов). Полагая, что в формуле (4) c(p) = 1, находим, что

.d

VV p

(5)

Этот хорошо известный коэффициент артериальной растяжимости (имеющий размерность (мм рт. ст.)–1 или Па–1) широко используется в медицинской практике и уже вошел в медицин-ские учебники [21]. Так как из данного индекса по простым математическим формулам, указан-ным в работе [6], легко получить другие показатели эластичности, основанные на линейной за-висимости приращения объема ∆V (или приращения диаметра ∆D) от приращения давления ∆p (артериальная податливость, модуль эластичности Петерсона, модуль Юнга), то формула (4) фактически объединяет и эти показатели.

Предположим теперь, что растяжимость сосудов с достаточно высокой степенью приближе-ния обратно пропорциональна давлению p и поэтому функцию c(p) можно считать равной 1/p. Тогда из равенства (4) следует, что

.ln

ks

dd

V

pV

p

(6)

Величина α является безразмерной и с точностью до простых математических преобразова-ний совпадает с индексом жесткости, введенным в работе [19]. Требование c(p) = 1/p более реа-листично, чем требование c(p) = 1, и поэтому коэффициент (6), как правило, более надежен, чем индекс (5).

Таким образом, из соотношения (4) легко получаются известные показатели эластично-сти артериальных сосудов, связывающие приращения объема с пульсовым давлением как линейной зависимостью (индекс (5)), так и нелинейной (коэффициент (6)). Уже это в какой-то степени говорит об обоснованности предложенной нами методики построения индексов эластичности.



Беларуси

28

Рассмотрим группу лиц, возраст которых более 50 лет. Типичные кривые объем–давление (диаметр–давление), характерные для лиц указанной группы, приведены в работах [8, 9, 21–24]. Анализ этих кривых приводит к следующим заключениям. Во-первых, объем сосудов возрастает вместе с увеличением АД, если давление не превышает величины, равной примерно 190 мм рт. ст.; после достижения этого уровня рост объема практически прекращается. Во-вторых, прираще-ния объема, отнесенные к приращению давления, с достаточной точностью представляют собой выпуклую вверх функцию. Обоснованность сделанных заключений подтверждается графиком (рис. 1), где приводится отношение ( ) ( ( ) ( )) / df p V p p V p pV (объем измеряется в милли-литрах, а давление – в мм рт. ст.) при δp = 10, p = 70, 80, ..., 180 для одного из артериальных сосу-дов лиц пожилого возраста, описанных в работе [22] (так как значения f(p) чрезвычайно малы, то на рис. 1 график функции 103f(p)).

Из приведенного выше следует, что функция c(p), описывающая типичные черты эластич-ности артериальных сосудов лиц пожилого возраста, должна обладать следующими свойствами: обращаться в нуль при p = 190 мм рт. ст., быть монотонно убывающей и выпуклой вверх. Легко убедиться, что перечисленные свойства имеет функция ( ) 190 .c p p Числовой пара-метр λ выберем так, чтобы величина f(p), приведенная на рис. 1, и значение с(p) были одинако-вого порядка, а формула (4), по возможности, простой. Очевидно, этим требованиям удовлетво-ряет число λ = 0,0015.

Таким образом, типичные эластичные свойства артериальных сосудов лиц пожилого возрас-та приближенно определяются функцией ( ) 0,0015 190 .c p p Поэтому, согласно формуле (4), индекс эластичности в данном случае имеет вид

3

1,5 1,510 ;

(190 ) (190 )c

sd d

V

V p p

(7)

его размерность — (мм рт. ст.)–1,5. Применять этот индекс можно лишь в тех случаях, когда си-столическое давление ps не превышает 190 мм рт. ст.

В силу выбора функции с(p) показатель (7) «настроен» на оценку эластичных свойств арте-риальных сосудов именно лиц пожилого возраста, и поэтому есть основание ожидать, что для них он лучше других показателей по критериям надежности и степени разрешения. Подтвердим этот вывод конкретными расчетами.

Поскольку коэффициент артериальной растяжимости (5) в большинстве случаев уступает ин-дексу (6) по критерию надежности, сравним только индексы (6) и (7). Обратимся к табл. 1, в кото-рой в столбцах V1 и V2 приведены значения объемов (в мл) при различных давлениях pi (мм рт. ст.) для двух артериальных сосудов (с начальными объемами Vd

′ и Vd′′, взятыми при p = pi = 60).

Рис. 1. График функции 103f(p), приближенно описывающий изменение коэффициента растяжимости сосуда в зави-симости от давления



Беларуси

29

Т а б л и ц а 1. Изменение объемов (V) артериальных сосудов в зависимости от давления (p) у лиц пожилого возраста

p V1 V2

60 Vd′ Vd

′′

70 1,04 Vd′ 1,025Vd

′′

80 1,07 Vd′ 1,05Vd

′′

90 1,09 Vd′ 1,08Vd

′′

100 1,11 Vd′ 1,1Vd

′′

110 1,13 Vd′ 1,125Vd

′′

120 1,15 Vd′ 1,14Vd

′′

130 1,16 Vd′ 1,16Vd

′′

140 1,18 Vd′ 1,175Vd

′′

150 1,19 Vd′ 1,188Vd

′′

160 1,20 Vd′ 1,20Vd

′′

170 1,21 Vd′ 1,208Vd

′′

180 1,215 Vd′ 1,21Vd

′′

Цифровые данные взяты из монографии [22]. Ясно, что первый сосуд (столбец V1) менее эластичный, чем второй (столбец V2), однако отношения их объе-мов при одинаковых давлениях pi к первоначаль-ным объемам Vd

′ и Vd′′ отличаются незначительно

(рис. 2) и колеблются в переделах от 0,002 (при вы-соком давлении) до 0,02 (при сравнительно низком давлении). На рис. 2 представлен прирост данных объемов в процентах.

Вычислим теперь индексы эластичности (6) и (7) для различных значений систолического ps и диастолического pd давлений, которые выбира-лись нами достаточно произвольно, однако с уче-том того, что пожилые люди часто страдают арте-риальной гипертензией и что с возрастом систоли-ческое давление повышается в большей степени,

чем диастолическое [21]. Результаты вычислений представим в виде табл. 2, в строках которой записаны значения индексов αk и αc при различных АД для первого и второго сосудов. Анализ этой таблицы приводит к следующим выводам.

Т а б л и ц а 2. Значения индексов эластичности (αk и αc) в зависимости от уровня артериального давления (p)

p, мм рт. ст. Первый сосуд Второй сосуддиаст. сист. αk αc αk αc

70 120 0,20 0,14 0,21 0,1580 140 0,18 0,13 0,21 0,1590 150 0,17 0,12 0,19 0,13100 150 0,18 0,12 0,20 0,1390 160 0,15 0,12 0,19 0,13100 160 0,17 0,12 0,19 0,13100 170 0,17 0,12 0,18 0,13100 180 0,16 0,11 0,17 0,12110 180 0,15 0,11 0,15 0,11

Рис. 2. Прирост объемов сосудов (кривая 1 — вто-рого; кривая 2 — первого) по отношению к исхо-

дным объемам при p = 60 мм рт. ст., %



Беларуси

30

1. Степень разрешения обоих индексов снижается при приближении к критическому давле-нию p = 190; уже при pd = 110, ps = 180 значения каждого их них совпадают для обоих сосудов и поэтому при таком АД определить различия в эластичности сосудов не представляется воз-можным. Объясняется это тем, что при давлении, близком к величине p = 190 мм рт. ст., увели-чение объема сосуда крайне незначительно, поэтому относительные приращения объемов раз-ных сосудов чрезвычайно близки, что приводит к указанному совпадению значений индексов.

2. При низком давлении значения обоих индексов выше (на каждом сосуде), чем при высо-ком, т. е. при низком давлении сосуды более эластичны, а при высоком — менее. Причина этого заключается в том, что в первом случае основную роль играет более эластичный компонент стенки сосуда эластин, а во втором — менее эластичный коллаген [25].

3. Ни один индекс не является полностью независимым от АД, если оно меняется в широ-ких пределах.

4. Зависимость индекса от пульсового давления может привести к неверным заключениям, если измерения проводятся при различных уровнях pd и ps. Проиллюстрируем это на следу-ющем примере. Из табл. 2 найдем значения индекса αk при pd = 70, ps = 120 для первого сосуда (αk = 0,20) и при pd = 90, ps = 150 — для второго (αk = 0,19). Так как 0,20 > 0,19, то полученные дан-ные приводят к ложному выводу о большей эластичности первого сосуда. В этом случае для индекса αk имеет место эффект инверсии.

5. Разброс значений индекса αk наблюдается во всем рассматриваемом диапазоне изменения АД, в то время как индекс αc имеет зону стабильности (табл. 2, рамка), в которой он не зависит от величины пульсового давления.

6. У обоих индексов (αk и αc) достаточно высокая степень разрешения, поскольку они разли-чают (при одинаковом АД) эластичность сосудов с близкими кривыми объем–давление (см. рис. 2).

Вывод 5 показывает, что если ограничиться лицами пожилого возраста, то для индекса αc менее вероятен эффект инверсии, чем для показателя αk, поэтому он более надежно оценивает эластичные свойства артериальных сосудов.

В заключение следует отметить следующее. Поскольку нет никаких оснований ожидать, что когда-либо будет изобретен универсальный индекс эластичности, надежно оцениваю-щий упругие свойства всех артериальных сосудов при разных пульсовых давлениях, то ме-тодика построения индексов эластичности для различных групп лиц, объединенных некото-рым типичным поведением их артерий при изменении давления, представляется достаточно обоснованной.

Кстати, в рамках предложенной методики можно легко объяснить противоречивость данных о независимости индекса жесткости [19] от АД, когда, с одной стороны, согласно [12, 26, 27], не-зависимость имеет место у больных сахарным диабетом и у здоровых лиц, а, с другой стороны, при некоторых сердечно-сосудистых заболеваниях достоверно установлено [14, 15, 28] влияние АД на него. По-видимому, дело здесь в том, что для первых двух групп растяжимость артери-альных сосудов с высокой степенью точности обратно пропорциональна давлению, а для лиц, описанных в работах [14, 15, 28], такой пропорциональности нет и, следовательно, в этом случае необходимо искать более адекватную, чем 1/p, функцию c(p).

Одним из факторов, влияющих на растяжимость артериальных сосудов, является толщина h их стенок (комплексов интима-медиа). При построении функции c(p) легко учесть и этот фактор (если известна зависимость коэффициента растяжимости от величины h). В частности, если ко-эффициент растяжимости обратно пропорционален параметру h (это предположение, например, используется при выводе такого известного показателя эластичности, как модуль упругости Юнга [6]), то индекс эластичности (4) модифицируется путем умножения на величину h, т. е. пе-реходит в показатель .h h

Во всех показателях эластичности, построенных нами, фигурируют относительные изме-нения объемов ∆V/Vd сосудов. Однако чаще всего удобнее измерять относительные изменения диаметров ∆D/Dd. Поэтому сформулируем простое правило перехода от индексов, содер-жащих величины ∆V/Vd, к индексам с соотношением ∆D/Dd. Определим по образцу фор-мулы (4) величину



Беларуси

,( )

s

d

p

pd

D

D c p dp

которая есть индекс эластичности, записанный через относительные изменения диаметра. Из ра-боты [6] следует, что показатели α и γ связаны простой зависимостью α = μγ, где .1 /s dD D

Заключение. Таким образом, с помощью предложенной методики, позволившей объединить в единую формулу большинство известных показателей эластичности артерий, указать причи-ны зависимости их от АД, получен новый показатель, который рекомендуется использовать для лиц пожилого возраста, особенно при наличии у них гипертонической болезни. Кроме того, дан-ная методика открывает возможности строить показатели эластичности, ориентированные на кон-кретные группы пациентов, что существенно увеличивает их надежность.

Литература1. B e n e t o s A., S a f a r M., R u d n i c h i A. et al. // Hypertension. 1997. Vol. 30. P. 1410–1415.2. K a n n e l W. B., G o r d o n T., S c h w a r t z M. J. // Amer. J. Cardiol. 1971. Vol. 27. P. 335–346.3. K a n n e l W. B., W o l f P. A., Mc G r e e D. L. et al. // JAMA. 1981. Vol. 245. P. 1225–1229.4. M i t c h e l l G. F., M o d y e L. A., B r a u n w a l d E. et al. // Circulation. 1997. Vol. 96. P. 4254–4260.5. П о л и в о д а С. Н., Ч е р е п о к А. А., С ы ч е в Р. А. // Iternetmap. Info / Запорож. гос. мед. ун-т. 2002. С. 1–20.6. М а н а к Н. А., П р и с т р о м А. М., Г а й ш у н Е. И. // Здравоохранение. 2010. № 6. С. 36–38.7. H i c k l e r R. B. // Clin. Cardiol. 1990. Vol. 13. P. 317–322.8. S t e f a n a d i s C., S t r a t o s C., V l a c h o p o u l u s C. et al. // Circulation. 1995. Vol. 92. P. 221–2219.9. S t e f a n a d i s C., D e r n e l l i s J., V l a c h o p o u l u s C. et al. // Circulation. 1997. Vol. 96. P. 1853–1858.10. D r z e w i e c k i G. M., M e l b i n J., N o o r d e r g r a a f A. // J. Biomech. 1983. Vol. 16. P. 141–152.11. K e l l y R. P., H a y w a r d C. S., G a n i s J. et al. // J. Vasc. Med. Biol. 1989. Vol. 1. P. 142–149.12. L e h m a n n E. D., H o p k i n s K. D., G o s l i n g R. G. // Ultrasound. Med. Biol. 1993. Vol. 19. P. 683–710.13. L e h m a n n E. D., H o p c i n s K. D., G o s l i n g R. G. // Hypertension. 1996. Vol. 27. P. 1188–1190.14. L e h m a n n E. D., H o p k i n s K. D., J o n e s R. L. et al. // Clin. Sci. 1995. Vol. 89. P. 247–253.15. L e h m a n n E. D., H o p k i n s K. D., R a w e s h A. et al. // Hypertension. 1998. Vol. 32. P. 565–569.16. S a f a r M. E., L o n d o n G. M. // J. Hypertension. 2000. Vol. 11. P. 1527–1535.17. О р л о в а Я. А., А г е е в Ф. Т. // Сердце. 2006. Т. 5, № 2. С. 65–68.18. Л о п а т и н Ю. М., И л ю х и н О. В. // Сердце. 2007. Т. 6, № 3. С. 128–132.19. K a w a s a k i T., S a s y a m a S., Y a g i S. et al. // Cardiovasc. Res. 1987. Vol. 21. P. 678–687.20. Л е л ю к В. Г., Л е л ю к С. Э. Ультразвуковая ангиология. 3-е изд., перераб. и доп. М., 2007.21. Ш м и д т Р., Т е в с Г. Физиология человека. М., 1996. Т. 2.22. С а в и ц к и й Н. Н. Биофизические основы кровообращения и клинические методы изучения гемодинамики.

Л., 1974.23. L i n Z. R., T i n g C. T., Z h u S. X. et al. // Hypertension. 1989. Vol. 14. P. 129–136.24. V a n Gorp A. W., v a n I n g e n S e h e n a n D. S., H o e k s A. P. et al. // Hypertension. 1995. Vol. 26. P. 363–368.25. R o a c h M., B u r t o n A. C. // Canad. J. Biochem. Physiol. 1957. Vol. 35. P. 681– 690. 26. L a n n e T., R y d e n A. A. // Diabetologia. 1996. Vol. 39. P. 871–872.27. L e h m a n n E. D., G o s l i n g R. G., P a r k e r J. R. et al. // Brit. J. Radiol. 1993. Vol. 66. P. 126–131.28. L e h m a n n E. D., H o p k i n s K. D., G o s l i n g R. G. // Diabetologia. 1996. Vol. 39. P. 870–871.

I. V. GAISHUN1, N. А. МАNАК2, Е. I. GAISHUN3, А. М. PRYSTROM4

METHODOLOGY OF CREATING ARTERIAL VESSELS ELASTICITY INDICES

1Institute of Mathematics of NAS of Belarus, Minsk,2Supreme Accreditation Committee of Republic of Belarus, Minsk,

31st City Clinical Hospital, Minsk, Belarus,4Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk

SummarуA general methodology of creating elasticity indices of arterial vessels has been worked out, which enables the specifi city

of vessel wall distensibility coeffi cients of various groups of patients to be taken into account as much as possible. Based on this methodology a new elasticity index of arteries of elderly persons has been obtained. This index possesses high reliability (independence on arterial pressure) at arterial hypertension. Moreover, it is revealed that under given particular conditions this methodology leads to the majority of the known parameters widely used when assessing the elasticity of arterial vessels.



Беларуси

32


УДК 611.314-018-08:616.314.17-008.1-091:599.238

Е. Л. КОЛБ, С. Л. КАБАК, С. Л. АНИЩЕНКО

ВЛИЯНИЕ МЕТОТРЕКСАТА НА ТЕЧЕНИЕ АПИКАЛЬНОГО ПЕРИОДОНТИТА У БЕЛОЙ КРЫСЫ: МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ



Введение. Апикальный периодонтит – одно из воспалительных заболеваний полости рта, те-чение и выраженность клинических проявлений которого в значительной степени зависят от общего состояния иммунной системы организма. Лечение апикального периодонтита направле-но на ликвидацию воспаления в периапикальной области, исключение патогенного влияния на организм одонтогенного воспалительного очага, стимулирование регенерации тканей периодон-та и восстановление функции зуба. Состояние иммунной системы пациента часто влияет на сте-пень выраженности воспалительных изменений периапикальных тканей зуба и во многом опре-деляет успех проводимого эндодонтического лечения. Одним из наиболее важных факторов, не-гативно влияющих на исход лечения апикального периодонтита, является снижение механизмов неспецифической резистентности организма и активности процессов регенерации тканей. Известно, что при подавлении иммунитета микроорганизмы, локализующиеся в ротовой поло-сти, легче проникают в соседние ткани, включая пульпу зуба [1, 2].

Цель настоящего исследования – установить морфологические особенности течения патоло-гического процесса в области верхушки корня зуба на фоне угнетения иммунной системы экспе-риментальных животных в результате введения метотрексата. Этот фармакологический препарат, антагонист фолиевой кислоты, является противоопухолевым средством группы антиметаболитов, которое наряду с противобластомным обладает также иммуносупрессивным действием [3].

Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 22 самцах беспородных белых крыс в возрасте 4 мес. массой от 250 до 320 г. Модель апикального периодонтита создава-ли путем вскрытия пульпарной полости первых моляров правой и левой половины нижней че-люсти. Все манипуляции проводили под общей анестезией путем внутрибрюшинного введения 1%-ного раствора тиопентала натрия в дозе 20 мг/кг массы тела. Для обеспечения адекватного доступа к первому моляру складки слизистой оболочки дна полости рта и язык отодвигали сер-повидной гладилкой. Препарирование твердых тканей зуба проводили стальными и твердо-сплавными шаровидными борами (размер № 1) с использованием портативного зубоврачебного аппарата «БЭС6-03М». Доступ содержимого ротовой полости к пульпарной камере зуба обеспе-чивали посредством разрушения окклюзионной поверхности коронки. Диагностическим крите-рием вскрытия полости зуба служило кровотечение из пульпы. Десяти крысам (опытная группа) через сутки после вскрытия пульпарной полости однократно внутрибрюшинно вводили мето-трексат в дозе 7,5 мг/кг массы тела животного. Группу сравнения (контрольную группу) соста-вили 12 белых крыс (24 зуба).

Животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинной инъекции летальной дозы тио-пентала натрия. Забор материала для гистологического исследования проводили на 7-е и 14-е сут-ки от начала эксперимента.

Сегменты нижней челюсти, включавшие зуб со вскрытой пульпарной полостью и два сосед-них интактных зуба, фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. После декаль-



Беларуси

33

цинации в 5%-ном растворе азотной кислоты материал заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 6 мкм, выполненные в мезиодистальном направлении, окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали при помощи светового микроскопа. Всего изучено 43 серии срезов зубов со вскрытой пульпарной полостью (24 зуба животных контрольной группы и 19 зубов крыс опытной группы).

Результаты и их обсуждение. Гистологическое исследование всех исследованных зубов по-казало, что их коронка была разрушена, а вскрытая пульпарная полость заполнена бесструктур-ными массами и остатками волокон растительного происхождения (пищевых продуктов). В кор-невой пульпе всех зубов отмечались некротические изменения различной степени выраженно-сти. На 7-е сутки у двух животных группы сравнения (4 зуба) после вскрытия пульпарной полости в корневой пульпе выявлялись очаги некроза на протяжении 2/3 длины корневых кана-лов. У трех крыс (6 зубов) очаги некроза в пульпе отмечались на всем протяжении корневого ка-нала. Определялась деструкция волокнистых структур и клеточных элементов пульпы, были видны фрагменты разрушенных ядер. Воспаление в тканях вокруг верхушки корня зуба у жи-вотных группы сравнения имело место в 100% случаев, причем выраженность воспалительных изменений зависела от срока наблюдения. На 7-е сутки вокруг верхушки корня зуба со вскрытой пульпарной полостью определялась полиморфноклеточная воспалительная инфильтрация с пре-обладанием сегментоядерных лейкоцитов (рис. 1). На 14-е сутки от начала эксперимента некроз пульпы наблюдался на всем протяжении корневых каналов, в том числе в добавочных корневых каналах, расположенных в дистальной трети корня, причем область некроза достигала апикаль-ного отверстия. В периодонтальной связке вблизи верхушки корня зуба определялся клеточный инфильтрат, в центре которого преобладали сегментоядерные лейкоциты, а по периферии – мо-нонуклеарные клеточные элементы и нежноволокнистые структуры, ориентированные парал-лельно границе периапикального очага воспаления.

У животных опытной группы через 7 сут от начала эксперимента коронковая пульпа полно-стью отсутствовала, в устьях корневых каналов локализовались колонии микроорганизмов. Кор-невая пульпа была некротизирована на всем про-тя жении каналов корня зуба. У двух крыс (3 зуба) множественные участки некроза и диа педез ные кровоизлияния определялись в перио дон тальной связке и тканях десны. Наблюдались на буха -ние и гомогенизация коллагеновых волокон пе-риодонтальной связки, а также полная резорбция аль веолярной кости, окружающей корень зуба. На месте межкорневых и межзубных перегоро-док обнаруживались изолированные фрагменты костной ткани с выраженными морфологически-ми признаками резорбции.

У двух животных (4 зуба) опытной группы через 7 сут после вскрытия пульпарной полости в области верхушки корня зуба выявлялась ради-кулярная киста (рис. 2, А). Полость кисты была связана с корневым каналом, а ее стенка состояла из грануляционной ткани, окруженной соедини-тельнотканной капсулой. Эпителиальная выстил-ка, представленная многослойным плоским не-ороговевающим эпителием, определялась на всем протяжении стенки кисты. Эпителиальные клет-ки располагались в 4–5 слоев и были ориентиро-ваны параллельно базальной мембране. В отдель-

Рис. 1. Область апикального отверстия после вскры-тия пульпарной полости у белой крысы контрольной группы: 1 − цемент корня зуба; 2 − пульпа; 3 − апи-кальное отверстие; 4 − лейкоцитарная инфильтрация периодонтальной связки; 5 − периодонтальная связка.

Окраска: гематоксилин-эозин. × 400

5



Беларуси

34

ных эпителиоцитах выявлялись вакуолизация ядер и конденсация хроматина в виде глыбок по периферии ядра. В полости кисты располагались лейкоцитарно-некротические массы и колонии микроорганизмов. Обращенные в полость кисты твердые ткани корня зуба (цемент и дентин) были подвержены резорбции. Цементные и цементно-дентинные ниши содержали некротические мас-сы, колонии микроорганизмов и сегментоядерные лейкоциты. В области периодонтальной связки определялись изолированные округлые островки эпителиальной ткани, представленные скоплени-ем клеток полигональной формы с базофильной цитоплазмой и гиперхромными округлыми или овальными ядрами (рис. 2, Б). По внешнему виду эти клетки можно классифицировать как остров-ки Малассе – остатки эпителиального корневого влагалища. В костной ткани вокруг очага пери-апикального воспаления отмечались выражен-ные признаки лакунарной резорбции.

На 14-е сутки наблюдения у всех животных опытной группы наблюдался некроз пульпы на всем протяжении корневого канала. Мор фо ло-гические изменения периодонта в области верху-шек зубов со вскрытой пульпарной полостью носили полиморфный характер. В то же время у одно го и того же животного морфологические изменения тканей периодонта в области обоих экспериментальных зубов были сходными. Так, периапикальная гранулема отмечена у одной кры-

сы (2 зуба), периодонтальный абсцесс – у двух (4 зуба), диффузное гнойное воспаление тканей периодонта – у одной (2 зуба), диффузное гнойное воспаление тканей периодонта и радикуляр-ная киста – у одной (2 зуба), некроз периодонтальной связки – у одной крысы (2 зуба). Периапикальные гранулемы, представлявшие собой очаг грануляционной ткани округлой фор-мы, окруженный тонкой соединительнотканной капсулой, локализовались как в области основ-ного, так и в области добавочных апикальных отверстий. В отличие от животных контрольной группы у крыс опытной группы в клеточном составе гранулем преобладали мононуклеарные элементы. В случае превалирования некротических изменений тканей в области верхушки зуба со вскрытой пульпарной полостью отмечалась деструкция периодонтальной связки и тканей десны, тканевой детрит был представлен гомогенными оксифильными массами с фрагментами ядер клеток.

У двух животных наряду с выраженными альтеративными изменениями определялась диф-фузная лейкоцитарная инфильтрация тканей периодонта без четких границ и соединительно-тканной капсулы по периферии (рис. 3). В непосредственной близости от цемента корня зуба прослеживались остатки подвергшихся деструкции коллагеновых волокон. У одной крысы в пе-риодонте по периферии радикулярной кисты отмечалась лейкоцитарная инфильтрация, за преде-лами которой определялись островки Малассе.

У двух животных на 14-е сутки после вскрытия полости зуба в тканях периодонта патомор-фологически определялись периодонтальные абсцессы, представленные скоплением большого количества сегментоядерных лейкоцитов и колоний микроорганизмов, отграниченных грануля-ционной тканью по периферии. Формирование периодонтального абсцесса сопровождалось ла-кунарной резорбцией цемента и дентина корня зуба (рис. 4). Морфологические признаки резорб-

Рис. 2. Радикулярная киста у белой крысы опытной группы: А – общий вид патологического образования (× 200); Б − эпителиальный островок Малассе (× 1000). 1 − цемент корня зуба; 2 − дентин корня; 3 − колонии микроорганизмов; 4 − лейкоцитарно-некротические массы; 5 − полость радикулярной кисты; 6 − эпите-лиальная выстилка; 7 − периодонтальная связка.

Окраска: гематоксилин-эозин

12

3

4

5

6

7

А

Б

Б



Беларуси

35

ции костной ткани стенки зубной альвеолы по периферии очага воспаления были выражены в значительной степени.

Известно, что применение иммунодепрессантов в эксперименте оказывает влияние на тече-ние воспалительного процесса в периапикальных тканях зуба. Так, по данным Nakamura и сотр. [4], метотрексат вызывает нейтропению, следствием которой является уменьшение количества нейтрофильных лейкоцитов в пульпе зуба. В результате развивается выраженный некроз пуль-пы и снижается вероятность формирования периапикального абсцесса. На фоне введения мето-трексата также удлиняются сроки образования воспалительного инфильтрата в периапикальных тканях [5]. Другой иммунодепрессант − циклоспорин, используемый для профилактики реакции отторжения при пересадке органов, ингибирует активность Т-лимфоцитов, которые обычно в большом количестве присутствуют в составе периапикального очага воспаления и играют важную роль в патогенезе апикального периодонтита [6]. После введения крысам циклоспорина размеры периапикального очага воспаления в период действия препарата уменьшаются, а после его отмены – увеличиваются [7].

Нами установлено, что после введения метотрексата альтеративные изменения в пульпе и появление структурно сформированного очага воспаления в апикальном периодонте у крыс опытной группы наступают раньше, чем у животных контрольной группы. На 14-е сутки по-сле вскрытия пульпарной полости вокруг верхушки корня зуба выявлялись признаки экссу-дативного гнойного воспаления диффузного или очагового (периодонтальный абсцесс) харак-тера. Это можно объяснить тем фактом, что метотрексат вызывает транзиторную лейкопе-нию, которая наиболее выражена через 7–10 сут после введения препарата. Спустя 14 сут показатели крови восстанавливаются. Интенсивную микробную инвазию и выраженный не-кроз пульпы после введения крысам метотрексата описывают Nakamura и др. [4]. Вместе

Рис. 3. Диффузная лейкоцитарная инфильтрация пе-риодонтальной связки у белой крысы опытной группы: 1 − цемент корня зуба; 2 − дентин корня; 3 − подвержен-ные деструкции коллагеновые волокна; 4 − лейкоцитар-ная инфильтрация периодонтальной связки. Окраска:

гематоксилин-эозин. × 400

Рис. 4. Периодонтальный абсцесс у белой крысы опыт-ной группы: 1 − цемент корня зуба; 2 − канал корня; 3 − области резорбции цемента корня; 4 − колонии микро-организмов за пределами апикального отверстия; 5 − пе-риодонтальный абсцесс; 6 − периодонтальная связка.

Окраска: гематоксилин-эозин. × 400



Беларуси

36

с тем Yamasaki и сотр. [5] отмечают, что использование в эксперименте данного препарата, вызывающего нейтропению, не изменяет морфологической картины периапикальных образо-ваний в тех случаях, когда он вводится после вскрытия пульпарной полости, но задерживает их появление при его назначении до начала эксперимента. С учетом данных Yamasaki и др. [8], которые доказали, что нейтрофилы защищают пульпу от бактериальной инвазии, неясно, по-чему в эксперименте при нейтропении происходит задержка сроков появления периапикаль-ного очага воспаления. Согласно полученным нами данным, на фоне введения метотрексата уже через 14 сут после вскрытия пульпарной полости микроорганизмы проникают в периапи-кальные ткани, что приводит к формированию периапикальных абсцессов. Сходная картина наблюдается у детей с синдром Костмана (врожденная нейтропения). У таких пациен тов тя-желые поражения тканей маргинального и апикального периодонта сопровождаются образо-ванием абсцессов [9–11], при этом поражения маргинального периодонта носят генерализо-ванный характер.

Данные литературы относительно влияния иммунодепрессантов на костную ткань неодно-значны. Del Pozo и Zapf [12] на экспериментальной модели ювенильного артрита у крыс показа-ли, что циклоспорин уменьшает степень резорбции костной ткани. По данным Orcel и др. [13], под действием препарата в телах позвонков крысы снижается количество остеокластов и воз-растает интенсивность процесса новообразования костной ткани. В то же время Movsowitz и сотр. [14] и Katz и сотр. [15] после введения циклоспорина наблюдали у крыс нарушение мета-болизма костной ткани и развитие остеопении, а Kawahara и сотр. [7] не обнаружили влияния иммуносупрессантов на строение нижней челюсти крысы. В нашем исследовании резорбция альвеолярной кости вокруг верхушки корня зуба выявлялась уже на 7-е сутки после вскрытия пульпарной полости. Этот процесс сопровождался формированием очага периапикального вос-паления в периодонтальной связке у животных двух сравниваемых групп. У крыс опытной группы нами обнаружена более выраженная деструкция костной ткани в составе стенки альве-олы зубов с периапикальным абсцессом. Это может быть связано с прямым действием мето-трексата на метаболизм костной ткани, однако не исключено, что быстрое разрушение кости вызвано прогрессированием воспалительного процесса в области верхушки корня зуба. Известно, что клетки, расположенные в области периапикального очага воспаления, выделяют в большом количестве провоспалительные цитокины (в частности, интерлейкин 1-α), кото-рые стимулируют остеокласты и способствуют деструкции костной ткани в стенке зубной альвеолы [6].

Заключение. Таким образом, на фоне введения метотрексата поражение пульпы и появление структурно сформированного очага воспаления в апикальном периодонте наступают раньше, чем в условиях нормальной неспецифической резистентности макроорганизма. В первые две не-дели эксперимента морфологические изменения периодонта в области верхушки корня зуба от-личаются полиморфизмом проявлений с преобладанием случаев диффузного гнойного воспале-ния тканей периодонта.


1. M u r r a y C. A., S a u n d e r s W. P. // Int. Endod. J. 2000. Vol. 33. P. 1−18.2. N e w m a n H. N. // J. Dent. Res. 1996. Vol. 75. P. 1912−1919.3. Х а р к е в и ч Д. А. Фармакология. М., 2008.4. N a k a m u r a K., Y a m a s a k i M., N i s h i g a k i N. et al. // J. Endod. 2002. Vol. 28. P. 287−290.5. Y a m a s a k i M., K u m a z a w a M., K o h s a k a T., N a k a m u r a H. // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 1994.

Vol. 77, N 6. P. 655−661. 6. S t a s h e n k o P., W a n g C. Y., T a n i - I s h i i N. et al. // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 1994. Vol. 78, N 4.

P. 494−502.7. K a w a h a r a T., M u r a k a m i S., N o i r i Y. et al. // J. Dent. Res. 2004. Vol. 83, N 9. P. 683−687. 8. Y a m a s a k i M., N a k a m u r a K., A m a n o K. et al. // Int. Endod. J. 2008. Vol. 41, N 7. P. 593−601.9. D e f r a i a E., M a r i n e l l i A. // J. Clin. Pediatr. Dent. 2001. Vol. 26, N 1. P. 99−102.10. T ö z ü m T. F., B e r k e r E., E r s o y F. et al. // Quintessence Int. 2003. Vol. 34, N 3. P. 221−226.



Беларуси

11. H a k k i S. S., A p r i k y a n A. A., Y i l d i r i m S. et al. // J. Periodontol. 2005. Vol. 76, N 5. P. 837−844.12. D e l P o z o E., Z a p f J. // Bone. 1994. Vol. 15. P. 625−628.13. O r c e l P., B i e l a k o f f J., M o d r o w s k i D. et al. // J. Bone Miner. Res. 1989. Vol. 4. P. 387−391.14. M o v s o w i t z C., E p s t e i n S., F a l l o n M. et al. // Endocrinology. 1988. Vol. 123. P. 2571−2577. 15. K a t z I., L i M., J o f f e I., S t e i n B. et al. // J. Bone Miner. Res. 1994. Vol. 9. P. 59−67.

E. L. KOLB, S. L. KABAK, S. L. ANISHCHENKO

METHOTREXATE INFLUENCE ON THE APICAL PERIODONTITIS COURSE IN WHITE RAT: MORPHOLOGICAL INVESTIGATION

Belarusian State Medical University, Minsk

Summary

The morphological features of a current pathologic process in the tissues surrounding the apex of the tooth root of ex-perimental animals in the course of the immune system depression have been studied. The research presents the data on the morphological changes in alveolar bone, periodontal ligament, cement and dentine of the white rat tooth in the case of acute and chronic apical periodontitis as a result of methotrexate administration.



Беларуси

38


УДК 616.832-002-097-018.46-089.843:576.314.6/7

Я. М. МОТУЗОВА1, А. С. ФЕДУЛОВ1, Д. Б. НИЖЕГОРОДОВА2, С. А. ГУЗОВ1, С. С. БАГАТКА2, М. Ю. ЮРКЕВИЧ2, М. А. ШПАКОВСКАЯ1,

Н. В. ЛАМОВСКАЯ2, М. М. ЗАФРАНСКАЯ2

ЭФФЕКТИВНОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО

АУТОИММУННОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

1 Белорусский государственный медицинский университет, Минск,2 Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск


Введение. Рассеянный склероз (РС) является мультифакториальным, аутоиммунным, хро-ническим, прогрессирующим заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), которое про-является рассеянной неврологической симптоматикой и в типичных случаях на ранних стадиях характеризуется ремиттирующим течением. При РС одновременно поражается несколько отде-лов нервной системы, что приводит к разнообразию неврологической симптоматики [1].

Несмотря на то что патогенез РС до сих пор окончательно не изучен, считается, что конеч-ный механизм заключается в аутоиммунной атаке против компонентов миелина. Дополнительные механизмы включают поражение аксонов в ЦНС и дегенеративный процесс, который, являясь, вероятно, результатом воспаления, приводит со временем к аккумуляции и необратимому по-вреждению [2].

Существующие в настоящее время методы лечения РС (как иммуносупрессивные, так и имму-номодулирующие), например с применением глатирамера ацетата и интерферонов, не всегда оказываются эффективными, а кроме того, использование указанных препаратов не приводит к излечиванию пациентов, а только снижает активность патологического процесса. При этом до-вольно значительная часть больных остаются резистентными к проводимой терапии [3].

Подобные неудовлетворительные результаты применяемых в настоящее время протоколов лечения при РС объясняются неполной эрадикацией Т- и В-лимфоцитов, действие которых на-правлено против нейральных антигенов. Поэтому актуальной задачей является разработка ин-новационных терапевтических подходов при РС. В частности, использование клеточных техно-логий может стать одним из патогенетически обоснованных решений для лечения РС.

В последние годы в качестве терапии при РС применяется высокодозная химиотерапия с под-держкой аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ВХТ + АуТГСК) [4]. Суть данной технологии лечения заключается в элиминации аутореактивных иммунных клеток посредством интенсивной иммуносупрессии с последующей полной иммунной рекон-ституцией за счет реинфузии гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Однако применение ВХТ, необходимой для иммуноаблации, сопровождается развитием ряда осложнений, а в ряде случаев – летальным исходом (1,3% случаев) [4].

В последние годы показана перспективность использования при РС трансплантации мезен-химальных стволовых клеток (ТМСК) [5–10], которая позволяет ремоделировать иммунную сист ему больных без применения режимов кондиционирования.

В силу своих биологических свойств МСК поддерживают рост гемопоэтических клеток-предшественников путем секреции некоторых гематопоэтических цитокинов (макрофагального



Беларуси

39

колониестимулирующего фактора (КОЕ-М), ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15; лейкемия-ингибирующего фактора), что объясняет сочетанное применение МСК и ГСК крови при аутоиммунных заболеваниях [11, 12].

Другой предпосылкой, указывающей на целесообразность применения МСК в качестве ко-трансплантата при введении ГСК после ВХТ, является способность МСК при прямом совместном культивировании с ГСК приводить к более выраженному иммуносупрессивному эффекту [13] и дифференцировке CD34 + ГСК в регуляторные дендритические клетки [14].

Таким образом, описанные свойства МСК указывают на перспективность их совместного использования с ГСК в качестве патогенетической терапии аутоиммунных демиелинизиру-ющих заболеваний ЦНС.

Тем не менее в литературе отсутствуют данные об эффективности ко-трансплантации МСК и ГСК после ВХТ, а также о сравнении эффективности и безопасности различных методик кле-точной терапии РС.

Общепризнанной моделью аутоиммунного демиелинизирующего заболевания ЦНС, которая широко используется во всем мире для оценки эффективности различных протоколов лечения, является экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) [15].

Цель нашего исследования – оценка эффективности и безопасности применения различных вариантов трансплантации МСК и ГСК на модели ЭАЭ.

Материалы и методы исследования. Индукция ЭАЭ. Для индукции ЭАЭ использовали ме-тод активной подкожной иммунизации животных (лабораторные крысы-самки линии Wistar массой 150–200 г) иммуногенной смесью, содержавшей гомогенат спинного мозга (ГСМ) в каче-стве иммуногена, в полном адъюванте Фрейнда (Sigma, Германия) [16].

Крыс иммунизировали иммуногенной смесью в объеме 300–400 мкл на животное, подкожно. Животным контрольной группы вводили аналогичную смесь, за исключением ГСМ.

Общее состояние и неврологический статус животных мониторировали ежедневно. После развития заболевания клиническую картину ЭАЭ оценивали по 6-балльной системе междуна-родных критериев (0 баллов – отсутствие симптомов; 0,5 балла – частичная потеря тонуса хво-ста, определяемая по неспособности дистального кончика завиваться; 1 балл – парез хвоста и/или незначительное изменение локомоторной функции; 2 балла – паралич хвоста и/или ухуд-шение локомоторной функции и/или атаксия; 2,5 балла – парез задних конечностей; 3 балла – па-ралич задних конечностей; 4 балла – полный паралич задних и парез передних конечностей; 5 баллов – паралич передних и задних конечностей, состояние агонии; 6 баллов – смерть).

Выделение и культивирование МСК. Для выделения МСК костный мозг вымывали из бе-дренной кости крыс фосфатно-буферным раствором PBS (Gibco, Германия) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (НИИЭиМ, Беларусь) и ресуспензировали. Выделение фракции мононуклеаров проводили путем центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Hypaque-Plus (Sigma, Германия). Клеточную суспензию дважды отмывали путем центрифугиро-вания в PBS с добавлением 5% ЭТС. Мононуклеары засевали на пластиковые чашки Петри для адгезивных культур с плотностью засева 1·106 клеток/см2 в полной культуральной среде, со-державшей DMEM-LG (Gibco, Германия), 10% ЭТС, 1% антибиотика-антимикотика и 2 мM L-глю та мина (Sigma, Германия) и культивировали при 37 °C и 5% CO2. Первую смену полной культуральной среды проводили через сутки после выделения клеток, а затем каждые 3 дня. Адге зи рованные к культуральному пластику клетки с фибробластоподобной морфологией куль-тивировали до достижения 80–90%-ной конфлюентности монослоя с последующим пересевом для получения последующих пассажей МСК. Аналогичную процедуру использовали для по лу-чения второго пассажа МСК. Для открепления МСК при проведении пассажей культур при-меняли 0,02%-ный раствор трипсина-ЭДТА (Gibco, Германия). Культуры МСК исследовали при помощи универсального инвертированного микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200 (Германия).

Полипотентность МСК подтверждали их дифференцировкой в адипо- и остеогенном направ-лениях в среде DMEM, содержавшей пониженный уровень (1000 мг/мл) глюкозы (Sigma, Германия), 10% ЭТС и следующие реагенты: дексаметазон (107 М), аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл), индо-метацин (50 мкг/мл) для адипогенной дифференцировки, дексаметазон (108 М), аскорбиновую



Беларуси

40

кислоту (50 мкг/мл), бетаглицерофосфат (10 мМ) (Sigma, Германия) для остеогенной дифферен-цировки. По истечении четырех недель культивирования в полученных средах культуры окра-шивали Oil Red и O Alizarin Red (Sigma, Германия) для подтверждения адипогенной и остеоген-ной дифференцировки соответственно.

Окрашивание МСК флуоресцентным красителем PKH26. Для изучения миграции МСК после их трансплантации в организм лабораторных животных использовали флуоресцентный краситель PKH26 с эмиссией 567 нм (Sigma, Германия). Для этого отмытые МСК, ресуспензиро-ванные в коммерческом буфере в концентрации 1·107 клеток/мл, окрашивали 4·10–6 М раствором PKH26 в общем объеме 2 мл и инкубировали в течение 5 мин в темноте при 25 оС. Реакцию окрашивания останавливали путем добавления равного объема ЭТС с последующим инкубиро-ванием в течение 1 мин. Окрашенные PKH26 МСК трижды отмывали в полной культуральной среде при 25 оС. Степень окрашивания МСК, оцениваемая методом проточной цитофлуориме-трии (FC500, Beckman Coulter, США), составила 99,7% PKH-позитивных клеток. Для трансплан-тации лабораторным животным окрашенные PKH26 МСК ресуспензировали в PBS и вводили в концентрации 1·106 клеток/мл на животное.

Протоколы лечения крыс с клинической картиной ЭАЭ. В зависимости от метода лече-ния все лабораторные животные с клиническими проявлениями ЭАЭ были разделены на че-тыре группы:

Первая группа (n = 14). На 12-й день после иммунизации животным вводили суспензию МСК в центральную вену хвоста в концентрации 1·106 МСК на крысу.

Вторая группа (n = 10). На 11-й день после иммунизации с целью иммуносупрессии живот-ным вводили циклофосфамид (ЦФ) в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно. На 12-й день проводили совместную трансплантацию МСК и ГСК в соотношении 1:20 в центральную вену хвоста.

Третья группа (n = 8). На 11-й день после иммунизации ЦФ вводили внутрибрюшинно в ука-занной выше дозировке. На следующий день ГСК в концентрации 2·107 трансплантировали в центральную вену хвоста животного.

Крысам контрольной группы (n = 4) с клиническими проявлениями ЭАЭ вводили 1 мл 0,9%-ного физиологического раствора в центральную вену хвоста.

Продолжительность эксперимента составила 42 дня (посттрансплантационный период – 30 дней). После этого животных умерщвляли путем введения тиопентала натрия.

Методика гистологического анализа образцов головного и спинного мозга лабораторных животных. Головной и спинной мозг животных исследуемых и контрольной групп фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. После этого выполняли срезы, начиная с лобных долей головного мозга, затем из проекции теменных и затылочных долей, ствола головного мозга и мозжечка, а также из проекции шейного и пояснично-крестцового утолщений спинного мозга, которые окрашивали гематоксилин-эозином, по Клювер-Барреру (в модификации Вик торова) и MSB.

Наличие воспаления оценивали по 3-балльной шкале: 0 баллов – отсутствие воспаления; 1 балл – наличие небольшого количества воспалительных клеток; 2 балла – образование перива-скулярных инфильтратов; 3 балла – обширное образование скоплений лейкоцитов вокруг крове-носных сосудов с распространением этих клеток в близлежащие ткани. Оценку выраженности демиелинизации проводили согласно 3-бальной шкале: 0 баллов – отсутствие демиелинизации; 0,5 балла – вакуольное набухание миелина; 1 балл – редкие очаги демиелинизации; 2 балла – не-большая область демиелинизации; 3 балла – большая (конфлюэнтная) область демиелинизации.

Для приготовления гистологических образцов органов лабораторных крыс первой и второй групп, которым вводили PKH-окрашенные МСК, головной и спинной мозг, а также внутренние органы (селезенки, лимфатических узлов, печени, почек) подвергали криоконсервации в жидком азоте. Криосрезы толщиной 4 мк высушивали при комнатной температуре и исследовали с по-мощью флуоресцентной микроскопии (Carl Zeiss Axiovert 200, Германия).

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью про-граммы Statistica 6.0. Достоверность различий определяли непараметрическим критерием Ман-на–Уитни (в случае независимых переменных). Результаты считали достоверными при уровне зна-чимости P < 0,05. Полученные данные представлены как медиана (25–75-й процентиль).



Беларуси

41

Результаты и их обсуждение. Характеристика куль-тур МСК. Клеточные культуры МСК КМ ранних пасса-жей характеризовались веретеновидной, фибробластопо-добной морфологией (рис. 1). В процессе роста МСК кост-ного мозга формировали колонии, которые сливались по мере увеличения количества клеток, в результате чего МСК образовывали монослой, полностью покрывавший поверхность культурального пластика (состояние конф-люэнтности).

Динамика клинической картины ЭАЭ после лечения. До 11-го дня после проведения иммунизации у крыс всех исследуемых и контрольной групп не было выявлено ста-тистически значимых различий по выраженности невро-логической симптоматики.

На рис. 2 представлена динамика клинической картины у исследуемых лабораторных животных. Клиническая картина ЭАЭ у крыс контрольной группы характеризовалась неуклонным про-

грессированием заболевания, что привело к гибели всех животных на 14-е сутки после модели-рования ЭАЭ.

Согласно протоколам лечения, у экспериментальных крыс по сравнению с животными контрольной группы отмечался значимый регресс неврологической симптоматики уже на-чиная с первых суток от начала терапии (P < 0,05). У крыс всех групп, которые получали лечение, наблюдалось отсутствие рецидивов заболевания в течение 30 сут после введения стволовых клеток.

У животных первой группы уже на следующий день после введения МСК отмечалось умень-шение выраженности неврологической симптоматики, а на 14-е сутки после введения МСК у всех крыс наблюдалось полное восстановление оцениваемых неврологических функций, что сопровождалось отсутствием рецидивов в течение последующего периода наблюдения.

У животных второй группы после введения ЦФ и МСК + ГСК течение заболевания стабили-зировалось с последующим регрессом неврологической симптоматики, начиная с первых суток после трансплантации, что сопровождалось полным восстановлением неврологического дефи-цита на 8-е сутки после введения стволовых клеток и отсутствием активности процесса в тече-ние всего периода наблюдения.

Рис. 1. Культура МСК костного мозга кры-сы, первый пассаж, 7-е сутки культивирова-

ния (× 100)

Рис. 2. Динамика клинической картины у лабораторных животных с ЭАЭ исследуемых и контрольной групп



Беларуси

42

У животных третьей группы, которым вводили только ГСК после ЦФ, отмечалась стойкая стабилизация неврологического статуса в течение 6 сут после трансплантации ГСК с постепен-ным регрессом неврологической симптоматики и полным восстановлением на 13-е сутки.

При сравнении эффективности примененных схем лечения в отношении восстановления не-врологического дефицита статистически значимых различий не выявлено. Тем не менее у лабо-раторных животных, получавших ЦФ с последующим совместным введением ГСК и МСК, от-мечалось более раннее восстановление неврологической симтоматики (8-е сутки после транс-плантации) по сравнению с лабораторными животными, получавшими МСК (14-е сутки после трансплантации) и ЦФ + ГСК (13-е сутки после трансплантации).

Трансплантация стволовых клеток сопровождалась различным уровнем летальности. Так, применение ВХТ (ЦФ), необходимой для иммуноаблации, сопровождалось самым высоким (75%) уровнем летальности в группе ЦФ + ГСК, однако применение МСК в качестве ко-транс-плантанта при ЦФ + ГСК + МСК характеризовалось выраженным снижением (до 20%) уровня летальности, что может объясняться протективным эффектом МСК за счет возможной экспрес-сии регуляторных молекул и трофического воздействия, которые способствуют выживаемости клеток. Летальность в группе МСК составила 28,6%.

Гистологический анализ образцов головного и спинного мозга лабораторных животных с клинической картиной ЭАЭ. Эффективность применения используемых протоколов лечения в отношении восстановления неврологической функции по сравнению с таковой в контрольной группе подтверждалась уменьшением воспалительной реакции, а также степенью демиелиниза-ции (табл. 1, 2).

Т а б л и ц а 1. Выраженность воспалительной реакции в головном и спинном мозге лабораторных животных с клинической картиной ЭАЭ, балл

ГруппаОбласть спинного мозга Доли головного мозга

Ствол головного мозга и мозжечокшейное утолщение пояснично-крестцовое

утолщение лобные теменные и затылочные

Контрольная 3 (3–3) 3 (3–3) 2,5 (2–3) 2,5 (2–3) 2,5 (2–3)МСК 0,5 (0–1)** 0,5 (0–1)** 0 (0–0,5)** 0 (0–0,5)** 0,5 (0–1)**ЦФ + МСК + ГСК 0 (0–0)** 0 (0–0)** 0 (0–1)** 0 (0-0)** 0 (0–0)**ЦФ + ГСК 0 (0–0)** 0 (0–0)** 0 (0–0)** 0 (0–0)** 0 (0–1)**

П р и м е ч а н и е. Результаты представлены в виде Ме (25–75-й процентиль). Достоверность (** – Р < 0,01) указана по отношению к выраженности воспалительной реакции в головном и спинном мозге крыс контрольной группы.

Т а б л и ц а 2. Выраженность демиелинизации в головном и спинном мозге лабораторных животных с клинической картиной ЭАЭ, балл

ГруппаОбласть спинного мозга Доли головного мозга

Ствол головного мозга и мозжечокшейное утолщение пояснично-крестцовое

утолщение лобные теменные и затылочные

Контрольная 3 (3–3) 3 (3–3) 2,5 (2–3) 2,5 (2–3)** 3 (3–3)**МСК 0,75 (0,25–1)** 0,5 (0,25–0,75)** 0 (0–0)** 0 (0–0)** 0 (0–0)**ЦФ + МСК + ГСК 1 (1–2)** 1 (1–1)** 0 (0–0)** 0 (0–0)** 0 (0–0)**ЦФ + ГСК 2 (1–2)** 1 (1–2)** 0 (0–1)** 0 (0–1)** 1 (1–2)**

П р и м е ч а н и е. Результаты представлены в виде Ме (25–75-й процентиль). Достоверность (** – Р < 0,01) указана по отношению к выраженности демиелинизации в головном и спинном мозге крыс контрольной группы.

На рис. 3 представлены гистологические срезы шейного утолщения спинного мозга живот-ных исследуемых групп.

Как видно из рис. 3, только у крыс контрольной группы выявлялась выраженная воспа ли-тельно-сосудистая реакция с образованием периваскулярных инфильтратов из лимфогистиоци-тов и моноцитов. Вокруг сосудов с воспалительно-сосудистой реакцией отмечалось наиболее заметное поражение нейронов, что проявлялось тяжелыми дистрофическими изменениями (вы-



Беларуси

43

раженный хроматолиз, тигролиз, кариолизис и кариорексис), формированием клеточных тяжей, явлениями саттелитоза и нейронофагии (рис. 3, а).

У животных группы ЦФ + ГСК васкулитов в спинном и головном мозге не выявлено, однако отмечалась незначительная демиелинизация (рис. 3, б).

Патоморфологический анализ спинного мозга лабораторных животных первой и второй групп обнаружил отсутствие васкулитов либо наличие небольшого количества воспалительных клеток, а также отсутствие демиелинизации (рис. 3, в, г).

В табл. 1, 2 представлены обобщенные результаты выраженности воспалительной реакции и демиелинизации в головном и спинном мозге лабораторных животных исследуемых групп, вы-раженные в баллах.

Таким образом, при гистологическом анализе образцов головного и спинного мозга лабора-торных крыс с клинической картиной ЭАЭ статистически значимых различий между животны-ми, получавшими лечение, не выявлено, что указывает на равнозначную эффективность разных схем клеточной терапии в отношении подавления воспалительной реакции и купирования про-цесса демиелинизации при ЭАЭ.

Миграция МСК после трансплантации. Несмотря на проводимые исследования функцио-нальных свойств МСК [10–15], до сих пор дискутируется вопрос о способности МСК мигриро-вать в ЦНС по их последующей нейротрансдифференцировке. Для изучения миграции МСК лабораторным животным первой и второй групп рандомно вводили МСК, окрашенные флуо-ресцентным красителем PKH26 (red fl uorescence; Sigma-Aldrich) согласно описанной выше методике. Животных выводили из эксперимента на 30-е сутки после транспланатации. Исследовали замороженные срезы селезенки, лимфатических узлов, печени, почек, спинного и головного мозга.

При помощи иммунофлуоресцентного анализа замороженных срезов спинного и головного мозга было обнаружено наличие PKH26-позитивных МСК в ЦНС, хотя их количество не позво-

Рис. 3. Шейное утолщение спинного мозга крыс, окраска по Клювер-Бареру: а – контрольная группа (стрелками по-казаны выраженные васкулиты и некрозы) (× 2,5); б – после ЦФ+ГСК (отсутствие васкулитов, незначительное побледне-ние миелина задних столбов) (× 2,5); в – после трансплантации МСК (отсутствие демиелинизации и васкулитов) (× 2,5);

г – после ЦФ+ГСК+МСК (отсутствие демиелинизации и васкулитов) (× 2,5)



Беларуси

44

ляет категорически утверждать, что они способны оказывать существенное влияние на нейроре-генерацию. Следует отметить, что нельзя исключить более выраженную колонизацию ЦНС ме-зенхимальными стволовыми клетками с последующей нейротрансдифференцировкой в более поздние сроки после трансплантации, поскольку в нашем случае период наблюдения после вве-дения МСК составил 30 сут.

Другим возможным объяснением полученных результатов могут служить данные итальян-ских исследователей [17]. Они сравнили миграционные способности МСК, полученных из костного мозга и жировой ткани лабораторных животных, и показали способность только МСК жировой ткани экспрессировать CD49d (α4-интегрин), который формирует гетероди-меры с CD49, приводя к поздней активации антигена-4 (VLA-4). Данные результаты пред-ставляют особый интерес, поскольку свидетельствуют о ключевой роли взаимодействую-щих между собой VLA-4 и эндотелиальных сосудистых молекул адгезии (VCAM-1) в мигра-ции клеток в ЦНС на фоне активного иммунного воспаления при РС и ЭАЭ. Таким образом, только МСК жировой ткани экспрессируют активированный α4-интегрин и за счет этого способны проникать в ЦНС при РС. В связи с этим необходимо дальнейшее исследование эффективности различных способов введения стволовых клеток (внутривенное, интрате-кальное, внутрижелудочковое), а также различных источников стволовых клеток (костный мозг, жировая ткань).

Наиболее выраженный пик флуоресценции окрашенных МСК был обнаружен в селезенке и лимфатических узлах на 30-е сутки после трансплантации, что указывает на повышенную ми-грацию данных клеток в периферические лимфоидные органы. В печени наблюдалось лишь не-значительное количество PKH26-позитивных МСК. В почках МСК не обнаружены.

Заключение. Терапевтический эффект МСК при ЭАЭ заключается, главным образом, в мо-дуляции аутоиммунной реакции. Нами показано, что МСК оказывают протективный эффект при ко-трансплантации с ГСК после ВХТ, значительно снижая частоту осложнений и летальных исходов по сравнению с этими показателями после применения только ГСК.

Прямых доказательств регенерации пораженных нейронов и олигодендроцитов не выяв-лено, однако, учитывая терапевтический потенциал МСК, необходимо изучить другие воз-можные (интратекальные) способы введения МСК костного мозга либо МСК, полученных из жировой ткани.

Таким образом, использование всех трех протоколов лечения является эффективным при лечении ЭАЭ, особенно на ранних стадиях, когда аутоимунная реакция играет ключевую роль в развитии заболевания. Однако в результате применения ко-трансплантации МСК и ГСК после высокодозной химиотерапии отмечается наиболее низкая частота осложнений и летальных исходов, что приводит к улучшению клинической картины ЭАЭ на более ран-ней стадии заболевания.

Исследования были выполнены при финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований.


1. W e i n s h e n k e r B. G. // Neurol. Clin. 1995. N 3. P. 119–146.2. S t e i n m a n L. // Nat. Immunol. 2001. Vol. 9, N 2. P. 762–764.3. B o s t e r A., E d a n G., F r o h m a n E. et al. // Lancet Neurol. 2008. N 7. P. 173–183.4. M a n c a r d i G. L., S a c c a r d i R. // Lancet Neurol. 2008. N 7. P. 626–666.5. K r a m p e r a M., P a s i n i A., P i z z o l o G. et al. // Curr. Opin. Pharmacol. 2006. N 6. P. 435–441.6. L e B l a n c K., T a m m i k K., S u n d b e r g B. et al. // Scand. J. Immunol. 2003. N 57. P. 11–20.7. Z a p p i a E., C a s a z z a S., P e d e m o n t e E. et al. // Blood. 2005. N 106. P. 1755–1761.8. Z h a n g J., L i Y., C h e n J. et al. // Exp. Neurol. 2005. N 195. P. 16–26.9. G e r d o n i E., G a l l o B., C a s a z z a S. et al. // Ann. Neurol. 2007. Vol. 3, N 61. P. 219–227.10. C r i g l e r L. et al. // Exp. Neurol. 2006. N 198. P. 54–64.11. L u k o m s k a B. // Transplant. Proc. 2001. N 33. P. 1757.12. M a j u m d a r M. // J. Hematother. Stem Cell Res. 2000. N 9. P. 841–848.13. T o u b a i T., P a c z e s n y S., S h o n o Y. et al. // Curr. Stem Cell Res. Ther. 2009. N 4. P. 252–259.



Беларуси

14. L i Y. P., P a c z e s n y S., L a u r e t E. et al. // J. Immunol. 2008. N 3. P. 1598–1608.15. G o l d R. // Brain. 2006. N 10. P. 1–19.16. Н и ж е г о р о д о в а Д. Б., К о л о б о в а М. Ю., Б а г а т к а С. С. и др. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. на-

вук. 2009. № 3. C. 75–81.17. C o n s t a n t i n G., M a r c o n i S., R o s s i B. et al. // Stem Cells. 2009. N 27. P. 2624–2635.

Y. M. MOTUZOVA1, A. S. FEDULOV1, D. B. NIZHEHARODOVA2, S. A. GUZOV1, S. S. BAGATKA2, M. Y. YURKEVICH2, M. A. SHPAKOVSKAYA1, N. V. LAMOVSKAYA2, M. M. ZAFRANSKAYA2

EFFICACY AND SAFETY OF STEM CELL TRANSPLANTATION IN THE MODEL OF EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE ENCEPHALOMYELITIS

1Belarusian State Medical University, Minsk, 2Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk

Summary

We have compared the effi cacy and the safety of various protocols of mesenchymal (MCS) and haematopoietic (HSC) stem cells in the model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Our results show that the use of the exam-ined protocols is effective in the EAE treatment. But the use of MSC and HSC co-transplantation after high-dose immuno-suppression demonstrates the lowest morbidity and mortality rate and ameliorates the clinical course of EAE at the earliest disease stage.



Беларуси

46


УДК 615.212.7: 543.544.5

О. М. ВЕРГУН1, В. Э. СЯХОВИЧ2, А. И. ХОМЕНКО2

КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАРКОТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ – МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

В ДОПИНГ-КОНТРОЛЕ

1Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск,2Национальная антидопинговая лаборатория, Минск


Введение. В настоящее время в Беларуси, как и во многих других странах, одним из обяза-тельных требований при проведении исследований употребления наркотических веществ стано-вится использование валидированных высокоспецифичных аналитических методов [1–11]. На сегодняшний день используемые в клинико-диагностических и химико-токсикологических ла-бораториях тест-системы позволяют эффективно осуществлять качественные, полуколиче-ственные и количественные исследования, однако они не обладают 100%-ной диагностической точностью, специфичностью и чувствительностью [12].

Основной задачей организованной в 2007 г. в Республике Беларусь Национальной антидо-пинговой лаборатории является создание обширной методологической базы для определения широкого спектра запрещенных для применения в спорте веществ, в том числе и наркотических соединений. Следует отметить, что в практике Всемирного антидопингового агентства (ВАДА) для большинства таких соединений допускаются полуколичественные методы определения, что связано с экзогенностью многих лекарственных препаратов и отсутствием разрешенной ниж-ней границы содержания этих веществ. В то же время повышенные требования предъявляют-ся к селективности разрабатываемых методов. Любой ложноположительный результат при анализе пробы имеет значительные социальные и психологические последствия для спортсме-на, а кроме того, может привести к аннулированию лицензии соответствующей антидопинго-вой лаборатории [13, 14].

Методом, обладающим не только высокой прецизионностью и крайне низким пределом об-наружения, но и высокой степенью специфичности к определяемым соединениям, является вы-сокоэффективная жидкостная хроматография – масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС) [15, 16].

Цель работы – разработка и валидация метода определения ряда распространенных нарко-тических веществ (морфина, метадона, оксикодона, пентазоцина, фентанила и петидина) пу-тем предварительного извлечения данных соединений из биологического образца (мочи) с по-мощью жидко-жидкостной экстракции с использованием тандемной ВЭЖХ-МС (ВЭЖХ-МС-МС) [17, 18].

Материалы и методы исследования. В работе использовали стандарты наркотических сое-динений морфина, метадона, оксикодона, пентазоцина, фентанила (Cerilliant, Германия) и пе-тидина (British Parmacopoeia Commission Laboratory, Великобритания), а в качестве внутрен-него стандарта – мефрузид (LGC Standards, Германия). При проведении жидко-жидкостной экстракции использовали диэтиловый эфир, Na2SO4, KH2PO4 и KOH (Fluka, США), Na2HPO4 (RdH, США). Основными компонентами буферных растворов при хромато-масс-спект ро мет-рических исследованиях служили ацетонитрил (Lab-Scan, Польша), CH3COONH4 и CH3COOH (Fluka, США).



Беларуси

47

Все растворы готовили на деионизированной воде Milli Q (Millipore, США), растворы для ЖХ-МС дополнительно фильтровали с применением системы для фильтрации и дегазации рас-творителей (Wilmad-LabGlass, США) через фильтр размером пор 0,45 мкм из регенерированной целлюлозы (Whatman, Великобритания). Перед вводом в хроматограф все образцы фильтровали с помощью шприцевых фильтров Iso-Disc PTFE-13-2 (Supelco, США).

Для приготовления реферес-образцов использовали мочу доноров, заведомо не содержав-шую наркотических веществ.

Подготовку образцов осуществляли методом жидкостной экстракции, используя диэтило-вый эфир при нейтральном и щелочном значениях рН и безводный сульфат натрия для удаления воды из аликвот. В каждый образец предварительно добавляли мефрузид (внутренний стандарт) в конечной концентрации 100 нг/мл, а в исследуемые образцы – стандарты морфина, метадона, оксикодона, пентазоцина, фентанила и петидина в той же концентрации [19]. Дополнительно проводили разрушение глюкуроновых конъюгатов определяемых соединений путем их инкуба-ции в течение 40 мин с β-глюкуронидазой E. coli (Roche, Швейцария) в калий-натрий фосфатном буфере, рН 6,4, при температуре 56 °С. Полученные в результате экстракции объединенные эфирные вытяжки выпаривали досуха в потоке азота, а затем растворяли в 200 мкл хроматогра-фического раствора (элюента).

Хромато-масс-спектрометрический анализ осуществляли с использованием жидкостного хроматографа Surveyor Plus (Thermo Fisher Scientifi c, США) с гибридным масс-спектроме три-чес ким детектором LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Fisher Scientifi c, США) с линейной квадруполь-ной и орбитальной ловушками высокого разрешения. Хроматографическое разделение наркотиче-ских соединений проводили на обращенно-фазной колонке Thermo BDS Hypersil C18 (150 × 2,1 мм) в 1 мМ аммоний ацетатном буфере, рН 3,5, с градиентом ацетонитрила от 15 до 85%. Скорость элюирования составляла 0,25 мл/мин. Состояние системы и выход анализируемых веществ до-полнительно контролировали с помощью диодно-матричного детектора Surveyor PDA Plus Detector (Thermo Fisher Scientifi c, США).

Ионизацию образца проводили путем электрораспыления с использованием источника ESI Ion Max в режиме положительной ионизации (за исключением внутреннего стандарта – меф-рузида) в потоке азота 0,45 л/мин с потенциалом на капилляре распыления 5 кВ и температурой на проводящем капилляре источника 350 °С. Детекцию осуществляли в режиме полного скани-рования в диапазоне от 100 до 800 m/z (отношение массы к заряду) с интервалом 0,1 с, а также в режиме селективного мониторинга реакции (selected reaction monitoring, SRM). В последнем случае проводили поиск материнских ионов с определенным значением m/z, а также с характер-ным распадом на дочерние ионы при столкновении с атомами коллизионного газа (гелия) при определенной энергии деградации, частоте RF и времени воздействия.

Испытуемые растворы, холостой раствор и растворы сравнения анализировали в описанных выше условиях, получая по одной хроматограмме. В дальнейшем обработку результатов прово-дили с помощью программного обеспечения XCalibur (Thermo Fisher Scientifi c, США) [20, 21].

Как отмечалось выше, важнейшей особенностью используемого нами метода является высо-кая специфичность определения целевых соединений, что достигается за счет учета как хрома-тографических, так и масс-спектрометрических характеристик рассматриваемых соединений [22]. К первому типу параметров относится время удерживания данного соединения, относительное значение которого является более или менее постоянной величиной при соблюдении основных условий хроматографирования: типа колонки (вплоть до использования строго определенного производителя), типа элюента, скорости потока, температуры разделения. Допол ни тельная кор-ректировка времени удерживания при конкретном анализе осуществляется с использованием реферес-проб, содержащих стандарты определяемых соединений [23]. Причем в соответствии с требованиями Всемирного антидопингового агентства допустимые отклонения времени удер-живания соединения в рефересной и изучаемой пробе не могут превышать 2%, либо 0,1 мин, что является довольно жестким ограничением [24].

Результаты и их обсуждение. На рис. 1–3 показаны хроматораммы разделения рассматри-ваемых наркотических соединений (морфина, метадона, фентанила, оксикодона, пентазоцина



Беларуси

48

Рис. 1. Вид хроматограмм и масс-спектров (МС-МС) морфина и метадона

Рис. 2. Вид хроматограмм и масс-спектров (МС-МС) пентазоцина и петидина



Беларуси

49

и петидина). К масс-спектрометрическим характеристикам в первую очередь относится показа-тель m/z и время удерживания иона определяемого нами соединения (верхняя часть рисунков), полученное при определенном режиме ионизации (положительном либо отрицательном). Сле-дующим параметром является показатель m/z дочерних ионов (и их соотношение), образующих-ся при тандемной масс-спектрометрии (МС-МС, МС2 в режиме селективного мониторинга реак-ции) за счет разрушения материнского иона (нижняя часть рисунков) при определенных значениях коллизионной энергии (энергии, необходимой для расщепления материнского иона), RF частоты, времени воздействия [8, 9].

Как следует из данных, полученных при валидации разработанного нами метода и касаю-щиеся воспроизводимости времени удерживания шести рассматриваемых наркотиков (табл. 1), для всех веществ выполняются требования критериев приемлемости: разница времени удержи-вания не превышает 2%, а относительное стандартное отклонение времени удерживания опре-деляемых веществ при анализе трех проб не превышает 1%. Это означает, что у каждого веще-ства строго определенное время удерживания (время выхода пика на хроматограмме) и свои ха-рактеристические ионы, даже если пики перекрываются.

Т а б л и ц а 1. Сравнение времени удерживания веществ при анализе ВЖЭХ-МС

Вещество Относительное стандартное отклонение, % Разница во времени удерживания, %

Морфин 0,46 0,02Оксикодон 0,19 0,93Петидин 0,38 0,28Пентазоцин 0,36 0,27Метадон 0,09 0,10Фентанил 0,17 0,36

Рис. 3. Вид хроматограмм и масс-спектров (МС-МС) фентанила и оксикодона



Беларуси

50

При использовании других методов возможно получение только материнских ионов. По след-ние могут быть похожи, как в случае с морфином и пентазоцином (материнский ион 286) (табл. 2), поэтому их идентификация затруднена. При использовании предлагаемого метода сочетание хроматографического времени удерживания и значений показателя m/z материнского и дочер-них ионов при тандемной масс-спектрометрии, а также их соотношение дают высокую сте-пень специфичности идентификации рассматриваемых наркотических соединений. В табл. 2 приведена суммарная информация по характеристике соединений, рассматриваемых по дан-ной методике. Следует отметить, что при использовании масс-спектрометра с линейной ква-друпольной ловушкой (LTQ XL) или гибридного масс-спектрометра линейная квадрупольная ловушка – орбитальная ловушка высокого разрешения (LTQ Orbitrap Discovery) позволяет практически полностью исключить риск ложноположительного результата. Это обусловлено тем, что линейные ловушки производят фрагментацию ионов во времени, а кроме того, спо-собны осуществлять последовательное программированное разрушение дочерних ионов рас-сматриваемого соединения (МС3, МС4...МС10). Полученные при этом дочерние ионы второго, третьего и других порядков, являясь строго специфичными для конкретного соединения, по-зволяют не только составить полный «отпечаток» данного соединения, но и с использованием масс-спектрометрических данных о различных его фрагментах предсказать возможные мо-лекулярную и структурную формулы. Отрицательным моментом в этом подходе является необходимость содержания значительного количества анализируемого вещества в пробе. Согласно нашим расчетам, для подтверждения вида наркотического соединения достаточно проведения дополнительного анализа с применением только МС3. Получение дочерних ио-нов второго порядка особенно важно при определении содержания метадона, пентазоцина, оксикодона и фентанила, когда обычная тандемная масс-спектрометрия дает только один до-черний ион (табл. 2, рис. 1–3), что в соответствии с требованиями ВАДА является крайне нежелательным [24].

Т а б л и ц а 2. Относительное время удерживания и характеристические ионы определяемых веществ

Вещество Относит. время удерживания

Коллизионная энергия

Материнский ион, m/z

Характеристические до черние ионы, m/z

Относительные интенсивности характеристических ионов, %

Морфин 0,11 +19 286,1 201,2 229,2 268 ,2 100:50:40Оксикодон 0,58 +19 316,3 – – 298,1 100:20Мефрузид 1,00 –20 381,0 – 317,0 345,0 50:100:80Петидин 1,07 +27 248,3 174,1 202,1 220,1 50:10:100:40Пентазоцин 1,17 +25 286,3 – – 216,2 100:35Метадон 1,74 +19 310,3 – – 265,1 100:40Фентанил 1,60 –19 264,3 – – 246,3 69:100:56

В этих случаях существенную помощь оказывают орбитальные ловушки высокого раз-решения. LTQ Orbitrap Discovery позволяет определить с точностью 5 ppm молекулярные массы как материнских, так и дочерних ионов после МС2 и МС3 масс-спектрометрии. Это дает возможность отсеять элементы матрицы с близкой молекулярной массой, а также одно-значно определить для искомого соединения его элементный состав (молекулярную форму-лу). Одновременно данный масс-спектрометр высокого разрешения позволяет значительно повысить чувствительность определения (до десятков пикограмм вещества) и снизить влия-ние шума.

Разработанная нами методика была валидирована в соответствии с ГОСТ 8.010-99. Проведена оценка таких параметров, как специфичность, чувствительность, стабильность, воспроизводи-мость. Для проверки степени извлечения повторяемость была оценена по результатам повтор-ных анализов шести испытуемых растворов. Как следует из данных, представленных в табл. 3, относительное стандартное отклонение отношений площадей пиков трех измерений не превы-шает 15% для всех определяемых веществ. Следует также отметить, что в процессе разработки методики и ее валидации производили расчет степени извлечения веществ, хотя в случае каче-



Беларуси

51

ственной методики это не обязательно. Более того, высокая степень концентрирования пробы в процессе жидкостной экстракции и значительная чувствительность метода позволяют эффек-тивно идентифицировать наркотические соединения даже при степени экстракции в несколько процентов. Для всех анализируемых веществ, кроме оксикодона и фентанила, рассматриваемый показатель составляет более 50% (табл. 3).

Т а б л и ц а 3. Итоговые результаты определения степени извлечения веществ

Вещество Степень извлечения вещ ества, % ОСО отношения пиков вещества и внутрен него стандарта (n = 3), %

Морфин 51 5,0Метадон 90 14,2Оксикодон 25 10,1Пентазоцин 85 8,8Петидин 77 14,4Фентанил 47 4,51

П р и м е ч а н и е. ОСО – относительное стандартное отклонение.

Заключение. Разработанная нами методика качественного определения ряда важнейших нар-котических соединений с применением жидкостной хромато-масс-спектрометрии отличается от используемых ранее более высокой диагностической чувствительностью и специфичностью.

Предлагаемая методика может использоваться как в допинг-контроле, так и в химико-токсикологическом анализе при проведении экспертизы употребления наркотиков, а также для подтверждения наличия низких концентраций наркотических веществ в биологических жидко-стях человеческого организма.


1. Ж д а н о в а В. В. Критерии оценки методов исследования. Совершенствование качества работы клинико-диагностических лабораторий: метод. пос обие. Кольцово, 1999. С. 1– 5.

2. СТБ 50.01-2000: Система аккредитации Р еспублики Беларусь. Основные положения.3. СТБ 8003-93: Система обеспеч ения единства измерений Республики Беларусь.4. СТБ 8004-93: Система обеспечения единства измерений Республики Бела русь. Метрологическая аттестация

средств измерений.5. СТБ 8005-2000: Система обеспечения единства измерений Р еспублики Беларусь. Стандартные образцы.

Основные положения.6. СТБ 8014-2000: Система обеспечения единс тва измерений Республики Бела русь. Калибровка средств измере-

ний. Организация и порядок проведения.7. СТБ 941.6-2000: Система аккредитации поверочных и испытательных лабораторий Республики Беларусь.

Межлабораторные сличения. Требования к программам, порядку их реализации. 8. ICH Q2A: Validation of Analytical Methods: Defi nitions and Terminology // Dir. 75/318/EEC. Nov. 1994.9. ICH Q2B: Validation of analytical procedures: Methodology // International Conference for the Registration of Pharma-

ceuticals for Human Use. Geneva, 1996. 10. Validation of compendial methods. General Chapter <1225>: United States Pharmacopoeia XXIII. National For mu-

lary, XVIII, Rockville, MD. The United States Pharmacopeial Convention. 1995. Р. 1710–1712.11. Производство лекарственных средств. Валидация. Основные положения: метод. указания. М., 2001.12. М а с я г о А. В. // Новости «Вектор-Бест». 2004. № 1.13. Всемирный антид опинговый кодекс (World Anti-Doping Code). 2009.14. Международный стандарт для лабораторий Всемирного Антидопингового Агентства // International Standard

for Laboratories, Version 6.0. Jan. 2009, WADA.15. F i r e s t o n e M., G o l d m a n B., F i s c h e r B. // Inter. J. of Drug Policy. 2008. [El. res. www.sciencedirect.com.

27.01.2010].16. S z e p e z i M. // J. Chromatogrаphy. Vol. 464. Р. 265–278.17. Л и с о в и к Ж. А., Б е л о в а М. В., И л ь я ш е н к о К. К. и др. // Токсиколог. вестн. 2008. № 5. 18. Л и с о в и к Ж. А., Л е ж е н и н а Н. Ф., Л и в а н о в А. С. и др. // Токсиколог. вестн. 2005. № 2. 19. Guidance for Industry. Analytical Procedure and Methods Validation // Draft Guidanc e. FDA, CDER, CBER.

Aug. 2000.



Беларуси

20. Положение об организации управления качеством исследований в учрежден иях здравоохранения Российской Федерации: Приложение 1 к приказу № 45 МЗ РФ от 7 февр. 2000 г.

21. Валидация фармакопейных методов: проект ОФС // Ведомости науч. центра экспертизы и государств. кон-троля лекарств. средств. 2001. № 1. С. 28.

22. А й з б е р г О. Р., А л е к с а н д р о в А. А., О с и п ч и к С. И. и др. // Психиатрия. 2009. № 4. С. 19–2 5.23. ГОСТ РИСО 5725-1-2002: Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений.

Часть 1: Основные положения и определения. (Введ. 23.04.02.) М., 2002. 24. WADA Technical Document – THE 2010 PROHIBITED LIST. Jan. 1, 2010.

O. M. VIARHUN1, V. E . SYAKHOVICH2, A. I. KHOMENKO2

QUALITATIVE ANALYSIS OF NARCOTICS BY LIQUID CHROMATOGRAPHY – MAS S SPECTROMETRY IN DOPING CONTROL

1 Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk,2National Antidoping Laboratory, Minsk, Belarus

Summary

The technique for drug determination (morphine, methadone, fentanyl, ox ycodone, pentazocine, pethidine) in urine based on liquid chromatography – mass spectrometry with electrospray ionization as well as with prob e preparation including liquid-liquid phase extraction and enzymati c hydrolysis is proposed.



Беларуси

53


УДК 618.19-006:576.5:577.3

Н. А. ШУКАНОВА1, Л. А. ПУТЫРСКИЙ2, С. В. ПИНЧУК1, М. А. МАРТЫНОВА1, Ю. Л. ПУТЫРСКИЙ2, Н. А. КОЗЛОВСКАЯ2

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ХИМИОПРЕПАРАТОВ НА КЛЕТКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОХИМИЧЕСКИХ КРИТЕРИЕВ

1Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск,2Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии

им. Н. Н. Александрова, Минск, Беларусь


Введение. Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующее место в структуре злокаче-ственных новообразований. При этом наблюдается постоянный рост этого заболевания, особен-но в промышленно развитых странах и регионах с неблагоприятной экологической обстановкой. Так, например, в период с 1986 по 2006 г. число пациенток с верифицированным РМЖ в Беларуси возросло почти в 2 раза [1]. Крайне важным моментом при лечении этого заболевания является правильный выбор схем применения химиопрепаратов при проведении как адъювантной, так и неоадъювантной химиотерапии. Нередко при назначении одного и того же препарата у па-циенток с гистологически однородными опухолями реализуются различные его эффекты [2]. Известны случаи, когда химиотерапевтический препарат подавлял работу системы иммунитета пациентки и оказывал токсическое действие на различные органы и ткани, практически не влияя на рост опухоли, что ускоряло летальный исход. Опасность назначения больной РМЖ заведомо не-активного для нее лекарственного средства обусловливает необходимость определения индивиду-альной чувствительности к противоопухолевым цитостатическим препаратам и разработки новых методов прогнозирования их действия. В последние годы предложен целый ряд методов для оцен-ки индивидуальной чувствительности клеток РМЖ к цитостатикам с использованием различных молекулярно-биологических и биохимических маркеров [3]. Однако следует отметить, что эти анализы весьма дорогостоящи и не всегда обеспечивают достоверные результаты. В связи с этим проблема разработки более простых, дешевых и надежных методов оценки индивидуальной чув-ствительности клеток РМЖ к применяемым химиопрепаратам остается актуальной. Одним из та-ких методов, на наш взгляд, является способ оценки влияния химиопрепаратов на клетки злокаче-ственных новообразований в первичной культуре, полученной из операционного материала или пунктатов опухоли молочной железы конкретной пациентки. Хорошо известно, что именно пер-вичные культуры, полученные из солидных опухолей, являются системами, которые по степени чувствительности к различным воздействиям наиболее приближаются к условиям in vivo [4].

Цель настоящей работы – исследование влияния двух групп цитостатиков на клетки РМЖ в первичной культуре с использованием биохимических подходов.

Материалы и методы исследования. Первичную культуру клеток получали из операционно-го опухолевого материала больной и инкубировали в течение 48 ч в питательной среде RPMI 1640, содержавшей эмбриональную сыворотку плодов коров (10%) и гентамицин (50 мкг/мл). Коли-чество и жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева с использованием эозина (5 мг/мл). Число клеток в гомогенате опухолевой ткани до культивирования составляло около 1·105 кл/мл, доля живых клеток – 60–70%. В результате культивирования опухолевых клеток в течение 48 ч



Беларуси

54

их количество увеличивалось в 1,5–3 раза. Культивирование проводили в стандартных условиях как в присутствии цитостатиков, так и без них. В работе использовали две комбинации цитоста-тиков, которые широко применяются при адъювантной и неоадъювантной химиотерапии РМЖ. Первая (группа CMF) состояла из циклофосфана (10–3 моль/л), метотрексата (10–3 моль/л) и 5-фто-рурацила (10–5 моль/л), вторая (группа АС) – из циклофосфана (10–3 моль/л) и доксорубицина (10–4 моль/л). Выбранные концентрации препаратов соответствовали литературным данным по исследованию химиочувствительности клеток в культурах [5, 6]. Окрашивание мазков осу-ществляли по методу Паппенгейма [7]: было установлено, что опухолевые клетки, полученные нами в первичной культуре, идентичны имеющимся в цитологическом атласе по диагностике за-болеваний молочной железы [8]. Активность дегидрогеназ определяли по модифицированно-му методу Хольста–Хансена [9]. К 0,5 мл клеточной суспензии добавляли 0,1 мл раствора 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолиум-бромида (ДТНБ) в концентрации 10 мг/мл и инкубировали при +37 оС в течение 4 ч. После инкубации суспензию центрифугировали 7 мин при 3000 об/мин, супернатант удаляли, осадок ресуспендировали 1,2 мл диметилсуль-фоксида и на спектрофотометре SPEKOL 11 (Германия) измеряли оптическую плотность D при двух длинах волн (λ = 570 нм и λ = 630 нм) для уменьшения влияния рассеянного света. Количество жизнеспособных опухолевых клеток определяли как разность между D570 и D630 и выражали в относительных единицах. Оценку активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в опу-холевых клетках проводили по методу Эллмана [10], концентрацию белка определяли по стан-дартному методу Лоури [11].

Результаты и их обсуждение. Было исследовано влияние цитостатиков групп СMF и АС на активность АХЭ в первичной культуре опухолевых клеток, полученных из операционного материала разных пациенток с диагнозом «рак молочной железы». Выбор этого параметра в ка-честве биохимического критерия, позволяющего оценить действие лекарственных препаратов на клетки РМЖ, основан на результатах исследований последних лет [12], которые свидетель-ствуют о том, что активность АХЭ в клетках РМЖ в 2 раза выше, чем в клетках соседней здоро-вой ткани молочной железы, и коррелирует с пролиферативной активностью злокачественно трансформированных клеток. На рисунке представлены данные о различном влиянии химио-препаратов на опухолевые клетки в первичной культуре, полученной из операционного материа-ла 4 пациенток. Как видно из рисунка, активность АХЭ в пересчете на одну клетку не одинакова для разных больных. Более того, каждая из групп препаратов оказывала различное действие на опухолевые клетки. Так, наибольший цитотоксический эффект наблюдался у пациентки С, в куль-туре опухолевых клеток которой активность АХЭ под действием препаратов группы АС была сни-

жена почти в 2 раза, что, как уже отмечалось, свидетельствует об уменьшении пролифера-тивной активности клеток.

Следует отметить, что в поисках простой и доступной тест-системы для определения индивидуальной чувствительности клеток со-лидных опухолей к химиопрепаратам иссле-дователи постоянно возвращаются к анализу биохимических ответов клетки на воздействие цитостатиков. В конце 1990-х годов китайские ученые разработали способ оценки цитоток-сического действия противоопухолевых пре-паратов с использованием МТТ-теста в пер-вичной культуре клеток РМЖ [13, 14]. После статистической обработки результатов, полу-ченных в условиях in vitro, ими были даны ре-комендации по применению препаратов в кли-нике. По истечении 3 лет после проведенного курса химиотерапии сравнительный анализ

Активность АХЭ (ААХЭ) одной клетки РМЖ в первичной культуре после 48 ч инкубации без (1) и в присутствии цитостатиков групп CMF (2) и АС (3). A–D – пациентки

с верифицированным диагнозом РМЖ

·Национальная


Беларуси

55

показал, что индивидуальная чувствительность клеток опухолей к лекарственным препара-там in vitro, оцененная в первичной культуре, в 80 случаях из 100 полностью коррелирует с результатами in vivo, а резистентность клеток к препаратам совпадает с клиническими эффектами на 100%.

В связи с изложенным выше нами было проведено сравнение двух биохимических параме-тров, позволяющее оценить влияние химиопрепаратов на опухолевые клетки РМЖ: активности АХЭ и активности дегидрогеназ (МТТ-тест) опухолевых клеток через 48 ч их культивирования (табл. 1, 2). Как видно из приведенных в таблицах данных, при воздействии обеих групп препара-тов наблюдалось однонаправленное изменение активности исследованных ферментов, т. е. при снижении активности АХЭ уменьшалась и активность дегидрогеназ, а, соответственно, с ростом активности АХЭ повышалась и активность дегидрогеназ. Следует отметить, что нередко актив-ность АХЭ являлась более информативным параметром (амплитуда эффекта более выражена). У отдельных пациенток (F, H, L – в таблицах выделено курсивом) культивирование клеток в при-сутствии химиопрепаратов приводило к увеличению числа активно пролиферирующих опухоле-вых клеток, что свидетельствовало о резистентности клеток к исследуемым цитостатикам и, как отмечалось выше [13, 14], хорошо коррелировало с клиническими показателями in vivo.

Т а б л и ц а 1. Влияние цитостатиков группы CMF на активность АХЭ и активность дегидрогеназ клеток РМЖ в первичной культуре после 48 ч культивирования

ПациенткаАктивность АХЭ, нМ/(мг белка×мин) МТТ-тест (D570–D630)

без цитост. CMF без цитост. CMF

А 0,96 0,61 0,019 0,017B 1,71 1,10 0,128 0,078C 1,60 1,45 0,045 0,034D 1,30 1,02 0,019 0,017E 2,30 1,89 0,042 0,018F 1,18 2,13 0,026 0,039G 0,50 0,42 0,064 0,031H 0,86 1,47 0,026 0,039

П р и м е ч а н и е. В табл. 1, 2 погрешность измерения активности ферментов не превышала 5–8%.

Т а б л и ц а 2. Влияние цитостатиков группы АС на активность АХЭ и активность дегидрогеназ клеток РМЖ в первичной культуре после 48 ч культивирования

ПациенткаАктивность АХЭ, нМ/(мг белка×мин) МТТ-тест (D570–D630)

без цитост. АС без цитост. АС

A 0,96 0,38 0,019 0,013B 1,71 1,17 0,107 0,103C 1,60 1,30 0,035 0,030D 1,30 0,40 0,019 0,013I 1,46 1,06 0,032 0,016J 1,72 1,18 0,084 0,062K 0,50 0,31 0,064 0,019L 1,18 1,32 0,041 0,050

Заключение. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что как активность мито-хондриальных дегидрогеназ, так и активность АХЭ могут служить критериями оценки способ-ности злокачественно трансформированных клеток к бесконтрольному делению и чувствитель-ности опухолевых клеток к действию химиопрепаратов. Корреляция между количеством актив-но пролиферирующих опухолевых клеток в первичной культуре и активностью АХЭ может быть положена в основу разработки относительно простого, быстрого и недорогого биохимиче-ского метода определения индивидуальной чувствительности данных клеток к цитостатикам в условиях in vitro, что, в свою очередь, позволит повысить эффективность терапии при РМЖ.



Беларуси


1. Доброкачественные и злокачественные заболевания молочной железы / Под ред. Л. А. Путырского, Ю. Л. Пу-тырского. М., 2008.

2. H e i d e l b e r g e r C. // Nature. 1961. Vol. 189, N 4765. P. 627.3. Ж у к о в а Л. Г., Ж у к о в Н. В. // Рос. онколог. журн. 2003. № 5. С. 43–47.4. Ф о м и н а И. П., Т е р е н т ь е в а Т. Г., Л а с к и н а А. В. и др. // Актуальные вопросы современной онколо-

гии. 1970. Вып. 2. С. 276–293. 5. F u r u k a w a T., K u b o t a T., H o f f m a n R. M. // Clin. Cancer Res. 1995. Vol. 1. P. 305–311.6. И щ е н к о Р. В. // Онкология. 2002. Т. 4, № 1. С. 15–17.7. Методы клинических лабораторных исследований. 2-е изд. / Под ред. В. С. Камышникова. Минск, 2002.8. Ш а б а л о в а И. П., Д ж а н г и р о в а Т. В., В о л ч е н к о Н. Н. и др. // Цитологический атлас. Диагностика

заболеваний молочной железы. М., 2005.9. H o l s t - H a n s e n C., B r u n e r N. // Cell Biology. A Laboratory Handbook. 1998. Vol. 1. P. 16–18.10. E l l m a n G. L., C o u r t n e u y K., A n d r e s V. // Biochem. Pharmacol. 1961. Vol. 7, N 2. P. 88–93.11. L o w r y O. H., R o s e b r o u g h H. L., F a r r A. L., R a n d a l P. J. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, N 1. P. 265–275.12. R u i z - E s p e j o F., C a b e z a s - H e r r e r a J., I l l a n a J. et al. // Breast cancer research and treatment. 2002.

Vol. 72. P. 11–22.13. X u J. M., S o n g S. T., T a n g Z. M. et al. // Breast cancer research and treatment. 1998. Vol. 49. P. 251–259.14. X u J. M., S o n g S. T., T a n g Z. M. et al. // Breast cancer research and treatment. 1999. Vol. 53. P. 77–85.

N. A. SHUKANOVA1, L. A. PUTYRSKI2, S. V. PINCHUK1, M. A. MARTYNOVA1, Y. L. PUTYRSKI2, N. A. KАZLOVSKAYA2

ESTIMATION OF THE CHEMOTHERAPEUTICAL DRUG INFLUENCEON BREAST CANCER CELLS IN PRIMARY CULTURE

WITH THE USE OF BIOCHEMICAL CRITERIA

1 Institute of Biophysics and Cell Engineering of NAS of Belarus, 2N. N. Alexandrov National Cancer Center of Belarus, Minsk

Summary

The infl uence of two groups of cytostatic drugs CMF (Cyclophosphamide, Methotrexate, 5-Fluorouracil) and AC (Doxorubicin, Cyclophosphamide) on breast cancer cells in primary culture was studied. It was shown that the acetylcholines-terase and mitochondrial dehydrogenase activity of breast cancer cells correlates with their proliferative activity and can be used as a criterion for assessment of the sensitivity of tumor cells to anticancer drugs.



Беларуси

57


УДК 577.3:612.65:621.391

А. В. СИДОРЕНКО1, Г. И. ОВСЯНКИНА2, Л. М. ЛЫНЬКОВ3, А. А. КАЗЕКА3, Ю. Л. ЛЕОНЧИК1

АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОЭНЦЕФАЛОГРАММ НА ОСНОВЕ ДИНАМИЧЕСКОГО ХАОСА ПРИ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЙ

МОБИЛЬНОГО ТЕЛЕФОНА И ЗАЩИТНЫХ ЭКРАНОВ

1Белорусский государственный университет, Минск, 2Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии, Минск, Беларусь,

3Белорусский государственный университет информатики и радиоэлектроники, Минск


Введение. Широкое распространение беспроводных телекоммуникационных систем, систем мобильной связи, использование компьютеров и бытовой аппаратуры в повседневной жизни вы-зывает необходимость в адаптации человека к условиям существования в среде с электромаг-нитными излучениями. В литературе отмечаются противоречивые данные о влиянии излуче-ний мобильных телефонов на отдельные системы организма и организм человека в целом [1–4]. Актуальной становится проблема исследования работы центральной нервной системы. Для это-го, как правило, проводится изучение электроэнцефалограмм, биоэлектрического сигнала, отоб ра-жающего процессы функционирования мозга.

Для защиты или снижения эффекта воздействия излучений на человека применяют защит-ные экраны на основе радиопоглощающих материалов [5, 6]. Представляется актуальным уста-новление информативных критериев диагностики и определения динамики протекания процес-сов при действии излучений мобильных телефонов и размещении защитных экранов между те-лефоном и ухом пользователя.

В качестве методологии исследований в данной работе был применен нелинейный метод, в основу которого положено представление о биоэлектрических сигналах, отображающих дея-тельность мозга, как о детерминированном хаосе. Это метод задержанной координаты, кото-рый позволяет по временному ряду зарегистрированных потенциалов определить динамиче-скую систему, характеризуемую нелинейными параметрами. В качестве таких параметров мо-гут быть использованы фрактальная или корреляционная размерность, энтропия Колмогорова, показатели Ляпунова. Данная методология успешно применена нами при обработке и анализе электроэнцефалографических сигналов у пациентов с нарушением мозгового кровообраще-ния [7], при спастической кривошее [8], у больных с пароксизмальными состояниями [9], а также при обработке и анализе электрокортикограмм у животных в условиях электромагнитного из-лучения [10].

Цель работы – изучение и анализ методами нелинейной динамики на основе динамического хаоса электроэнцефалограмм здоровых лиц для получения информативных показателей, харак-теризующих изменения состояния центральной нервной системы при действии излучений мо-бильного телефона и защитных экранов.

Методика проведения исследований. Зарегистрированные по схеме «10-20» электроэнце-фалографом «Нейрокартограф» фирмы МБН электроэнцефалограммы обрабатывали и анализи-ровали с помощью разработаннго нами информационно-измерительного комплекса, описанного в работе [10]. В процессе проведения исследований были обработаны электроэнцефалограм-



Беларуси

58

мы 10 здоровых лиц в восьми отведениях: Fp1–A1, Fp2–A2, C3–A1, C4–A2, O1–A1, O2–A2, T3–A1, T4–A2. Электроэнцефалограммы обрабатывались в состояниях, определяемых пятью режима-ми: фон (режим 1); звонок без ответа (режим 2); звонок без ответа, экран (режим 4); звонок, ответ (режим 3); звонок, ответ, экран (режим 5). В процессе исследований были использованы два типа мобильных телефонов различных фирм-изготовителей и четыре типа экранов. В дальнейшем типы телефонов обозначены как тел. I и тел. II.

В работе использованы защитные экраны: экран 3 – алюминиевая фольга, экран 4 – целлю-лозное полотно – алюминиевая фольга – целлюлозное полотно, экран 8 – машинно-вязанное по-лотно, экран 9 – алюминиевая фольга с отверстием диаметром 4 мм. Размеры экранов 80 × 160 мм2 [5]. Экраны, кроме металлических, представляли собой многослойные конструкции на основе син-тетического машинно-вязанного полотна, из нетканого целлюлозного материала, пропитанные водным раствором (не менее 50%), в состав которого входили высокомолекулярные органиче-ские соединения (спирты), что обеспечивало эксплуатацию устройств при температуре ниже 0 °С. Для предотвращения испарения жидкостного наполнителя в процессе эксплуатации и хранения экранов проводили герметизацию образцов полиэтиленом. Коэффициент ослабления S21 исполь-зованных экранов в диапазоне от 0,76 до 2,14 ГГц в среднем составлял: для экрана 4 – (14–29) дБ, для экрана 8 – (13,5–15,3) дБ.

Функциональное состояние центральной нервной системы определяли в указанных вы ше режимах.

В качестве метода нелинейной динамики на основе динамического хаоса выбран метод за-держанной координаты, который позволяет учесть нелинейности, свойственные исследуемому сигналу. По временной реализации сигнала, зависящего от одной переменной, указанный метод дает возможность восстановить структуру динамической системы в фазовом пространстве, ко-торое характеризуется корреляционной размерностью и энтропией Колмогорова. Алгоритм ме-тода задержанной координаты, приведенный в работе [12], адаптирован нами для электроэнце-фалографических сигналов и подробно описан в работах [8, 10]. Для динамических систем, опре-деляемых из экспериментальных временных реализаций, энтропию Колмогорова целесообразно представлять в нормированном на энергию виде [13]. В качестве нормирующей величины исполь-зовали энергию в том частотном диапазоне ритмических составляющих мозга, который характе-ризуется максимальной частотой спектра [10].

Для визуального анализа проводили построение фазовых портретов электроэнцефалограмм. Фазовые портреты сложных колебательных процессов использовали для определения структу-ры исследуемой динамической системы.

В процессе обработки электроэнцефалограмм использовали метод задержанной координаты и спектральный корреляционный метод и с помощью разработанного программного обеспече-ния рассчитывали корреляционную размерность d, энтропию Колмогорова Е, спектр мощности, спектральную плотность мощности и ее распределение в частотном диапазоне ритмической со-ставляющей мозга – альфа-диапазоне.

Достоверность параметров определяли методом дискриминационной статистики [11]. Достоверными при обработке цифровых данных считали результаты при вероятности ошибки Р < 0,05.

Результаты и их обсуждение. В процессе исследования представляли интерес результаты, полученные в отношении электроэнцефалограмм отведения О1–А1 здоровых лиц.

При анализе фазовых портретов (рис. 1), построенных на основании полученных в клиниче-ских условиях электроэнцефалограмм в состояниях центральной нервной системы, определяе-мых как режим 1 (фон) (рис. 1, а), режим 2 (звонок без ответа) (рис. 1, б), режим 3 (звонок, ответ) (рис. 1, в), отмечалось изменение области локализации портрета.

Для электроэнцефалограмм в состоянии, характеризуемом фоном (режим 1), наблюда-лась размытая структура эллипса; для электроэнцефалограмм в состоянии режима 2 область локализации фазового портрета имела четкие очертания с бóльшими по отношению к фону сжатием и площадью эллипса; в состоянии режима 3 фазовый портрет изменял форму, при-



Беларуси

59

, . I , , . I

, 9, . I , , 9, . I

, , , 8, . I 8, . I

Рис. 1. Фазовые портреты электроэнцефалограмм отведения Ol–Al в состояниях, определяемых как режим 1 (а); режим 2 (б); режим 3 (в); режим 4, экран 9 (г); режим 5, экран 9 (д); режим 4, экран 8 (е); режим 5, экран 8 (д)



Беларуси

60

обретая размытые очертания с бóльшими по отношению к фону фокусным расстоянием и сжатием эллипса.

Различия фазовых портретов исследуемых электроэнцефалограмм (отведение О1–А1) про-явились в количественном изменении параметров динамической системы – корреляционной размерности d и энтропии Колмогорова Е, а также спектральной плотности мощности альфа-ритма. Динамику указанных параметров можно наблюдать по гистограммам, приведенным на рис. 2. Исходные значения параметров корреляционной размерности d, энтропии Кол мо-горова Е, спектральной плотности мощности альфа-ритма Si/S0 составляли: d = 1,443 ± 0,012; Е= (1,24 ± 0,05)·10–2; Si/S0 = 0,086. В количественном отношении пользование мобильным теле-фоном в состояниях режимов 2 и 3 приводило к следующим изменениям в электроэнцефало-граммах: возрастанию параметра корреляционной размерности d на 17,6 и 15,3%; снижению

Рис. 2. Гистограммы распределений корреляционной размерности d (а), энтропии Колмогорова Е (б), спектральной плотности мощности альфа-ритма (в) в состояниях режим 2 и режим 3



Беларуси

61

энтропии Колмогорова Е на 9,6 и 16,1%; увеличению спектральной плотности мощности альфа-ритма на 69,7 и 51,1% соответственно по отношению к фону. О возрастании спектраль-ной плотности мощности альфа-ритма при работе мобильного телефона сообщается также в работах [14, 15].

Размещение экрана 9 между телефоном и ухом пользователя приводило к изменению фазо-вых портретов электроэнцефалограмм в режимах 4, 5: по сравнению с фоном в режиме 4 пло-щадь фазового портрета в виде эллипса увеличилась, а в режиме 5 фокусное расстояние и сжа-тие эллипса уменьшились (рис. 1, г, д). Параметры исследуемых электроэнцефалограмм при этом изменились следующим образом: по сравнению с фоном значение параметра корреляцион-ной размерности d возросло на 12,3 и 12,4%; энтропия Колмогорова E увеличилась на 47,5%, а в режиме 5 (экран 9) снизилась на 41,9%; спектральная плотность мощности альфа-ритма в ре-жиме 4 (экран 1) увеличилась на 48,8% и уменьшилась в режиме 5 (экран 9) на 59,3% соответ-ственно. Динамика параметров представлена на рис. 2.

При размещении экрана 8 между телефоном и ухом пользователя фазовые портреты так-же изменили свою конфигурацию: в режиме 4 область локализации фазового портрета, пред-ставляющего собой эллипс, увеличилась, а в режиме 5 параметры эллипса изменились, фо-кусное расстояние и сжимаемость по отношению к фону снизились (см. рис. 1, е, ж). Так, для режимов 4, 5 отмечалось увеличение корреляционной размерности d на 13,7 и 16,0%; сниже-ние энтропии Колмогорова на 9,6% и увеличение на 55,0%; возрастание спектральной плот-ности мощности альфа-ритма на 17,4% и снижение на 84,8% соответственно по отношению к фону. Динамика параметров исследуемых электроэнцефалограмм представлена на гисто-граммах (рис. 2).

Размещение экранирующих материалов между мобильным телефоном и ухом пользова-теля приводило к улучшению динамических параметров электроэнцефалограмм, включая корреляционную размерность и энтропию Колмогорова, а также спектральную плотность мощности альфа-ритма. Сравнительный анализ указанных параметров при размещении экранов 8 и 9 позволяет отдать предпочтение экрану 8 при работе мобильного телефона в режиме «звонок, ответ».

Представляют интерес результаты анализа полученных экспериментальным путем электро-энцефалограмм здоровых лиц при пользовании телефонами системы GSM двух различных про-изводителей. Обозначим эти телефоны как тел. I и тел. II. Фазовые портреты электроэнцефало-грамм отведения О1–А1 в режиме 3 (звонок, ответ) при использовании телефонов обоих типов различались (рис. 3, б, в) и отличались от фоновых значений (рис. 3, а).

При использовании тел. I характерным для фазового портрета электроэнцефалограммы, имевшего форму эллипса, являлось смещение области локализации вверх влево от центра, а для тел. II, соответственно, смещение вниз вправо от центра по отношению к фону (рис. 3, б, в). При этом область заполнения портрета электроэнцефалограммы при использовании тел. II меньше, чем для тел. I, и в обоих случаях меньше по отношению к фону.

Размещение экрана 3 между телефоном и ухом пользователя приводило к ограничению об-ласти локализации фазового портрета электроэнцефалограмм при использовании обоих типов телефонов (рис. 3, г, д).

При использовании тел. I и размещении экрана 4 область локализации фазового портрета электроэнцефалограмм отведения О1–А1 была ограничена и по отношению к фоновой занимала меньшую площадь (рис. 3, е, ж). Электроэнцефалограмма отведения О1–А1 при использовании тел. II и экрана 4 давала фазовый портрет также в форме эллипса, однако с большим сжатием и большей площадью по сравнению с фоном.

Переходя от качественного анализа к количественному, следует отметить, что для тел. I и тел. II в режиме 3 (звонок, ответ) параметр корреляционной размерности d возрос по отноше-нию к фону на 6,1 и 5,4%; энтропия Колмогорова Е увеличилась на 14,1 и 43,9%; спектральная плотность мощности альфа-ритма снизилась на 66,9 и 44,3% соответственно. Динамика параме-тров приведена на рис. 4.



Беларуси

62

, , . I , , . II

, , 3, . I , , 3, . II

, , 4, . I , , 4, . II

Рис. 3. Фазовые портреты электроэнцефалограмм отведений О1–А1 в состояниях, определяемых как режим 1 (а); режим 3, тел. 1 (б); режим 3, тел. II (в); режим 5, экран 3, тел. 1 (г); режим 5, экран 3, тел. II (д); режим 5, экран 4, тел. I (е);

режим 5, экран 4, тел. II (д)



Беларуси

63

Рис. 4. Гистограммы распределений корреляционной размерности d (а), энтропии Колмогорова Е (б), спектральной плотности мощности альфа-ритма ( в) в состоянии 2 (звонок, ответ) для тел. I и тел. П

При использовании тел. I и размещении экрана 3 между телефоном и ухом пользователя (ре-жим 5) значения корреляционной размерности по сравнению с фоном не изменились, а для тел. II этот показатель увеличился на 4,1% (к сведению: без экрана 3 корреляционная размерность увели-чилась на 5,4%); значения же энтропии Колмогорова Е возросли при использовании обоих телефо-нов (на 65,8 и 75,2%); спектральная плотность мощности альфа-ритма снизилась на 72,9 и 68,1% соответственно. Динамика параметров приведена на рис. 4.

При размещении экрана 4 между телефоном и ухом пользователя (режим 5) параметры элек-троэнцефалограмм по отношению к фону изменились: корреляционная размерность d увеличи-лась на 5,5 и 5,7%; энтропия Колмогорова Е возросла на 32,3 и 32,7%; спектральная плотность мощности снизилась на 67,4 и 78,7% соответственно для тел. I и тел. II. Динамика параметров приведена на рис. 4.

Из приведенных данных видно, что если при использовании экрана 3 значения изменений корреляционной размерности и энтропии Колмогорова значительно отличаются для тел. I и II, то применение экрана 4 дает практически одинаковые значения, соответствующие изменению корреляционной размерности для электроэнцефалограмм, полученных без экрана в случае при-менения тел. II. Изменения же энтропии Колмогорова одинаковы как для тел. I, так и для тел. II.



Беларуси

64

Что касается спектральной плотности мощности, то ее значения существенно отличаются от по-казателей, полученных для электроэнцефалограмм при использовании экрана 3.

Проведенный сравнительный анализ нелинейных параметров электроэнцефалограмм при размещении экранов 3 и 4 позволяют отдать предпочтение экрану 4 при работе обоих типов мо-бильных телефонов в режиме «звонок, ответ».

Выводы

1. При обработке и анализе в разработанной нами информационно-измерительной системе результатов действия излучений мобильных телефонов системы GSM и размещении защитных экранов на основе радиопоглощающих материалов между телефоном и ухом пользователя выяв-лены особенности в структуре электроэнцефалограмм и определены количественные показате-ли последних у здоровых лиц.

2. Работа мобильных телефонов системы GSM в режимах «звонок без ответа» и «звонок, от-вет» различным образом проявляется в структуре электроэнцефалограмм здоровых лиц. Это можно объяснить дополнительным действием афферентных раздражителей во втором из ука-занных выше режиме работы, приводящем к меньшим изменениям в параметрах корреляцион-ной размерности d и спектральной плотности мощности альфа-ритма и большим в энтропии Кол мо горова Е по сравнению с фоном.

3. Использование экранирующих средств с целью защиты от электромагнитных излучений изменяет параметры электроэнцефалограмм, что можно оценить как по нелинейным параме-трам, включая корреляционную размерность d и энтропию Колмогорова Е, определяемым на основе детерминированного хаоса, так и по значениям спектральной плотности мощности альфа-ритма, определяемым при помощи традиционного спектрального корреляционного ана-лиза. Сравни тельный анализ количественных параметров электроэнцефалограмм позволил установить предпочтительный вариант при сравнении экранов 8 и 9, а также 3 и 4, отличающих-ся по технологии изготовления и, соответственно, имеющих разные характеристики.

4. Использование защитного экрана вызывает изменения в электроэнцефалограмме, опреде-ляемые следующими параметрами: корреляционной размерностью d, энтропией Колмогорова Е, спектральной плотностью мощности альфа-ритма, которые при использовании мобильных теле-фонов разных производителей носят различный характер.

5. Применение нелинейных методов, которые рассматривают биоэлектрические сигналы, отображающие деятельность мозга, как детерминированный хаос, позволяет ввести такие ин-формативные показатели, как корреляционная размерность и энтропия Колмогорова. Это дает возможность определить изменения состояния центральной нервной системы при действии из-лучений мобильных телефонов и защитных экранов.


1. L e i f S. G., B r u n A. E., E b e r h a r d t J. L. et al. // Environment. Health Perspectives. 2003. Vol. 111, N 7. P. 881–883.

2. F r a n k e L. // Bioelectromagnetics. 2007. Vol. 26, N 7. P. 529–535. 3. L u r i a R., E l i y a h u I., H a r e u v e n y R. et. al. // Bioelectromagnetics. 2009. Vol. 3, N 30. P. 198–204. 4. R u e d i g e r H. W. // Pathophysiology (Elsevier). 2009. Vol. 16, N 2–3. P. 89–98. 5. Б о р б о т ь к о Т. В., К о л б у н Н. В., Л ы н ь к о в Л. М. Антропогенные источники электромагнитного из-

лучения. Безопасность жизнедеятельности человека. Минск, 2008. 6. Н и к и т и н а В. Н., Л я ш к о Г. Г., П о ц е л у е в а Л. Н. // Ежегодник Российского Национального Комитета

по защите от неионизирующих излучений за 2004–2005: сб. М., 2006. С. 109–114.7. S i d o r e n k o A. V., O v s y a n k i n a G. I., S o l o n o v i c h N. A. // Nonlinear Phenomena in Complex Systems.

2006. Vol. 9. P. 97–104.8. Л и х а ч е в С. А., С и д о р е н к о А. В., О в с я н к и н а Г. И. и др. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук.

2009. № 3. С. 31–38.9. С и д о р е н к о А. В., С а д о в н и к о в В. В., О в с я н к и н а Г. И. // Нейронаука для медицины и психологии:

материалы Второго междунар. междисциплинар. конгр. Судак, 2009 г. С. 203–205 (рус. и англ.).10. С и д о р е н к о А. В. Методы информационного анализа биоэлектрических сигналов. Минск, 2003.



Беларуси

11. P r i c h a r d D. // Phys. Rev. Lett. 1994. Vol. 73, N 7. P. 951–959.12. G r a s s b e r g e r P., P r o c a c c i a I. // Phys. Rev. Lett. 1983. Vol. 50, N 5. P. 346–349.13. А н и щ е н к о В. С., А с т а х о в В. В., В а д и в а с о в а Т. Е. Нелинейные эффекты в хаотических и стоха-

стических системах. М.; Ижевск, 2003. 14. Электромагнитные поля и здоровье человека / Под ред. Ю. Г. Григорьева. М., 2002.15. K r a u s e C. // Cogn. Neurosci. and Psychol. 2000. Vol. 11, N 4. P. 761–764.

A. V. SIDORENKO1, G. I. OVSYANKINA2, L. M. LYNKOV3, A. A. KAZEKA3, Yu. L. LEONCHIK1

ANALYSIS OF THE ELECTROENCEPHALOGRAMS UNDER THE EFFECT OF MOBILE PHONE RADIATION AND PROTECTION SCREENS USING THE DYNAMIC CHAOS

1Belarusian State University, Minsk, 2Republican Scientifi c and Practical Center of Neurology and Neurosurgery, Minsk, Belarus,

3Belarusian State University of Informatics and Radioelectronics, Minsk

Summary

It is proposed to study the clinical electroencephalograms, subjected to the effect of mobile phone radiation and infl u-enced by protection screens based on radiation absorbing materials, with the use of the nonlinear dynamics methods. The clinical electroencephalograms recorded for healthy volunteers were processed and analyzed using the specially developed information-measuring system.

The performed analysis of electroencephalograms shows that the structural changes in signals are different for GSM-sy-stem mobile phones operated in the regimes “phone – no reply”; “phone – reply”, and also with the use of protection screens between the mobile phone and human ear.

The employment of nonlinear methods considering bioelectric signals of the brain as a deterministic chaos enables one to realize the construction of phase portraits and to introduce such informative parameters as the correlation dimension d and Kol-mogorov entropy Е, making it possible to determine the infl uence of screens protecting against the electromagnetic radiation.



Беларуси

66


УДК 618.56:616-008.64-036.12-07

О. А. БУДЮХИНА1, Е. И. БАРАНОВСКАЯ1, А. И. ГРИЦУК1, Д. Р. ПЕТРЕНЁВ2

РОЛЬ ФАКТОРОВ ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ И АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ У БЕРЕМЕННЫХ

В ПАТОГЕНЕЗЕ РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

1Гомельский государственный медицинский университет, Беларусь,2Институт радиобиологии НАН Беларуси, Гомель


Введение. Плацентарная недостаточность (ПН) – это клинический симптомокомплекс, вы-званный функциональными и морфологическими изменениями плаценты с нарушением ком-пенсаторно-приспособительных реакций в системе мать–плацента–плод [1, 2]. ПН является важ-нейшей проблемой современного акушерства и неонатологии, так как осложняет до 60% всех беременностей, играет ведущую роль в структуре перинатальной заболеваемости и смертности. Несмотря на доступность высокотехнологичных методов диагностики и появление новых спосо-бов лечения, доля тяжелых форм ПН не снижается и составляет 22–26%, а наличие декомпенси-рованной ПН при критическом внутриутробном состоянии плода является основанием для до-срочного оперативного родоразрешения [1–4].

Структурные и функциональные изменения в плаценте, обусловленные различными факто-рами, носят неспецифический характер и реализуются за счет усиления процессов свободнора-дикального окисления низкомолекулярных соединений и белков [5]. Установлено четыре мише-ни окислительной цитотоксической атаки активных форм кислорода: индукция процессов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах, повреждение мембраносвязанных белков, инактивация ферментов и повреждение ДНК клеток. При физиологически протекающей беременности, которая сопровождается изменениями в прооксидантно-антиоксидантном стату-се, окислительный стресс временный, локальный, так как отмечается надежное функционирова-ние механизмов антиоксидантной защиты (АОЗ) [6]. Свободные радикалы запускают механизмы пролиферации и дифференцировки клеток в первом триместре беременности, участвуют в про-цессах апоптоза, элиминации ксенобиотиков, активируют внутриклеточные бактерицидные факторы, участвуют в синтезе гидроперикиси холестерина, являющейся предшественником про-гестерона. Образующиеся в процессе ПОЛ токсичные радикалы обладают способностью инак-тивировать эндотелиальные факторы релаксации (простациклин, оксид азота), способствуя ва-зо констрикции, повышению агрегации тромбоцитов и нарушению микроциркуляции в плацен-те, а также оказывают повреждающее действие на белки и липиды клеточных мембран, что приводит к ферментативной и гормональной недостаточности плаценты [5, 7].

При ПН изменяется свободнорадикальная активность и антиоксидантный статус плаценты, а при антенатальной гибели плода подавляется активность компонентов антиокислительных си-стем сыворотки крови и усиливаются процессы липопероксидации [2, 8–11].

Цель работы – оценить состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса при плацентар-ной недостаточности и диагностическую значимость показателей перекисного окисления липи-дов и антиоксидантной системы защиты при различных клинических формах хронической ПН.

Материалы и методы исследования. Всего обследовано 33 женщины с физиологическим течением беременности (контрольная группа) и 109 беременных с хронической ПН (основная



Беларуси

67

группа). В зависимости от клинической формы ПН основная группа была разделена на следу-ющие подгруппы: женщины с хронической ПН, проявляющейся гипоксией плода (n = 46), паци-ентки с ПН с развитием задержки роста плода (n = 48) и беременные с декомпенсированной ПН с развитием антенатальной гибели плода (n = 15). Диагноз ПН выставлен в период беременно-сти на основании динамического наблюдения за развитием беременности, данных кардиотоко-графии, ультразвукового исследования, допплерометрии кровотока в системе мать–плацента–плод и подтвержден при морфологическом исследовании последов.

Забор крови для исследования проводили в 7–8 ч утра в стандартных условиях, натощак. Сыворотки, полученные путем центрифугирования (2000 об/мин) в течение 20 мин при комнат-ной температуре, замораживали и хранили до проведения анализа при –20 °С. Для оценки со-стояния системы ПОЛ–АОС сыворотки крови определяли уровень общей антиокислительной активности сыворотки крови (ОАОА), активность супероксиддисмутазы (СОД) и уровень одного из конечных продуктов ПОЛ – малонового диальдегида (МДА). Антиокислительную активность околоплодных вод (ОВ) определяли по их общей антиокислительной активности.

Определение состояния антиокислительной системы сыворотки крови. Для оценки анти-окислительной активности сыворотки крови использован метод индуцированной хемилюминес-ценции (ХЛ) [12]. Метод основан на способности компонентов сыворотки задерживать время люминесцентной вспышки в системе, содержащей 2,2′азо-бис-(2-амидинопропан) дигидрохло-рид (ААРН) и люминол. В ячейки 96-луночного планшета вносили 10 мкл образца сыворотки или раствора Тролокс – водорастворимого аналога витамина Е. Добавляли 200 мкл мМ раствора люминола в среде Хенкса и термостатировали при 37 °С в течение 10 мин, после чего индуциро-вали радикалообразование путем добавления 100 мкл 50 мМ свежеприготовленного раствора ААРН в среде Хенкса. Введение азосоединения ААРН в среду, содержавшую люминол, сопрово-ждалось вспышкой ХЛ после некоторого латентного периода. Содержавшиеся в сыворотке кро-ви антиоксиданты увеличивали продолжительность так называемой лаг-фазы – периода, необхо-димого для развития реакции аутоокисления по радикальному типу, которая регистрировалась как усиление ХЛ. Антиоксидантный потенциал сыворотки выражали в эквивалентах тролокса (в мкМ). Дополнительно оценивали интенсивность ХЛ образцов сыворотки, которая пропорцио-нальна пулу промежуточных продуктов ПОЛ (липоперекисей, диеновых конъюгатов, а возмож-но, и других биомолекул, окисляемых по свободнорадикальному механизму). Интенсивность вспышки оценивали по площади под кривой ХЛ, регистрируемой в течение часа, и выражали в относительных единицах люминесценции (relative luminescent unit).

Определение общей антиокислительной активности околоплодных вод. ОВ были получены до начала родовой деятельности путем трансвагинальной амниотомии с целью индукции родов или путем интраоперационного амниоцентеза при плановом кесаревом сечении. Антиокис ли-тельную активность ОВ оценивали по их способности влиять на скорость реакции аутоокисле-ния адреналина в щелочной среде (метод Т. В. Сирота) [13]. В измерительную кювету с 2 мл кар-бонатного буфера (рН 10,55) вносили 0,1 мл 0,1%-ного раствора адреналина гидрохлорида (ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия), в опытную пробу добавляли 0,1 мл ОВ. Скорость окисления адреналина была прямо пропорциональна скорости образования промежу-точного продукта окисления адреналина, регистрируемого спектрофотометрически при λ = 347 нм. Измерения оптической плотности проводили каждые 5 с в течение 135 с на спектрофотоме-тре СФ-46 (ЛОМО). Кривые окисления адреналина имели линейную зависимость, следователь-но, оптическая плотность является функцией времени D = f(t), а показатель ∆D/∆t постоянен в каждой точке определения, т. е. скорость окисления адреналина возрастает с течением времени линейно. Скорость реакции аутоокисления адреналина выражали в единицах оптической плот-ности в минуту (∆D/∆t). Расчет скоростей окисления адреналина производили в соответствии с законом Бугера–Ламберта–Бера, согласно которому c = D/(ехl). В таком случае dc/dt = (dD/dt) ×1/(ехl). Коэффициент изменения скорости окисления адреналина (К) для каждого исследуемого образца ОВ был рассчитан по формуле K = (dD/dt)/(dDбуфера/dt).

Активность супероксиддисмутазы сыворотки крови выражали как ингибирование скорости аутоокисления адреналина (в %). Для изучения показателей кинетики реакции аутоокисления



Беларуси

68

адреналина в щелочной среде в ячейки планшета вносили 5 мкл сыворотки, добавляли 10 мкл 0,1%-ного раствора адреналина гидрохлорида, вносили 200 мкл карбонатного буфера (0,2 М, pH 10,2) и регистрировали кинетику изменения оптической плотности (λ = 347 нм) в течение 70 мин при 37 °С [13].

Уровень МДА сыворотки крови определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методу H. N. Ohkawa [14]. К образцам сыворотки добавляли трихлоруксусную кислоту в конеч-ной концентрации 5% для осаждения белков, выдерживали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали 3 мин при 9000 g. Супернатант переносили в новые пробирки и добавля-ли 2,5% ТБК, растворенной в диметилсульфоксиде, для получения конечной концентрации 0,25%. Процессы ПОЛ останавливали путем добавления бутилгидрокситолюена (2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol, Fluka) в конечной концентрации в пробе 0,03%. Для образования окра-шенного триметинового комплекса пробы инкубировали 15 мин при постоянном перемешива-нии (100 °С) в твердотельном термостате Biosan TS-100. После охлаждения образцы центрифуги-ровали 3 мин при 9000 g. Супернатант переносили в 96-луночные планшеты в повторах по 200 мкл и спектрофотометрировали на сканирующем спектрофотометре TECAN Safi re2 при λ = 532 нм. Для построения калибровочной кривой использовали серийно разведенный метиловый эфир МДА (1,1,3,3-Tetramethoxypropan, Aldrich).

Статистическую обработку количественных данных проводили с определением доли (р, %) изучаемого признака и стандартной ошибки доли (sp, %), вычисляли двухсторонний критерий Фишера (P) и критерий χ2. Характер распределения признаков оценивали с помощью теста Ша-пиро–Уилка. Применяли непараметрические статистические методы: рассчитывали квартили Me (25–75), критерий Манна–Уитни с поправкой Йейтса (ZT), критерий Данна (Q), критерий Крус-кала–Уоллиса (H) и коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). Различия считали стати-стически значимыми при P < 0,05. Статистическую обработку показателей кинетики аутоокис-ления адреналина с ОВ проводили с помощью программного пакета Origin.

Результаты и их обсуждение. Общая антиокислительная активность является интеграль-ным показателем, отражающим потенциальную антиокислительную активность во всем много-образии взаимодействия различных компонентов биологической жидкости [15]. Интенсивность ХЛ, напротив, отражает прооксидантную активность сыворотки крови, соответствующую за-пасу промежуточных продуктов ПОЛ.

Распределение общей антиокислительной активности и интенсивности ХЛ сыворотки крови у пациенток исследуемых групп не соответствовало нормальному распределению. Выявлена об-ратная корреляционная связь между индивидуальными ОАОА и интенсивностью ХЛ (rs = –0,5; P = 0,000001), что подтверждается статистически значимыми различиями при сопоставлении процентильных категорий данных показателей (табл. 1).

Т а б л и ц а 1. Прооксидантная активность сыворотки крови беременных в зависимости от процентильных категорий ОАОА (Me 25–75 процентилей)

Процентильные уровни ОАОА Интенсивность ХЛ, отн. ед. Количество случаев

Менее 25 104,82 (94,94–116)# ^ 3625–75 97,27 (92,67–106,46) * ^ 70Более 75 91,18 (84,97–99,01)* # 36

П р и м е ч а н и е. Различия статистически значимы (Р < 0,05) по сравнению с интенсивностью ХЛ: * – при ОАОА от 0 до 25 процентилей; # – при ОАОА от 25 до 75 процентилей; ^ – при ОАОА более 75 процентилей.

Выявлены различия ОАОА (Н = 9,22; Р = 0,027) и интенсивности ХЛ (Н = 9,88; Р = 0,02) у па-циенток исследуемых групп (табл. 2). Однако показатели ОАОА сыворотки крови у беременных с физиологическим течением беременности и хронической ПН, проявляющейся гипоксией пло-да, не различались и составили 0,396 (0,322–0,492) и 0,398 (0,330–0,487) мкМ эквивалента тро-локса соответственно. У пациенток при задержке роста плода ОАОА сыворотки крови была выше на 17%, при антенатальной гибели плода – на 11%. Учитывая, что показатели антиокисли-



Беларуси

69

тельной и прооксидантной активности изменяются в динамике гестационного процесса, прове-дена оценка ОАОА и интенсивности ХЛ при доношенной беременности. Определено статистиче-ски значимое повышение ОАОА при доношенной беременности, сопровождающейся формиро-ванием СЗРП (Q = 3,36; P < 0,05). Показатели ОАОА и интенсивности ХЛ у пациенток при до ношенной беременности представлены в табл. 3.

Т а б л и ц а 2. Показатели антиокислительной и прооксидантной активности у беременных (Me 25–75 процентилей)

Группа ОАОА, мкМ эквивалента тролокса Интенсивность ХЛ, отн. ед.

Контрольная (n = 33) 0,396 (0,322–0,492) 101,08 (93,29–106,54)Гипоксия плода (n = 46) 0,398 (0,330–0,487) 100,21 (91,23–108,15)СЗРП (n = 48) 0,464 (0,383–0,586) 99,17 (88,54–100,83)Антенатальная гибель плода (n = 15) 0,440 (0,397–0,522) 96,73 (93,05–103,26)

Т а б л и ц а 3. Показатели антиокислительной и прооксидантной активности у обследованных при доношенной беременности (Me 25–75%)

Группа ОАОА, мкМ эквивалента тролокса Интенсивность ХЛ, отн. ед.

Контрольная (n = 33) 0,396 (0,322–0,492) 101,08 (93,29–106,54)Гипоксия плода (n = 43) 0,397 (0,331–0,494) 100,27 (91,63–109,26)СЗРП (n = 47) 0,468 (0,383–0,577)* 99,21 (88,45–100,84)Антенатальная гибель плода (n = 7) 0,476 (0,405–0,522) 96,73 (94,63–99,62)

*Статистически значимое различие (Р < 0,05) с группой контроля и ПН.

Величина ингибирования скорости аутоокисления адреналина сывороткой крови прямо пропор-циональна активности СОД, одному из ключевых ферментов антиокислительной системы. В кон-трольной группе этот показатель составил 31,63 (30,37–33,0)%, в основной – 28,14 (27,28–30,8)%, что явилось статистически значимым различием (ZT = 2,15; P = 0,03). Таким образом, при ПН, несмо-тря на повышение общей антиокислительной активности, наблюдается снижение ферментатив-ного звена антиокислительной системы.

Уровень конечного продукта перекисного окисления липидов МДА был ниже в основной груп-пе и составил соответственно 0,28 (0,21–0,37) мкмоль/л в основной и 0,46 (0,34–0,60) мкмоль/л в контрольной группе, различия явились статистически значимыми (ZT = 2,19; P = 0,028). Кор-реляционная связь между уровнем МДА и интенсивностью ХЛ не выявлена, что объясняется вкладом в интенсивность ХЛ других прооксидантов, в частности промежуточных продуктов ли-попероксидации.

При изучении состояния плода большое внимание уделяется исследованию ОВ. Последние обладают высокой аутоокисляемостью и слабой элиминирующей способностью в отношении продуктов перекисного окисления [16–19]. Определена общая антиокислительная активность 52 образцов ОВ. Околоплодные воды способны ингибировать или потенцировать процесс ауто-окисления адреналина. В случае, если добавление ОВ приводило к ускорению процесса аутоо-кисления адреналина и величина коэффициента составляла более 1, активность ОВ была оцене-на как проокислительная, при коэффициенте менее 1 – как антиокислительная. Коэффициент изменения скорости окисления адреналина околоплодными водами составил 1,062 (0,86–1,77)в основной и 0,76 (0,64–0,85) в контрольной группе. ОАОА околоплодных вод при хронической ПН статистически ниже (ZT = 2,55; P = 0,01). Низкие процентильные значения коэффициента (ме-нее 25 процентилей) статистически чаще выявлены у женщин контрольной группы (55,56 ± 16,56% в контрольной группе против 8,6 ± 5,9% в основной группе; РФишер = 0,033).

Анализ результатов функционирования системы ПОЛ–АОС показал различия показателей при физиологическом течении беременности и при формировании хронической ПН. Определено повышение ОАОА сыворотки крови у беременных при развитии синдрома задержки роста пло-да, что можно объяснить компенсаторно-приспособительными изменениями метаболических



Беларуси

70

процессов при ранней активации антиокислительной системы и вкладом длительной поддержи-вающей лекарственной терапии в суммарную антиокислительную активность сыворотки крови у таких пациенток.

Как известно, первой реакцией в системе перекисные процессы–антиокислительная защита на патологическое воздействие является активация ферментативного звена антиокислительной системы. При физиологически протекающей беременности к III триместру СОД увеличивается в 10 раз [20]. Выявленное нами снижение СОД после 37 недель беременности при ПН подтверж-дает предположение о длительном воздействии на антиокислительную систему, что приводит к истощению ферментативного звена АОЗ у пациенток данной группы. Низкая ферментативная активность СОД может быть объяснена также сниженной индукцией образования фермента, так как основной субстрат реакции дисмутации – супероксиданион радикал реагирует с оксидом азота с образованием пероксинитрита [21]. Согласованная работа ферментативного и нефермен-тативного звеньев антиокислительной защиты обеспечивает резервные адаптационные возмож-ности фетоплацентарного комплекса, а угнетение ферментативного компонента АОС накануне родоразрешения может иметь неблагоприятные последствия в процессе родов.

Установлено снижение ОАОА околоплодных вод при хронической ПН, что является отраже-нием сниженных компенсаторно-приспособительных реакций фетоплацентарного комплекса и, учитывая низкую элиминирующую способность ОВ в отношении прооксидантов, может оказы-вать неблагоприятное воздействие на плод.

Несколько неожиданным стало снижение уровня конечного продукта липопероксидации МДА при хронической ПН. Данные литературы об изменениях МДА при плацентарной недоста-точности противоречивы [9], но большинство исследователей указывают на повышение конеч-ного продукта ПОЛ при данном осложнении беременности [2, 8, 14]. Можно предположить, что выявленное снижение МДА при ПН является также следствием более ранней активации звеньев АОС с развитием компенсаторно-приспособительных реакций фетоплацентарного комплекса.

Выводы

1. Хроническая плацентарная недостаточность формируется при измененном балансе систе-мы перекисное окисление–антиокислительная защита.

2. При хронической плацентарной недостаточности наблюдаются разнонаправленные изме-нения антиокислительной активности: снижение ОАОА околоплодных вод (P = 0,01) и повыше-ние ОАОА сыворотки крови при формировании задержки роста плода (Р < 0,05).

3. Угнетение СОД (P = 0,03), одного из основных ферментов антиокислительной системы, при хронической плацентарной недостаточности позволяет рассматривать его в качестве веду-щей причины оксидативного стресса.


1. М а л е в и ч Ю. К., Ш о с т а к В. А. Фетоплацентарная недостаточность. Минск, 2007. 2. С а в е л ь е в а Г. М. Плацентарная недостаточность. М., 1991. 3. В и л ь ч у к К. У., Х а р к е в и ч О. Н., Г о р б а ч Л. А. // Современные перинатальные медицинские техно-

логии в решении проблем демографической безопасности: сб. науч. тр. и материалов науч.-практ. конф. Минск, 2008. С. 7–10.

4. П е р е с а д а О. А., П и с а р е н к о Е. А. // Мед. новости. 2007. № 10. С. 47–49.5. Д о б р о х о т о в а Ю. Э. [и др.] // Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2008. № 6. С. 33–36.6. А б р а м ч е н к о В. В. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве. СПб., 2001. 7. Б у р м и с т р о в С. О. [и др.] // Акушерство и гинекология. 2001. № 6. С. 17–20.8. К о т о в а Г. С., О д и н ц о в а Н. А. // Безопасное материнство в XXI веке: сб. материалов VIII съезда

акушеров-гинекологов и неонатологов РБ. Витебск, 2007. С. 204–207.9. Ф л о р е н с о в В. В., П р о т о п о п о в а Н. В., К о л е с н и к о в а Л. И. // Журн. акушерства и женских бо-

лезней. 2005. № 2. С. 44–49. 10. K i m Y. J. [et al.] // Reprod. Toxicol. 2005. Vol. 19, N 4. P. 487–492.11. B i r i A. [et al.] // Gynecol. Obstet. Invest. 2007. Vol. 64, N 4. P. 187–192.12. Ш к у р у п и й В. А. [и др.] // Бюл. РАМН. 2006. № 2. С. 159–165.



Беларуси

13. С и р о т а Т. В. // Вопр. мед. химии. 1999. № 45 (3). С. 263–272. 14. O h k a w a H., O h i s h i N., Y a g i K. // Anal. Biochem. 1979. Vol. 95, N 2. Р. 351–358.15. Б е л я к о в Н. А., С е м е с ь к о С. Г. // Эфферентная терапия. 2005. Т. 11, № 1. С. 5–21.16. Б у р л е в В. А. Свободнорадикальное окисление в системе мать–плацента–плод при акушерской патологии:

автореф. ... дис. д-ра мед. наук: 14.00.01, 03.00.04. М., 1992. 17. Ч е р н у х а Е. А. [и др.] // Акушерство и гинекология. 1986. № 12. С. 31–32.18. М а к а р о в О. В., Б а х а р е в а И. В., И д р и с о в а Л. С. // Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2004. № 4.

С. 24–29.19. B u r l i n g a m e J. M. [et al.] // Obstet. Gynecol. 2003. Vol. 101, N 4. P. 756–761.20. Ш е с т о п а л о в В. А. Метаболическая активность плацентарных макрофагов и молекулярные механизмы

формирования плаценты при различных вариантах течения беременности: автореф. ... дис. д-ра мед. наук: 03.00.04. Ростов н/Д, 2007.

21. C h a m y V. M. [et al.] // Biol. Res. 2006. Vol. 39. P. 229–236.

O. A. BUDJUKHINA1, E. I. BARANOVSKAJA1, A. I. GRITSUK1, D. R. PETRENYOV2

ROLE OF FACTORS OF PROOXIDANT-ANTIOXIDANT SYSTEMS OF BLOOD AND AMNIOTIC FLUID IN PREGNANT WOMEN IN PATHOGENESIS OF DEVELOPMENT OF CHRONIC FETOPLACENTAL

INSUFFICIENCY

1Gomel State Medical University, Belarus,2Institute of Radiobiology of NAS of Belarus, Gomel

Summary

Parameters of antioxidant and prooxidant activity in 109 pregnant women with chronic fetoplacental insuffi ciency and 33 pregnant women without thigh complication of pregnancy are investigated. Contrary changes in the total antioxidant activity (TAOA) are established: TAOA decrease of amniotic fl uid and TAOA increase of maternal blood with fetal growth retardation. In pregnant women with fetoplacental insuffi ciency after 37 week gestation, the fermentative link activity of anti-oxidant protection of superoxide dismutase is suppressed and the malondialdehyde level increases.



Беларуси

72


УДК 577.121:612.112.95.014.46

Е. А. ДЕВИНА, Т. Ю. ПРИНЬКОВА, А. Д. ТАГАНОВИЧ

ВЛИЯНИЕ N-АЦЕТИЛЦИСТЕИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ, КОНТАКТИРОВАВШИХ

С ЭКСТРАКТОМ СИГАРЕТНОГО ДЫМА, И ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЗМА АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И АЗОТА



Введение. Исследования последних лет показали, что одной из основных причин возникно-вения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) является курение табака [1]. Цент-ральная роль в развитии ХОБЛ отводится альвеолярным макрофагам (AM), что обусловлено их локализацией и наличием у них сильных эффекторных свойств. В частности, обсуждается воз-можное участие свободных радикалов, продуцируемых этими клетками, в формировании вос-палительной реакции.

В норме активные формы кислорода (АФК) и активные формы азота, образуемые АМ, явля-ются важными элементами защиты организма, так как обладают антибактериальными и проти-воопухолевыми свойствами, выполняют регуляторные функции [2]. Повреждающее действие АФК на клетки прослеживается в условиях, способствующих их избыточному образованию. При курении табака в легкие поступает большое количество оксидантов и АФК, содержащихся в сигаретном дыме (СД) [3]. Имея в своем составе неспаренные электроны, АФК, такие как су-пероксид анион (О2

.−) и гидроксильный радикал (ОН•), обладают высокой реакционной способ-ностью к окислению белков, ДНК и липидов. Продукты такого окисления могут непосред-ственно вызывать повреждение легких или действовать через стимуляцию образования в клетках вторичных активных радикалов или других биологически активных соединений [4]. Есть сведения, что повышенный уровень АФК формирует воспалительную реакцию в легких за счет активации таких факторов транскрипции, как ядерный фактор-kВ (NF-kB) и актива-торный белок-1 (AP-1) [5]. АФК могут стимулировать слизеобразование, ингибировать анти-протеазы и вызывать апоптоз клеток [6].

Основу антиоксидантной ферментативной защиты клетки составляют супероксиддисмута-за (СОД), каталаза и ферменты глутатион-редокс-цикла, так как они предотвращают цепные свободнорадикальные реакции посредством снижения концентраций радикалов, инициирую-щих этот процесс.

Выполненные нами ранее экспериментальные исследования in vitro показали, что СД ока-зывает выраженное влияние на окислительный метаболизм и функциональное состояние АМ. Было установлено, что при воздействии СД уменьшается доля жизнеспособных АМ в культуре клеток, нарушается структурная целостность клеточных мембран, снижается внутриклеточ-ный уровень нитрит-ионов, увеличивается продукция АФК на фоне угнетения активности ферментов антиоксидантной защиты и истощения пула восстановленного глутатиона (Г-SH), возрастает интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), угнетается фа-гоцитоз [7].

Учитывая, что АФК принимают участие в патогенезе ХОБЛ, изучается возможность исполь-зования антиоксидантов в качестве средств эффективного лечения этого заболевания.



Беларуси

73

N-Ацетилцистеин (N-АЦ) – фармакопейный лекарственный препарат, который используется для лечения больных ХОБЛ, поскольку обладает выраженным муколитическим действием. Муколитическая активность N-АЦ связана с наличием в его структуре SH-групп, которые раз-рывают дисульфидные связи белков слизи – протеогликанов, вызывая снижение вязкости мок-роты [8]. Появились доказательства способности N-АЦ оказывать антитоксическое и антиокси-дантное действие [9]. Кроме того, поставляя цистеин внутрь клеток, N-АЦ может вызывать по-вышение уровня Г-SH [10]. Есть данные, что у курильщиков N-АЦ способствует нормализации клеточного состава бронхо-альвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), уменьшает стимулиро-ванную продукцию АФК и уровень маркеров воспаления [11].

Сведения о влиянии N-АЦ на АМ как при контакте с СД, так и в его отсутствие, несмотря на важность этой информации, оказались немногочисленными и разрозненными.

С учетом вышеизложенного в данной работе изучалось прямое действие N-АЦ на альвеоляр-ные макрофаги, чтобы выяснить его способность устранять функциональные и метаболические сдвиги, вызванные воздействием СД.

Цель исследования – изучить эффекты N-ацетилцистеина на фагоцитарную активность, по-казатели оксидантно-антиоксидантного состояния и метаболизм оксида азота в альвеолярных макрофагах в условиях воздействия сигаретного дыма.

Материалы и методы исследования. АМ получали из БАЛЖ крыс. Лаважную жид-кость центрифугировали. Клеточный осадок ресуспендировали в 3 мл питательной среды ДМЕМ. Клеточную суспензию высевали на чашки Петри в концентрации 2·106 макрофагов, добавляли N-АЦ (0,01 мМ) и помещали в СО2-инкубатор (температура 37 °C, увлажненная атмосфера, 5% CO2) на 2 ч. После инкубации жидкую фазу удаляли, к адгезированным ма-крофагам добавляли ДМЕМ, обогащенную СД, содержавшим 0,7 и 2,1 г/л смол, и инкубиро-вали в течение 1 и 20 ч.

Экстракт сигаретного дыма (ЭСД) в концентрации 2,1 г/л был приготовлен путем пропуска-ния дыма от трех сигарет («Крона», Беларусь; содержание смол в 1 сигарете – 14 мг) со ско-ростью 1 сигарета/мин через 20 мл среды ДМЕМ с помощью вакуумного насоса. ЭСД в концен-трации 0,7 г/л получали путем разведения исходного экстракта. ЭСД-среду стерилизовали с по-мощью бактериального фильтра (Sigma, США) диаметром пор 0,22 мкм, рН 7,4.

Для стимуляции АМ использовали бактериальный липополисахарид (ЛПС) в концентрации 1 мкг/мл. После инкубации АМ соскребали с поверхности чашек скрепером и клеточную су-спензию гомогенизировали. Количество Н2О2 определяли спектрофотометрическим методом по реакции окисления 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина пероксидазой из хрена [12]. Содержание не-белковых SH-групп определяли спектрофотометрически с использованием реактива Эллмана. Генерацию NO· оценивали по концентрации стабильного конечного метаболита оксида азота – нит-рита (NO2

−). Активность СОД определяли непрямым спектрофотометрическим методом, осно-ванным на использовании реакции супероксидзависимого окисления кверцетина; глутатион-пероксидазы (ГПО) – по скорости окисления Г-SH в присутствии гидроперекиси трет-бути-ла [13]. Активность каталазы измеряли методом комплексонообразования с солями молибдена [14]. Для оценки фагоцитарной активности определяли фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число микроорганизмов (Staph. aureus), поглощенных одним АМ, и фагоцитарный показатель (ФП) – долю фагоцитирующих клеток (в %). Отклонения определяемых показателей оценивали путем сравнения их значений с полученными при исследовании АМ, которые не контактировали с СД (контроль). Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0. Статистическая значимость полученных результатов была оценена при по-мощи U-теста Манна–Уитни для непараметрических выборок. Различия считали значимыми при Р < 0,05.

Результаты и их обсуждение. При инкубации АМ в присутствии N-АЦ изменялись значе-ния определяемых показателей. Спустя 1 ч ФП увеличился в среднем на 7% и наблюдалась тен-денция к увеличению ФЧ (табл. 1). Через 1 и 20 ч инкубации клеток после контакта с N-АЦ степень увеличения проявлялась приблизительно одинаково. Концентрация Н2О2 в АМ через 1 ч после



Беларуси

74

прединкубации с N-АЦ снижалась на 18,5%. Через 20 ч этих различий уже не выявлялось. Как через 1 ч, так и через 20 ч после инкубации АМ, обработанных N-АЦ, в них значимо повыша-лись активность Кат, ГПО и уровень Г-SH. Активность Кат через 1 ч после обработки N-АЦ по-высилась на 26,8%, активность ГПО – на 15,7, внутриклеточная концентрация Г-SH – на 14,8%; через 20 ч после обработки клеток N-АЦ – на 20,2; 28,3 и 27,8% соответственно. Активность СОД не отличалась в контрольных АМ и обработанных N-АЦ.

Т а б л и ц а 1. Влияние N-ацетилцистеина на фагоцитарную активность и показатели оксидантно-антиоксидантного состояния альвеолярных макрофагов,

контактирующих с экстрактом сигаретного дыма

ПоказательУсловия инкубации альвеолярных макрофагов

Контроль + N-АЦ + ЭСД (0,7 г/л) + ЭСД (2,1 г/л) + N-АЦ + ЭСД (0,7 г/л) + N-АЦ + ЭСД (2,1 г/л)1 2 3 4 5 6

Длительность инкубации альвеолярных макрофагов с ЭСД – 1 ч

ФП, % 45,0(42,0−45,0)

48,0*(2–1)

(47,0−51,0)28,0* (3–1)

(26,0−30,0)19,0* (4–1), (4–3)

(17,0−22,0)32,0*(5–2), (5–3)

(32,0−35,0)25,0*(6–2), (6–4), (6–5)

(22,0−28,0)ФЧ 5,0

(4,7−6,0)5,2

(4,8−8,0)3,6*(3–1)

(2,7−4,2)3,4*(4–1)

(2,9−3,5)4,2*(5–2), (5–3)

(4,0−4,4)4,2*(6–2), (6–4)

(4,0−4,4)Н2О2,нМ/106 кл.

2,7(2,5−3,2)

2,2*(2–1)

(1,9−2,4)3,5*(3–1)

(3,4−3,5)4,0*(4–1), (4–3)

(3,6−4,4)2,8*(5–2), (5–3)

(2,6−3,1)3,0*(6–2), (6–4)

(2,8−3,3)СОД, Е/л 8,8

(8,3−9,3)9,6

(8,5−9,6)8,6

(8,4−9,1)7,4*(4–1), (4–3)

(6,4−7,9)9,6

(8,6−11,8)8,8

(7,7−10,0)Каталаза, Е/мг белка 52,9

(47,3−55,2)67,1*(2–1)

(64,2−70,1)37,7*(3–1)

(34,4−42,1)27,0* (4–1), (4–3)

(26,5−37,2)51,8* (5–2), (5–3)

(44,4−57,4)48,0* (6–2), (6–4), (6–5)

(44,0−52,0)ГПО, мкМ/мин/мг белка

54,7(53,6−54,8)

63,3* (2–1)

(62,5−63,9)49,9* (3–1)

(43,0−50,0)22,9* (4–1), (4–3)

(22,5−24,3)52,3* (5–2), (5–3)

(50,3−60,1)25,3*(6–2), (6–4),(6–5)

(23,8−25,4)Г-SH, нМ/мг белка 12,2

(11,5−16,4)14,0* (2–1)

(13,9−17,5)10,2* (3–1)

(10,0−10,7)8,9*(4–1), (4–3)

(8,7−9,0)12,0* (5–2), (5–3)

(12,0−12,2)10,0**(6–2), (6–4),(6–5)

(9,5−11,2)

Длительность инкубации альвеолярных макрофагов с ЭСД – 20 ч

ФП, % 42,0(39,0−44,0)

45,5* (2–1)

(44,5−47,0)27,5* (3–1)

(26,0−29,5)18,0* (4–1)(4–3)

(16,0−20,5)30,5* (5–2)

(28,5−31,5)21,0* (6–2), (6–5)

(18,0−22,5)ФЧ 6,5

(5.8,−6,8)6,7

(6,4−6,9)3,7* (3–1)

(3,3−4,7)3,3* (4–1)

(2,5−3,7)3,1* (5–2)

(2,7−4,4)2,5* (6–2)

(2,2−3,5)Н2О2,нМ/106 кл.

3,0(2,7−3,2)

3,4(2,8−3,5)

3,6* (3–1)

(3,4−3,6)4,5* (4–1), (4–3)

(3,9−5,1)3,4

(2,5−3,7)4,3

(3,1−4,9)СОД, Е/л 12,5

(9,4−13,1)12,6

(12,3−13,2)3,3* (3–1)

(2,4−3,5)2,1* (4–1), (4–3)

(1,9−2,2)2,8* (5–2), (5–3)

(2,8−3,3)1,9

(1,8−3,0)Каталаза, Е/мг белка 62,4

(52,3−64,2)75,0* (2–1)

(68,5−81,1)22,4* (3–1)

(21,1−27,7)21,0* (4–1), (4–3)

(19,0−21,6)22,8* (5–2)

(22,1−27,5)21,3* (6–2)

(16,9−22,0)ГПО, мкМ/мин/мг белка

60,0(59,0−65,0)

77,0* (2–1)

(76,2−77,0)35,4* (3–1)

(33,3−36,2)26,2* (4–1), (4–3)

(22,8−31,3)26,8* (5–2)

(22,1−27,5)18,6*(6–2), (6–4), (6–5)

(17,8−19,7)Г-SH, нМ/мг белка 9,0

(8,7−9,5)11,5* (2–1) (11,1−12,0)

6,3* (3–1)

(5,9−6,6)5,8* (4–1)

(5,2−6,2)6,8* (5–2)

(5,8−7,4)6,0* (6–2)

(5,9−6,3)

П р и м е ч а н и е. Контроль − клетки инкубировали в питательной среде без добавления ЭСД или N-АЦ; + N-АЦ − клетки прединкубировали 2 ч в питательной среде с добавлением N-АЦ (концентрация 0,01 мМ); + ЭСД − клетки инкуби-ровали с ЭСД; + N-АЦ+ ЭСД− клетки после прединкубации с N-АЦ инкубировали в присутствии ЭСД. * − Р < 0,05. Цифры в скобках верхнего индекса обозначают сравниваемые группы или столбцы. n = 10.

ФП уменьшился через 1 ч и еще более выраженно – через 20 ч инкубации АМ в среде, со-державшей ЭСД. У обработанных с N-АЦ клеток ФП через 1 ч контакта с ЭСД был досто-верно выше, чем у клеток без N-АЦ, на 14,3 и 31,6% (соответственно концентрации смол в ЭСД (0,7 и 2,1 г/л)), хотя медианы значений оставались ниже контрольных. Аналогичные из-менения отмечались для ФЧ.



Беларуси

75

Через 20 ч контакта с ЭСД у АМ, предварительно обработанных N-АЦ, ФП был выше, чем у клеток без прединкубации с N-АЦ, но только при минимальной концентрации ЭСД (0,7 г/л). При этом наблюдалась тенденция к еще большему снижению ФЧ (табл. 1).

Уровень Н2О2 в АМ под влиянием ЭСД значительно повысился. Причем данные демонстри-руют прямую концентрационную зависимость этого повышения от дозы ЭСД (через 1 ч – на 29,6 и 48,1%, через 20 ч – на 20 и 50% соответственно по отношению к контролю). В клетках, пред-варительно обработанных N-АЦ с последующей инкубацией с ЭСД, в течение 1 ч количество Н2О2 уменьшилось на 20% при концентрации ЭСД 0,7 г/л и на 25% при концентрации ЭСД 2,1 г/л по сравнению с АМ, не обработанными N-АЦ. После 20 ч инкубации с ЭСД предварительная об-работка АМ ацетилцистеином не сопровождалась существенным изменением уровня Н2О2 по сравнению с клетками, не обработанными N-АЦ.

Активность СОД практически не претерпела изменений во всех экспериментальных груп-пах, когда она определялась в АМ, контактировавших с ЭСД в течение 1 ч. Исключение состави-ла группа, в которой АМ инкубировались в ЭСД в концентрации 2,1 г/л. Более длительная (20 ч) инкубация АМ с ЭСД сопровождалась резким падением активности этого фермента – с 12,5 Е/л в контроле до 3,3 Е/л при концентрации ЭСД 0,7 г/л и до 2,1 Е/л при концентрации ЭСД 2,1 г/л (приведены медианы значений). В клетках, обработанных N-АЦ, активность СОД не отличалась от таковой в необработанных клетках. Активность Кат и ГПО значительно снижалась после экспози-ции с ЭСД по сравнению с контролем (после 1 ч инкубации: Кат – на 28,7 и 49% по мере увеличе-ния концентрации ЭСД, ГПО – на 8,7 и 58,1% соответственно; после 20 ч инкубации: Кат – на 64,1 и 66,3%, ГПО – на 41 и 56,3% соответственно). Аналогично снизилось количество восстановлен-ного Г-SH в АМ. Увеличение длительности инкубации сопровождалось статически значимым уменьшением уровня Г-SH – в среднем на 16,2%.

В клетках, предварительно обработанных N-АЦ, снижение уровня этих показателей также имело место. При этом оно практически не отличалось от такового в клетках без прединкубации с N-АЦ, когда они контактировали с ЭСД в течение 20 ч. В АМ, которые инкубировались с ЭСД в течение 1 ч, активность Кат существенно выросла под влиянием N-АЦ (на 37,4% при концен-трации ЭСД 0,7 г/л и на 77,7% при концентрации ЭСД 2,1 г/л), однако в обоих случаях она не до-стигла контрольного уровня. Активность ГПО и концентрация Г-SH в клетках, обработанных N-АЦ, также были статистически достоверно выше, чем в необработанных АМ, но ниже кон-трольных значений.

Концентрация нитрит-ионов в АМ, стимулированных ЛПС, более чем в 3 раза превышала их концентрацию в нестимулированных клетках (табл. 2). Уровень NO2

− после прединкубации АМ с N-АЦ снижался. Это отчетливо прослеживалось в нестимулированных ЛПС клетках и еще более – в стимулированных. Выраженность снижения концентрации NO2

− в стимулированных клетках была большей при концентрации N-АЦ 0,01 мМ и составила 17%, а при концентрации N-АЦ 0,1 мМ – 26,8% (Р < 0,05).

Т а б л и ц а 2. Влияние N-ацетилцистеина на уровень нитрит-ионов в АМ, контактирующих с экстрактом сигаретного дыма

ПоказательКонтроль +0,01мМ

N-АЦ +0,1мМ N-АЦ +ЭСД (0,7 г/л) +ЭСД (2,1 г/л)

ЭСД (0,7 г/л) +N-АЦ

(0,01 мМ )

ЭСД (2,1 г/л) + N-АЦ

(0,01 мМ)

ЭСД (0,7 г/л) + N-АЦ (0,1 мМ)

ЭСД (2,1 г/л) + N-АЦ (0,1 мМ)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

NO2– в не сти-

му ли рован ных АМ, нМ/106 кл.

4,4(4,3–4,5)

4,1* (2–1)

(4,0–4,3)4,0* (3–1)

(3,7–4,2)1,8* (4–1)

(1,6–2,0)2,9* (5–1), (5–4)

(2,7–3,1)1,9

(1,9–2,1)3,0* (7–6)

(2,9–3,1)2,3* (8–4), (8–6)

(2,2–2,5)3,5* (9–5),(9–7)

(3,3–3,7)

NO2– в АМ +

ЛПС, нМ/106 кл.14,2

(12,9–15,4)11,8* (2–1)

(11,2–12,0)10,4* (3–1), (3–2)

(10,1–10,6)5,8* (4–1)

(5,6–6,2)6,6* (5–1), (5–4)

(6,5–6,8)6,7* (6–4)

(6,5–6,9)7,3* (7–5),(7–6)

(7,1–7,6)7,8* (8–4)

(7,7–8,0)8,4* (9–5),(9–7)

(8,1–8,6)

П р и м е ч а н и е. Контроль – клетки инкубировали в питательной среде в течение 20 ч без добавления ЭСД или N-АЦ; + N-АЦ – клетки прединкубировали 2 ч в питательной среде с добавлением N-АЦ (0,01 или 0,1 мМ); + ЭСД – клетки инкубировали с экстрактом сигаретного дыма; ЭСД + N-АЦ – клетки после прединкубации с N-АЦ инкубировали в присутствии ЭСД; + ЛПС – клетки инкубировали в течение 20 ч с ЭСД (0,7; 2,1 г/л) и без ЭСД в присутствии липопо-лисахарида (1 мкг/мл). Каждое значение представляет результат четырех независимых экспериментов. – Р < 0,05.



Беларуси

76

В результате инкубации с ЭСД резко снижалось количество нитрит-ионов в АМ. При кон-центрации ЭСД в среде инкубации 0,7 г/л в нестимулированных клетках степень снижения со-ставила 59%, а в стимулированных – 99% (табл. 2). При концентрации ЭСД 2,1 г/л как в стиму-лированных, так и в нестимулированных ЛПС АМ наблюдалась несколько более высокая кон-центрация NO2

−, чем в клетках, инкубировавшихся с ЭСД в концентрации 0,7 г/л, но она все равно оставалась значительно ниже контрольного уровня.

В клетках, предварительно обработанных N-АЦ и контактировавших с ЭСД, уровень NO2−

был выше, чем в клетках без N-АЦ. Особенно это было заметно в АМ, стимулированных ЛПС. Имела значение и концентрация N-АЦ. В образцах клеток, обработанных 0,1 мМ N-АЦ, уровень NO2

− был существенно выше, чем при концентрации 0,01 мМ N-АЦ.Как показали результаты нашего исследования, уровень Г-SH увеличился после прединкуба-

ции клеток с N-АЦ. Поскольку выраженность увеличения была приблизительно одинаковой че-рез 1 и 20 ч, можно полагать, что эффект появился сразу и в дальнейшем не имел развития. Это может быть обусловлено непрямым антиоксидантным действием N-АЦ, которое заключается в том, что он является предшественником Г-SH. Исследования in vitro показали, что N-АЦ легко проходит через клеточную мембрану и затем деацилируется, превращаясь в цистеин, который расходуется на синтез Г-SH [15].

Г-SH используется клетками, главным образом, для обезвреживания токсичных продуктов. В частности, он является участником глутатионпероксидазной реакции, в ходе которой разру-шается Н2О2. Полученные нами результаты показывают стимулирующее влияние N-АЦ на ак-тивность ГПО в АМ, которое, подобно уровню Г-SH, проявилось в течение 1 ч. С учетом этого обстоятельства реальное повышение количества Г-SH под влиянием N-АЦ может быть больше наблюдаемого в нашей работе.

Увеличению активности ГПО под влиянием N-АЦ сопутствовало повышение актив-ности Кат, которая также катализирует расщепление Н2О2. В клетках, обработанных N-АЦ, активность СОД не изменялась, а точнее, имелась лишь тенденция к ее увеличению. Этот фермент ответственен за продукцию Н2О2. Таким образом, N-АЦ создает в АМ предпо-сылки для усиления катаболизма Н2О2 при неизменной его продукции. Можно было бы считать закономерным наблюдаемое нами снижение концентрации Н2О2 в АМ через 1 ч по-сле прединкубации клеток с N-АЦ. Однако через 20 ч подобного снижения уже не на-блюдалось.

Имеющиеся в литературе сведения о том, что N-АЦ способен влиять на образование АФК, противоречивы. Вначале было установлено, что очень высокая концентрация N-АЦ (более 15 мМ) ингибирует люминол-зависимую хемилюминесценцию нейтрофилов и моноцитов [16]. Позже это было объяснено как артефакт [17]. Впоследствии были опубликованы результаты, согласно которым N-АЦ в концентрации 100 мкмоль снижает уровень Н2О2 в среде инкубации интакт-ных и предварительно стимулированных АМ [18].

Краткосрочный эффект снижения уровня Н2О2 в АМ под влиянием N-АЦ, неизменная активность СОД и сохраняющееся в течение длительного времени повышенная активность ферментов катаболизма Н2О2 наводят на мысль о существовании других путей его превраще-ния. Было показано, что SH-группы N-АЦ способны взаимодействовать с Н2О2. В результате образуется конечный продукт – дисульфидная форма N-АЦ [19]. В связи с этим некоторые авторы допускают, что снижение образования Н2О2 в макрофагах, обработанных N-АЦ, свидетель-ствует об антиоксидантном действии N-АЦ в большей степени, нежели о его влиянии на кле-точные механизмы [20].

В целом благоприятное влияние N-АЦ на оксидантно-антиоксидантное состояние интакт-ных АМ сочеталось с повышением фагоцитарной активности клеток, на что указывает увеличе-ние ФП. Стимулирующее влияние N-АЦ на фагоцитарную активность АМ наблюдали и другие исследователи [18].

Приведенные в данной работе результаты еще раз наглядно продемонстрировали, что в АМ, которые контактировали с СД, нарушено равновесие оксиданты/антиоксиданты в сторо-



Беларуси

77

ну накопления АФК, в частности Н2О2, и снижения активности важнейших антиоксидантных ферментов.

Выраженность изменений, как правило, зависела от концентрации ЭСД и была наибольшей при концентрации 2,1 г/л. Количественные особенности, как и ожидалось, сводились к боль-шей выраженности изменений при длительной инкубации клеток с ЭСД. Эти данные свиде-тельствуют о том, что развитие оксидативного стресса и сопряженное с ним снижение фаго-цитарной активности проявляется в АМ уже при минимальном (по времени) контакте с СД, а при более продолжительном контакте уже имеющиеся изменения усугубляются.

В макрофагах, контактировавших с ЭСД, N-АЦ снижал выраженность изменений некоторых из определяемых показателей. Наблюдалось незначительное увеличение ФП. Однако контроль-ный уровень поглотительной способности клеток не был достигнут ни при кратковременном, ни при длительном контакте с ЭСД.

Влияние N-АЦ на показатели оксидантно-антиоксидантного состояния после контакта с ЭСД также было различным. Анализ работы ферментов, участвовавших в метаболизме Н2О2, показал, что N-АЦ эффективно препятствовал снижению их активности только при кратковре-менном контакте АМ с ЭСД. В результате длительного контакта с ЭСД в клетках с N-АЦ актив-ность ГПО и СОД еще больше снизилась. Аналогичным образом уменьшение снижения концен-трации Г-SH в АМ, контактировавших с СД, но прединкубированных с N-АЦ, имело место толь-ко при кратковременном контакте с ЭСД. Следствием несостоятельности регуляторного влияния N-АЦ при длительном контакте АМ с ЭСД на вышеназванные показатели представляется на-блюдаемое нами отсутствие снижения первоначально повышенной под воздействием ЭСД кон-центрации Н2О2.

Согласно данным литературы, в ряде исследований in vitro и in vivo изучалось влияние N-АЦ на функциональные и метаболические сдвиги в АМ, контактировавших с СД [21]. Так, СД, по-ступавший в легкие мыши через трахею, вызывал дозозависимое снижение общего легочного фонда Г-SH. Введение N-АЦ вместе с СД предотвращало снижение Г-SH в легких [15]. Есть дан-ные и об улучшении фагоцитарной активности АМ, инкубировавшихся с N-АЦ и контактиро-вавших с СД [21].

С внутриклеточным метаболизмом АФК тесно связан метаболизм NO, который, выступая в качестве сигнальной и регуляторной молекулы, является частью эффекторного механизма не-специфической защиты [22]. В АМ синтез NO катализирует индуцибельная NO-синтаза (iNOS). Образовавшийся NO функционирует в клетке в течение 6–10 с. Его дальнейший метаболизм имеет три варианта развития. Он может реагировать с гемопротеинами, образуя пероксинитрит (ONOO.) в реакции с О2

.–.. Причем скорость этой реакции превышает скорость реакции, катали-зируемой СОД [23]. NO может окислять соединения, содержащие SH-группы, с образованием нитрозотиолов (RS-NO). В растворенном состоянии NO, взаимодействуя с О2, способен образо-вывать неактивный метаболит – нитрит (NO2

–.).Уровень нитритов, измеренный в АМ, стимулированных ЛПС, более чем в 3 раза превышал

их содержание в нестимулированных клетках. ЛПС использовали в качестве стимулятора iNOS [24]. Дозозависимое снижение концентрации нитрит-ионов в АМ под влиянием ЭСД и неболь-шой, но значимый дозозависимый прирост, если инкубации с ЭСД предшествовала обработка клеток N-АЦ, имели место в интактных АМ, но еще больше в АМ, стимулированных ЛПС. Об ингибирующем влиянии ЭСД на образование NO мы сообщали ранее, сформировав гипотезу, согласно которой избыток нитритов в ЭСД ингибирует по принципу обратной связи работу iNOS в АМ [7]. Кроме того, NO в клетке быстро взаимодействует с О2

.– с образованием пе-роксинитрита. Тот, в свою очередь, способен модифицировать цистеиновые остатки (Cys-94 и Cys-99), обеспечивающие внутримолекулярное взаимодействие между двумя мономерами iNOS. В результате происходит конформационное изменение белка-фермента и снижается его активность [25].

Возникает вопрос: с чем связан некоторый подъем уровня NO2–. в АМ после прединкубации

их с N-АЦ, контактировавших с ЭСД? N-АЦ может напрямую взаимодействовать с продуктами



Беларуси

78

катаболизма NO, сокращая тем самым его пул в клетке. Такое предположение нельзя назвать го-лословным, поскольку показана способность N2O3 и N2O4 нитрозилировать тиоловые группы в составе альбумина, глутатиона с образованием нитрозотиолов [26]. В таком случае становится понятным установленное снижение концентрации NO2

–. в АМ, не контактировавших с ЭСД, но инкубировавшихся с N-АЦ. Уменьшенное количество NO не так эффективно тормозит работу NO-синтазы. Поэтому синтез NO подавляется под влиянием ЭСД, но в меньшей степени, чем в АМ, обработанных N-АЦ.

Выводы

1. N-ацетилцистеин, контактируя с альвеолярными макрофагами, увеличивает их фагоци-тарную активность, уровень восстановленного глутатиона, активность каталазы и глутатионпе-роксидазы, снижает концентрацию пероксида водорода и конечных продуктов катаболизма мо-нооксида азота. Эти изменения ярко проявляются в течение 1 ч после контакта с N-аце тил-цистеином. В дальнейшем они или не имеют развития, или исчезают.

2. N-ацетилцистеин препятствует снижению фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов, уровня SH-соединений, росту количества пероксида водорода и снижению актив ности антиоксидантных ферментов, уровня конечных катаболитов монооксида азота в альвеолярных макрофагах в условиях кратковременного (1 ч) воздействия ЭСД. Более про-должительный контакт клеток с ЭСД минимизирует такое протекторное действие N-аце-тилцистеина.

Таким образом, выявленное отсутствие или минимизация защитного действия N-АЦ при дли-тельном контакте СД с альвеолярными макрофагами in vitro могут ограничивать его антиокси-дантную эффективность у курильщиков, клетки легких которых длительно и неоднократно кон-тактируют с сигаретным дымом.

Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда фундаментальных исследований НАН Беларуси.

Литературa

1. B a r n e s P. J., S h a p i r o S. D. // Eur. Respir. J. 2003. Vol. 22. P. 672–688. 2. H a l l i w e l l В. // Ann. Rev. Nutr. 1996. Vol. 16. Р. 33–50.3. P r y o r W. A. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1993. Vol. 686. P. 12–28.4. В л а д и м и р о в Ю. А. // Вестн. РАМН. 1998. № 7. С. 43–51.5. B a r n e s P. J. // Pharm. Rev. 2004. Vol. 56 (4). P. 515–548.6. R a h m a n I., A d c o c k I. // Eur. Respir. J. 2006. Vol. 28. P. 219–242.7. Д е в и н а Е. А., Т а г а н о в и ч А. Д. // Журн. лаб. диагн. 2009. № 4 (50). С. 7–12.8. Х а р к е в и ч Д. А. // Фармакология. 2004. С. 204–206.9. G i l l i s e n A., N o v a c D. // Respir. Med. 1998. Vol. 924. P. 609–623.10. M a c N e e W., R a h m a n I. // Eur. Respir. J. 2000. Vol. 16. P. 534–554.11. S t e y C., S t e u r e r J. // Eur. Respir. J. 2000. Vol. 16. P. 253–262.12. G a l l a t i H. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985. Vol. 23, N 8. P. 453–460.13. М о и н В. М. // Лаб. дело. 1986. № 12. С. 724–727.14. К о р о л ю к М. А. // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16–17. 15. M o l d e u s P., C o t g r e a v e I. // J. Respir. 1986. Vol. 50. P. 31–42. 16. K h a r a z m i A. // Int. J. Immunopharm. 1988. Vol. 10. P. 39–46. 17. D r o s t E., L a n n a n S. // Eur. Respir. J. 1991. Vol. 4. P. 723–729.18. A r u o m a O. // Free Radic. Biol. Med. 1989. Vol. 6. P. 593–597.19. C o t g r e a v e I. // Adv. Pharm. 1997. Vol. 38. P. 205–227.20. D e n t G., R a b e K. // Br. J. Pharm. 1997. Vol. 122. P. 758–764.21. L i n d e n M. // Eur. Respir. J. 1988. Vol. 1 (7). P. 645–650.22. B o g d a n C // Nat. Immunol. 2001. Vol. 2. P. 907–916.23. H e y C. // Naunyn-Schm. Arch. Pharm. 1995. Vol. 351. P. 651–659.24. M a c M i c k i n g J. D. // Annu. Rev. Immunol. 1997. Vol. 15. P. 323–350.25. C h a m b e r s D., T u n n i c l i f f e W. // Thorax J. 1998. Vol. 53. Р. 677–679.26. F i s c m a n n T., H r u z a A. // Nat. Struct. Biol. 1999. Vol. 6, N 3. Р. 233–242.



Беларуси

E. A. DEVINA, T. Y. PRINKOVA, A. D. TAHANOVICH

EFFECT OF N-ACETYLCYSTEIN ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY AND METABOLISM OF REACTIVE SPECIES IN ALVEOLAR MACROPHAGES EXPOSED

TO CIGARETTE SMOKE

Belarusian State Medical University, Minsk

Summary

We studied the effect of N-acetyl-L-cysteine (N-AC) on the phagocytic activity, the generation of reactive oxygen and nitrogen species, and the enzymatic antioxidant activity in the alveolar macrophages (AMs) exposed to cigarette smoke extract (CSE). AMs were isolated from bronchoalveolar lavage fl uid of rats. AMs were preincubated with N-AC (0.01 mM), after this the cells were exposed to CSE during 1 and 20 h. The protective effect of N-AC was found. It was established that N-acetyl-L-cysteine prevented the reduction of SH-compounds and the reduction of the activity of anti-oxidant enzymes in the AM after short-term (1 h) incubation with CSE, but N-AC did not prevent the reduction of SH-compounds and the decrease in the activity of superoxid dismutase, catalase and glutathione peroxidase that took place after long-term (24 h) cell incubation with CSE. However, the degree of this reduction was less expressed in the presence of N-AC.



Беларуси

80


УДК 577.171.5:547.962+591.147.1:599.323.4

В. В. ВИНОГРАДОВ1, А. В. ТУМАНОВ1, П. В. ГОЛЫШКО1, Я. Р. МАЦЮК2, В. П. АНДРЕЕВ2, С. В. ВИНОГРАДОВ2, Ю. В. ЯРОЦКИЙ1

ВЛИЯНИЕ ТИРОКСИНА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ТИРОЦИТОВ ПОСЛЕ СУБТОТАЛЬНОЙ РЕЗЕКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У КРЫС

1Научно-производственный центр «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси», Гродно,2Гродненский государственный медицинский университет, Беларусь


Введение. Известно, что после парциальной тиреоидэктомии в культе щитовидной железы (ЩЖ) в результате увеличения рабочей нагрузки по компенсации послеоперационного гипоти-реоза оставленная часть паренхимы претерпевает функциональное возбуждение и гипертрофию ее секреторных элементов [1]. Согласно [2], начальная гипертрофия тироцитов в дальнейшем переходит в их гиперплазию. Физиологический смысл такой трансформации видится в том, что высокопризматическая форма, которую принимают тироциты при повышении функциональной активности ЩЖ в процессе гипертрофии, способствует эндомитозу – образованию двуядерных клеток и их последующему делению в поперечном направлении, с которого начинается экстра-фолликулярная пролиферация тиреоидной паренхимы.

В этой связи было важно оценить постоперационную гиперплазию тиреоидного остатка ЩЖ при искусственном снижении функциональной нагрузки на тироциты в условиях гипертиреоза, вызванного введением экзогенных йодтиронинов.

Цель работы состояла в изучении влияния L-тироксина (L-Т4) на пролиферацию тироцитов после субтотальной резекции (СР) щитовидной железы у крыс и в раскрытии механизмов обна-руженных эффектов.

Материалы и методы исследования. Влияние тироксина на пролиферацию тироцитов у крыс исследовали до и через 2 мес. после СР ЩЖ (удаление левой и половины правой доли), которая сама по себе стимулирует рост тиреоидного остатка за счет активации в нем гормоносинтеза и уси-ления регенерации ткани на месте утраченного в результате оперативного вмешательства фрагмен-та. Эксперименты проводили на 40 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 150–200 г. Животные были разделены на четыре группы по 10 особей в каждой. Первая группа состояла из интактных животных, которые служили контролем. Вторая группа включала животных, получав-ших перорально с помощью металлического зонда L-тироксин в дозе 40 мг/кг массы тела, эмуль-гированный в 0,2 мл дистиллированной воды, в течение 14 дней. Третью группу составили живот-ные, на момент обследования которых прошло 2 мес. после СР. Чет вер тая группа через 1,5 мес. после операции получала L-тироксин в дозе 40 мкг/кг, вводимый анало гичным путем в течение 14 дней.

Материал щитовидных желез сразу после забора фиксировали в жидкости Карнуа и заклю-чали в парафин. Изготовленные парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксили-ном и эозином для изучения общей микроструктуры щитовидных желез крыс. Срезы толщиной 10 мкм подвергали гистохимической обработке по А. Шабадашу с целью определения функцио-нальной активности тироцитов и содержания в коллоиде гликопротеинов.

Кариометрические исследования (определение площади, периметра и диаметра ядер) окра-шенных гематоксилин-эозином срезов оптимальной толщины (5 мкм, что не более чем в 1,5–2 раза превышало средний диаметр измеряемых ядер), проводили при помощи компьютерного анализа изображений Bioscan NT 2.0 (It Lab., Беларусь), микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия) при увеличении 40 и цифровой видеокамеры Sony (DFW-X 710, Япония). Измеряли только те ядра, которые попадали в срез целиком. Идентификацию целых ядер осуществляли традиционным



Беларуси

81

способом (фокусировка с помощью вращения микровинта микроскопа). Для количественных из-мерений обводили контуры 40–50 ядер.

Для исследования эндомитозов ткань ЩЖ животных контрольной и опытной групп фикси-ровали глютаровым альдегидом и четырехокисью осмия и заливали в смесь метилового и бути-лового метакрилатов. Серийные полутонкие срезы толщиной 0,5–1,0 мкм окрашивали смесью красителей – азура II и основного фуксина. Окрашенные препараты изучали методом световой микроскопии и фотографировали с помощью цифровой фотокамеры Canon Power Shot А710.

Процентное содержание двуядерных форм в общей популяции 100 специализированных кле-ток проводили с помощью микрометрической сетки, вставленной в окуляр микроскопа «Биолам Л-211» (× 400). Полученный цифровой материал обрабатывали методами параметрической ста-тистики, используя лицензионную компьютерную программу Statistica 6.0 для Windows.

Результаты и их обсуждение. По сравнению с контролем (рис. 1, а, б) 14-дневное введение L-Т4 приводит к уплощению эпителия фолликулярной стенки, увеличению размеров фоллику-

Рис. 1. Влияние тироксина и СР на общий вид фолликулов цельной ЩЖ и ее постоперационного фрагмента (а, в, д, ж), а также на содержание в них гликопротеинов (б, г, е, з): а, б – контроль; в, г – тироксин; д, е – СР; ж , з – СР + тироксин. × 200



Беларуси

82

лов за счет расширения внутрифолликулярных полостей, полностью заполненных коллоидом, содержащим большое количество гликопротеинов (рис. 1, в, г), что морфологически отражает снижение секреторной активности тироцитов.

На фоне СР (рис. 1, д, е) резкая гиперплазия сопровождается уменьшением просвета фолли-кулов с ослаблением реакции базальных мембран фолликулов, а также коллоида с HJO4, окис-ляющим гликолевые группы в диальдегиды (ШИК-реакция), что указывает на физиологическое перенапряжение и функциональное истощение тиреоидной ткани. Антитиреоидное действие L-Т4 на эндокринную паренхиму ЩЖ визуально подтверждается развитием функциональной ареактивности ЩЖ: уменьшением отечности эндокринной паренхимы ЩЖ, сужением междоле-вых и межфолликулярных пространств, а также заметно большим, чем в группе СР, заполнени-ем фолликулов коллоидом, содержащим значительное количество гликопротеинов (рис. 1, ж, з).

Через 2 мес. после СР в пульпообразном регенерате ЩЖ начинают массово появляться пер-вые фолликулы, содержащие небольшое количество коллоида и гликопротеинов. Они, как пра-вило, малых размеров. Стенка у многих из них складчатая, вероятно, за счет продолжающегося деле-ния эпителиальных клеток. Тироциты в фолликулах низкопризматической формы (6,0 ± 0,17 мкм) с явлениями микровакуолизации (рис. 2, а, б).

После 14-дневного введения L-тироксина процесс образования фолликулов в регенерате идет быстрее, чем после одной СР. Зачастую их стенка отличается складчатостью. Тироциты фолли-кулов кубической или уплощенной формы, высотой в среднем 4,9 ± 0,17 мкм, за счет чего про-светы фолликулов увеличиваются. Коллоида в фолликулах мало, содержание гликопротеинов невысокое (рис. 2, в, г).

Для зоны в основании регенерата характерны гиперемия, сочетающаяся с образованием ла-кун и усиление васкуляризации, сопровождающейся выходом из сосудистого русла гематоген-ных макрофагов (рис. 3, а). Вблизи регенерирующих сосудов группируются эпителиальные клетки, а также фиброциты и фибробласты, продуцирующие коллаген, необходимый для фор-мирования стромы (рис. 3, в). За счет клеток межфолликулярных островков (рис. 3, д), которые делятся эндомитотически – путем перешнуровки ядер и последующей цитотомии, в под-лежащей регенерату сильно васкуляризованной ткани происходит образование новых фол-ликулов (рис. 3, ж).

Рис. 2. Фолликулярная структура (а, в) и содержание гликопротеинов (б, г ) в постоперационном регенерате ЩЖ через 2 мес. после СР (а, б) и СР + 14-дневное введение тироксина (в, г). × 400



Беларуси

83

Рис. 3. Тиреоидный остаток (зона в основании регенерата) через 2 мес после СР (а, в, д, ж) и СР + 14-дневное введе-ние тироксина (б, г, е, з): а, б – усиление васкуляризации; в, г – рост стромы; д, е – образование новых фолликулов в межфолликулярных островках; ж, з – эндомитотическое деление тироцитов – образование двуядерных клеток. × 1000

При принудительной тиреоидизации L-Т4, создающей высокую концентрацию гормона ЩЖ в организме, в постоперационной зоне активируются все фазы репарации: от усиления васкуляри-зации (рис. 3, б) и роста стромы (рис. 3, г) до образования новых железистых структур (рис. 3, е) и деления тироцитов с образованием двуядерных клеток (рис. 3, з).

Зависимая от введения экзогенного тироксина гипотрофия тироцитов документируется дан-ными морфометрии и кариометрии: достоверно уменьшается высота секреторных клеток, а так-же площадь, диаметр и периметр их ядер. Морфометрически о выраженном антитиреоидном действии L-Т4 на фоне СР свидетельствует отчетливое уменьшение высоты тироцитов и карио-



Беларуси

84

метрических параметров их ядер по сравнению с данными показателями у животных остальных групп (см. таблицу).

В регенерате уплощающее действие L-Т4 на тироциты выражено гораздо слабее, чем в остатке: высота клеток в регенерате снижается всего в 1,2 раза против 2,0 в остатке; пло-щадь, диаметр, периметр ядер в регенерате не изменяются, а в остатке – достоверно снижают-ся (см. таблицу). По-видимому, экзогенный гормон вызывает функциональную гипотрофию (уплощение) дифференцированных, активно функционирующих секреторных элементов остатка, но не слабо дифферен цированных, еще не функционирующих в полной мере эпители-альных клеток регенерата.

Морфометрические и кариометрические параметры тироцитов в тиреоидном остатке и регенерате после субтотальной резекции щитовидной железы и введения тироксина

ПоказательГруппа

Контроль L -Т4 СР СР + L-Т4

Цельная железа Тиреоидный остатокВысота тироцитов, мкм 8,77 ± 0,21 5,44 ± 0,13* 9,11 ± 0,20 4,53 ± 0,15*

Площадь ядра, мкм2 18,45 ± 0,35 16,68 ± 0,35* 18,46 ± 0,44 15,01 ± 0,49*

Диаметр ядра, мкм 4,31 ± 0,06 3,99 ± 0,08* 4,35 ± 0,07 3,53 ± 0,10Периметр ядра, мкм 16,75 ± 0,17 16,19 ± 0,21* 17,97 ± 0,36 15,23 ± 0,25Доля двуядерных клеток, % 7,24 ± 0,14 11,07 ± 0,17* 8,93 ± 0,18* 11,97 ± 0,23*

РегенератВысота тироцитов, мкм 6,01 ± 0,17 4,99 ± 0,22**

Площадь ядра, мкм2 14,85 ± 0,43 14,98 ± 0,57Диаметр ядра, мкм 5,04 ± 0,08 5,36 ± 0,11Периметр ядра, мкм 15,15 ± 0,23 15,68 ± 0,32Доля двуядерных клеток, % 11,79 ± 0,27 13,00 ± 0,25**

П р и м е ч а н и е. Достоверность различий (P < 0,05): * – по сравнению с контролем; ** – по сравнению с СР.

Вместе с тем процентное содержание двуядерных клеток под влиянием экзогенного гор-мона существенно увеличивается в цельной ЩЖ (11,07 ± 0,17%) по сравнению с контролем (7,24 ± 0,14%), в постоперационном тиреоидном остатке (11,97 ± 0,23%) и особенно сильно в регенерате (13,0 ± 0,25%) по сравнению с их содержанием у животных после СР (см. табли-цу). Согласно модели генетического триггера, описывающей реципрокные взаимоотношения между оперонами пролиферации и дифференцировки, при развитии гипофункционального со-стояния клеток неизбежно активируются процессы их деления [3], что, очевидно, имеет место и в данном случае.

Показано, что при частичной тиреоидэктомии вследствие возникшего в организме гормо-нального дефицита функция тиреоидного остатка увеличивается обратно пропорционально объему оставленной части [4]. После удаления 2/3 ЩЖ (всей правой доли и половины левой) у взрослых крыс поглощение радиоактивного йода вначале снижается, затем достигает нормаль-ного уровня, а позже превышает его. Эти явления развиваются на фоне гиперплазии тиреоидно-го эпителия и резорбции коллоида, которая отмечается наряду с утратой железой радиоактивно-го йода [1].

В условиях тиреоидизации такие признаки усиления функции оставленной железистой па-ренхимы, как гипертрофия и перераздражение ее секреторных элементов, отсутствуют (см. рис. 1) и на первый план выходят явления функциональной гипотрофии постоперационного фрагмента и повышения пролиферационной активности его клеток. Увеличение доли двуядерных клеток в клеточном спектре ЩЖ при всех вариантах применения L-Т4 означает, что дело не в гипертро-фии, а в гипофункции тироцитов как главного условия переключения генетического триггера на пролиферацию (см. таблицу).

В прилежащих к зоне повреждения участках железы отмечается образование множества мелких фолликулов со сниженной функцией, о чем свидетельствует уплощение тиреоидного



Беларуси

85

эпителия и накопление гомогенного коллоида (рис. 2). Такого рода сдвиг в состоянии ЩЖ объяс-няется достаточной обогащенностью организма экзогенным гормоном.

Согласно [5], введение животным L-тироксина в дозе 35,7 мкг/кг в течение 14 дней вызывает у них состояние гипертиреоза. В сыворотке крови резко увеличивается содержание гормонов ЩЖ: уровень Т4 – 120,03 нмоль/л, а Т3 – 3,94 нмоль/л, что выше показателей интактных живот-ных в 1,3 и 1,9 раза соответственно. По принципу обратной связи при данном уровне тиреоид-ных гормонов содержание тиреотропного гормона (ТТГ) снижается до 0,26 мкМЕ/мл (при кон-трольном значении 0,35 мкМЕ/мл).

Установлено, что йодтиронины обладают выраженным пролиферативным потенциалом. Спустя 90 дней после тиреоидэктомии митотический индекс в паренхиматозных клетках пе-чени составлял 0,004%, а у оперированных животных, получавших физиологические дозы Т3 или Т4, – 0,2% [6]. В фармакологических дозах in vivo тиреоидные гормоны стимулируют кле-точное деление в надпочечниках, повышают число полиплоидных гепатоцитов и клеточную мас-су печени [7], а также увеличивают митотический индекс клеток лимфоидных бляшек кишечни-ка [5]. На культуре лимфоцитов человека in vitro L-тироксин в дозе 2·10–10 М достоверно повыша-ет митотическую активность. Стимулирующий эффект гормона реализуется в конце G1- – первой трети S-периодов клеточного цикла. При этом возрастает количество клеток, вступающих в S-период, и ускоряется прохождение ими фазы редупликации ДНК [7].

В эндокринной паренхиме ЩЖ, где основную пролиферативную нагрузку несет эндоми-тоз, а кариокинез играет второстепенную роль [4], аналогичное действие L-T4 имеет свои особенности, а именно – существенное увеличение количества двуядерных клеток в цель-ной железе и ее постоперационном фрагменте (см. таблицу). Опыты с введением in vivo мече-ного тимидина и цитофотометрические определения констатируют репликацию ДНК в кле-точных ядрах, что соответствует S-периоду митотического цикла. Важно отметить, что в описываемых условиях в ЩЖ митозы не наступают, а размножение клеток, проявляющее-ся разделением клеточного ядра и обособлением двух частей тироцита, несмотря на удвоение количества ДНК в S-фазе, протекает при сохранении ядерной мембраны, т. е. фактически при выключенной G2-фазе, когда образуются белки митоза и формируется митотический аппарат. Поэтому данный эндомитотический процесс обозначают как «про ли фе р ационный эндоми-тоз», в отличие от обычного (полиплоидизирующего) эндомитоза, когда может происходить амитозоподобное деление ядер, но не клеток. Считается, что по сравнению с кариокинезом пролиферационный эндомитоз обеспечивает более быстрый рост (гиперплазию) тиреоид-ной ткани [8].

Прямая зависимость нормального роста отдельных тканей от йодтиронинов заметно прояв-ляется при физическом и психическом недоразвитии. Поскольку тиреоидная недостаточность у молодых крыс, как правило, сопровождается снижением количества полиплоидных клеток в пе-чени, было выдвинуто предположение, что тиреоидные гормоны реализуют свой эффект на про-цессы деления клеток и рост животных не прямо, а за счет повышения продукции гипофизом соматотропного гормона (СТГ) [7]. Экспериментально показано, что введение СТГ тиреоидэкто-мированным крысам увеличивает митотический индекс в гепатоцитах, а также массу печени и всего тела, тогда как инъекции тиреоидных гормонов гипофизэктомированным животным не оказывает заметного эффекта [6]. Позже выяснилось, что синтез и секреция СТГ чрезвычайно чувствительны к действию тиреоидных гормонов. Так, у гипотиреоидных крыс содержа-ние мРНК, транскрибируемой с этого гена, в гипофизе и сыворотке крови очень низкое. В куль-туре клеток гипофиза тиреоидные гормоны также вызывали увеличение скорости транскрипции гена гормона роста [9].

Исходя из того, что йодтиронины стимулируют гормонообразующую функцию коры над-почечников, а глюкокортикоиды являются синергистами Т3, влияя на образование СТГ через увеличение экспрессии соответствующего гена, можно заключить, что существуют дополни-тельные пути усиления СТГ-опосредованного действия тиреоидных гормонов на пролифера-цию клеток. Подтверждением этому служит тот факт, что индукция в гипофизе новых специ-ализированных мРНК под влиянием Т3 отчетливо потенцируется глюкокортикостероидами



Беларуси

86

надпочечников [10]. Стероидзависимая стимуляция продукции соматотрофами гипофиза СТГ (глюкокортикоиды в физиологической концентрации усиливают секрецию гормона роста и увеличивают число рецепторов к соматолиберину, контролирующему синтез соматотро-пина [11]) пермиссивно снижает гормонообразующую функцию ЩЖ за счет увеличения коли-чества светлых клеток, не секретирующих йодтиронины [1], но способных эндомитотически размножаться [4].

Учитывая общепринятую в биологии несовместимость на клеточном уровне программ про-лиферации и дифференцировки, которую лаконично выражает аксиоматический принцип – «ра-ботающая клетка не делится», и исходя из модели генетического триггера, описывающей после-довательное переключение деятельности секреторной клетки из одного функционального со-стояния в другое [12], механизм индуцированной экзогенными тиреоидными гормонами гиперплазии тироцитов можно представить следующим образом. Введение in vivo Т3 или Т4 при-водит к увеличению уровня СТГ в крови, инициирующего синтез активатора пролиферации – инсулиноподобного ростового фактора 1 (ИРФ-1) в печени и тиреоидной паренхиме [10], кото-рый, как и инсулин, способен как бы «снимать» рецепторы с поверхности эффекторных клеток, делая их нечувствительными к действию тропных гормонов [12]. Следствием этого является блокирование гормонообразующей функции тироцитов, т. е. вывод части секреторных клеток из-под контроля ТТГ и активация их деления путем пролиферационного эндомитоза [4].

Тот факт, что принудительная тиреоидизация животных активирует пролиферативную мультипликацию тиреоидных клеток эндокринной паренхимы ЩЖ, свидетельствует о том, что ТТГ не имеет к этому отношения, поскольку L-Т4 тормозит его продукцию гипофизом. Увеличение двуядерных клеток при всех вариантах применения экзогенного тироксина озна-чает, что дело не в ТТГ, а в гипофункции тироцитов как главного условия действия генетиче-ского триггера, переводящего жизнедеятельность тироцитов из одного стационарного состоя-ния в другое – из фазы секреции в фазу пролиферации и наоборот. Согласно Моно и Жакобу [13], триггеры, т. е. системы, способные неопределенно долго находиться в любом из двух устойчи-вых пограничных состояний, играют большую роль в механизмах биологической регуляции. Разработана модель генетического триггера тироцитов, где роль модуляторов дифференци-ровки и пролиферации секреторных клеток выполняют соответственно тиреотропин и инсу-лин [3]. При введении in vivo L-Т4 продукция ТТГ гипофизом блокируется [10] и триггерная роль «запуска» пролиферации тироцитов, очевидно, переходит к инсулину и инсулиноподоб-ным факторам роста.

Заключение. Показано, что состояние гипофункции тироцитов, вызванное in vivo 14-днев-ным введением L-тироксина, существенно увеличивает процентное содержание двуядерных клеток в цельной щитовидной железе по сравнению с контролем, в постоперационном тиреоид-ном остатке и особенно в регенерате по сравнению с их содержанием у животных, подвергнутых субтотальной струмэктомии. Согласно модели генетического триггера, описывающей реципрок-ные взаимоотношения между оперонами пролиферации и дифференцировки, при развитии ги-пофункционального состояния клеток неизбежно активируются процессы их деления, что, оче-видно, имеет место и в данном случае. Обсуждается пермиссивная роль инсулина и СТГ/ИРФ-1 оси в отмеченных эффектах.


1. В о й т к е в и ч А. А. Восстановительные процессы и гормоны. Л., 1965. 2. L e v i t T. The Thyroid. Baltimore, 1954.3. В и н о г р а д о в В. В., Г о л ы ш к о П. В. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2008. № 4. С. 110–122.4. В и н о г р а д о в В. В., Г о л ы ш к о П. В., М а ц ю к Я. Р., Я р о ц к и й Ю. В. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед.

навук. 2010. № 1. С. 105–111.5. Г р и г о р е н к о Д. Е., Е л а е в а Э. Б. // Успехи совр. естествознания. 2003. № 9. С. 84.6. C a r r i e r e R. // Endocrinology. 1962. Vol. 70. P. 201–205.7. Р а ч е в Р. Р., Е щ е н к о Н. Д. Тиреоидные гормоны и субклеточные структуры. М., 1975.8. А л е ш и н Б. В., Б р и н д а к О. И., М а м и н а В. В., К р и в о б о к Ю. В. // Проблемы эндокринол. 1988.

№ 4. С. 60–64.



Беларуси

9. К у б а р к о А., Я м а ш и т а С., Д е н и с о в С. и др. Щитовидная железа. Фундаментальные аспекты. Минск; Нагасаки, 1998.

10. Т е п е р м е н Д., Т е п е р м е н Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М., 1989.11. Х и ж н я к О. О. // Проблемы эндокрин. патол. 2009. № 1. С. 90–95.12. В и н о г р а д о в В. В. Стресс: морфобиология коры надпочечников. Минск, 1998.13. М о н о Ж., Ж а к о б Ф. // Регуляторные механизмы клетки. М., 1964.

V. V. VINOGRADOV1, A. V. TUMANOV1, P. V. GOLYSHKO1, Ya. R. MATSYUK2, V. P. ANDREYEV2, S. V. VINOGRADOV2, Yu. V. YAROTSKY1

THYROXINE EFFECT ON THYROCYTE PROLIFERATION AFTER SUBTOTAL STRUMECTOMY OF RAT THYROID GLAND

1Research and Innovation Center “Institute of Pharmacology and Biochemistry of NAS of Belarus”, Grodno,2Grodno State Medical University, Belarus

Summary

It was shown that the state of thyrocyte hypofunction induced in vivo by 14-day L-thyroxine administration signifi cantly increased the percentage of binucleate cells in the whole thyroid gland as compared to the group of animals subjected to sub-total strumectomy. According to the genetic trigger model describing the reciprocal relationships between proliferation dif-ferentiation operons, the development of the hypofunction cellular state will activate cell division processes. This may also be related to the above state. A permissive role of insulin and the STG/IGF axis in the above effects is discussed.



Беларуси

88


УДК 612.8.015

Г. К. ТРОПНИКОВА

ЭФФЕКТЫ МЕЛАТОНИНА НА ВЫЗЫВАЕМЫЕ ГИПОКСИЕЙ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СЕРОТОНИНА В МОЗГЕ КРЫС

С РАЗНЫМ ТИПОМ ПОВЕДЕНИЯ

Институт физиологии НАН Беларуси, Минск


Введение. Мелатонин (МТ) – нейрогормон, который участвует в контроле широкого круга физиологических функций. Вместе с тем для большинства его эффектов механизм действия окончательно не установлен. В частности, остаются мало изученными механизмы, лежащие в осно-ве индивидуальных различий в ответ на введение мелатонина при действии различных пов реж да-ющих факторов.

МТ является производным серотонина, недостаток которого в мозге проявляется наруше-нием познавательных функций, поведенческих реакций, ослаблением долговременной памяти, которые сопровождаются необратимыми изменениями в мозге. По мнению ряда авторов, мно-гие эффекты МТ на поведенческие реакции опосредованы серотонинергической нейропереда-чей [4, 5, 18]. Данные литературы [19] и результаты собственных экспериментальных исследова-ний [3] также свидетельствуют о дифференцированном изменении содержания серотонина на раз-ных уровнях ЦНС при введении экзогенного МТ.

Целью настоящего исследования было изучение особенностей эффектов мелатонина на вы-зываемые острой гипоксией ответные реакции серотонинергических структур мозга крыс с раз-личными типом поведения и локомоторной активностью в незнакомой обстановке (тест типа «открытое поле»).

Материалы и методы исследования. Опыты проводили в весенний период на 24 самцах беспородных белых крыс с исходной массой тела 180–200 г. Животных содержали в естествен-ных условиях вивария, они получали стандартный корм и имели свободный доступ к воде. Пер-воначально крыс оценивали по их реакции на новую обстановку в тесте типа «открытое поле», позволяющего определить двигательную активность и условно уровень их тревожности и эмоцио-нальности [2]. Для этого животных помещали в емкость диаметром 18 см и высотой 30 см и в тече-ние 10 мин изучали особенности поведенческих реакций. По числу вертикальных стоек, гори-зонтальных перемещений, дефекаций, груминга, движений на месте, реакций замирания (каждый двигательный акт оценивали в баллах) животные были условно разделены на группы с низ- кой (НЛА), высокой (ВЛА) и средней локомоторной активностью. Для животных с НЛА бы ли характерны такие паттерны поведения, как «сидит», «сидит с упором передними лапами на стен-ку», «замирание», «спит», свидетельствующих о низкой эмоциональной реактивности. В то же время крысы с ВЛА отличались большим количеством вертикальных стоек, движений на месте, вертикальных стоек с упором, указывающих на эмоциональную тревожность [2].

Животные со средним (16–17) баллом двигательной активности служили контролем, а кры-сам с ВЛА (41 балл) и НЛА (4 балла) посредством внутрибрюшинных инъекций в течение 3 дней вводили один раз в сутки МТ в дозе 0,5 мг/кг (Sigma, США). Контрольные животные были раз-делены на две группы, одну из которых составлял интактный контроль. Животных этой группы не подвергали действию гипоксии. Вторую подгруппу контрольных животных и крыс, получав-



Беларуси

89

ших МТ, подвергали умеренной гипобарической гипоксии (2300 м над уровнем моря) до насту-пления первого апноэ. Каждая группа состояла из 6 животных. Гипобарическую гипоксию соз-давали путем разрежения воздуха в сосуде, соединенном с вакуометром. Для предотвращения накопления в емкости углекислоты использовали натронную известь. Через 20 мин после пре-кращения действия гипоксии животных декапитировали.

На холодной подложке выделяли кору больших полушарий, стриатум, гиппокамп, гипота-ламус, средний мозг, дорсомедиальную область продолговатого мозга, мозжечок, миндалину и шейные сегменты спинного мозга, в которых методом [12] определяли содержание серотон и -на (5-ОТ) и его основного метаболита – 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК). Полученные данные обрабатывали статистически с применением метода ANOVA для малых выборок. До сто-верность оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. Поведенческие реакции. Известно, что острая гипоксия явля-ется мощным стрессорным фактором, который изменяет поведенческие реакции животных, вы-зывая повышение эмоциональной и двигательной активности, что нашло отражение и в наших опытах (табл. 1). По сравнению с исходным фоном общий балл двигательной активности у крыс всех групп возрос и составлял соответственно 53,6 (контроль), 91,9 (ВЛА) и 67,2 (НЛА).

Т а б л и ц а 1. Влияние гипоксии на паттерн поведенческих реакций у контрольных животных и у крыс, получавших мелатонин

Паттерн движения Контроль I II

Вертикальная стойка 4,4 ± 1,32 8,8 ± 1,08* 7,0 ± 1,04Вертикальные вращения 7,0 ± 0,70 10,7 ± 0,75* 9,6 ± 1,16 Подъем головы 8,6 ± 0,50 10,8 ± 0,58* 9,8 ± 0,48Груминг 4,0 ± 0,70 5,0 ± 0,89 3,4 ± 0,60Дефекация 1,4 ± 0,50 1,0 ± 0,31 1,4 ± 0,50Оборот по горизонтали 13,2 ± 1,59 21,2 ± 2,15* 18,6 ± 1,43* Полуоборот по горизонтали 3,6 ± 0,24 4,6 ± 0,24* 6,6 ± 0,6*#«Сидит» 8,2 ± 0,80 3,8 ± 0,37 7,6 ± 0,24#«Роет опилки» 2,2 ± 0,24 2,6 ± 0,24 3,2 ± 0,24*

П р и м е ч а н и е. Группы животных, получавших мелатонин: I, II – крысы с высокой и низкой локомоторной актив-ностью соответственно. Достоверность различий (P < 0,05): * – по отношению к контролю; # – по отношению к группе I.

Несмотря на сведения о седативных и угнетающих локомоторную активность эффектах МТ при гипоксии [8, 16], в наших экспериментах МТ в условиях гипоксии, напротив, активировал дви-гательную активность (табл. 1). Возможно, это связано с дозой вводимого МТ, так как ранее было установлено, что у крыс снижение двигательной активности наблюдалось при дозе 60 мг/кг [11]. Нами выявлены как сходные черты, так и различия в изменении отдельных видов поведения у животных с изначально различными локомоторным поведением и уровнем эмоциональности. Так, в условиях гипоксии у крыс с ВЛА, получавших МТ, по сравнению с контрольными живот-ными и крысами с НЛА наблюдалось более значимое увеличение таких паттернов поведения, как вертикальная стойка, вертикальное вращение (паническое вращение вокруг пробки, закры-вающей емкость), подъем головы, оборот по горизонтали. Вместе с тем у этих крыс отмечался бо-лее низкий уровень паттерна «сидит», чем у контрольных животных и крыс с НЛА, у которых превалировал такой паттерн исследовательского поведения, как «роет опилки» (табл. 1). В то же время достоверных различий по числу груминговых реакций и дефекаций в ответ на острую ги-поксию между животными исследуемых групп не обнаружено.

Таким образом, предварительное субхроническое введение МТ в дозе 0,5 мг/кг в большей степени, чем у контрольных животных, усиливало уровень двигательной активности в гипокси-ческой среде, особенно у крыс с ВЛА. Аналогичное увеличение локомоторной и исследователь-ской активности у животных под влиянием экзогенного МТ отмечалось в работе [1].

Какие же механизмы лежат в основе обнаруженных различий в поведенческих реакциях жи-вотных исследуемых групп? Общеизвестно, что 5-ОТ-ергические нейроны играют важную роль



Беларуси

90

в глобальной регуляции различных поведенческих актов (страх, эмоции, память, когнитивные процессы, двигательное поведение), участвуя в иннервации важнейших центров регуляции этих функций и контроле не только возбудимости нейронов, но их функционального восстановления после повреждения [6]. Кроме того, как хемосенсорные нейроны 5-ОТ-ергические нейроны под-держивают pH-гомеостаз и участвуют в респираторном контроле [20]. В частности, у трансген-ных мышей, лишенных серотонинергических нейронов, апноэ проявляется в более тяжелой форме, а кроме того, отмечается высокая смертность в период их развития [13].

Особенности изменения содержания 5-ОТ и 5-ОИУК в мозге. Мозжечок. Данные, пред-ставленные в табл. 2, свидетельствуют, что острая гипоксия сопровождается достоверным уве-личением содержания 5-ОТ в мозжечке как контрольных животных, так и крыс, получавших МТ. Следует, однако, отметить, что введение МТ способствовало более значимому повышению уровня 5-ОТ, причем наибольшее его увеличение (за счет снижения энзиматической инактива-ции посредством фермента МАО-А) отмечалось у крыс с НЛА. На это указывал более низкий уровень 5-ОИУК и индекса 5-ОИУК/5-ОТ у крыс с НЛА по сравнению с этими показателями в контроле и у животных с ВЛА. Данные литературы также свидетельствуют, что гипоксиче-ский стресс увеличивает уровень 5-ОТ и 5-ОТ2-рецепторов в мозжечке – важнейшей структуре мозга, участвующей в контроле позы и движений [17].

Т а б л и ц а 2. Влияние мелатонина на вызываемые острой гипоксией изменения содержания 5-ОТ и 5-ОИУК (мкг/г ткани), индекса 5-ОИУК/5ОТ в мозжечке, миндалине и гиппокампе крыс с различным исходным паттерном двигательной активности (M ± m)

Группа 5-ОТ 5-ОИУК 5-ОИУК/5ОТ

Мозжечок1. Контроль 0,069 ±0,004 0,069± 0,007 0,997±0,0402. Контроль + гипоксия 0,128 ±0,006* 0,122±0,004* 0,960±0,0403. Мелатонин + гипоксия (I) 0,157 ±0,005*# 0,099±0,004* 0,635±0,026*#4. Мелатонин + гипоксия (II) 0,179 ±0,008*# 0,045±0,003*#^ 0,255±0,021*#^

Миндалина1. Контроль 0,653 ±0,038 1,127± 0,059 1,728±0,0282. Контроль + гипоксия 0,676 ±0,041 1,012±0,063 1,507±0,0873. Мелатонин + гипоксия (I) 0,778 ±0,077 0,754±0,042*# 0,990±0,074*#4. Мелатонин + гипоксия (II) 0,928 ±0,048* 0,559±0,066*#^ 0,599±0,048*#^

Гиппокамп1. Контроль 0,446±0,033 0,357±0,021 0,812±0,0892. Контроль + гипоксия 0,507±0,041 0,590±0,023* 1,200±0,024*3. Мелатонин + гипоксия (I) 0,395±0,016 0,519±0,035* 1,308±0,062*4. Мелатонин + гипоксия (II) 0,418±0,019 0,619±0,030* 1,480±0,028*

П р и м е ч а н и е. I и II – крысы с исходно высокой и низкой локомоторной активностью. Достоверность различий (Р < 0,05): * – по отношению к группе 1, # – по отношению к группе 2, ^ – по отношению к группе 3. То же для табл. 3, 4.

Известно, что в мозге 5-ОТ наряду с нейромедиаторной функцией выполняет функцию нейро-трофического фактора. Следовательно, вызываемое МТ увеличение 5-ОТ в мозжечке крыс могло быть компенсаторным и направленным на защиту клеток мозжечка от индуцируемого гипокси-ей окислительного стресса. Кроме того, известно, что индуцируемая гипоксией активация пост-синаптических 5-ОТ2-рецепторов на ГАМК-ергических интернейронах (клетки Lugaro) оказы-вает модулирующее (преимущественно тормозное) влияние 5-ОТ на активность клеток Пур-кинье [9, 21]. Поэтому двукратное увеличение уровня 5-ОТ в мозжечке крыс, получавших МТ, является одной из возможных причин их большей двигательной активности в условиях гипок-сии по сравнению с контролем и исходным фоном.

Миндалина. В этой важнейшей структуре лимбической системы, участвующей в регуляции эмоций и страха [22], направленность изменений содержания 5-ОТ и 5-ОИУК при гипоксии была аналогична таковой в мозжечке: введение МТ способствовало более выраженному нако-



Беларуси

91

плению 5-ОТ у крыс с НЛА (+42,1%), чем у животных контрольной группы (+3,5%) и у крыс с ВЛА (+19,2%), благодаря снижению катаболизма 5-ОТ. Свидетельством тому служат данные о достоверно более низком уровне 5-ОИУК и индекса 5-ОИУК/5-ОТ в миндалине этих живот-ных (табл. 2). Возможно, однонаправленные изменения метаболизма 5-ОТ в мозжечке и мин-далине объясняются тем фактом, что основную 5-ОТ-ергическую иннервацию они получают из дорсального ядра шва. Именно высоким содержанием 5-ОТ в миндалине, действующим на 5-ОТ 2С-рецепторы базолатерального ядра миндалины, некоторые авторы объясняют состоя-ние страха у животных после неконтролируемого стресса [10].

Гиппокамп. Следует отметить, что гиппокамп получает 5-ОТ-ергическую иннервацию в основ-ном из медиального ядра шва. В отличие от миндалины в этой структуре лимбической системы, участвующей в организации процессов долговременной памяти, в ответ на гипоксию наблюда-лась противоположная картина – усиление катаболизма 5-ОТ как у контрольных, так и инъеци-рованных МТ крыс, более значимое у животных с НЛА. При этом у животных всех групп сох-ранялся контрольный уровень 5-ОТ (см. табл. 1). Данные о достоверном повышении уровня 5-ОИУК и индекса 5-ОИУК/5-ОТ при сохранении контрольного уровня 5-ОТ в условиях гипок-сии свидетельствуют об активации 5-ОТ-ергических структур гиппокампа, направленной на под-держание его функций в условиях гипоксии [14], в частности, за счет запуска механизма защит-ных реакций.

Кора больших полушарий. Достоверных изменений уровня 5-ОТ и индекса 5-ОИУК/5-ОТ в коре больших полушарий в условиях гипоксии у животных исследованных групп не обнаружено. Только у крыс с ВЛА введение МТ способствовало небольшому увеличению содержания 5-ОИУК по сравнению с интактным контролем (табл. 3).

Т а б л и ц а 3. Влияние мелатонина на вызываемые острой гипоксией изменения содержания 5-ОТ и 5-ОИУК (мкг/г ткани), индекса 5-ОИУК/5ОТ в коре больших полушарий, стриатуме

и среднем мозге крыс с различным исходным паттерном двигательной активности (M ± m)

Группа животных 5-ОТ 5-ОИУК 5-ОИУК/5ОТ

Кора больших полушарий1. Контроль 0,195 ± 0,019 0,225 ± 0,006 1,192±0,0952. Контроль + гипоксия 0,206 ± 0,010 0,274 ± 0,022 1,289±0,1223. Мелатонин + гипоксия (I) 0,270 ± 0,029 0,289 ± 0,006* 1,114±0,1144. Мелатонин + гипоксия (II) 0,220 ± 0,029 0,265 ± 0,015 1,215±0,088

Стриатум1. Контроль 0,530 ± 0,037 0,588 ± 0,096 1,115±0,0742. Контроль + гипоксия 0,551 ± 0,068 0,471 ± 0,025 0,914±0,1353. Мелатонин + гипоксия (I) 0,453 ± 0,026 0,644 ± 0,024# 1,539±0,095 *#4. Мелатонин + гипоксия (II) 0,537 ± 0,095 0,698 ± 0,048# 1,308±0,054 #

Средний мозг1. Контроль 0,856 ± 0,078 0,670 ± 0,021 0,782±0,0782. Контроль + гипоксия 0,888 ± 0,050 0,561 ± 0,044 0,472±0,0783. Мелатонин + гипоксия (I) 0,914 ± 0,015 0,761 ± 0,042# 0,830±0,036#4. Мелатонин + гипоксия (II) 0,894 ± 0,038 0,667 ± 0,046 0,744±0,036

Стриатум. У контрольных животных в ответ на острую гипоксию достоверных изменений изучаемых показателей в стриатуме (регуляция тонких двигательных актов) не зафиксировано, хотя наблюдалась некоторая тенденция к снижению уровня 5-ОИУК. Предварительное трех-кратное введение МТ также не изменяло уровень 5-ОТ в условиях гипоксии, но при этом наблю-дался некоторый рост уровня 5-ОИУК и индекса 5-ОИУК/5-ОТ, особенно у животных с ВЛА.

Средний мозг. 5-ОТ-ергические нейроны дорсального и медиального ядер шва среднего моз-га осуществляют дифференцированную иннервацию структур переднего мозга, в частности гиппокампа и стриатума. В данной области мозга, как и в коре больших полушарий, гиппо-кампе и стриатуме, достоверных сдвигов в содержании 5-ОТ в ответ на гипоксию не отмеча-



Беларуси

92

лось ни у контрольных, ни у получавших МТ крыс. Вместе с тем следует отметить, что, несмо-тря на отсутствие достоверных изменений, уровень 5-ОИУК и индекс 5-ОИУК/5-ОТ у контроль-ных крыс в условиях гипоксии были ниже таковых у интактных животных. МТ способствовал некоторому усилению катаболизма 5-ОТ, особенно у крыс с ВЛА.

Гипоталамус. У контрольных животных в ответ на гипоксию наблюдалось параллельное (но недостоверное) нарастание уровней 5-ОТ и 5-ОИУК (табл. 4), поэтому индекс 5-ОИУК/5-ОТ со-хранялся на прежнем уровне. В сравнении с контролем МТ существенно не изменил реакцию гипоталамических 5-ОТ-ергических структур крыс с ВЛА на гипоксию. У крыс с НЛА уровень 5-ОТ в условиях гипоксии не изменился, хотя наблюдалось усиление процесса окислительного дезаминирования 5-ОТ, о чем свидетельствовало достоверное по сравнению с контролем увели-чение и уровня 5-ОИУК (+43,0%), и индекса 5-ОИУК/5-ОТ (+28,4%).

Т а б л и ц а 4. Влияние мелатонина на вызываемые острой гипоксией изменения содержания 5-ОТ и 5-ОИУК (мкг/г ткани), индекса 5-ОИУК/5ОТ в гипоталамусе,

дорсомедиальной области продолговатого мозга и шейных сегментах спинного мозга крыс с различным исходным паттерном двигательной активности (M ± m)

Группа 5-ОТ 5-ОИУК 5-ОИУК/5ОТ

Гипоталамус1. Контроль 1,026 ± 0,068 0,637 ± 0,027 0,633 ± 0,0532. Контроль + гипоксия 1,211 ± 0,043 0,831 ± 0,050* 0,686 ± 0,0343. Мелатонин + гипоксия (I) 0,946 ± 0,056# 0,740 ± 0,021 0,796 ± 0,6614. Мелатонин + гипоксия (II) 1,141 ± 0,054 0,911 ± 0,030*^ 0,813 ± 0,052*

Дорсомедиальный отдел продолговатого мозга1. Контроль 1,418 ± 0,044 1,420 ± 0,134 0,996 ± 0,0802. Контроль + гипоксия 1,008 ± 0,031* 1,958 ± 0,113* 1,937 ± 0,058*3. Мелатонин + гипоксия (I) 0,980 ± 0,099* 1,646 ± 0,132 1,702 ± 0,093*4. Мелатонин + гипоксия (II) 0,868 ± 0.095* 1,334 ± 0,078# 1,615 ± 0,211*

Шейные сегменты спинного мозга1. Контроль 0,527 ± 0,037 0,452 ± 0,045 0,852 ± 0,0372. Контроль + гипоксия 0,560 ± 0,060 0,539 ± 0,031 1,023 ± 0,0703. Мелатонин + гипоксия (I) 0,432 ± 0,022 0,634 ± 0,049* 1,492 ±0,156*#4. Мелатонин + гипоксия (II) 0,540 ± 0,033 0,705 ± 0,067 1,302 ± 0,070*

Дорсомедиальный отдел продолговатого мозга (ДМОПМ). Известно, что 5-ОТ, выделяясь из нервных окончаний во время гипоксии, действует на 5-ОТ(2А)-рецепторы ДМОПМ, участвуя в механизме срочной оборонительной адаптации к гипоксии путем немедленного включения первоначальной гипервентиляции [14].

В ДМОПМ контрольных животных в ответ на гипоксию наблюдалась повышенная утилиза-ция 5-ОТ, на что указывало достоверное снижение уровня 5-ОТ, сопровождаемое достоверным увеличением содержания 5-ОИУК и индекса 5-ОИУК/5-ОТ. МТ существенно не изменил эту реакцию, что подтверждается достоверным снижением уровня 5-ОТ и увеличением индекса 5-ОИУК/5-ОТ у крыс как с ВЛА, так и с НЛА (табл. 4). Возможно, что снижение уровня 5-ОТ в ДМОПМ (важнейшей области мозга, участвующей в регуляции кардиососудистых функций и дыхания) является причиной респираторной вариабельности и панических расстройств, как отмечалось в работе [6].

Шейные сегменты спинного мозга. По сравнению с интактными животными у контрольных животных, подвергавшихся гипоксии, уровень исследуемых показателей был несколько выше, но достоверных отличий не отмечалось. МТ способствовал большей активации спинальных 5-ОТ-ергических структур, особенно у крыс с ВЛА, у которых по сравнению с контрольными и получавшими МТ крысами с НЛА наблюдалось достоверное увеличение содержания 5-ОИУК и индекса 5-ОИУК/5-ОТ.

Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о зависимости эффектов МТ на серотонинергические структуры мозга в условиях острой гипоксии от индивидуальных



Беларуси

особенностей поведенческих реакций животных в незнакомой обстановке. Как правило, у крыс с НЛА в отличие от животных других групп острая гипоксия вызывала более значимое накопле-ние 5-ОТ в мозжечке и миндалине. Кроме того, у них наблюдался более высокий уровень метабо-лизма 5-ОТ в гиппокампе, что лежит в основе активации памяти с целью извлечения необходимой информации о возможных путях выхода из стрессовой ситуации путем активации двигательной системы животного. Данные литературы свидетельствуют также о большей чувствительности крыс со слабой реакцией на новую обстановку к действию серотонинергических препаратов [23]. В других изученных отделах мозга ответы 5-ОТ-ергических структур на гипоксию у кон-трольных и получавших МТ крыс не отличались специфичностью. Для выяснения конкретных причин селективных эффектов МТ на активность серотонинергических структур мозга в стрес-совых ситуациях у животных с разным статусом двигательной и эмоциональной активности не-обходимы дальнейшие исследования.

Литература 1. А р у ш а н я н Е. Б., Н а у м о в С. С. // Эксперим. клин. фармакол. 2010. Т. 73, № 1. С. 7–9.2. Б у р е ш Я., Б у р е ш о в а О., Х ь ю с т о н Д. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга

и поведения. М., 1991. С. 110–122.3. Т р о п н и к о в а Г. К., К о р и к Е. О., А н т о н о в а М. В. и др. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2007.

№ 4. С. 55–60.4. Т р о п н и к о в а Г. К. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 49–52.5. Т р о п н и к о в а Г. К. // Новости мед.-биол. наук. 2010. № 2. С. 182–187.6. A n n e r b r i n k K., O l s o n M., H e d n e r J., E r i c k s s o n E. // Int. J. Neuropsychopharmacol. 2003. Vol. 6,

N 1. P. 51–56.7. A z m i t i a E. Ch. // Neuropsichopharmacology. 1999. Vol. 21, N 2. Р. 33–45.8. A z p e l t a C., M a r t i n e z-A l v a r e z R. M., D e l g a d o M. J. // Horm. Behav. 2010. Vol. 7, N 3. P. 323–329.9. C i r a n n a L. // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, N 33. Р. 10341–10349.10. C h r i s t i a n s o n J. P., R a g o l e T., A m a t J. et al. // Biol. Psychiatr. 2010. Vol. 67, N 4. P. 339–345.11. C h u a n g J. I., L i n M. T. // J. Pineal Res. 1994. Vol. 17, N 1. P. 11–16.12. C u r z o n G., G r e e n A. R. // Br. J. Pharmacol. 1970. Vol. 39, N 3. P. 653–655.13. H o d g e s M. R., W e h n e r M., A u g u s t J. et al. // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, N 3. P. 10341–10349.14. H u n g M. W., T i p o e G. L., P o o n A. M. et al. // J. Pineal. Res. 2008. Vol. 44, N 2. P. 214–217.15. K a n a m a r u M., H o m m a I. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2009. Vol. 297, N 1. P. 34–41.16. L o p e z - O l m e d a J. F., B a j a r r y M. J., R o l l d e L a m a M. A. et al. // J. Physiol. Biochem. 2006. Vol. 82,

N 1. P. 17–26.17. M a t h e w J., A n j u T. R., J a y a n a r a y a n S., P a u l o s e C. S. // Respir. Physiol. Neurobiol. 2010. Vol. 172,

N 3. P. 147–153.18. M i c a l e V. J., A r e z z i A. M., R a m p e l l o L., D r a g o F. // Eur. Neuropsychopharmacol. 2006. Vol. 16, N 7.

P. 538–545.19. M i g u e z J. M., M a r t i n F. J., A l d e g u n d e M. // Neurochem. Res. 1997. Vol. 22, N 1. P. 87–92.20. R i c h e r d s o n G. B. // Nat. Rev. Neurosci. 2004. Vol. 5. P. 449–461.21. S c h w e i g h o f e r N., D o y a K., K u r o d a S. // Brain Res. Brain Res. Rev. 2004. Vol. 44, N 2–3. P. 103–116.22. S p i g a F., L i g h t m a n S. L., S h e k h a r A., L o w r y A. // Neuroscience. 2006. Vol. 138, N 4. P. 1265–1276.23. V e r h e i j M. M., V e e n v l i e t J. V., G r o o t K o r m e l i n k T. et al. // Psichopharmacology (Berl.). 2009. Vol. 205,

N 3. P. 441–455.

G. K. TROPNIKOVA

MELATONIN EFFECTS ON HYPOXIA-INDUCED CHANGES OF THE SEROTONIN CONTENT IN THE BRAIN OF RATS WITH DIFFERENT PATTERN BEHAVIOR

Institute of Physiology of NAS of Belarus, Minsk

Summary

In experiments on rats it has been shown that the pretreatment with melatonin (introperitoneal, 0.5 mg/kg/day, 3 days) enhanced the locomotor activity under acute hypoxia more than under control. The dependence of the melatonin effects on hypoxia-induced responses of brain serotoninergic structures to acute hypoxia caused by the behavior pattern of animals in the unknown situation was also found. Melatonin enhanced the degree of increase in the hypoxia-induced serotonin level more signifi cantly in the cerebellum and amygdale of rats with the low locomotor activity than in control rats and in rats with the high locomotor activity.



Беларуси

94


УДК 616.441-006.6-089:616-056.257]:612.015

Т. А. МИТЮКОВА, Т. А. ЛЕОНОВА, А. А. ТУЗОВА, Т. Ю. ПЛАТОНОВА, М. Л. ЛУЩИК

ВЛИЯНИЕ СУПРЕССИВНОЙ ТЕРАПИИ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С ИЗБЫТОЧНОЙ МАССОЙ ТЕЛА, ПРООПЕРИРОВАННЫХ

ПО ПОВОДУ КАРЦИНОМЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск


Введение. В последние годы проблема избыточной массы тела выходит на передний план в ряду широкого спектра медико-социальных проблем. Каждый третий-четвертый взрослый че-ловек в экономически развитых странах имеет избыточную массу тела, что в перспективе повы-шает риск развития заболеваний, сопутствующих характеру патологических изменений при ожирении [1–4]. Известно, что у мужчин молодого и среднего возраста с избыточной массой тела и наличием признаков метаболического синдрома (МС) более часто наблюдаются отклоне-ния со стороны сердечно-сосудистой системы [5, 6], а у женщин такого же возраста на фоне избы-точной массы тела чаще регистрируются отклонения в репродуктивной сфере [7].

Последний этап мониторинга (2008―2009) относительно молодых пациентов (средний воз-раст 26,7 года), прооперированных по поводу карциномы щитовидной железы (ЩЖ), неожидан-но выявил у них высокую частоту (около 25% от общего числа обследованных) распространен-ности избыточной массы тела. Для сравнения можно привести данные скрининговых исследова-ний по выявлению эндокринной патологии среди студентов старших курсов БГМУ (2008–2009), которые показали, что у молодых людей сопоставимого возраста (средний возраст 24,5 года) так-же наблюдаются отклонения по индексу массы тела (ИМТ), причем несколько чаще в сторону его снижения (ИМТ < 18 кг/м2 у 12,3%), чем в сторону увеличения (ИМТ > 25 кг/м2 у 7,9%).

Учитывая, что при адекватном лечении дифференцированный рак ЩЖ (ДРЩЖ) имеет бла-гоприятный прогноз, на первый план выходят проблемы сохранения работоспособности, репро-дуктивного здоровья и удовлетворительного качества жизни. С этой точки зрения крайне насто-раживает факт выявления довольно высокого числа пациентов с повышенным ИМТ, поскольку в перспективе можно ожидать прогрессирования метаболических отклонений и сопутствующих заболеваний у данной категории лиц.

Проведение супрессивной терапии L-тироксином (L-T4) является важнейшей составляющей лечения пациентов, прооперированных по поводу ДРЩЖ. Поэтому закономерен интерес к влия-нию супрафизиологических доз L-T4 на метаболические процессы у лиц как с нормальной, так и с избыточной массой тела.

Цель работы – изучить особенности биохимического статуса больных с ДРЩЖ, имеющих избыточную массу тела, в сравнении с пациентами и лицами группы контроля с нормальной массой тела, а также в зависимости от эффективности супрессивной терапии L-T4.

Материалы и методы исследования. Общая группа пациентов состояла из 373 человек – 269 женщин и 104 мужчин в возрасте 19–40 лет (средний возраст 26,69 ± 4,55 года). Боль-шинство из них (343 чел., 92%) перенесли тотальную тиреоидэктомию (ТТЭ), остальные (30 чел., 8%) – гемитиреоидэктомию. Для дальнейших исследований были отобраны лица с ТТЭ, а пациенты с сопутствующей эндокринной патологией и наличием других заболева-ний были исключены.



Беларуси

95

Пациенты с ТТЭ были разделены на две группы: 1-я – 243 человека с нормальной массой тела (ИМТ = 18–25 кг/м2) и 2-я – 88 человек с избыточной массой тела (ИМТ > 25 кг/м2). Группа контроля состояла из 54 практически здоровых молодых людей (42 женщин и 12 мужчин) в воз-расте 19–39 лет (средний возраст 26,40 ± 4,32 года) с нормальной массой тела.

Тиреоидные гормоны в сыворотке крови – тироксин свободный (св. Т4), трийодтиронин сво-бодный (св. Т3), а также тиреотропный гормон (ТТГ) определяли ИФА-методом с использовани-ем наборов фирмы «Диалаб» (Австрия), все определения осуществляли в дублях. Дополнительно были проведены референтные определения уровня ТТГ с помощью ИФА-наборов фирмы «Хоффман Ля Рош» (Швейцария) на закрытой автоматической системе «Модуляр 170».

Биохимические лабораторные исследования проводили с использованием наборов «Кормэй-Диана» (Польша) на автоматическом анализаторе HITACHI фирмы Boehringer Mannheim (Германия), а также на анализаторе электролитов ROCHE (Швейцария). Определяли уровни кальция, фосфора, общего холестерола (ОХ), холестерола липопротеидов низкой (ХЛНП) и вы-сокой плотности (ХЛВП), триглицеридов (Тг), билирубина, мочевины, креатинина, железа, ак-тивность щелочной фосфатазы, АЛТ, АСТ, а также уровни электролитов: калия, натрия и иони-зированного кальция. Оценивали также расчетный показатель – коэффициент атерогенности (КА = ХЛНП/ХЛВП, норма менее 3,0).

Статистический анализ полученных данных проводили в таблицах Microsoft Excel с исполь-зованием критерия Стьюдента для сравнения двух групп и поправки Бонферрони для несколь-ких групп, результаты представлены в виде средних величин с их стандартными отклонениями (X ± Sd) [8].

Результаты и их обсуждение. Обследованные нами пациенты обеих групп (ТТЭ-1 – боль-ные с нормальной массой тела, ТТЭ-2 – лица с избыточной массой тела) были сопоставимы по возрасту на период аварии на ЧАЭС. Возраст на момент операции был достоверно выше у лиц с избыточной массой тела по сравнению с больными c нормальной массой тела. Длительность лечения лиц с избыточной массой тела была несколько меньше, чем у больных с нормальной массой тела. На момент последнего обследования достоверных отличий по возрасту между па-циентами этих групп не выявлено. Очевидно, что среднее значение ИМТ было достоверно выше среди лиц, отобранных по этому признаку, чем в группе контроля (рис. 1).

Соотношение числа пациентов с нормальной массой тела и больных с избыточной массой тела составляло примерно 3:1 (см. таблицу). У пациентов с ИМТ > 25 кг/м2 отмечался целый ряд отличий по биохимическим показателям (см. таблицу): повышение средних уровней ОХ, ХЛНП,

Рис. 1. Основные характеристики пациентов обследованных групп (контроль, больные с нормальной (ТТЭ-1) и избыточной (ТТЭ-2) массой тела). Достоверность отличий (P < 0,05): * ― c ТТЭ-1, # ― от группы контроля



Беларуси

96

глюкозы, активности АЛТ и АСТ по сравнению с данными показателями у лиц группы кон-троля и у пациентов с нормальной массой тела. Отмечалось снижение среднего уровня ХЛВП по сравнению с контролем. По-видимому, это свидетельствует о нарастании неблагоприятных метаболических сдвигов и о повышении риска атерогенных изменений у лиц с избыточной массой тела.

Биохимические показатели сыворотки крови у пациентов с нормальной (группа 1) и избыточной (группа 2) массой тела по сравнению с контролем (группа 3), Х ± Sd

Показатель Группа 1 (п = 243) Группа 2 (п = 88) Группа 3 (п = 54)

Доза тироксина, мкг/кг 2,86 ± 0,50 2,33 ± 0,40* ―ИМТ, кг/м2 21,16 ± 2,20 29,07 ± 3,73 20,84 ± 2,07Св. Т4, нмоль/л 20,75 ± 5,97 19,81 ± 4,90 15,74 ± 2,85Мочевина, ммоль/л 4,06 ± 1,31 4,16 ± 1,21 4,96 ± 1,85Креатинин, ммоль/л 82,15 ± 8,01 85,31 ± 8,74 86,82 ± 8,99Щелочная фосфатаза, ед/л 54,22 ± 23,28 58,25 ± 15,95 64,69 ± 11,42ОХ, ммоль/л 4,47 ± 0,86 4,86 ± 0,81*^ 4,53 ± 0,74ХЛВП, ммоль/л 1,68 ± 0,40 1,38 ± 0,29* 1,51 ± 0,35ХЛНП, ммоль/л 2,66 ± 0,72 3,36 ± 0,91*^ 2,68 ± 0,87Тг, ммоль/л 0,79 + 0,35 0,94 + 0,40 0,84 + 0,28Билирубин, ммоль/л 12,72 ± 6,99 11,95 ± 6,29 12,85 ± 5,90Глюкоза, ммоль/л 5,13 ± 0,56 5,38 ± 0,45*^ 5,13 ± 0,41Натрий, ммоль/л 140,46 ± 2,62 140,17 ± 2,14 140,34 ± 2,07Калий, ммоль/л 4,56 ± 0,40 4,57 ± 0,39 4,52 ± 0,42Кальций, ммоль/л 2,29 ± 0,27 2,35 ± 0,27 2,47 ± 0,11Кальций ионизированный, ммоль/л 1,17 ± 0,14 1,18 ± 0,1 1,25 ± 0,06Фосфор, ммоль/л 1,39 ± 0,70 1,33 ± 0,45 1,24 ± 0,19Железо, мкмоль/л 15,36 ± 5,51 13,95 ± 4,20 23,09 ± 8,84АСТ, ед/л 20,31 ± 7,07 22,68 ± 7,00*^ 19,32 ± 5,63АЛТ, ед/л 19,99 ± 9,45 27,85 ± 12,46*^ 17,24 ± 6,52

П р и м е ч а н и е. Достоверность отличий (P < 0,05): * ― по сравнению с 1-й группой, ^ ― по сравнению с 3-й груп-пой. ОХ ― общий холестерин; ХЛВП, ХЛНП― холестерин липопротеинов высокой и низкой плотности соответ-ственно; Тг ― триглицериды.

Всем прооперированным проводили супрессивную терапию с целью снижения уровня ТТГ до 0,1–0,5 мМЕ/л, исходя из общепринятых рекомендаций Американской тиреоидной ассоциа-ции (АТА) [9]. Средняя доза тироксина у прооперированных с нормальной массой тела составля-ла 2,86 ± 0,50 мкг/кг, а у лиц с избыточной массой тела – 2,33 ± 0,40 мкг/кг, отличия были недо-стоверными (табл. 1). У пациентов обеих групп среднее содержание св. Т4 в сыворотке крови было практически одинаковым и не давало достоверных отличий от контроля, доля лиц с до-стигнутой супрессией ТТГ (ТТГ < 0,5 мМЕ/л) была также практически одинакова (около 71%).

Далее был проведен анализ биохимических показателей у пациентов в зависимости от эффек-тивности супрессивной терапии, оцениваемой по уровню ТТГ. Больные были разделены на три группы: 1) супрессия ТТГ (ТТГ < 0,5 мМЕ/л), 2) ТТГ в интервале нормы (0,5–4,2 мМЕ/л) и 3) не-компенсированный гипотиреоз (ТТГ > 4,2 мМЕ/л). Результаты выборочно представлены на рис. 2.

Как известно из литературы, у взрослых пациентов [10], а также у детей и подростков [11] при гипотиреозе наблюдается повышение уровней ОХ и ХЛНП в крови. При достигнутой су-прессии ТТГ на фоне приема супрафизиологических доз L-T4 возможно некоторое снижение содержания ОХ, ХЛНП и повышение уровня глюкозы, так как это является проявлением метабо-лических эффектов тироксина и трийодтиронина [12]. Действительно, у лиц с нормальной мас-сой тела (рис. 2, А) на фоне супрессии ТТГ (ТТГ < 0,5 мМЕ/л) отмечалась тенденция к повыше-нию среднего уровня глюкозы и достоверно сниженный уровень ОХ по сравнению с данными показателями у больных с некомпенсированным гипотиреозом. При гипотиреозе у этих пациен-тов наблюдались наиболее высокие средние значения ОХ, ХЛНП и ХЛВП, при этом среднее значение КА и содержание Тг практически оставались неизменными.



Беларуси

97

Интересно, что у пациентов с избыточной массой тела (рис. 2, Б) не были выявлены все эти характерные сдвиги показателей липидного профиля, обусловленные влиянием тиреоидного статуса. На фоне гипотиреоза отмечалось только достоверное нарастание уровня ХЛВП по срав-нению с его уровнем у лиц с супрессией ТТГ.

Между пациентами обеих групп (рис. 2, А, Б) наблюдались достоверные отличия. У лиц с избыточной массой тела отмечались достоверно более высокие средние уровни глюкозы, ОХ, ХЛНП и КА как при супрессии, так и при нормальном уровне ТТГ. В группе супрессии уро-вень ХЛВП был достоверно ниже у лиц с повышенной массой по сравнению с этим показате-лем у пациентов с нормальной массой тела.

Из литературы известно [1–7, 13], что избыточная масса тела и ожирение являются фактора-ми, предрасполагающими к развитию МС ― симптомокомплекса, центральным звеном которо-го является инсулинорезистентность. К биохимическим признакам МС относят повышенный уровень глюкозы, а также признаки дислипидемии. Нами был проведен анализ частоты биохи-мических признаков МС у пациентов с нормальной и избыточной массой тела (рис. 3).

Рис. 2. Средние уровни глюкозы и показателей липидного профиля в сыворотке крови пациентов с нормальной (А) и избыточной (Б) массой тела в зависимости от уровня ТТГ. Достоверность отличий (P < 0,05): * ― между пациентами

групп А и Б; # ― между больными с супрессиией и гипотиреозом



Беларуси

98

Как видно из рис. 3, при избыточной массе тела нарастает частота повышенных значений ОХ и ХЛНП как у пациентов общей группы, так и у лиц с супрессией ТТГ. Достоверные отличия за-регистрированы только по частоте высоких значений ОХ. Эта же тенденция наблюдалась у лиц с более высокими значениями ТТГ (более 0,5 мМЕ/л).

Поскольку состояние некомпенсированного послеоперационного гипотиреоза можно рассмат-ривать как временное явление, а целью мониторинга пациентов является выход на стабильную супрессию ТТГ, особого внимания заслуживают сдвиги биохимического статуса у больных с до-стигнутым уровнем супрессии ТТГ. У лиц этой группы при избыточной массе тела кроме выше-названных отклонений (повышенные уровни ОХ и ХЛНП) чаще отмечались повышенные значе-ния активности АЛТ (9,8% по сравнению с 2,9% при нормальной массе тела), что указывает на тенденцию к неблагоприятным изменениям метаболических процессов в печеночной ткани.

Полученные нами результаты близки к данным других авторов [1–7, 13], которые изучали развитие признаков МС у лиц с избыточной массой тела и, как правило, констатировали нарас-тание уровней глюкозы, Тг, ОХ, активности АЛТ и снижение уровня ХЛВП. В литературе об-суждается также наличие ассоциативной связи между ожирением и злокачественными опухоля-ми у женщин и у мужчин, поскольку метаболические сдвиги могут способствовать снижению иммунитета и тем самым благоприятствовать развитию опухолевого роста. Выявленные нами неблагоприятные биохимические изменения у пациентов с ДРЩЖ, имеющих повышенную массу тела, безусловно, требуют проведения профилактических мероприятий, направленных на кор-рекцию массы тела, питания и образа жизни у данной категории больных.

Выводы

1. Среди обследованных нами относительно молодых пациентов 19–40 лет (средний возраст 26,7 года), прооперированных по поводу ДРЩЖ, выявлена высокая доля (около 25%) лиц с из-быточной массой тела.

2. У пациентов с повышенным ИМТ (более 25 кг/м2) по сравнению с больными с нормальной массой тела и лицами группы контроля отмечается целый ряд неблагоприятных биохимических

Рис. 3. Частота биохимических признаков метаболического синдрома (%) у пациентов с нормальной и избыточной массой тела в зависимости от уровня ТТГ: А ― общие группы пациентов с нормальной (ТТЭ-1) и избыточной (ТТЭ-2) массой тела; Б ― больные с ТТГ < 0,5 мМЕ/л с нормальной (ТТЭ-1) и избыточной (ТТЭ-2) массой тела; В ― пациенты

с ТТГ > 0,5 мМЕ/л с нормальной (ТТЭ-1) и избыточной (ТТЭ-2) массой тела



Беларуси

отклонений (нарастание средних уровней ОХ, ХЛНП, глюкозы, активности АЛТ и АСТ, а также достоверно чаще встречаются повышенные значения ОХ, выходящие за пределы нормы.

3. Анализ метаболического статуса в зависимости от уровня ТТГ показывает, что у лиц с из-быточной массой тела наблюдаются достоверно более высокие средние уровни глюкозы, ОХ, ХЛНП и КА как при супрессии, так и при нормальном уровне ТТГ. У больных с супрессией ТТГ и повышенной массой тела уровень ХЛВП является достоверно более низким, чем у пациентов с нормальной массой тела.

Работа выполнена при поддержке Международного проекта ПРООН UNDP/EC Project “Establishment of International Scientifi c and Practical Center of Thyroid Disease in Belarus”.


1. А м е т о в А. С. и др. // Тер. архив. 2001. № 8. С. 66–69.2. У и р т А. // Проблемы эндокринол. 2006. № 3. С. 21–25.3. Б е с с е с е н Д. Г., К у ш н е р Р. Избыточный вес и ожирение. Профилактика диагностика, лечение. М., 2004.4. L e a n M. C. Clinical Handbookof Weight Management. Berlin, 1998. 5. Ч у б р и е в а С. Ю., Г л у х о в Н. В. // Мед. акад. журн. 2006. Т. 6, № 4. С. 88–98.6. Г р о м н а ц к и й Н. И., П е т р о в а Г. Д. // Рос. кардиол. журн. 2007. № 5. С. 24–27.7. Т и к а н о в а В. В., К у з н е ц о в а И. В. // Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2006. № 3. С. 12–17.8. С т е н т о н Г. Медико-биологическая статистика / Пер. с англ.; под ред. Н. Е. Бузикашвили и Д. В. Самойлова.

М., 1999.9. C o o p e r D. S., D o h r t y G. M., H a u g e n B. R. et al. // Thyroid. 2006. N 16. P. 109–142.10. T z o t z a s T., R r a s s a s G. E., K o n s t a n t i n i d i s T., B o u g o u l i a M. // Thyroid. 2000. Vol. 10, N 9. P. 803–808.11. М и т ю к о в а Т. А., Д р о з д В. М., М р о ч е к А. Г. // Мед. новости. 2005. № 2. С. 88–91.12. R e f e t o f f S., W e i s s R. E., U s a l a S. J. // Endocrinol. Rev. 1993. Vol. 14. P. 348–399. 13. К г а й М. А., Л у т о в Ю. В., П и н х а с о в Б. Б. и др. // Вестн. нов. мед. 2008. Т. 15, № 1. С. 141–143.

T. A. MITYUKOVA, T. A. LEONOVA, A. A. TUZOVA, T. Yu. PLATONOVA, M. L. LUSHCHUK

SUPPRESSIVE THERAPY INFLUENCE ON BIOCHEMICAL BLOOD INDICES OF OVERWEIGHT PATIENTS OPERATED ON ACCOUNT OF THYROID GLAND CARCINOMA

Belarusian Academy of Postgraduate Education, Minsk

Summary

The biochemical status of overweight patients (19–40 years old) operated on account of differentiated thyroid gland carci-noma is examined. It is shown that the overweight patients (BBI > 25 kg/m2) have a diversity of unfavorable deviations as com-pared to normal weight and control group patients. The analysis of the metabolic status depending on the effi cacy of thyroxin suppressive therapy has shown that overweight patients have really higher levels of glucose, cholesterin, cholesterin of low-density lipoproteins and atherogenity both at suppression and at the normal THS level. In the case of overweight, the level of cholesterin of high-density lipoproteins in patients with THS suppression is really lower than that in normal weight patients.



Беларуси

100


АГЛЯДЫ

УДК 616-006.6-092:615.155.2(476)

Л. М. ШИШЛО1, Е. В. ШАМОВА2, Е. Н. АЛЕКСАНДРОВА1, В. И. ПРОХОРОВА1, И. В. ГОРУДКО2

РОЛЬ ТРОМБОЦИТОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ И РОСТА ОПУХОЛИ

1 Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н. Н. Александрова, Минск, Беларусь,

2Белорусский государственный университет, Минск


Введение. Одним из важнейших этапов гематогенного метастазирования является проник-новение опухолевых клеток в просвет кровеносного сосуда. В процессе циркуляции в крови они могут взаимодействовать с эндотелиальными клетками, лейкоцитами и эритроцитами, а также с тромбоцитами, результатом чего может явиться агрегация тромбоцитов, индуцированная опу-холевыми клетками (АТИОК), которая играет важную роль в патогенезе диссеминации опухоле-вых клеток [1, 2].

История исследования тромбоцитов в онкологической практике. Основной функцией тромбоцитов является формирование первичной тромбоцитарной пробки в зоне повреждения со-суда, т. е. участие в сосудистом гемостазе. Однако хорошо известен вклад тромбоцитов и в пато-логические процессы, такие как тромбоз, атеросклероз, воспаление и метастазирование [3, 4]. Роль тромбоцитов в прогрессировании злокачественных новообразований исследуется более 140 лет, причем особый интерес проявляется к установлению механизмов взаимодействия тром-боцитов с опухолевыми клетками.

В 1865 г. A. Trousseau [5] сообщил о широком распространении венозных тромбозов среди онкологических пациентов. Он описал 182 случая первичного тромбофлебита, который имелся у больных раком, обратив внимание на то, что в сосудах этих больных образовывались тром-боцитарные микротромбы. У многих онкобольных с синдромом Trousseau наблюдались также аномалии тромбоцитов, указывающие на гиперкоагуляционное состояние [6]. Оригинальное ис сле до вание А. Trousseau подтверждается многочисленными клиническими и патологоанато-мическими наблюдениями, которые демонстрируют повышение риска развития тромбоза у онко логических пациентов и указывают на вовлечение как коагуляционного и фибринолити-ческого, так и тромбоцитарного звена системы гемостаза в патогенез злокачественных ново-образований [7–16].

Важная роль тромбоцитов в процессе метастазирования была выявлена, когда G. Gasic c соавт. [17] показали, что индуцированная тромбоцитопения после введения нейраминидазы у мышей способствовала сокращению количества метастазов асцитических клеток опухоли, т. е. предот-вращала прогрессирование опухолевого процесса. В последующем T. Billroth [18] обнаружил, что опухолевые клетки зачастую образуют тромбы. В связи с этим он предположил, что гема-тогенное распространение злокачественных клеток может осуществляться посредством тром-бов, содержащих опухолевые клетки. Так как агрегаты тромбоцитов – один из главных компо-нентов таких тромбов, большинство исследователей на протяжении второй половины XX – на-



Беларуси

101

чала XXI в. занимались изучением взаимодействия тромбоцит–опухолевая клетка, играющего критическую роль в патогенезе метастазирования.

Структура тромбоцитов, механизмы тромбоцитарного гемостаза. Тромбоциты – безъ-ядерные фрагменты цитоплазмы мегакариоцитов диаметром 2–4 мкм, которые в интактном со-стоянии имеют форму диска, однако при активации приобретают сферическую форму и образу-ют специфические «выросты» – псевдоподии. Средняя продолжительность жизни тромбоцитов составляет 9–10 сут [19, 20]. В тромбоцитах, как и в других эукариотических клетках, можно вы-делить следующие зоны: гликокаликс, плазматическую мембрану, цитоскелет и зону органелл тромбоцитов, состоящую из различных по величине и плотности гранул, содержащих фермен-ты, другие белки и небелковые компоненты (аденозиндифосфат (АДФ), серотонин, адреналин, Са2+ и др. ) [21].

Основные функции тромбоцитов, адгезия и агрегация, опосредуются мембранными ре-цепторами – гликопротеинами (ГП). На поверхности цитоплазматической мембраны каждого тромбоцита расположено значительное количество специфических рецепторов, связанных со сложной системой передачи и обработки сигналов, поступающих извне. Цир кули рующие в кровотоке при нормальных условиях тромбоциты не взаимодействуют ни с внут ренней по-верхностью сосуда, покрытой атромбогенным пластом эндотелиальных клеток, ни с други-ми тромбоцитами. Однако при повреждении сосудистой стенки и различных патологиче-ских состояниях в просвет сосуда экспонируются компоненты субэндотелия и молекулы ад-гезии, при участии которых тромбоциты быстро прикрепляются к поврежденному участку и друг к другу.

Реакции, протекающие в тромбоцитах, достаточно сложны, но независимо от стимула при-водят к развитию универсального ответа – агрегации. Индукторами агрегации являются тром-бин, тромбоксан А2 (TХA2) [22], катехоламины, АДФ [23], коллаген, матриксметаллопротеи-наза-2 (MMP-2) [24], циркулирующие иммунокомплексы и др. В результате активации тромбо-цитов происходят изменения конформационной структуры ГП IIb/IIIa и ГП Ib-V-IХ, приводящие к открытию участка связывания высокомолекулярных лигандов, основными из которых явля-ются фибриноген и фактор Виллебранда. Фибриноген имеет симметричную структуру и может взаимодействовать одновременно с двумя рецептора ми на поверхности соседних активирован-ных тромбо цитов, образуя своего рода «мостики». Нити фибрина стабилизиру ют тромбоцитар-ный агрегат, что приводит к форми рованию полноценного тромба, а фактор Виллебранда обе-спечивает прочную фиксацию тромбоцитов к субэндотелиальным структурам [25]. В физиоло-гических условиях, при повреждении сосудов, процесс образования тромбоцитарных агрегатов выполняет защитную функцию, приводя к остановке кровотечения. При патологии же повышен-ная функциональная активность тромбоцитов нередко является причиной развития инфаркта миокарда, инсульта, тромбоза вен, а в онкологической практике – причиной диссеминирования опухолевых клеток, которые агрегируют вместе с тромбоцитами.

Механизмы АТИОК. Способность злокачественных клеток вызывать агрегацию тромбоци-тов дает им значительные преимущества для успешного метастазирования (см. рисунок) [26, 27]. Тромбоциты образуют защитную оболочку вокруг опухолевых клеток, благодаря чему злокаче-ственные клетки становятся «невидимыми» для иммунной системы. Так, показано, что тромбо-циты, покрывая слоем опухолевые клетки, защищают их от цитотоксичной активности фактора некроза опухоли-α (TNF-α) [28–31]. При рассмотрении реологических аспектов гемостаза важно отметить, что тромбоциты экранируют злокачественные клетки от физического воздействия силы сдвига, которая возникает при течении крови и представляет потенциальную опасность для опухолевых клеток. Опухолевые клетки, покрытые тромбоцитарной оболочкой, не только свободно циркулируют по кровеносному руслу, но и способны эмболизировать микрососуды и образовывать новые очаги метастазов [32]. Так, тромбоциты облегчают адгезию опухолевых клеток к сосудистому эндотелию [33] и высвобождают большое количество факторов, которые могут использоваться опухолевой клеткой для роста [34]. Важно отметить, что тромбоциты так-же содействуют опухоль-индуцированному ангиогенезу, высвобождая ангиогенные факторы, такие как сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF) [35–38].



Беларуси

102

Схематическое изображение участия тромбоцитов в процессегематогенного метастазирования [27]

Несмотря на то что важность АТИОК в метастазировании ясна, молекулярные механизмы, лежащие в основе данного процесса, до конца не изучены. Было продемонстрировано, что неко-торые линии опухолевых клеток вызывают агрегацию тромбоцитов in vitro, в ряде случаев эта способность, коррелируя с метастатическим потенциалом опухоли, носит концентрационно-зависимый характер [39].

Ультраструктурные исследования показали, что процесс АТИОК является двухстадийным: сначала, при контакте с плазматической мембраной клетки опухоли, происходит адгезия и дегра-нуляция отдельных тромбоцитов, а затем секретируемые из адгезированных тромбоцитов фак-торы агрегации (АДФ, ТХА2 и др.) активируют остальные тромбоциты, способствуя образова-нию тромбоцитарных и тромбоцитарно-опухолевых агрегатов [40].

Так, АДФ, высвобождаемый из внутриклеточных гранул тромбоцитов, способствует агрега-ции тромбоцитов, индуцированной клетками нейробластомы SKNMC [41], мелкоклеточного рака легкого [42], меланомы M1Do, M3Da, M4Be [43], рака молочной железы MCF7 и фибробла-стомы HT-1080 [44]. ТХА2, образующийся в результате метаболизма циклооксигеназы тромбо-цитов, приводит к значительному усилению агрегации тромбоцитов, активированных опухоле-выми клетками линии саркомы Walker 256 [45, 46].

Важно отметить, что клетки опухоли стимулируют агрегацию и в дальнейшем активируют коагуляционный каскад также благодаря генерации тромбина [47]. Последний, являясь ключе-вым ферментом в коагуляционном каскаде и наиболее сильным активатором функции тромбо-цитов, действует через протеиназ-активируемые рецепторы (PARs) [48–50]. Данные линии опу-холевых клеток (глиобластома U87MG, нейробластома NCG [51] и клетки рака поджелудочной железы [52]) способны генерировать тромбин, усиливая таким образом АТИОК.

АТИОК стимулируется как сериновыми протеиназами, включающими тромбин, так и цистеи-новыми протеиназами (катепсин В, раковый прокоагулянт и ММР). Катепсин В и раковый про-коагулянт секретируются опухолевыми клетками [53–55]. MMP-2 синтезируется как профер-мент и активируется на поверхности клетки мембранно-ассоциированной металлопротеиназой MT1-MMP-1 [56]. Активированная MMP-2 опухолевых клеток участвует в ремоделировании внеклеточного матрикса и способствует инвазии опухоли [57–60]. В последнее время показано, что высвобождение ММР-2 из тромбоцитов и злокачественных клеток влечет за собой агрега-цию тромбоцитов, индуцируемую клетками линии фибробластомы HT-1080 и рака молочной железы MCF7 [61]. Интересно, что повышение агрегационной способности тромбоцитов у па-циентов с метастатическим раком предстательной железы может быть обусловлено увеличе-нием концентрации ММР-2 [62]. Данный процесс может быть также опосредован вовлечением в АТИОК адгезионных рецепторов: ГП Ib-IX-V, ГП IIb/IIIa и P-селектина [63]. Так как оба адге-зионных рецептора (ГП IIb/IIIa, ГП Ib) могут быть экспронированы на поверхности как тромбо-цитов, так и опухолевых клеток [64–67], то это взаимодействие в процессе АТИОК по своей при-роде является двухсторонним.



Беларуси

103

Следует отметить, что для разного типа опухолевых клеток механизмы активации ими тром-боцитов различны. Например, MMP-2-зависимая агрегация тромбоцитов наблюдается в случае индуцирования клетками линии фибробластомы HT-1080, но в меньшей степени при воздей-ствии клеток линии аденокарциномы A549 [68]. Данное обстоятельство должно учитываться при проведении антиагрегантной терапии, направленной на уменьшение степени АТИОК [69].

Ингибирование АТИОК как предотвращение прогрессирования опухолевого процесса. Изучение механизмов, отвечающих за формирование агрегатов тромбоцит–опухолевая клетка, привело к тестированию различных антитромбоцитарных агентов в качестве потенциальных ингибиторов АТИОК in vitro и in vivo.

Так как механизмы АТИОК основаны не только на прямом взаимодействии тромбоцитов с клетками опухоли, но и на генерации агонистов агрегации (тромбин, АДФ, ТХА2, ММР-азы и др.), для ингибирования АТИОК используют антагонисты адгезионных рецепторов клеток и инги-биторы ферментов, участвующих в активации тромбоцитов.

Наиболее часто используемым антиагрегатным средством является ацетилсалициловая кислота, которая подавляет агрегацию тромбоцитов через ингибирование циклооксигеназы [70]. Аспирин является слабым ингибитором АТИОК in vitro [71, 72]. Как показали ранние клинические исследования, применение аспирина не предотвращает метастазирования у па-циентов с колоректальным или мелкоклеточным раком легкого [73, 74]. Однако его профи-лактическое использование снижает риск развития колоректального рака [75] и рака молоч-ной железы [76].

Для ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов традиционно использу-ют апиразу – фермент, катализирующий гидролиз аденозиновых нуклеотидов, а также селектив-ные ингибиторы пуринорецепторов АДФ. Данные вещества эффективны и при ингибировании АТИОК, так как АДФ, секретируемый в процессе агрегации из тромбоцитов или опухолевых кле-ток, стимулирует процесс образования тромбоцитарно-опухолевых агрегатов. С учетом этого исследовалось действие апиразы на процесс АТИОК [43, 77], ингибитора пуринорецептора P2Y12(2-метилтио-АДФ) и антоганиста пуринорецепторов P2Y (тиклопидина) [78].

В последнее время в многочисленных клинических испытаниях для замедления прогресси-рования злокачественных опухолей широко используют фармакологические ингибиторы ММР-аз [79]. Исследования показали, что селективное ингибирование ММР-аз антителами или ткане-выми ингибиторами металлопротеиназы-4 (TIMP-4) уменьшает агрегацию тромбоцитов, инду-цированную опухолевыми клетками MCF7 и HT-1080 [80]. Следует отметить, что данный эффект ингибиторов ММЗ-аз значительно усиливается в присутствии апиразы [81].

Наиболее эффективными из известных ингибиторов АТИОК являются антагонисты рецеп-тора ГП IIb/IIIa. Показано, что препараты, принадлежащие к этой группе, уменьшают АТИОК. И парентеральное (Abciximab) [82], и пероральное (XV454) [83] применение антагонистов дан-ного рецептора демонстрировало мощный ингибиторный эффект АТИОК. К тому же ингиби-рование АТИОК этими соединениями может уменьшать адгезию опухолевых клеток к эндоте-лию и способствовать снижению ангиогенеза [84–88].

Антиагрегантные препараты, ингибируя взаимодействие тромбоцит–опухолевая клетка, мо-гут также снижать опухолевую прогрессию независимо от их эффекта на тромбоциты. В двух исследованиях, основанных на антитромбоцитарной гипотезе, был изучен эффект ингибитора фосфодиэстеразы (Mopidamol) при немелкоклеточном раке легкого [89, 90]. В результате было установлено значимое увеличение выживаемости пациентов, на основании чего авторы сдела-ли вывод, что этот препарат обладает также и противоопухолевыми свойствами.

Мощными агентами, регулирующими процесс АТИОК, являются простациклин и оксид азо-та (NO). Простациклин синтезируется эндотелиальными клетками и является наиболее сильным из известных ингибиторов агрегации тромбоцитов [91–93]. Известно, что дисбаланс между эндо-генным простациклином и TXA2 может оказывать влияние на агрегацию опухолевых клеток с тромбоцитами в крови [94]. Кроме того, в работах [92–94] показано, что простациклин эффек-тивен при ингибировании АТИОК. Данный эффект простациклина связан с ингибированием экспрессии ГП IIIa/IIb на поверхности тромбоцитов [61].



Беларуси

104

NO также является эффективным ингибитором агрегации тромбоцитов. В сосудистой системе NO синтезируется NO-синтазами, главным образом в эндотелии, тромбоцитах и лейкоцитах [95]. Интересно, что некоторые клетки аденокарциномы человека (SW480, SW620) способны генери-ровать NO, ослабляя тем самым АТИОК [96], причем данный эффект усиливается в присутствии простациклина [69]. Однако в отличие от простациклина механизмы NO-индуцированного сни-жения АТИОК связаны не только с ингибированием функциональной активности ГП IIIa/IIb, но и с высвобождением ММP-аз [68]. Важно отметить, что роль NO в регуляции опухолевого про-цесса весьма противоречива. Так, в литературе имеются данные о стимулирующем действии NO в метастазировании. В работах [97, 98] показано, что NO, генерируемый NO-синтазой, способ-ствует росту опухолевых клеток. Кроме того, он может способствовать распространению опухо-левого процесса благодаря усилению неоваскуляризации [99, 100]. Ингибирующее либо стиму-лирующее действие NO в развитии метастазирования может зависеть от ряда факторов, таких как тип и генетика опухоли, состояние васкуляризации, функциональная активность адгезион-ных рецепторов клеток опухоли и тромбоцитов, а также от концентрации NO.

Заключение. Таким образом, мировой опыт показывает, что на ингибировании патологиче-ского взаимодействия тромбоцит–опухолевая клетка может быть основана эффективная тера-пия метастазирования. Исследование и клиническое тестирование специфических модуляторов функции тромбоцитов необходимы для борьбы с прогрессированием болезни у больных раком. Следовательно, дальнейшее изучение механизмов АТИОК позволит разработать новые подходы в онкологии, направленные на снижение уровня тромбообразования и метастазирования в орга-низме онкологических больных, и увеличить выживаемость таких пациентов.


1. S u v a 1 L. J., G r i f f i n R. J., M a k h o u l I. // Endocrine-related Cancer. 2009. Vol. 16. P. 703–713.2. Д а н и л о в И. П. // Здравоохранение. 2005. № 8. С. 21–22.3. G a e t a n o G. // Haematologica. 2001. Vol. 86, N 4. P. 349–356.4. A l o n s o D., R a d o m s k i M. W. // Heart Fail. Rev. 2003. Vol. 8. P. 47–54.5. T r o u s s e a u A. Clinique Medicale de l’Hotel-Dieu. Paris; London, 1865. P. 94–96.6. N a s h G. F., T u r n e r L. F., S c u l l y M. F. et al. // Lancet Oncol. 2002. Vol. 3, N 7. P. 425–430.7. V a r k i A. // Blood. 2007. Vol. 110, N 6. P. 1723–1729.8. K h o r a n a A. A. // Ann. of Oncol. 2009. Vol. 20. P. 1619–1630.9. Б а р с у к о в В. Ю., П л о х о в В. Н., Ч е с н о к о в а Н. П. // Сиб. онкол. журн. 2007. № 3. С. 73–76.10. L o r e t o M. F., D e - M a r t i n i s M., C o r s i M. P. et al. // Pathol. Oncol. Res. 2000. Vol. 6. P. 301–312.11. W h i t e R. H. // Circulation. 2003. Vol. 107. P. 41–48.12. K a k k a r A. K. // Haemost. Thromb. 2003. Vol. 33. P. 67.13. R i c k l e s F. R., P a t i e r n o S., F e r n a n d e z P. M. // Chest. 2003. Vol. 124. P. 58S–68S.14. R i c k l e s F. R., F a l a n g a A. // Thromb. Res. 2001. Vol. 102. P. V215–V224.15. Z a c h a r s k i L. R. // Cancer Lett. 2002. Vol. 186. P. 1–9.16. L e e A. Y., L e v i n e M. N. // Circulation. 2003. Vol. 107. P. 117–121.17. G a s i c G. J., G a s i c T. B., S t e w a r t T. D. // Natl. Acad. Sci. USA. 1968. Vol. 61. P. 46–52.18. B i l l r o t h T. // Lectures on Surgical Pathology and Therapeutics: A Handbook for Students and Practitioners.

London, 1878. P. 355.19. Б е р к о в с к и й А. Л., В а с и л ь е в С. А., Ж е р д е в а Л. В. и др. // Пособие по изучению адгезивно-

агрегационной активности тромбоцитов. М., 2003. 20. Л у г о в с к а я С. А., М о р о з о в а В. Т., П о ч т а р ь М. Е. и др. // Лабораторная гематология. М., 2002. 21. Д о н ю ш Е. К. // Тромбоциты, их ультраструктура и свойства. М., 1999. 22. N e e d l e m a n P., M o n c a d a S., B u n t i n g S. et al. // Nature. 1976. Vol. 261. P. 558–560.23. B o r n G. V. // Br. J. Haematol. 1966. Vol. 12. P. 37–38.24. S a w i c k i G., S a l a s E., M u r a t J. et al. // Nature. 1997. Vol. 386. P. 616–619.25. Д о л г о в В. В., С в и р и н П. В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. М.; Тверь, 2005. 26. G a s i c G. J., G a s i c T. B., G a l a n t i N. et al. // Int. J. Cancer. 1973. Vol. 11. P. 704–718.27. T s u r u o T., F u j i t a N. // Proc. Jpn. Acad. 2008. Vol. 84. P. 189–198.28. B a l k w i l l F. // Nature Rev. Cancer. 2009. Vol. 9. P. 361–371.29. P h i l i p p e C., P h i l i p p e B., F o u q u e r a y B. et al. // Am. J. Pathol. 1993. Vol. 143. P. 1713–1723.30. S h a u H., R o t h M. D., G o l u b S. H. // Nat. Immunol. 1993. Vol. 12. P. 235–249.31. N i e s w a n d t B., H a f n e r M., E c h t e n a c h e r B. et al. // Cancer Res. 1999. Vol. 59. P. 1295–1300.32. M a l i k A. B. // Physiol. Rev. 1983. Vol. 63. P. 1114–1207.



Беларуси

105

33. M e t h a P. // Blood. 1984. Vol. 63. P. 55–63.34. H o n n K. V., T a n g D. G., C h e n Y. Q. // Semin. Thromb. Hemost. 1992. Vol. 18. P. 392–415.35. K l e m e n t G. L., Y i p T., C a s s i o l a F. et al. // Blood. 2009. Vol. 113, N 12. P. 2835–2842.36. V e r h u e l H. M., H o e k m a n K., L u p u F. et al. // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. P. 166–171.37. S a l v e n P., O r p a n a A., J o e n s u u H. // Clin. Cancer Res. 1999. Vol. 5. P. 487–491.38. S a l g a d o R., V e r m e u l e n P. B., B e n o y I. et al. // Br. J. Cancer. 1999. Vol. 80. P. 892–897.39. P e a r l s t e i n E., S a l k P. L., Y o g e e s w a r a n G. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 4336–4339.40. B r a d l e y C. J., D a u e r R. J., T h u r l o w P. J. et al. // Pathology. 1997. Vol. 29. P. 189–195.41. B a s t i d a E., E s c o l a r G., O r d i n a s A. et al. // J. Lab. Clin. Med. 1986. Vol. 108. P. 622–627.42. H e i n m o l l e r E., W e i n e l R. J., H e i d t m a n n H. H. et al. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1996. Vol. 122.

P. 735–744.43. B o u k e r c h e H., B e r t h i e r - V e r g n e s O., P e n i n F. et al. // Br. J. Haematol. 1994. Vol. 87. P. 763–772.44. J u r a s z P., S a w i c k i G., D u s z y k M. et al. // Cancer Res. 2001. Vol. 61. P. 376–382.45. T z a n a k a k i s G. N., K r a m b o v i t i s E., T s a t s a k i s A. M. et al. // Int. J. Gastrointest. Cancer. 2002.

Vol. 32. P. 23–30.46. S t e i n e r t B. W., T a n g D. G., G r o s s i I. M. et al. // Int. J. Cancer. 1993. Vol. 54. P. 92–101.47. P e a r l s t e i n E., A m b r o g i o C., G a s i c G. et al. // Cancer Res. 1981. Vol. 41. P. 4535–4539.48. C o u g h l i n S. R. // Nature. 2000. Vol. 407. P. 258–264.49. C h u n g A. W., J u r a s z P., H o l l e n b e r g M. D. et al. // Br. J. Pharmacol. 2002. Vol. 135. P. 1123–1132.50. K a h n M. L., N a k a n i s h i - M a t s u i M., S h a p i r o M. J. et al. // J. Clin. Invest. 1999. Vol. 103. P. 879–887.51. E s u m i N., T o d o S., I m a s h u k u S. // Cancer Res. 1987. Vol. 47. P. 2129–2135.52. H e i n m o l l e r E., S c h r o p p T., K i s k e r O. et al. // Scand. J. Gastroenterol. 1995. Vol. 30. P. 1008–1016.53. H o n n K. V., C a v a n a u g h P., E v e n s C. et al. // Science. 1982. Vol. 217. P. 540–542.54. F a l a n g a A., G o r d o n S. G. // Biochemistry. 1985. Vol. 24. P. 5558–5567.55. D o n a t i M. B., G a m b a c o r t i - P a s s e r i n i C. et al. // Cancer Res. 1986. Vol. 46. P. 6471–6474.56. J u r a s z P., C h u n g A. W., R a d o m s k i A. et al. // Circ. Res. 2002. Vol. 90. P. 1041–1043.57. M e d i n a C., J u r a s z P., S a n t o s - M a r t i n e z M. J. et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2006. Vol. 317. P. 739–745.58. L i o t t a L. A., T r y g g v a s o n K., G a r b i s a S. et al. // Nature (Lond.) 1980. Vol. 284. P. 67–68.59. L i o t t a L. A. // Cancer Res. 1986. Vol. 46. P. 1–7. 60. R a y J. M., S t e t l e r - S t e v e n s o n W. G. // Eur. Respir. J. 1994. Vol. 7. P. 2062–2072.61. J u r a s z P., S t e w a r t M. W., R a d o m s k i A. et al. // Br. J. Pharmacol. 2001. Vol. 134. P. 1104–1112.62. J u r a s z P., N o r t h S., V e n n e r P. et al. // Thromb. Res. 2003. Vol. 112. P. 59–64.63. O l e k s o w i c z L., D u t c h e r J. P. // Med. Oncol. 1995. Vol. 12. P. 95–102.64. O l e k s o w i c z L., M r o w i e c Z., S c h w a r t z E. et al. // Thromb. Res. 1995. Vol. 79. P. 261–274.65. G r o s s i I. M., H a t f i e l d J. S., F i t z e r a l d L. A. et al. // FASEB J. 1988. Vol. 2. P. 2385–2395.66. M a r t i n e z A., S a l a s E., R a d o m s k i A. et al. // Sci. Monit. 2001. Vol. 7. P. 646–651.67. G a l t S. W., L i n d e m a n n S., A l l e n L. et al. // Circ. Res. 2002. Vol. 90. P. 1093–1099.68. J u r a s z P., S a w i c k i G., D u s z y k M. et al. // Cancer Res. 2001. Vol. 61. P. 376–382.69. R a d o m s k i M. W., J e n k i n s D. C., H o l m e s L. et al. // Cancer Res. 1991. Vol. 51. P. 6073–6078.70. V a n e J. R., B a k h l e Y. S., B o t t i n g R. M. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998. Vol. 38. P. 97–120.71. H a m i l t o n J., S u b b a r a o V., G r a n a c k K. et al. // Am. J. Pathol. 1986. Vol. 122. P. 160–168.72. B a s t i d a E., A l m i r a l l L., O r d i n a s A. // Int. J. Cancer. 1987. Vol. 39. P. 760–763.73. L i p t o n A., S c i a l l a S., H a r v e y H. et al. // J. Med. 1982. Vol. 13. P. 419–429.74. L e b e a u B., C h a s t a n g C., M u i r J. F. et al. // Cancer. 1993. Vol. 71. P. 1741–1745.75. S a n d l e r R. S., H a l a b i S., B a r o n J. A. et al. // N. Engl. J. Med. 2003. Vol. 348. P. 883–890.76. T e r r y M. B., G a m m o n M. D., Z h a n g F. F. et al. // JAMA. 2004. Vol. 291. P. 2433–2440.77. G r i g n a n i G., P a c c h i a r i n i L., R i c e t t i M. M. et al. // Invasion Metast. 1989. Vol. 9. P. 298–309.78. B a n d o H., Y a m a s h i t a T., T s u b u r a E. // Gann. 1984. Vol. 75. P. 284–291.79. O v e r a l l C. M., L o p e z - O t i n C. // Nat. Rev. Cancer. 2002. Vol. 2. P. 657–672.80. R a d o m s k i A., J u r a s z P., S a n d e r s E. J. et al. // Br. J. Pharmacol. 2002. Vol. 137. P. 1330–1338. 81. A l o n s o - E s c o l a n o D., S t r o n g i n A. Y., C h u n g A. W. et al. // Br. J. Pharmacol. 2004. Vol. 141. P. 241–252.82. C o h e n S. A., T r i k h a M., M a s c e l l i M. A. // Pathol. Oncol. Res. 2000. Vol. 6. P. 163–174.83. A m i r k h o s r a v i A., M o u s a S. A., A m a y a M. et al. // Thromb. Haemost. 2003. Vol. 90. P. 549–554.84. P i n e d o H. M., V e r h e u l H. M. W., D ’ a m a t o R. J. et al. // Lancet North. Am. Ed. 1998. Vol. 352. P. 1775–1777.85. M a r a g o u d a k i s M. E., T s o p a n o g l o u N. E., A n d r i o p o u l o u P. et al. // Matrix Biol. 2000. Vol. 19.

P. 345–351.86. P i n e d o H. M., S l a m o n D. J. // Oncologist. 2000. Vol. 5. P. 1–2.87. S a l g a d o R., B e n o y I., B o g e r s J. et al. // Angiogenesis. 2001. Vol. 4. P. 37–43.88. M a n e g o l d P. C., H u t t e r J., P a h e r n i k S. A. et al. // Blood. 2003. Vol. 101. P. 1970–1976.89. Z a c h a r s k i L. R., M o r i t z T. E., B a c z e k L. A. et al. // J. Natl. Cancer Inst. 1988. Vol. 80. P. 90–97.90. B l a h a H., D i e r k e s m a n n R., F e u e r e r W. et al. // Pneumologie. 1989. Vol. 43. P. 299–304.91. M o n c a d a S., G r y g l e w s k i R., B u n t i n g S. et al. // Nature. 1976. Vol. 263. P. 663–665.92. H o n n K. V., C i c o n e B., S k o f f A. // Science. 1981. Vol. 212. P. 1270–1272.



Беларуси

93. S c h n e i d e r M. R., S c h i l l i n g e r E., S c h i r n e r M. et al. // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 1991. Vol. 21B. P. 901–908.

94. H o n n K. V., M e y e r J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. Vol. 102. P. 1122–1129.95. J u r a s z P., R a d o m s k i A., S a w i c k i G. et al. // Acad. Press. 2000. P. 823–840.96. J e n k i n s D. C., C h a r l e s I. G., B a y l i s S. A. et al. // Br. J. Cancer. 1994. Vol. 70. P. 847–849.97. M o r t e n s e n K., S k o u v J., H o u g a a r d D. M. et al. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 376–379.98. M o r c o s E., J a n s s o n O. T., A d o l f s s o n J. et al. // Urology. 1999. Vol. 53, N 6. P. 1252–1257.99. J e n k i n s D. C., C h a r l e s I. G., T h o m s e n L. L. et al. // PNAS. 1995. Vol. 92. P. 4392–4396.100. B a u e r K. S., C u d e K. J., D i x o n S. C. et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. Vol. 292. P. 3.

L. M. SHISHLO1, E. V. SHAMOVA2, Е. N. ALEKSANDROV1, V. I. PROKHOROVA1, I. V. GORUDKО2

ROLE OF PLATELETS IN PATHOGENESIS OF METASTASES AND TUMOUR GROWTH

1N. N. Alexandrov National Cancer Center of Belarus, Minsk,2Belarusian State University, Minsk

Summary

In the process of hematogenous metastasizing, tumour cells migrate along blood vessels and interact with platelets. The re-sult of this interaction is the tumour – cell induced platelet aggregation (TCIPA) that plays an important role in the pathogenesis of tumour cell dissemination. The article reviews the biological and clinical signifi cance of TCIPA, possible molecular mecha-nisms of triggering platelets aggregation under the infl uence of tumour cells, and pharmacologic regulation of this process.



Беларуси

107


УДК 577.161.3:618.2-083]:611-018.54

Е. А. МОЙСЕЁНОК

СОВРЕМЕННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИТАМИНА Е И Е-ВИТАМИННЫЙ СТАТУС У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА

Гродненский государственный медицинский университет, Беларусь


Несмотря на большое количество исследований, проведенных с момента открытия витамина Е, т. е. группы токоферолов (α, β, γ, δ) и их токотриенольных производных, отличающихся от соответ-ствующих токоферолов структурой боковой полиизопреноидной цепи, метаболизм и физиологи-ческие функции, относящиеся к механизму действия витамина Е, остаются во многом неясными. Имеющиеся данные подтверждают роль этой группы соединений в поддержании метаболизма и клеточного гомеостаза, которые реализуются через эффекты токоферолов на специфические сиг-нальные пути и активность генов, причастных к пролиферативной, метаболической, противовос-палительной и антиоксидантной активности [1–3].

Известно, что витамин Е является основным жирорастворимым антиоксидантом в систе-ме антиоксидантной защиты клетки и эссенциальным фактором в питании высших живот-ных и человека [4, 5].

Термин «витамин Е» объединяет семейство из 8 природных гомологов, которые синтезиру-ются в растениях. Все они являются производными 6-оксихромана (6-хроманола) и отличаются числом и расположением метильной группы в структуре кольца. Химическая структура витами-на Е представлена на рисунке [6, 7].

Недавно описаны десметил и дидесметил-токотриенолы и некоторые другие производные, однако основными формами с доказанной биологической активностью являются 8 упомянутых форм токоферолов и токотриенолов [7].

Основной потенциал биологической активности витамина представлен α-токоферолом. Последний изучен наиболее обстоятельно и является общепринятым эквивалентом для оценки Е-витаминной активности витаминоносителей и фар мацевтических препаратов.

Комиссиями Всемирной организации здравоохранения и Продовольственной и сельскохо-зяйственной организации Объединенных Наций регламентирован 1 эквивалент α-токоферола (α-ТЕS), действие которого соответствует действию 1 мг RRR-α-токоферола (d-α-токоферола). Определяя сум марное содержание витамина Е, уровни потребления витамин Е-содержащих ком-понентов оценивают следующим образом: количество β-токоферола (в мг) умножают на 0,5, γ-токоферола – на 0,1, α-то котриенола – на 0,3, а любых синтетических рац-α-ток оферолов (dl/α-токоферолы) – на 0,74 (1 мг последнего в ацетатной форме эквивалентен 1 МЕ ви тамина Е) [1].

Синтез токоферола осуществляется клетками растений путем конденсации гомогентизино-вой кислоты и фетилпирофосфата с образованием 2-метил-6-фетилпластахинона, являющегося ключевым общим предшественником всех токоферолов. Токотриенолы являются первичной формой витамина Е в эндосперме семян, например в зернах пшеницы, риса и ячменя. Больше всего токотриенолов (до 800 мг/кг), преимущественно в форме γ- и α-токотриенола, содержится в пальмовом масле [8, 9]. Однако самой распространенной формой в растительных тканях явля-ются токоферолы. Трансгенная экспрессия трансферазы гомогентизиновой кислоты позволила достигнуть 10–15-кратного увеличения содержания общего витамина Е по сравнению с данным



Беларуси

108

показателем у нетрансформированных растений. Сверхэкспрессия относилась как к токоферо-лам, так и к токотриенолам, что демонстрирует генно-инженерный подход к получению расти-тельного сырья с высоким антиоксидантным потенциалом [2, 10].

В практической нутрициологии и гигиене питания исходят из положения, что потребление витамина Е при сбалансированном рационе, включая обогащенные витамином Е растительные масла, является достаточным для предупреждения его возможного дефицита [5, 11].

Доля растительных масел как носителей α-токоферола в типичной европейской диете состав-ляет не менее 50%. Из других источников поступление витамина Е обеспечивают: животные жиры, овощи, мясо – до 10% каждый; фрукты, орехи, крупы и молочные продукты – до 4% каж-дый; яйца, рыба и бобовые – около 2% каждый [12].

Расчет уровня потребления α-токоферола затрудняется значительным варьированием со-держания токоферолов в различных типах пищевых жиров, а также различным соотношением гомологов токоферолов в пищевых продуктах. Например, подсолнечное масло содержит около 55 мг% α-токоферола, тогда как соевое масло – не более 8 мг%. Содержание различных компо-нентов витамина Е в растительных маслах представлено в таблице [13].

Содержание различных форм токоферолов в растительных маслах (мг токоферола в 100 г продукта) [13]

Растительное масло α-Токоферол γ-Токоферол σ-Токоферол α-Токотриенол

КокосовоеКукурузноеПальмовоеОливковоеАрахисовоеСоевоеПшеничное (из зародышей)Подсолнечное

0,511,225,65,1

13,010,1

133,0

48,7

060,231,6следы21,459,326,0

5,1

0,61,87,00

2,126,427,1

0,8

0,50

14,3000

2,6

0

Как упоминалось выше, наиболее насыщено токотриенолами пальмовое масло. Оно содер-жит до 40% ненасыщенных жирных кислот и 10% полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), однако имеет ограниченное применение в связи с высоким содержанием в нем насыщенных жи-ров. Более распространенным источником токотриенолов является рисовое масло, широко по-требляемое в азиатских странах. Все эти, а также другие особенности распространения токофе-ролов и токотриенолов в продуктах питания обусловливают большие различия в уровне потре-бления витамина Е в различных странах: от 8–10 мг/сут (Финляндия, Исландия, Япония, Новая

Зеландия) до 20–25 мг/сут (Франция, Греция, Испания) [12, 13].

В основе рекомендаций по уровню диетическо-го потребления витамина Е лежат главным обра-зом его антиоксидантные свойства и, в частности, его способность предупреждать окисление ПНЖК [3]. Метаанализ данных европейских источников свидетельствует, что оптимальное потребление предполагает достижение концентрации витамина Е в плазме крови 25–30 мкмоль/л (из расчета на стандартизированный α-токоферол) [14].

Несмотря на то что уровень токоферолов в плазме крови остается общепризнанным биомарке-ром состояния антиоксидантной системы организ-ма и Е-витаминного статуса, следует иметь в виду, что в системе кровообращения присутству-Химическая структура витамина Е



Беларуси

109

ет не более 1% токоферолов организма и их уровень регулируется воздействием липидемии [15]. В этой связи предлагается использовать показатель так называемой концентрации липид-стандартизированного витамина Е, рассчитываемый как соотношение уровней α-токоферола (в мкмоль) и холестерина (в ммоль) в плазме крови. Если этот показатель составляет величину свы-ше 2,25, то Е-витаминный статус оценивается как удовлетворительный [15, 16], что подтвержда-ется повышенной склонностью к гемолизу эритроцитов при добавлении окислительных агентов в соотношении менее 2,25 [17]. Этот тест, являясь биохимическим маркером ранней стадии недо-статочности витамина Е, позволяет выявить Е-витаминный дефицит задолго до проявления та-ких характерных его признаков, как мышечные повреждения, неврологические нарушения и вы-раженная гипотокоферолемия [18].

На потребность организма в витамине Е и на уровень его потребления существенно влияет пищевое поступление ПНЖК, играющих исключительную роль в прооксидантно-антиок си-дантном равновесии [19–21]. Это является еще одним фактором, модулирующим реальное по-требление витамина Е, существенно отличающееся от рекомендуемых доз суточного потребле-ния (мужчины – 10 мг, женщины – 7–8 мг из расчета на α-токоферол) [22]. Однако наиболее сущ е ственным фактором является соотношение α-токоферола в различных потребляемых расти тельных маслах, на что указывают данные эпидемиологических исследований в Вели коб-ри тании и Франции – странах, существенно различающихся как по потреблению α-токоферола, так и по уровню риска сердечно-сосудистой патологии [13, 23, 24]. В указанных исследованиях пра ктически не выявлен риск развития Е-витаминной недостаточности (соотношение α-то ко фе-рола к холестерину составляет менее 2,25) [23].

В то же время возрастающее потребление в составе диеты ПНЖК, таких как линоленовая кислота, побуждает к поиску дополнительных биомаркеров обеспеченности витамином Е (пред-ложено соотношение потребления токоферол/ПНЖК, равное 0,4, как адекватное для взрослого человека) [25, 26]. Контрольные исследования показали, что если рацион мужчин и женщин со-ставляет в среднем 2550 и 1940 ккал/сут, а содержание ПНЖК в рационе – 6% (17 и 13 г соответ-ственно) [22], то это эквивалентно потреблению 7 и 5 мг/сут α-токоферола. В другом исследова-нии величина указанного соотношения составила 0,6 [27]. По данным рабочей группы ILSI, по-требление соевого масла с высоким содержанием γ-токоферола может вносить существенные изменения в общий уровень потребления токоферолов [28]. Однако соотношение потребления различных форм токоферолов не оказывает критического влияния на уровень α-токоферола в плазме крови. Другими факторами, сказывающимися на статусе витамина Е, являются нару-шение всасывания, снижение транспортирующей способности плазмы крови (падение уровня липопротеинов низкой плотности), что характерно для новорожденных [29]. Их подверженность окислительному стрессу связывают с недостаточным потреблением α-токоферола с грудным мо-локом (около 2,7–3,0 мг/сут) [30]. Исходя из этого, в формуле молочных смесей предусматривается концентрация α-токоферола 0,3 мг% и соотношение α-токоферол (мг)/ПНЖК (г), равное 0,4 [1].

Согласно существующим в Европе и странах СНГ рекомендациям, потребность в витамине Е у женщин составляет 8 мг/сут. В разных источниках указывается, что увеличение этой потреб-ности при беременности на 2 мг, а при кормлении грудью на 3 мг/сут обусловлено увеличением потребляемой энергии. Об особенностях Е-витаминного статуса в прегравидарный период не со-общается [1, 4–6].

Метаболизм токоферолов изучен достаточно хорошо. Их эстерифицированные формы пол-ностью гидролизуются в желудочно-кишечном тракте и поступают в виде хиломикронов в лим-фу. При этом посредством механизма пассивной диффузии α-токоферол ассимилируется быстрее, чем γ-токоферол. После взаимодействия с липопротеинами токоферолы транспортируются к ор-ганам и тканям [31]. В нормальных условиях плазма крови содержит от 11,6 до 26,9 мкмоль/л то-коферолов, преимущественно в форме α-токоферола [32]. Уровень γ-токоферола примерно в 10 раз меньше. Наибольшее содержание токоферолов выявляется в печени и жировой ткани, однако мышечная ткань также вносит вклад в формирование общего депо витамина Е организ-ма [33]. Субклеточная локализация токоферолов отражает их функцию и выявляет их преиму-



Беларуси

110

щественное содержание в митохондриях и клеточных мембранах. Различные источники позво-ляют определить величину абсорбировавшегося пищевого витамина Е как 50–80% пищевого потребления, следовательно, часть токоферолов выводится в неизмененном виде с калом. В каче-стве водорастворимых метаболитов в моче идентифицируются токофероновая кислота и ее лак-тон как продукты окисления токоферола – токоферилхинона [1, 2, 6].

Несмотря на то что существует генеральная концепция антиоксидантной функции вита-мина Е как компонента системы, регулирующей интенсивность протекания свободнорадикаль-ных реакций и предупреждения генерализованного процесса перекисного окисления липидов в биологических мембранах и других субклеточных структурах [34], детальные механизмы био-логической активности витамина Е выяснены относительно недавно [3]. Роль токоферолов свя-зывают с модулированием специфических сигнальных путей и генов, вовлекаемых в пролифе-ративную, метаболическую, противовоспалительную и антиоксидантную активность [3, 35, 36].

Основная биологическая роль витамина Е заключается в защите ПНЖК и других компонен-тов клеточных мембран, а также липопротеинов низкой плотности от окисления свободными радикалами. α-Токоферол и его гомологи эффективно предупреждают процесс перекисного окисления липидов, хотя соотношение токоферолов и фосфолипидов к молекулам фосфолипи-дов в клеточных мембранах составляет 1:2000. Это предполагает высокую реакционноспособ-ность различных форм витамина Е и быструю их регенерацию [37]. Кроме того, биологическую активность токоферолов обеспечивают высокоспецифичные механизмы внутриклеточного транс-порта, способствующие аккумуляции антиоксидантов в мембранах митохондрий и эндоплазма-тического ретикулума (т. е. в местах интенсивного свободнорадикального окисления, например в сердце и легких), а также наличие рецепторов, оптимально ориентирующих молекулы токофе-ролов в мембранных образованиях для реализации функции антиоксидантов [3, 38, 39].

Белок-витаминные взаимодействия в механизмах кишечного, внутриклеточного и межткане-вого транспорта гомологов токоферола обеспечивают доминирование d-α-токоферола в крови и тканях. Это объясняет отличия в биологической активности компонентов (форм) витамина Е, антиоксидантная эффективность которых выявлена, например, в наблюдениях in vivo и in vitro или при использовании их в качестве стабилизаторов пищевых продуктов и напитков. С точки зрения гигиены питания предпочтительной формой является α-токоферол, который служит свое-образным эталоном в оценке биологической активности различных токоферолов и токотриено-лов. По тесту предупреждения мышечной дистрофии активность β-токоферола составляет 50%, γ-токоферола – 10, δ-токоферола – 3, α-токотриенола – 30, β-токотриенола – 5% от степени актив-ности d-α-токоферола [40].

В последнее время выявлены эффекты различных форм витамина Е, которые квалифициро-ваны как сигнальные, ассоциированные с физиологической функцией этого витамина. Иден ти-фицированы цитозольные белки класса Sec 14p, взаимодействующие с гидрофобным доменом токоферолов, регулирующие внутриклеточное распределение витамина Е, экспрессируемые в различных тканях и ассоциированные (в сочетании с витамином) как фактор супрессии опухо-лей [3, 41]. Эффекты токоферолов выявлены на киназных системах, которые регулируют клеточ-ный цикл и активность белков эндоплазматического ретикулума, обладающих свойством стресс-сигналирования, а токотриенолы идентифицированы как лиганды эстрогеновых рецеп-торов β (ERβ) [42]. Дефосфорилирование киназы Akt-PKB предупреждается α-токоферолом, но не γ-токоферолом [43]. В то же время антиканцерогенная активность последнего (например, ассо циированная с курением) реализуется посредством рецепторов Nrf2/AhR/NFkB [44, 45]. Ви-т амин Е взаимодействует также с некоторыми ядерными рецепторами, действуя в качестве про-мотора транскрипции генов, причастных к метаболизму самого витамина и некоторых липидов, а посредством механизма гомо- или гетеродимеризации контролирует активность генов, отве-чающих за антиоксидантный потенциал и протекцию биомембран, посредством модуляции ме-таболизма глутатиона и активности гемоксигеназы 1 [45, 46]. Взаимодействием витамина Е с ядерными рецепторами объясняется его способность модулировать эффекты лекарственных средств, нутриентов на метаболизм липидов, что весьма характерно, например, при назначении



Беларуси

111

гиполипидемических средств и особенно статинов [47]. Кроме того, описаны эффекты регуля-ции токоферолами ферментативной активности: α-токоферол является конкурентным ингибито-ром изоферментов фосфолипазы А2, циклооксигеназы-2 и 5-липоксигеназы; γ-токоферол – наи-более эффективный ингибитор циклооксигеназы-2 in vitro и in vivo [48–52].

По сравнению с α-токоферолом в экспериментах in vitro и in vivo продемонстрирована более высокая эффективность α- и γ-токоферола как модуляторов клеточного сигналирования и экс-прессии генов. Это нашло подтверждение в исследованиях нейропротективных, гипохолестери-немических и противоопухолевых свойств этих соединений. Более того, минорные токоферолы, так же как γ-токоферол, проявили эффект стимуляции антиоксидантного и флоголитического потенциала в наблюдениях на больных с метаболическим синдромом [53].

Идентифицирован продукт метаболизма трансформеров витамина Е в производные хрома-нола (через изоформу цитохрома CYP4F2 и процесс β-окисления) – 2,2′-карбоксиэтил-гидрокси-хромановая кислота (КЭХК), образование которой выявлено в пероксисомах и митохондриях [54, 55]. В последующем КЭХК выявлена в желчи и моче в качестве основного метаболита ви-тамина Е [55]. Накопление КЭХК обнаружено в клетках рака простаты, а исследование различ-ных витамерных форм КЭХК выявило сходную, если не идентичную антиоксидантную, про-тивовоспалительную и антипролиферативную активность [56]. Кроме того, γ-КЭХК метаболит обладает свойствами натрийуретического фактора [3, 57]. Все формы КЭХК ха рак теризуются, подобно витамерам, разной степенью сигнальной активности, которая оп ре де ляет ся длиной боковой цепи [58].

В последнее время открыто и изучено фосфорилированное производное витамина Е – α-то ко-фе рилфосфат (ТФФ) [59]. Как синтез, так и гидролиз этого соединения осуществляется фермен-тативно (токоферол-киназа и ТФФ-фосфатаза), доказано присутствие ТТФ в различных тканях, в том числе в крови (плазма) [38]. Более того, у кроликов, например, содержание ТФФ в плазме крови идентично уровню α-токоферола [60]. Эффективность последнего оказалась ниже ТФФ в тесте на клеточных культурах (влияние на пролиферацию, сигнальную трансдукцию, экспрес-сию генов) [61]. Получены данные о высокой активности ТФФ на моделях атеросклероза, ише-мии/реперфузии [62]. Предполагается, что новый метаболит токоферола является липидным ме-диатором, сходным по механизму действия с фосфатидилинозитолом [3].

Как указывалось выше, межтканевой транспорт токоферолов опосредован липопротеинами, уровень которых находится под контролем генетических факторов, что предопределяет значи-тельную вариабельность токоферолемии и различия в ответ на диетическое потребление. Значительную роль играют полиморфизм аполипопротеина С-II, CEPT и печеночной липазы, а также гаптоглобина Нр 2-2, дефектные формы которого приводят к падению уровня витаминов Е и С в плазме крови [63, 64]. Роль генетических факторов столь же велика в физиологических процессах кишечного всасывания и переноса компонентов витамина Е хиломикронами и липо-протеинами высокой плотности энтероцитов, а также в процессах катаболизма и выведения про-дуктов метаболизма с желчью [65, 66].

Внепеченочное распределение витамина Е, вероятно, ассоциируется с экспрессией и функци-ей липопротеинового рецептора, что не исключает существования специализированных транс-портных механизмов для отдельных витамеров [39]. Максимальный уровень γ-токоферола на-блюдается, например, в коже, скелетных мышцах, венах и жировой ткани. Причиной различий тканевого распределения α- и γ-токоферолов может быть взаимодействие с SR-BI-липоп ро теи но-вым рецептором, метаболический процессинг которого имеет гендерные различия [67]. Роль транспортных механизмов в формировании тканевых депо витамина Е и реализации сигналь-ных функций демонстрируется при дефиците α-ТТР (токоферол-транпортирующего белка) плаз-мы крови, фактора, безусловно, доминирующего в формировании Е-витаминного статуса орга-низма. Функциональная неполноценность этого биохимического механизма предполагает фор-мирование риска развития нейродегенеративного фенотипа [68, 69]. В связывании α-токоферола нейронами выявлен кооперативный эффект γ-токоферола и δ-токоферола, что предполагает су-ществование внутри витамеров процесса взаимодействия по контролю оптимального внутри-



Беларуси

112

клеточного баланса витамина Е [70]. Не случайно неблагоприятные эффекты моноформы α-то-коферола связывают со снижением тканевого уровня γ-токоферола [2, 3].

Биологические и фармакологические свойства токоферолов и токотриенолов интенсивно изу-чаются с учетом недавно открытых механизмов их метаболизма и взаимодействия, в том числе в отношении других микронутриентных факторов. Для витамина Е это прежде всего взаимо-действие с антиоксидантными витаминами и селеном, что предполагает развитие новых пред-ставлений о функционировании антиоксидантной системы организма. На модели культуры клеток Jurkat (культивируемых на селен-дефицитной среде), приводящей к их гибели, более эффективными протекторами оказались токотриенолы, нежели токоферолы, при этом актив-ность α- и γ-то ко ферола была идентичной. Причиной максимальной активности α-токоферола являлась высокая скорость захвата витамера клетками [7, 37], что подчеркивает роль механиз-мов трансмембранного и внутриклеточного транспорта в реализации физиологических функ-ций витамина Е.

Исходя из изложенного выше, особое значение приобретает оценка обеспеченности токофе-ролами организма женщин репродуктивного возраста. Содержание биомаркеров в плазме крови будущих матерей и беременных женщин изучено, безусловно, недостаточно, несмотря на то что нарушения прооксидантно-антиоксидантного баланса являются широко распространенным синдромом в развитии осложнений беременности и течения родов [71]. Проведенное нами ранее исследование статуса токоферолов у женщин репродуктивного возраста показало, что медиана значений α- и γ-токоферола (20,86 и 1,34 мкмоль/л соответственно) ниже референтных значений содержания данных микронутриентов в плазме крови взрослого человека, получающего сбалан-сированный рацион по макро- и микронутриентам (25–34 и 3,0–4,9 мкмоль/л соответственно) [72, 73]. Низкий уровень обеспеченности α-токоферолом обследованных женщин подтвержден результатами анализа центильных величин, которые у 75% обследованных были ниже рефе-рентных величин, а для γ-токоферола это характерно для 90% обследованных. В какой мере эти данные могут быть интерпретированы с учетом современных представлений о статусе липид-стандартизированного витамина Е, рассчитанного как соотношение α-токоферола к холестерину в плазме крови? Результаты исследования показали, что только у 62% обследованных женщин в возрасте 17–39 лет уровень холестерина плазмы крови не превышал 5 ммоль/л, а у значительной части обследованных он достигал 6,05–6,59 ммоль/л. В этой связи величина соотношения α-токоферол/холестерин являлась завышенной и в среднем составляла 4,46 ± 1,35 (n = 111), что существенно превышало величину минимального удовлетворительного показателя липид-стандартизированного витамина Е. Однако, как показал процентильный анализ, у 3% обследован-ных женщин Е-витаминный статус являлся критическим. При выраженной гиперхолестеринемии (более 5,2 ммоль/л (n = 36)) доля женщин с критическим Е-витаминным статусом составляла 4%. С учетом чрезвычайно низкого уровня γ-токоферола [73, 74] и Е-витаминного статуса в целом зна-чительное число женщин репродуктивного возраста можно отнести к группе риска развития ви-таминной недостаточности, а следовательно, у них высока предрасположенность к развитию окислительного стресса.


1. WHO/FAO. Vitamin and mineral requirements in human nutrition. Geneva, 2004. P. 94–107.2. S e n C h., K h a n n a S., R o y S. // Mol. Aspects Med. 2007. Vol. 28, N 5–6. P. 692–728.3. G a l l i F., A z z i A. // Biofactors. 2010. Vol. 36, N 1. P. 33–42.4. М о р о з к и н а Т. С., М о й с е е н о к А. Г. Витамины: краткое руководство для врачей и студентов мед., фар-

мацевт. и биол. специальностей. Минск, 2002. 5. Т у т е л ь я н В. А., С п и р и ч е в В. Б., С у х а н о в Б. П., К у д а ш е в а В. А. Микронутриенты в питании

здорового и больного человека (справочное руководство по витаминам и минеральным веществам). М., 2002.6. С п и р и ч е в В. Б., М а т у с и с И. И., Б р о н ш т е й н Л. М. // Экспериментальная витаминология (справоч-

ное руководство) / Под ред. Ю. М. Островского. Минск, 1979. С. 18–57.7. Y o s h i d a Y., S a i t o Y., J o n e s L. S., S h i g e r i Y. // J. Biosci. Bioeng. 2010. Vol. 104, N 6. P. 439–445.8. S u n d r a m K., S a m b a n t h a m u r t h i R., T a n Y. A. // Asia Pac. J. Clin. Nutr. 2003. Vol. 12, N 3. P. 355–362.



Беларуси

113

9. H o r v a t h G. et al. // Phytochemistry. 2006. Vol. 67, N 12. P. 1185–1195.10. C a h o o n E. B. et al. // Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21, N 9. P. 1082–1087.11. М а р т и н ч и к А. Н., М а е в И. В., Я н у ш е в и ч О. О. Общая нутрициология: учеб. пособие. М., 2005.12. B e l l i z z i M. C. et al. // Eur. J. Clin. Nutr. 1994. Vol. 48. P. 822–831.13. S l o v e r H. T. // Lipids. 1971. Vol. 6. P. 291–296.14. G e y K. F. // Vitamin E in health and disease / Eds. L. Packer, J. Fuchs. N. Y., 1993. P. 589–634.15. H o r w i t t M. K. et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1972. Vol. 203. P. 223–236.16. T h u r n h a m D. I. et al. // Ann. Clin. Biochem. 1986. Vol. 23. P. 514–520.17. L e o n a r d P. J., L o s o w s k y M. S. // Am. J. Clin. Nutr. 1971. Vol. 24. P. 388–393.18. H o r w i t t M. K. // Vitamin E, a comprehensive treatise / Ed. L. Machlin. N. Y., 1980. P. 621–636.19. S i e s H. // Oxidative stress: oxidants and antioxidants / Ed. H. Sies. L., 1993. P. 15–22.20. S c o t t G. Antioxidants in science, technology, medicine and nutrition. Chichester, 1997.21. D u t h i e G. G. // Eur. J. Clin. Nutr. 1993. Vol. 47. P. 759–764.22. Department of Health. Dietary reference values for food energy and nutrients for the United Kingdom. L., 1991.23. Subcommittee on the Tenth Edition of the Recommended Dietary Allowances, Food and Nutrition Board.

Recommended dietary allowances. 10th ed. Washington, 1989.24. H o w a r d A. N. et al. // Int. J. Vit. Nutr. Res. 1996. Vol. 66. P. 113–118.25. B i e r i J. G., E v a r t s R. P. // J. Amer. Diet. Assoc. 1973. Vol. 62. P. 147–151.26. W i t t i n g L. A., L e e L. // Am. J. Clin. Nutr. 1975. Vol. 28. P. 571–576.27. G r e g o r y J. R. et al. The Dietary and Nutritional Survey of British Adults. L., 1990.28. Nutrition Working Group of the International Life Science Institute Europe // Nutrition Abstracts and Reviews (Series A).

1990. Vol. 60. P. 827–842.29. L l o y d J. K. // Acta Pediatrica Scandinavica. 1990. Vol. 79. P. 6–11.30. K e l l y F. J. et al. // Br. J. Nutr. 1990. Vol. 63. P. 631–638.31. G a l l o-T o r r e s H. E. // Lipids. 1970. Vol. 5. P. 379–384.32. B i e r i J. G. // Present knowledge in nutrition / Ed. M. L. Brown. Washington, 1990. P. 117–121.33. T r a b e r M. G., R a m a k r i s h n a n R., K a y d e n H. J. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1994. Vol. 91. P. 10005–10008.34. D i p l o c k A. T. // Mol. Asp. Med. 1994. Vol. 15. P. 293–376.35. J u J. et al. // Carcinogenesis. 2010. Vol. 31, N 4. P. 533–542.36. R e i t e r E., J i a n g Q., C h r i s t e n S. // Mol. Aspects Med. 2007. Vol. 28, N 5–6. P. 668–691.37. S a i t o Y. et al. // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 39428–39434.38. Z i n g g J. M. // Mini Rev. Med. Chem. 2007. Vol. 7. P. 543–558.39. R i g o t t i A. // Mol. Aspects Med. 2007. Vol. 28. P. 423–436.40. D u t t a - R o y A. K. et al. // J. Nutr. Biochem. 1994. Vol. 5. P. 562–570.41. Z i n g g J. M., K e m p n a P., P a r i s M. et al. // Biochimie. 2008. Vol. 90. P. 1703–1715.42. C o m i t a t o R., N e s a r e t n a m K., L e o n i G. et al. // Am. J. Physiol. 2009. Vol. 297. P. E427–E437.43. G a l l i F. // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 43. P. 678–680.44. G o h i l K., O o m m e n S., V a s u V. T. et al. // Mol. Aspects Med. 2007. Vol. 28. P. 453–480.45. B a r v e A., K h o r T. O., N a i r S. et al. // Int. J. Cancer. 2009. Vol. 124. P. 1693–1699.46. M u s t a c i c h D. J., G o h i l K., B r u n o R. S. et al. // J. Nutr. Biochem. 2009. Vol. 20. P. 469–476.47. W e r b a J. P., C a v a l c a V., V e g l i a F. et al. // Atherosclerosis. 2007. Vol. 193. P. 229–233.48. J i a n g Q., Y i n X., L i l l M. A. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. Vol. 105. P. 20464–20469.49. R e i t e r E., J i a n g Q., C h r i s t e n S. // Mol. Aspects Med. 2007. Vol. 28. P. 668–691.50. C h a n d r a V., J a s t i J., K a u r P. et al. // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 320. P. 215–222.51. D o s S a n t o s J. I., M a r c h i - S a l v a d o r D. P., F e r n a n d e s C. A. et al. // Protein Pept. Lett. 2007. Vol. 14.

P. 698–701.52. Z i n g g J. M., A z z i A. // Curr. Med. Chem. 2004. Vol. 11. P. 1113–1133.53. D e v a r a j S., L e o n a r d S., T r a b e r M. G., J i a l a l I. // Free Radic. Biol. Med. 2008. Vol. 44. P. 1203–1208.54. H e n s l e y K., B e n a k s a s E. J., B o l l i R. et al. // Free Radic. Biol. Med. 2004. Vol. 36. P. 1–15.55. G a l l i F., P o l i d o r i M., S t a h l W. et al. // Vitam. Horm. 2007. Vol. 76. P. 263–280.56. C o n t e C., F l o r i d i A., A i s a C. et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. Vol. 1031. P. 391–394.57. Z i n g g J. M. // Mol. Aspects Med. 2007. Vol. 28. P. 481–506.58. A z z i A. // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 43. P. 16–21.59. G i a n e l l o R., L i b i n a k i R., A z z i A. et al. // Free Radic. Biol. Med. 2005. Vol. 39. P. 970–976.60. N e g i s Y., A y t a n N., O z e r N. et al. // Arch. Biochem. Biophys. 2006. Vol. 450. P. 63–66.61. M u n t e a n u A., Z i n g g J. M., O g r u E. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. Vol. 318. P. 311–316.62. M u k h e r j e e S., L e k l i I., D a s M. et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 1782. P. 498–503.63. B o r e l P., M o u s s a M., R e b o u l E. et al. // Br. J. Nutr. 2009. Vol. 101. P. 680–687.64. Z i n g g J. M., A z z i A., M e y d a n i M. // Nutr. Rev. 2008. Vol. 66. P. 406–414.65. A n w a r K., I q b a l J., H u s s a i n M. M. // J. Lipid Res. 2007. Vol. 48. P. 2028–2038.66. R e b o u l E., T r o m p i e r D., M o u s s a M. et al. // Am. J. Clin. Nutr. 2009. Vol. 89. P. 177–184.67. B u r t o n G. W., T r a b e r M. G., A c u f f R. V. et al. // Am. J. Clin. Nutr. 1998. Vol. 67. P. 669–684.68. C u d d i h y S. L., A l i S. S., M u s i e k E. S. et al. // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283. P. 6915–6924.



Беларуси

69. N i s h i d a Y., I t o S., O h t s u k i S. et al. // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284. P. 33400–33408.70. G a o R., S t o n e W. L., H u a n g T. et al. // Nutr. J. 2002. Vol. 1–2. P. 78–85.71. Г у т и к о в а Л. В. Критерии степени тяжести позднего гестоза. Витаминно-гормональный гомеостаз в си-

стеме мать–плацента–плод. Гродно, 2005.72. М о й с е ё н о к Е. А., А л ь ф т а н Г. В., М о й с е ё н о к А. Г. // Новости мед.-биол. наук. 2009. № 1–2.

С. 76–81.73. М о й с е е н о к Е. А., А л ь ф т а н Г. В., М о й с е е н о к А. Г. // Журн. ГрГМУ. 2009. № 3. С. 98–102.74. М о й с е е н о к Е. А., А л ь ф т а н Г. В., М о й с е е н о к А. Г. // Здоровье и окружающая среда: сб. науч. тр.

Минск, 2008. Вып. 12. С. 186–191.

E. A. MOISEENOK

MODERN TENDENCIES IN VITAMIN E RESEARH AND THE VITAMIN E STATUS IN WOMEN OF CHILDBEARING AGE

Grodno State Medical University, Belarus

Summary

Modern concepts of assimilation, metabolism and physiological functions of vitamin E (α-, β-, γ-, δ-tocopherols and α-, β-, γ-, δ-tocotrienols) are reviewed. Methods of vitamin status assessment based on the concept of lipid-standardized vitamin E are considered. Alpha- and gamma-tocopherols blood plasma levels in women of childbearing age are presented. The pos-sibility of critical forms of vitamin E defi ciency and oxidative stress development during pregnancy is emphasized.



Беларуси

115


УДК 616.992.282-036.22-07

Г. В. ИЛЮКЕВИЧ1, Ю. Н. ДОЦЕНКО2, А. Г. ИЛЮКЕВИЧ3

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ГРИБКОВОЙ ИНФЕКЦИИ

1Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск,2Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека,

Гомель, Беларусь, 3Белорусский государственный медицинский университет, Минск


Грибковая инфекция – одна из наиболее серьезных и частых инфекций у пациентов лечеб-ных учреждений. Сегодня приходится констатировать, что данная патология, которая поража-ла в основном больных с иммуносупрессией или нейтропенией, все чаще стала встречаться у пациентов отделений интенсивной терапии и реанимации (ОИТР), причем в подавляющем большинстве случаев как нозокомиальная инфекция. Согласно данным исследования, вклю-чавшего 24 179 случаев документированной госпитальной инфекции кровотока у пациентов в 49 госпиталях США, кандидемия в условиях ОИТР составила 10,1% от инфекций кровото-ка по сравнению с 7,9% в общесоматических отделениях [1]. Развитие данной инфекции свя-зано с увеличением продолжительности госпитализации в общесоматических отделениях и в ОИТР на 12,7 и 15,5 дней соответственно, а также с общим увеличением стоимости лече-ния (до 40 тыс. долларов США) [2, 3].

Согласно результатам исследования ENVIN, инфекции в ОИТР Испании, вызванные Candida, занимают 6-е место по частоте после Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus (коагулазонегативных и золотистых) и Acinetobacter spp. [4].

По данным Национального комитета США по контролю за внутрибольничными инфек-циями (NNIS), за 10 лет частота кандидемии в США возросла в 5 раз, нозокомиальных мико-зов – в 2,5 раза [5]. Причиной распространенности грибковой инфекции называются массивная терапия антибиотиками широкого спектра, использование центральных венозных катетеров, предшествующие вмешательства на органах брюшной полости, парентеральное питание, прове-дение заместительной терапии у больных с острой почечной недостаточностью, а также дли-тельное (более 7 сут) нахождение в ОИТР, и все это на фоне иммуносупрессии или нейтропении [6, 7]. Нельзя не признать, что усовершенствование и внедрение в клиническую практику новых высокотехнологичных методов интенсивной терапии, поддерживающих жизнь пациентов, кото-рые находятся в критическом состоянии, привело к расширению показаний к хирургическому вмешательству и увеличению их объема у новорожденных и «возрастных» пациентов, т. е. уве-личило долю пациентов с факторами риска развития грибковых инфекций [8]. Столь широкое распространение кандидозной инфекции и темпы ее роста явились основанием для выделения кандидемии в самостоятельную нозологическую форму [1, 9, 10].

За последнее десятилетие среди всех зарегистрированных случаев грибковых инфекций в лечебных учреждениях все большую долю занимают кандидемия и инвазивный кандидоз [1], которые осложняют течение основного заболевания, что зачастую приводит к летальному ис-ходу. По данным некоторых исследований, 6–11% всех госпитальных инфекций кровотока вы-званы Candida spp. [1, 2]. Считается, что относительная летальность от инвазивного кандидоза достигает 47% [9], хотя многие авторитетные клиники оценивают этот показатель как 15–25%



Беларуси

116

для взрослых и 10–15% для новорожденных и детей [11, 12], что выше уровня летальности от инфекций, вызванных микробной флорой. Так, в известном уже нам исследовании, выпол-ненном в 49 ОИТР США, причиной летального исхода являлись следующие возбудители: Candida species (39,2%), Pseudomonas aeruginosa (38,2%), Acinetobacter baumannii (34,0%), Enterococci (33,9%) и Klebsiella (27,6%) [1].

У пациентов ОИТР грибковая инфекция протекает преимущественно в виде кандидемии (определяется как по крайней мере однократное выделение Candida spp. при посеве крови, полу-ченной при лихорадке более 38 ºС или других признаках системной воспалительной реакции) и острого диссеминированного кандидоза (устанавливается при сочетании кандемии с выявле-нием Candida spp. при гистологическом исследовании и/или при посеве материала из глубоких тканей, включая подкожную клетчатку, а также при выявлении Candida spp. при гистологиче-ском исследовании и/или посеве материала из глубоких тканей двух и более локализаций) [13]. И хотя диссеминированный кандидоз развивается нечасто, его доля среди всех микозов остает-ся высокой. Так, по данным различных исследований, на диссеминированный кандидоз при-ходится от 21 до 45% случаев [14, 15].

К клинической группе грибковых инфекций кровотока относится и инвазивный аспергиллез (ИА), который чаще всего возникает у иммуносупрессивных пациентов (с острой лейкемией, пе-ренесших пересадку стволовых клеток или трансплантацию органа, со СПИДом или лимфогра-нулематозом) [16–18]. Aspergillus fumigatus является наиболее частым этиологическим фактором в развитии ИА, однако некоторые авторы сообщают о все большем распространении A. terreus и A. fl avus [17, 19, 20]. У онкогематологических больных этот условно-патогенный микоз характе-ризуется высокой летальностью – в пределах от 40 до 80% [17, 21].

К сожалению, в республике отсутствуют официальные данные многоцентровых исследова-ний о распространенности грибковой инфекции и частоте ее возникновения у пациентов ОИТР, не проводится мониторинг чувствительности данной флоры к применяемым антимикотикам.

Несмотря на неоспоримые данные, свидетельствующие о росте и распространенности грибковой инфекции во всем мире, а также об уровне летальности и осложнениях, связанных с кандидемией и инвазивным кандидозом, проблема ранней диагностики кандидозной инфек-ции до сих пор не решена. Особую значимость эта проблема приобретает в связи с тем, что в ряде исследований была наглядно продемонстрирована прямая зависимость уровня леталь-ности от сроков начала противогрибковой терапии после установления диагноза. При назначе-нии адекватной терапии пациентам с кандидемией в первые 48 ч летальность составила 40%, при более позднем назначении – 78% [22]. В группе нелеченых пациентов летальность соста-вила 77%, в группе больных, получавших лечение,– 30% [23]. В недавнем исследовании была продемонстрирована статистически достоверная связь между сроком установления диагноза кандидемии и началом адекватной эмпирической терапии. Так, при установлении кандидемии и начале терапии в сроки менее 12 ч уровень летальности составил всего 11,0%, от 12 до 24 ч – 31,0, от 24 до 48 ч – 33,0 и более 48 ч – 35% [24]. В самом крупном проспективном исследовании, проведенном в Санкт-Петербурге, получены следующие данные: летальность в течение 30 дней после выявления кандидемии составила 49%, у получавших антимикотики – 37, без специфи-ческой терапии – 72% [25]. К сожалению, приходится констатировать, что адекватная терапия назначается своевременно только 15–40% пациентов, при этом летальный исход зачастую на-ступает до назначения специфического лечения [26]. Становится очевидным, что только имея клинические и микробиологические данные, необходимые для назначения соответствующей свое временной противогрибковой терапии, можно снизить летальность при грибковой инфек-ции у пациентов ОИТР.

В настоящем обзоре предпринята попытка систематизировать клинические, лабораторные и инструментальные методы диагностики грибковой инфекции у пациентов ОИТР с учетом на-личия факторов риска развития данной инфекции.

Прежде чем рассматривать отдельные методы диагностики грибковой инфекции у пациентов ОИТР, следует признать, что кандидоз диагностируется слишком поздно. Объясняется это не-сколькими факторами: клинические проявления являются неопределенными, бактериологиче-



Беларуси

117

ские исследования крови обычно положительны приблизительно в 50% случаев, методы взятия образцов бактериологического исследования крови достаточно часто выполняются с нарушени-ем правил [26, 27]. Наконец, серологические тесты и культуры, кроме бактериологических ис-следований крови, являются неопределенными, а их диагностическая ценность все еще обсуж-дается в мировой литературе [27–29]. В результате клиницисты часто игнорируют возможный ранний диагноз кандидоза. Еще одним препятствием в диагностике кандидоза является тот факт, что пациенты в ОИТР достаточно часто получают в качестве профилактики грибковых осложнений неадекватные дозы флуконазола (100 мг/сут), что приводит к отрицательным ре-зультатам диагностических тестов и не оказывает лечебного воздействия.

Одна из главных особенностей в диагнозе – оценка факторов риска для грибковой инфекции пациентов различных групп. Во многих исследованиях [30–32] были представлены следующие возможные факторы риска, которые могли бы помочь клиническим врачам вовремя идентифици-ровать грибковую инфекцию и выработать оптимальный терапевтический подход: предшествую-щая антибактериальная терапия (множественная или длительная), катетеризация мочевого пузы-ря, использование назогастрального зонда и центрального сосудистого катетера (артериального и венозного), полное парентеральное питание, искусственная вентиляция легких, предшествующее хирургическое вмешательство, повторные перфорации ЖКТ, операции по поводу острого панкреа-тита или спленэктомия, продолжительность пребывания в ОИТР, почечная недостаточность и гемо-диализ, предшествующая бактериемия и выделение Candida spp. (не из крови), терапия кортико-стероидами, лучевая терапия, иммуносупрессивная терапия и сахарный диабет.

Колонизация анатомических областей Candida spp. для пациентов ОИТР имеет особое значе-ние при наличии четырех групп факторов риска [33]: тяжесть основного заболевания (высокие баллы по шкале АРАСНЕ II); длительное применение антибиотиков широкого спектра действия; многокомпонентный инвазивный мониторинг и методы интенсивной терапии; характер хи-рургического заболевания и оперативного вмешательства. Недавно в работе [31] было показано, что наиболее значимыми в диагностическом плане являются комбинации следующих факторов риска – применение антибиотиков широкого спектра действия или использование центрального венозного катетера с двумя другими факторами: полное парентеральное питание, любой вид диализа, полостная абдоминальная операция, панкреатит и любое использование стероидов или иммуносупрессоров.

Для большей объективности и с целью унифицирования риск развития инвазивного канди-доза и раннего назначения антимикотиков у пациентов ОИТР оценивают с помощью специаль-ной шкалы (Candida score), согласно которой подсчитывают суммы баллов: клиника тяжелого сепсиса – 2,038 балла; мультифокальная колонизация –1,112; послеоперационный период – 0,997; полное парентеральное питание – 0,908. При сумме баллов более 2,5 можно говорить о развитии инвазивного кандидоза с чувствительностью метода 81% и специфичностью 74% и о начале про-тивогрибковой терапии. Оценку по данной шкале следует проводить при госпитализации паци-ента в ОИТР и любом подозрении на развитие кандидоза [34].

Не следует забывать и о клинических проявлениях кандидемии и диссеми нированного канди-доза. Хотя они и неспецифичны, но при их выявлении вероятность развития грибковой инфек-ции очень высокая. Клиническая диагностика основывается на выявлении признаков систем-ной воспалительной реакции и включает оценку общего состояния, измерение температуры тела (свыше 38,5 ºС или ниже 36,0 ºС) и артериального давления (снижение систолического АД ниже 90 мм рт. ст. или на 30 мм рт. ст. и более по сравнению с исходным в течение более 2 ч и не корригируемое восстановлением объема крови), оценку эффективности адекватной анти-бактериальной терапии (отсутствие положительной динамики), подсчет количества лейкоцитов в периферической крови (лейкоцитоз со «сдвигом влево» и наличие более 10% палочкоядерных нейтрофилов или лейкоцитопении), выявление полиорганной недостаточности или синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. В случае выявления эндофталь-мита следует заподозрить диссеминированный кандидоз, так как это осложнение встречает-ся у 9–22% больных с кандидемией [30]. Интерпретация клинических признаков проводится обязательно с учетом микробиологических данных.



Беларуси

118

Для выявления очагов диссеминации при подозрении на кандидемию проводится офтальмо-скопия, рентгенография и/или компьютерная томография органов грудной клетки, ультразвуко-вое исследование или компьютерная томография органов брюшной полости, при наличии невро-логической симптоматики – магнитно-резонансная томография или компьютерная томография головного мозга.

Микробиологическое (микологическое) и гистологическое исследования. Кровь. В пери-од лихорадки 1 раз в сутки в течение 3 дней из центральной вены забирают 5 мл крови, которую помещают во флакон с 50 мл жидкой среды Сабуро, или 10 мл крови, которую помещают во фла-кон со средой Bio-AER (Bio-Rad, Франция). Посевы инкубируют при температуре 37 ºС не более 10 сут. Через 2, 5 и 10 сут пробы крови из флаконов высевают на чашки Петри с агаром Сабуро и инкубируют при температуре 37 ºС до 3 сут, ежедневно просматривая их на предмет роста грибов.

При выявлении роста грибов проводят микроскопию и видовую идентификацию выделен-ных штаммов. Способность последних образовывать ростковые трубки в сыворотке крови определяют при инкубации их в течение 2–3 ч при температуре 37 ºС, что позволяет достаточ-но быстро идентифицировать штаммы Candida albicans. При отрицательном тесте на ростко-вые трубки используют коммерческие системы для быстрой идентификации дрожжеподобных грибов, основанной на их биохимических свойствах. Так, Fongiscreen (Bio-Rad, Франция) позво-ляет идентифицировать дрожжеподобные грибы в течение 4 ч, Auxacolor (Bio-Rad) – за 24–72 ч, API 20 C – за 48–72 ч и API Candida (bioMerieux, Франция) – за 18–24 ч. Чувствительность к анти-микотикам изучается с помощью наборов АТВ FUNGUS 3 (bioMerieux) [25]. В многочисленных рандомизированных исследованиях было доказано, что бактериологические исследования кро-ви, несмотря на ежедневный контроль, положительны только в 50% случаев [35].

Перитонеальная жидкость. У пациентов с интраабдоминальными абсцессами или перито-нитом выделение Candida spp. из перитонеальной жидкости, полученной путем аспирации или во время операции, может рассматриваться как признак перфорации кишечника [23, 36]. Выделение Candida spp. из образцов перитонеальной жидкости, полученной через дренаж, менее вероятно, чем при заборе методом парацентеза, хотя в работе [37] это различие не выявлено.

Cтерильные жидкости и ожоговые раны. Признаком наличия грибковой инфекции может быть выделение Candida spp. из стерильных жидкостей – спинномозговой, синовиальной и др., а также из ожоговых ран [38].

Моча. Выделение Candida spp. (у 1–20% пациентов ОИТР) возможно при колонизации моче-вого катетера, инфекции слизистой мочевого пузыря, инфекции почечной паренхимы или си-стемной инфекции [32, 39].

Сосудистые катетеры. Катетеры могут быть источником кандидемии в 20–30% случаев, а положительные посевы могут свидетельствовать о колонизации, фунгемии и гнойном флеби-те [32, 38, 40].

Бронхоальвеолярная жидкость. Дыхательные пути у пациентов ОИТР легче всего колонизи-руются Candida spp., которая как этиология первичной пневмонии встречается крайне редко [23, 41].

Среди всех факторов риска, рассмотренных выше, особую роль играет кандидозное микроб-ное обсеменение, или колонизация. Взаимосвязь степени колонизации и риска развития грибко-вых инфекций у пациентов ОИТР до сих пор является предметом обсуждения. В некоторых ис-следованиях колонизация грибами рода Candida двух или более удаленных анатомических об-ластей была ассоциирована с высоким риском развития диссеминированного кандидоза (иногда даже более высоким, чем при кандидемии) и высокой летальностью [30].

На основании результатов клинико-лабораторных исследований у пациентов ОИТР предпри-нята попытка стандартизации и унифицирования в ранней диагностике инвазивного кандидоза с последующим дифференцированным подходом к назначению противогрибковой терапии [29]. Так, с высокой степенью достоверности диагноз доказанный инвазивный кандидоз может быть поставлен в следующих случаях:

при кандидемии и клинических симптомах инфекции;выделении Candida из стерильных сред (кроме мочи и перитонеального содержимого

при перфорации ЖКТ);



Беларуси

119

вероятный инвазивный кандидоз:при кандидемии без клинических симптомов инфекции;выделении Candida из двух и более нестерильных участков, лихорадке (≥ 38,5 ºС) и лейкоци-

тозе (≥ 12·10³), исключая бактериальные патогены как причину;выделении Candida из мочи (≥ 105/мл КОЕ), лихорадке и лейкоцитозе, исключая бактериаль-

ные патогены как причину; выделении Candida из центрального венозного катетера (> 15 КОЕ), лихорадке и лейкоцито-

зе, исключая бактериальные патогены как причину;лихорадке и лейкоцитозе на фоне приема антибиотиков широкого спектра при выделении

Candida из одного и более нестерильных участков или из центрального венозного катетера, исклю-чая бактериальные патогены как причину или при выделении Candida из двух и более несте-рильных участков или из центрального венозного катетера;

возможный инвазивный кандидоз:при выделении Candida из центрального венозного катетера, исключая другие критерии, ли-

хорадке и лейкоцитозе.Гистопатологическое нахождение микроорганизмов в гистологических препаратах. Дан-

ный метод достаточно широко используется для диагностики грибковой инфекции. Микро-биологическое (микологическое) и гистологическое исследования крови, биологических жидко-стей и тканей все еще считаются золотым стандартом диагностики, но следует признать, что получить стопроцентное подтверждение диагноза с помощью этих методов не всегда представ-ляется возможным, что ограничивает их диагностическую ценность [42, 43].

Биохимические методы рассматриваются как дополнительные методы диагностики кандиде-мии. Наиболее распространенный из них – определение концентрации D-арабинитола и маннозы в крови методом газовой хроматографии. Данный метод утвержден и рекомендован для практиче-ского применения Министерством здравоохранения России. Грибы рода Candida spp. (кроме C. krusei и C. globrata) продуцируют арабинитол, в связи с чем и отмечается его повышенная концентрация при определенных клинических состояниях [44].

Из относительно новых методов следует отметить определение в крови концентрации (1-3)-β-D-глюкана, входящего в состав клеточной стенки всех грибов, за исключением neofor-mans и зигомицетов. Метод имеет высокую чувствительность, однако обладает недостаточной специфичностью и нередко дает ложноположительные результаты, особенно у больных с бакте-риемиями [45] .

Для дифференциальной диагностики грибковых и бактериальных инфекций используется метод определения уровней С-реактивного белка и прокальцитонина. Высокие показатели С-реактивного белка могут наблюдаться как при грибковой, так и при бактериальной инфекции, а повышение прокальцитонина характерно для бактериальной инфекции или для микст-инфек ции (бактерии+грибы) [46] .

Серологические методы. Данные методы основываются на обнаружении элементов клеточ-ной оболочки грибковых организмов в сыворотке крови или в других жидкостях организма. В на-стоящее время используются методы, основанные на обнаружении высокоиммуногенных компо-нентов грибковой клеточной оболочки – галактоманнана и маннана. Галактоманнан – полисахарид клеточной оболочки грибкового организма с молекулярной массой от 35 до 100 кДа, который по-падает в сыворотку крови во время роста грибка в тканях. Обнаружение в сыворотке циркулиру-ющего антигена галактоманнана имеет огромное значение в диагностике инвазивных аспергилле-зов. Его наличие характерно для A. fumigatus и других видов Aspergilla spp. (A. fl avus, A. niger, A. vesicolor, A. terreus, A. nidulans, A. oryazeae). Тест обладает высокой чувствительностью и специ-фичностью в диагностике инвазивных аспергиллезов у онкогематологических пациентов [47]. У больных, перенесших аллогенную трансплантацию стволовых клеток, исследование на наличие галактоманна в плазме (2 раза в неделю) показало, что чувствительность и специфичность метода составляет приблизительно 90%. Соответственно, было предложено проведение мониторинга его серологических образцов после начала противогрибковой терапии с целью возможности оценки ее эффективности и определения сроков назначения альтернативных форм лечения [48, 49].



Беларуси

120

Иммунодиагностика инвазивного кандидоза основана на обнаружении циркуляции в сыво-ротке у пациента главного компонента клеточной оболочки Candida spp. – антигена маннана. Maннан – высокоиммуногенный антиген полисахарида с иммуномодулирующими свойствами, его олигоманнозные эпитопы способны вызвать гуморальную реакцию, т. е. образование анти-тел [50, 51]. Новая диагностическая стратегия основана на контроле параллельной циркуляции в крови титров антител и антигенов маннана у больных с высоким риском развития системного кандидоза. Параллельное обнаружение обоих маркеров значительно увеличивает чувствитель-ность (80%) и специфичность (93%) грибковой инвазии [52]. Важное значение в онкогематологии имеет параллельное обнаружение анитигенов и антител маннана в диагностике инвазивного кандидоза и у больных с нейтропенией.

По данным, опубликованным в Европейском журнале клинической микробиологии, поло-жительные серологические результаты биологических маркеров определялись у 73% пациен-тов за 2–15 дней до высевания грибка из крови [35]. Непрерывный серологический мониторинг антигенов и антител маннана у больных с высоким риском развития инвазивного кандидоза, особенно если он проводится параллельно с культуральными методами исследования крови, способствует раннему обнаружению и подтверждению фунгемии. С другой стороны, наличие антител не дает возможности провести дифференциальную диагностику между инвазивными и поверхностными формами кандидоза [35, 52, 53].

Достаточно информативным признан также метод полимеразной цепной реакции, позво-ляющий определить специфические участки ДНК конкретного вида возбудителя. Методика бы-стро выполнима, высокочувствительна, однако достаточно часто дает ложноположительные ре-зультаты [54].

Таким образом, анализ данных литературы позволяет сделать вывод о том, что на современ-ном этапе наблюдается рост распространенности кандидемии и инвазивного кандидоза у пациен-тов отделений интенсивной терапии и реанимации, что заставляет рассматривать данную патоло-гию как актуальную клиническую проблему. Одним из наиболее реальных путей улучшения ре-зультатов борьбы с грибковой инфекцией является проведение адекватной анти микотической терапии, что невозможно без ранней диагностики микозов. Однако следует отметить, что ни одна из методик не позволяет установить точный диагноз, но с помощью параллельного приме-нения приведенных нами тестов возможно раннее диагностирование кандидемии и инвазивного микоза, что позволяет раньше начать адекватную противогрибковую терапию.


1. W i s p l i n g h o f f H., B i s c h o f f T., T a l l e n t S. M. еt al. // Clin. Infect. Dis. 2004. Vol. 39. P. 309–317.2. R e n t z A. M., H a l p e r n M. T., B o w d e n R. // Clin. Infect. Dis. 1998. Vol. 27. P. 781–788.3. O l a e c h e a P. M., P a l o m a r M., L e o n - G i l C. еt al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004. Vol. 23.

P. 323–330.4. M e n s a J., P i t a r t C., M a r c o F. // Inter. J. Antimicrob. Agents. 2008. N 32. Suppl. 2. P. 93–97.5. J a r w i s W. R. // Clin. Infect. Dis. 1995. Vol. 20. P. 1526–1530.6. S c h e l e n z S. // J. Antimicrob. Сhemother. 2008. Vol. 61. P. 131–134.7. P a p p a s P. G., K a u f f m a n С. A., A n d e s D. et al. // Clin. Infect. Dis. 2009. Vol. 48. P. 503–535.8. П о п о в Д. А., Б е л о б о р о д о в а Н. В., Се д р а к я н А. Р. // Клин. анестезиол. и реаниматол. 2009. Т. 6,

№ 6. С. 4–13.9. M a r c h e t t i O., B i l l e J., F l u c k i g e r U. et al. // Clin. Infect. Dis. 2004. Vol. 38. P. 311–320.10. R i c h e t H., R o u x P., D e s C h a m p s C. et al. // Clin. Microbiol. Infect. 2002. Vol. 8. P. 405–412.11. G u d l a u g s s o n O., G i l l e s p i e S., L e e K. еt al. // Clin. Infect. Dis. 2003. Vol. 37. P. 1172–1177.12. H a d l e y S., L e e W. W., R u t h a z e r R. еt al. // Crit. Care Med. 2002. Vol. 30. P. 1808–1814.13. R e x J. H., W a l s h T. J., S o b e l J. D. et al. // Clin. Infect. Dis. 2000. Vol. 30. P. 662–678.14. A b i - S a i d D., A n a i s s i e E., U z u n O. et al. // Clin. Infect. Dis. 1997. Vol. 24. P. 1122–1128.15. W e n z e l R. Р. // Clin. Infect. Dis. 1995. Vol. 20. P. 1531–1534.16. E n o c h D. A., L u d l a m H. A, B r o w n N. M. // J. Med. Microbiol. 2006. Vol. 55. P. 809–818.17. P a g a n o L., C a i r a M., C a n d o n i A. et al. // Haematologica. 2006. Vol. 91. P. 1068–1075.18. S e g a l B. H., W a l s h T. J. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005. Vol. 173. P. 707–717.19. W a r n o c k D. W. // Jpn. J. Med. Mycol. 2007. Vol. 48. P. 1–12.20. B a d d l e y J. W., P a p p a s P. G., S m i t h A. C., M o s e r S. A. // J. Clin. Mcrobiol. 2003. Vol. 41. P. 5525–5529.



Беларуси

21. R e i c h e n b e r g e r F., H a b i c h t J. M., G r a t w o h l A., T a m m M. // Eur. Respir. J. 2002. Vol. 19. P. 743–755.22. N o l l a - S a l a s J., S i t g e s - S e r r e A., L e o n - G i l C. et al. // Intensive Care Med. 1997. Vol. 23. P. 23–30.23. S t o t m a n G. J., S a p h i r o R., M o f f a S. M. // Am. Surg. 1994. Vol. 60. P. 107–113.24. M o r r e l l M. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. Vol. 49. P. 3640–3645.25. К л и м к о Н. Н., Б о г о м о л о в а Т. С., К о л б З. К. и др. // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотерапия.

2002. № 1. С. 15–21.26. L e o n - G i l C., L e o n - R e g i d o r M. A., N o l l a - S a l a s J., S a n c h e z - J i m e n e z M. A. // Rev. Clin.

Esp. 1997. Vol. 197. P. 17–28.27. F l u c k i g e r U., M a r c h e t t i O., B i l l e J., E g g i m a n n P. еt al. // Swiss Med. Wkly. 2006. Vol. 136. P. 447–463.28. S p e l l b e r g B. J., F i l l e r S. G., E d w a r d s J. E. // Clin. Infect. Dis. 2006. Vol. 42. P. 244–251.29. P a p h i t o u N. I., O s t r o s k y - Z e i c h n e r L., R e x J. H. // Med. Mycol. 2005. Vol. 43. P. 235– 243.30. М у н о з П., Б у р и л о А., Б о у з а Э. // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотерапия. 2001. № 1. С. 69–78.31. O s t r o s k y - Z e i c h n e r L., S a b l e C., S o b e l J., A l e x a n d e r B. D. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis.

2007. Vol. 26. P. 271–276.32. B e r n h a r d t H., Z i m m e r m a n n K., S i s s o l a k D. et al. // Rev. Iberoam Micol. 2000. Vol. 17. P. 146.33. Г е л ь ф а н д Б. Р., Г о л о г о р с к и й В. А., Г е л ь ф а н д Е. Б. // Клин. антибиотикотерапия. 2002. № 2. С. 23–30.34. L e o n C., R u i z - S a n t a n a S., S a a v e d r a P. еt al. // Crit. Care Med. 2006. Vol. 34, N 3. P. 730–737.35. Y e r a H., S e n d i d B., F r a n c o i s N., Ca m u s D. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001. Vol. 20. P. 864–870.36. C a l a n d r a T., B i l l e J., S c h n e i d e r R., M o s i m a n n F. // Lancet. 1999. Vol. 2. P. 1437–1440.37. E g g i m a n n P., F r a n c i o l i P., B i l l e J. et al. // Crit. Care Med. 1999. Vol. 27. P. 1066–1072.38. P f a l l e r M. N. // Clin. Infеct. Dis. 1996. Vol. 22. P. 89–94.39. T o r t o r a n o A. M., V i v i a n i M. A., R o g o n i A. L. et al. // Rev. Iberoam Micol. 2000. Vol. 17. P. 143.40. P e m a n J., C e r c o s A., P e n a l v e r M. C. et al. // Rev. Iberoam Micol. 2000. Vol. 17. P. 143.41. F r a s e r V. G., J o n e s M., D u n k e l J. et al. // Clin. Infect. Dis. 1999. Vol. 15. P. 414–421.42. M a r r K. A., C a r t e r R. A., C r i p p a F. et al. // Clin. Infect. Dis. 2002. Vol. 34. P. 909–917.43. Y e o S. F., W o n g B. // Clin. Microbiol. Rev. 2002. Vol. 15. P. 465–484.44. W a l s h T. D., M e r z W. G., L e e J. W. et al. // Am. J. Med. 1995. Vol. 99. P. 164–172.45. P i c k e r i n g J. W., S a n t H. W., B o w l e s C. A. et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. Vol. 34, N 12. P. 5957–5962.46. Б е л о б о р о д о в а Н. В., П о п о в Д. А. Тест на прокальцитонин: алгоритмы применения и новые возмож-

ности. М., 2008. 47. S t e v e n s D. // J. Antimicrob. Chemoth. 2002. Vol. 49. P. 11–19.48. S e n d i d B., P o i r o t J. L., T a b o u r e t M. еt al. // J. Med. Microbiol. 2002. Vol. 51. P. 433–442.49. W i n g a r d J. R., L e a t h e r H. A. // Biol. Blood Marrow. Trans. 2004. Vol. 10. P. 73–90.50. M a r t i n e z J. P., G i l M. L., L o p e z - R i b o t J. L., C h a f f i n W. L. // Clin. Microbiol. Rev. 1998. Vol. 11. P. 121–141.51. S e n d i d B., C a i l l o t D., B a c c o u c h - H u m b e r t B. et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41. P. 4551–4558.52. S e n d i d B., T a b o u r e t M., P o i r o t J. L. et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37. P. 1510–1517.53. V e r w e i j P. E., Meis J. F. // Transpl. Infect. Dis. 2000. Vol. 2. P. 80–87.54. E l l e p o l a A. N., M o r r i s o n C. J. // J. Microbiol. 2005. Vol. 43. P. 65–84.

G. V. ILUKEVICH, Y. N. DOTSENKO, A. G. ILUKEVICH

EPIDEMIOLOGY AND METHODS OF DIAGNOSIS OF FUNGAL INFECTION

Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk

Summary

The review of the literature has shown an increasing incidence and spread of invasive candidiasis and candidemia in inten-sive care unit patients. The fungal infections in this population are associated with high mortality rate. Early diagnosis of mycosis is a real way to improve the results of treatment. The review evaluates laboratory, microbiological and histological diagnostic methods usable in clinical practice. Conclusion: neither of these tests in a single use may be suffi cient or specifi c enough for proven diagnosis. Only parallel use of different diagnostic methods makes possible early diagnosis of invasive mycosis and candidemia and allows early start of adequate antifungal treatment.



Беларуси

122


ВУЧОНЫЯ БЕЛАРУСІ

ИОСИФ ВИКТОРОВИЧ ЗАЛУЦКИЙ (К 60-летию со дня рождения)

Иосиф Викторович Залуцкий родился 5 сентября 1950 г. в д. Му мишки Поставского района Витебской области в семье крестьян.

В 1969 г. окончил Молодечненское медицинское училище, после чего служил в Советской Армии (1969–1971). В 1978 г. с отличием окон чил лечебный факультет Минского медицин-ского ин ститута. Работал клиническим ординатором, врачом-радиологом радиологического отделения Научно-исследо ва-тельского института онкологии и медицинской радиологии МЗ БССР (1978–1982). По окончании аспиранту ры (1982–1985) рабо-тал младшим, старшим научным сотрудником ла бора тории ги-пертермии и клинической терапии (1985–1990), старшим науч-ным сотрудником от деления реабилитации, руководителем, за-тем ведущим научным сотрудником отделения реабилитации и брахитерапии (1990–1994), заведующим отделением об щей онкологии и пластической хирургии Науч но-иссле дова тель-ского института онкологии и медицинской радиологии (1994).

В 1986 г. защитил кандидатскую диссертацию на тему «Пластические операции при комби-нированном лечении больных меланомой кожи с применением предоперационной терморадио-терапии», в 1994 г. — докторскую диссертацию на тему «Восстановление тканей лоскутами с осевым кровообращением при лечении местно-распространенных злокачествен ных новообра-зований наружных локализаций и поздних лучевых повреждений». В 2000 г. ему присвоено уче-ное звание про фессора. В 2000 г. назначен директором ГУ «Научно-исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии им. Н. Н. Александрова». С 1999 по 2007 г. заведовал ка-федрой онкологии Белорусской медицинской академии последипломного образования.

В 2004 г. И. В. Залуцкий избран членом-корреспондентом НАН Беларуси. Основные направ-ления научной деятельности – разработка и внедрение в клиническую практику новых методов лечения и реабилитации онкологических боль ных; внедрение методов микрохирургии, расши-ривших возможности пластических хирургов при лечении больных опухолями кожи, мягких тканей, костей, молочной железы, головы и шеи; разработка методологии органосохраняющих и реконструктивно-восстановительных операций при местно-распространенных злокачествен ных новообразо ваниях наружных локализаций и осложнениях, развившихся после лучевой и ком-бинированной терапии. Им осуществлена на практике идея выполнения таких хирургических вмешательств в рамках современных способов комплексного и многокомпонентного лечения.

В течение долгих лет (2001–2009) Иосиф Викторович координировал работу онкологической службы республики, активно занимался исследованиями в области эпидемиологии, профилак-тики и раннего выявления опухолей.

И. В. Залуцкий являлся председателем научно-технического совета по подпрограмме «Онко-логия» Госу дарст венной научно-технической программы «Лечебные и диагностические тех но-логии» и научным руководителем подпрограммы «Онкология», председателем ученого совета



Беларуси

ГУ «Научно-исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии им. Н. Н. Алек-сандрова» и совета по защите диссертаций Д 03.12.01, а также членом ученых советов Бе лорусской медицинской академии последипломного образования, ГУ «Республиканский научно-практи-чес кий центр детской онкологии и гематологии». В настоящее время он член правления Меж ду-народной ассоциации пластических хирургов и онкологов (UAPSO), член Европейского обще-ства лучевых терапевтов-онкологов (ESTRO), член Европейского общества хирургов-онкологов (ESSO), действительный член общества пластических, реконструктивных и эстетических хи-рургов России (ОПРЭХ).

Иосиф Викторович является членом редколлегий четырех научных журналов («Весці НАН Беларусі. Серыя медыцынскіх навук», «Здравоохранение», «Медицинские новости», «Українсь-кий радiологiчний журнал»). С 2001 г. он был главным редактором ежегодных сборников науч-ных работ «Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии», редактором ежегод-ного сборника «Злокачественные новообразования в Беларуси», главным внештатным онколо-гом Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

С 15 января 2010 г. работал заместителем академика-секретаря отделения медицинских наук Национальной академии наук Беларуси. С 26 декабря 2010 г. назначен директором ГНУ «Институт физиологии» НАН Беларуси.

Под его руководством защищено 15 кандидатских и 4 докторские диссертационные работы. Он автор 213 научных и научно-методических работ, 4 монографий, имеет 12 патентов.

И. В. Залуцкий награжден знаком «Отличник здравоохранения», почетными грамотами Ми-нистерства здравоохранения Республики Беларусь, памятной медалью за самоотверженную дея-тельность, обеспечившую выживание и развитие онкологической школы (Россия).

Искренне желаем Вам, уважаемый Иосиф Викторович, доброго здоровья, счастья, оптимиз-ма, новых творческих достижений.

Редколлегия



Беларуси

124

УДК 616.36-002.2-089.843-018.46-013.395-06:616.36-004

А л е й н и к о в а О. В., Л у к а ш и к С. П., Ц ы р к у н о в В. М., И с а й к и н а Я. И., К р а в ч у к Р. И. Трансплантация аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга пациенту с хро-ническим гепатитом С на стадии цирроза печени // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010.

№ 4. С. 5–13.

Предложен метод получения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и изучено их влияние на патологический процесс в печени пациентов с хронической HCV-инфекцией на стадии цирро-за печени.

Проведена трансплантация аутологичных МСК в ткань печени пациента. Показано, что через 6 мес. по-сле лечения его самочувствие улучшилось и снизились значения биохимических показателей крови. При изучении биоптата печени под световым микроскопом через 6 мес. обнаружено сохранение фибрилл колла-геновых волокон. В то же время выявленные с помощью иммуногистохимического и электронномикроско-пического исследований признаки усиления процессов внутриклеточной регенерации гепатоцитов и акти-вации процессов фибролиза могут служить определяющими в отслеживании результатов терапии при дальнейших исследованиях.

Табл. 1. Ил. 8. Библиогр. – 12 назв.

УДК 616:612.017.1

Г о н ч а р о в А. Е., Т и т о в Л. П., Ч и ж К. А., С о р о к а Н. Ф. Иммунофенотип плазмацитоидных дендритных клеток пациентов с системной красной волчанкой // Весці НАН Беларусі. Сер. мед. навук.

2010. № 4. С. 14–19.

Проведен анализ экспрессии ко-стимуляторных и адгезивных мембранных молекул плазмацитоид-ных дендритных клеток (пДК) пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), осложненной люпус-нефритом (ЛН), с целью установления взаимосвязи этих параметров с поражением почек. В результате проведенных исследований установлено снижение абсолютного числа пДК у больных СКВ и СКВ+ЛН, что может указывать как на нарушение дифференцировки предшественников пДК, так и на усиленную миграцию пДК во внутренние органы и лимфоидную ткань. Выявлено статистически достоверное уси-ление экспрессии молекул CD86 и CD54 у пациентов с СКВ и СКВ+ЛН по сравнению с лицами кон-трольной группы, что свидетельствует о наличии в крови больных СКВ фракции активированных пДК, способных поддерживать иммуновоспалительный процесс. За исключением различной интенсивности экспрессии молекулы CD86, между группами пациентов с СКВ и СКВ-ЛН не выявлено статистически достоверных различий в количестве пДК в периферической крови и экспрессии этими клетками ряда поверхностных молекул. В этой связи представляется необходимым проведение дальнейших исследо-ваний по изучению профиля активированных генов, регулирующих функцию иммунной системы, ме-тодом DNA-microarray.

Ил. 4. Библиогр. – 10 назв.

УДК 616.91/.93:5А6.8.097.29:612.55:547.495:616.36

В и с м о н т А. Ф., Л о б а н о к Л. М. Об участии мочевины и аргиназы печени в процессах терморегуляции при эндотоксиновой лихорадке // Весці НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 20–24.

Показано, что динамика процессов теплообмена при эндотоксиновой лихорадке у крыс и кроликов, их стадийность зависят от активности аргиназы печени, состояния L-аргинин-NO-системы и уровня мочевины в крови, которые и определяют их направленность и выраженность. Предполагается, что утечка L-аргинина в цикл мочевины и активное его использование в процессах мочевинообразования при бактериальной эндо-токсинемии играют важную роль в механизмах регуляции активности L-аргинин-NO-системы, терморегуля-ции и эндогенного антипиреза.

Библиогр. – 17 назв.


РЕФЕРАТЫ



Беларуси

125

УДК 616-13-008.21

Г а й ш у н И. В., М а н а к Н. А., Г а й ш у н Е. И., П р и с т р о м А. М. Методика построения индексов эластичности артериальных сосудов // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 25–31.

Разработана общая методика построения индексов эластичности артериальных сосудов, позволяющая мак-симально учесть особенности коэффициентов растяжимости сосудистых стенок пациентов различных групп. В подтверждение эффективности предложенной методики на ее основе получен новый индекс эластичности арте-рий лиц пожилого возраста, обладающий высокой надежностью (независимостью от уровня артериального дав-ления) при артериальной гипертензии. Установлено, что при определенных условиях данная методика приводит к большинству известных показателей, широко используемых при оценке эластичности артериальных сосудов.


УДК 611.314-018-08:616.314.17-008.1-091:599.238

К о л б Е. Л., К а б а к С. Л., А н и щ е н к о С. Л. Влияние метотрексата на течение апикального периодонтита у белой крысы: морфологическое исследование // Весці НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 32–37.

Изучены особенности морфологических проявлений и воспалительных изменений в области верхуш-ки корня зуба в условиях угнетения иммунной системы экспериментальных животных. Установлено, что на фоне введения метотрексата поражение пульпы и появление структурно сформированного очага воспале-ния в апикальном периодонте наступают раньше, чем в условиях нормальной неспецифической резистентно-сти макроорганизма. В первые две недели эксперимента морфологические изменения периодонта в области верхушки корня зуба отличаются полиморфизмом проявлений с преобладанием случаев диффузного гнойно-го воспаления тканей периодонта.


УДК 616.832-002-097-018.46-089.843:576.314.6/7

М о т у з о в а Я. М., Ф е д у л о в А. С., Н и ж е г о р о д о в а Д. Б., Г у з о в С. А., Б а г а т к а С. С., Ю р к е -в и ч М. Ю., Ш п а к о в с к а я М. А., Л а м о в с к а я Н. В., З а ф р а н с к а я М. М. Эффективность и без-опасность трансплантации стволовых клеток на модели экспериментального аутоиммунного энцефало-

миелита // Весці НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 38–45.

Проведена оценка эффективности и безопасности применения различных вариантов трансплантации ме-зенхимальных (МСК) и гемопоэтических (ГСК) стволовых клеток на модели экспериментального аутоиммун-ного энцефаломиелита (ЭАЭ). Показано, что использование изученных протоколов лечения является эффек-тивным при лечении ЭАЭ. Однако применение ко-трансплантации МСК и ГСК после высокодозной химиоте-рапии сопровождается снижением частоты осложнений и летальных исходов и приводит к улучшению клинической картины ЭАЭ на более ранней стадии заболевания.


УДК 615.212.7: 543.544.5

В е р г у н О. М., С я х о в и ч В. Э., Х о м е н к о А. И. Качественное определение наркотических веществ методом жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии в допинг-контроле // Весці НАН Беларусі.

Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 46–52.

Разработан высокочувствительный и специфичный метод идентификации наркотических веществ (морфи-на, метадона, оксикодона, пентазоцина, фентанила, петидина) в моче (в концентрации до 0,02 мкг/мл), основанный на высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тандемной масс-спектрометрии (МС-МС) с иони-зацией электрораспылением и предварительной жидко-жидкостной экстракцией анализируемых соединений.

Данная методика может быть использована как в допинг-контроле, так и в химико-токсикологическом анализе при проведении экспертизы употребления наркотиков, а также для подтверждения наличия низких концентраций наркотических веществ в биологических жидкостях человеческого организма.


УДК 618.19-006:576.5:577.3

Ш у к а н о в а Н. А., П у т ы р с к и й Л. А., П и н ч у к С. В., М а р т ы н о в а М. А., П у т ы р с к и й Ю. Л., К о з л о в с к а я Н. А. Эффективность действия химиопрепаратов на клетки рака молочной железы в первичной культуре с использованием биохимических критериев // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук.

2010. № 4. С. 53–56.

Изучено влияние двух групп цитостатиков CMF (циклофосфан, метотрексат, 5-фторурацил) и АС (док-сорубицин, циклофосфан) на клетки рака молочной железы (РМЖ) в первичной культуре, полученной из операционного материала пациенток. Показано, что критериями оценки чувствительности клеток РМЖ к действию химиопрепаратов в условиях in vitro могут служить как активность митохондриальных дегид-



Беларуси

126

рогеназ, так и активность ацетилхолинэстеразы. Последний параметр может быть положен в основу разра-ботки нового, относительно простого, быстрого и недорогого способа определения индивидуальной чув-ствительности таких клеток к противоопухолевым препаратам, что позволит повысить эффективность те-рапии при РМЖ.


УДК 577.3:612.65:621.391

С и д о р е н к о А. В., О в с я н к и н а Г. И., Л ы н ь к о в Л. М., К а з е к а А. А., Л е о н ч и к Ю. Л. Анализ электроэнцефалограмм на основе динамического хаоса при действии излучений мобильного телефона

и защитных экранов // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010. № 4. C. 57–65.

Для обработки и анализа электроэнцефалограмм при действии излучений мобильного телефона и защит-ных экранов на основе радиопоглощающих материалов предлагается использование методологии нелинейной динамики. Электроэнцефалограммы здоровых лиц, зарегистрированные в клинических условиях, подвергали обработке и анализу с помощью разработанной нами информационно-измерительной системы.

Установлено, что электроэнцефалографические сигналы структурно изменяются при работе мобильных телефонов в системе GSM в режимах «звонок без ответа», «звонок, ответ», а также при действии защитных от электромагнитных излучений экранов различным образом.

Применение нелинейных методов, рассматривающих биоэлектрические сигналы, отображающие дея-тельность мозга, как детерминированный хаос, позволяет реализовать построение фазовых портретов, а так-же ввести информативные показатели – корреляционную размерность d и энтропию Колмогорова E. Это дает возможность определить изменения состояния центральной нервной системы при действии излучений мо-бильных телефонов и защитных экранов.


УДК 618.56:616-008.64-036.12-07

Б у д ю х и н а О. А., Б а р а н о в с к а я Е. И., Г р и ц у к А. И., П е т р е н ё в Д. Р. Роль факторов прооксидантно-антиоксидантной системы сыворотки крови и амниотической жидкости у беременных в патогенезе развития хронической плацентарной недостаточности // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук.

2010. № 4. С. 66–71.

Изучены показатели анти- и проокислительной активности у 109 беременных с хронической плацентар-ной недостаточностью (ПН) и у 33 беременных без данного осложнения беременности. Установлены разнона-правленные изменения общей антиокислительной активности: снижение общей антиокислительной активно-сти (ОАОА) околоплодных вод и повышение ОАОА сыворотки крови при формировании задержки роста плода. Показано, что при доношенной беременности, осложненной ПН, происходит угнетение активности фермента-тивного звена антиокислительной защиты супероксиддисмутазы и повышение уровня малонового диальдегида.

Табл. 3. Библиогр. – 21 назв.

УДК 577.121:612.112.95.014.46

Д е в и н а Е. А., П р и н ь к о в а Т. Ю., Т а г а н о в и ч А. Д. Влияние N-ацетилцистеина на функциональную активность альвеолярных макрофагов, контактировавших с экстрактом сигаретного дыма, и показатели метаболизма активных форм кислорода и азота // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 72–79.

Изучено влияние N-ацетилцистеина на фагоцитарную активность и показатели метаболизма альвеоляр-ных макрофагов (АМ) в условиях воздействия сигаретного дыма. Установлено, что N-ацетилцистеин препят-ствует снижению фагоцитарной активности АМ, истощению пула глутатиона, росту количества пероксида во-дорода и снижению активности антиоксидантных ферментов, уровня нитрит-ионов в АМ в условиях кратковре-менного (1 ч) воздействия экстракта сигаретного дыма (ЭСД). Более продолжительный контакт клеток с ЭСД минимизирует протекторное действие N-ацетилцистеина.


УДК 577.171.5: 547.962+591.147.1:599.323.4

В и н о г р а д о в В. В., Т у м а н о в А. В., Г о л ы ш к о П. В., М а ц ю к Я. Р., А н д р е е в В. П., В и н о -г р а д о в С. В., Я р о ц к и й Ю. В. Влияние тироксина на пролиферацию тироцитов после субтотальной

резекции щитовидной железы у крыс // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 80–87.

Показано, что состояние гипофункции тироцитов, вызванное in vivo 14-дневным введением L-тироксина, существенно увеличивает процентное содержание двуядерных клеток в цельной ЩЖ по сравнению с контро-лем, а в постоперационном тиреоидном остатке и особенно в регенерате – по сравнению с их содержанием



Беларуси

127

у животных, подвергнутых субтотальной струмэктомии. Согласно модели генетического триггера, описыва-ющей реципрокные взаимоотношения между оперонами пролиферации и дифференцировки, при развитии гипофункционального состояния клеток неизбежно активируются процессы их деления, что, очевидно, имеет место и в данном случае. Обсуждается пермиссивная роль инсулина, а также соматотропного гормона и инсу-линоподобного ростового фактора 1 в отмеченных эффектах.


УДК 612.8.015

Т р о п н и к о в а Г. К. Эффекты мелатонина на вызываемые гипоксией изменения содержания серотонина в мозге крыс с разным типом поведения // Весцi НАН Беларуси. Сер. мед. навук 2010. № 4. С. 88–93.

В экспериментах на крысах показано, что предварительное введение мелатонина в дозе 0,5 мг/кг в день в течение трех дней в большей степени, чем у контрольных животных, усиливало двигательную актив-ность в условиях острой гипоксии. Установлена также зависимость эффектов мелатонина на индуцируемые гипоксией ответы серотонинергических структур мозга на острую гипоксию от паттерна поведения крыс в незнакомой обстановке. Действие мелатонина усиливало индуцируемое гипоксией повышение уровня серо-тонина в мозжечке и миндалине крыс с низкой локомоторной активностью значительно больше, чем у кон-трольных животных и у крыс с высокой двигательной активностью.


УДК 616.441-006.6-085.357

М и т ю к о в а Т. А., Л е о н о в а Т. А., Т у з о в а А. А., П л а т о н о в а Т. Ю., Л у щ и к М. Л. Влияние супрессивной терапии на биохимические показатели крови пациентов с избыточной массой тела, про-оперированных по поводу карциномы щитовидной железы // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010.

№ 4. С. 94–99.

Изучен биохимический статус лиц (19―40 лет) с избыточной массой тела, прооперированных по поводу дифференцированного рака щитовидной железы. Установлено, что у больных с повышенным индексом массы тела (ИМТ > 25 кг/м2) по сравнению с пациентами с нормальной массой тела и группой контроля имеется це-лый ряд неблагоприятных биохимических отклонений. Анализ метаболического статуса в зависимости от эф-фективности супрессивной терапии тироксином показал, что у лиц с избыточной массой тела наблюдаются достоверно более высокие средние уровни глюкозы, холестерина, холестерина липопротеинов низкой плот-ности и коэффициента атерогенности как при супрессии, так и при нормальном уровне ТТГ. На фоне повы-шенной массы тела уровень холестерина липопротеинов высокой плотности у лиц с супрессией ТТГ досто-верно более низкий, чем у пациентов с нормальной массой тела.


УДК 616-006.6-092:615.155.2(476)

Ш и ш л о Л. М., Ш а м о в а Е. В., А л е к с а н д р о в а Е. Н., П р о х о р о в а В. И., Г о р у д к о И. В. Роль тромбоцитов в патогенезе метастазирования и роста опухоли // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010.

№ 4. С. 100–106.

В процессе гематогенного метастазирования клетки опухоли мигрируют по кровеносным сосудам и взаи-модействуют с тромбоцитами. Результатом этого взаимодействия является агрегация тромбоцитов, индуци-рованная опухолевыми клетками (АТИОК), которая играет важную роль в патогенезе диссеминации опухоле-вых клеток. В обзоре рассматриваются биологическая и клиническая значимость АТИОК, возможные молеку-лярные механизмы включения агрегации тромбоцитов под действием опухолевых клеток и фармакологическое регулирование данного процесса.


УДК 577.161.3:618.2-083]:611-018.54

М о й с е ё н о к Е. А. Современные направления исследования витамина Е и Е-витаминный статус у женщин репродуктивного возраста // Весцi НАН Беларусi Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 107–114.

Изложены современные представления об усвоении, метаболизме и физиологических функциях ви-тамина Е (α-, β-, γ-, δ-токоферолов и α-, β-, γ-, δ-токотриенолов), рассмотрены методы оценки обеспечен-ности витаминами с учетом представлений о липид-стандартизированном витамине Е. Приведены ре-зультаты исследований α-, γ-токоферолов в плазме крови женщин репродуктивного возраста. Указывается на возможность развития критических форм Е-витаминного дефицита и окислительного стресса при раз-витии беременности.




Беларуси

УДК 616.992.282-036.22-07

И л ю к е в и ч Г. В., Д о ц е н к о Ю. Н., И л ю к е в и ч А. Г. Эпидемиология и методы диагностики гриб-ковой инфекции // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2010. № 4. С. 115–121.

На основании данных литературы сделан вывод о росте распространенности кандидемии и инвазивно-го кандидоза у пациентов отделений интенсивной терапии и реанимации, которые все чаще заканчиваются летальным исходом. Одним из реальных путей улучшения результатов лечения является ранняя диагности-ка микозов. Приведены используемые в клинике лабораторные, микробиологические и гистологические ме-тоды диагностики микозов. Сделан вывод о том, что ни одна из методик не позволяет установить точный диагноз, и только с помощью параллельного применения приведенных тестов возможно раннее диагности-рование кандидемии и инвазивного микоза, что позволяет раньше начать адекватную противогрибко-вую терапию.

Библиогр. – 54 назв.



Беларуси

Documents

m k Z j gb yf I - ЦНБ НАН Беларусиcsl.bas-net.by/xfile/v_med/2010/4/j6uax.pdfРэдактар В. Г. К а л а с о ў с к а я Камп’ютаррстная