1

MỞ ĐẦU

Glutathione (GSH), cysteine (Cys) và homocysteine (Hcy) là những hợp chất

thiol đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học. Mức độ bất thường của các

biothiol có liên quan đến nhiều loại bệnh như tổn thương gan, tổn thương da,

Alzheimer, Parkinson, tim mạch, tiểu đường và HIV.

Thủy ngân là một trong những chất gây ô nhiễm nguy hiểm và phổ biến, phát

thải thông qua các hoạt động tự nhiên hoặc các hoạt động của con người, gây ảnh

hưởng nghiêm trọng về sức khỏe con người bằng cách phá hoại hệ thống thần kinh

trung ương và tuyến nội tiết, dẫn đến sự rối loạn về nhận thức và vận động.

Vì vậy, việc xác định biothiol trong tế bào, hàm lượng thủy ngân trong các

nguồn nước là rất quan trọng trong sự chẩn đoán sớm các bệnh liên quan, bảo vệ môi

trường sống và hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài

nước. Có nhiều phương pháp đã được áp dụng phát hiện các biothiol và ion Hg(II)

như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phổ khối lượng

(MS), phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp phân tích điện hóa, phương pháp

quang phổ hấp thụ phân tử (MAS) - phương pháp phân tích UV-Vis, phương pháp

quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) và phương pháp huỳnh quang… Trong đó,

phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm hơn, đó là không đòi hỏi thiết bị máy

móc đắt tiền, dễ thực hiện, ít tốn kém, và áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng,

đặc biệt có thể phân tích các chất trong tế bào sống.

Phương pháp huỳnh quang được Giáo sư Anthony W. Czarnik ở Đại học

Quốc gia Ohio nghiên cứu và đề xuất cách tiếp cận mới trong lĩnh vực sensor quang

học vào năm 1992. Với những ưu thế của phương pháp huỳnh quang, nên trong

nhiều năm qua, các nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm phát hiện các ion kim

loại, anion, đặc biệt các phân tử sinh học luôn thu hút sự quan tâm của các nhà

khoa học trong và ngoài nước với số lượng các sensor huỳnh quang mới được

công bố ngày càng nhiều trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh

quang bắt đầu từ năm 2007 bởi tác giả Dương Tuấn Quang. Các sensor huỳnh

quang đã được tác giả Dương Tuấn Quang công bố bao gồm: chemosensor phát

2

hiện ion Fe(III), F-, Cs+ và Cu(II) dựa trên calix[4]arene; chemosensor chứa vòng

1,2,3-triazole phát hiện Al(III) và chemosensor phát hiện ion Hg(II) từ dẫn xuất của

chất phát huỳnh quang rhodamine.

Để xác định các biothiol, các nghiên cứu đã thiết kế sensor huỳnh quang dựa

trên các phản ứng đặc trưng của biothiol như phản ứng tạo vòng với aldehyde, phản

ứng cộng Michael, phản ứng ghép nối peptide, phản ứng sắp xếp nhóm thế ở nhân

thơm, phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate ester, phản ứng phân

tách disulfides. Ngoài việc sử dụng phản ứng đặc trưng của biothiol, phản ứng trao

đổi phức (phức của chất huỳnh quang với ion Cu(II)…) cũng được sử dụng.

Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên các

phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) như phản ứng tách loại lưu huỳnh và đóng vòng

guanidine, phản ứng chuyển đổi nhóm thiocarbonyl thành nhóm carbonyl, phản ứng

tách loại thiol,…và dựa trên phản ứng tạo phức giữa ion Hg(II) với các phối tử -O,-

N,-S trong vòng hoặc ở mạch hở.

Đến nay, nhiều chất phát huỳnh quang khác nhau đã được sử sụng để phát

triển các sensor huỳnh quang. Tuy nhiên, từ những đặc tính huỳnh quang vượt trội,

nên các dẫn xuất của cyanine và coumarin đã được sử dụng khá nhiều trong nghiên

cứu phát triển các sensor huỳnh quang, trong đó có các sensor huỳnh quang phát

hiện ion Hg(II), cũng như biothiol.

Mặc dù có nhiều nỗ lực phát triển các sensor huỳnh quang để xác định các

biothiol và ion Hg(II) nhưng đa phần các sensor này vẫn tồn tại một số hạn chế như

sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát hiện còn cao, có bước sóng

phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, và phản ứng giữa sensor với chất phân tích

xảy ra chậm.

Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu thiết

kế các sensor huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện các biothiol

và ion Hg(II). Đây là hướng nghiên cứu đang được các nhà khoa học trên thế giới

quan tâm rất lớn, có nhiều tiềm năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng môi

trường và trong y sinh học.

3

Với sự phát triển và hỗ trợ mạnh của công nghệ thông tin, vì thế, hoá tính

toán đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu hoá học nói chung và nghiên

cứu sensor huỳnh quang nói riêng. Nhiều tính chất lý, hoá đã được dự đoán chính

xác, cũng như được làm sáng tỏ từ quá trình tính toán.

Sự kết hợp hóa tính toán với nghiên cứu thực nghiệm là hướng nghiên cứu

hiện đại. Bởi vì, tính toán lý thuyết nhằm định hướng cho thực nghiệm về thiết kế,

tổng hợp và dự đoán đặc tính của sensor; thực nghiệm kiểm chứng, khẳng định

những kết quả tính toán, trong một số trường hợp, kết quả thực nghiệm cũng định

hướng cho tính toán trong việc nghiên cứu bản chất, cũng như giải thích rõ hơn cơ

chế phản ứng. Sự kết hợp linh hoạt này giúp giảm thiểu thời gian thực nghiệm, tiết

kiệm hóa chất và tăng khả năng thành công của nghiên cứu. Tuy nhiên, hiện vẫn

còn rất ít sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng này được công bố.

Trước những thực trạng trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Thiết kế, tổng hợp

một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định

biothiol và Hg(II) ".

Nhiệm vụ của luận án:

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn xuất

của cyanine dựa trên phản ứng tạo phức và phản ứng trao đổi phức, nhằm phát hiện

các biothiol và ion Hg(II).

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor AMC từ dẫn

xuất của coumarin phát hiện các biothiol, dựa trên phản ứng cộng Michael.

Những đóng góp mới của luận án:

- Sensor L mới được thiết kế từ dẫn xuất cyanine đã được công bố, phát

hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức, hoạt động theo kiểu bật-tắt

(ON-OFF); phức chất của Hg(II) với L (Hg2L2) phát hiện chọn lọc Cys dựa trên

phản ứng trao đổi phức, hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON). Giới phát hiện và

giới hạn định lượng ion Hg(II) bằng L tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay

0,059 μM và 0,19 μM; giới phát hiện và giới hạn định lượng Cys bằng Hg2L2

tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM.

4

- Sensor AMC mới được thiết kế từ dẫn xuất coumarin đã được công bố,

phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng cộng Michael, hoạt động theo kiểu dựa

trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới phát hiện và giới

hạn định lượng Cys được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM.

- Sensor L và sensor AMC được nghiên cứu bằng sự kết hợp linh hoạt

nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm.

Những đóng góp mới của luận án đã được công bố tại:

- Dyes and Pigments, 2016, 131, pp. 301-306.

- Chemistry Letters, 2017, 46, pp. 135-138.

- Dyes and Pigments, 2018, 152, pp. 118-126.

- Vietnam Journal of Chemistry, International Edition, 2017, 55, pp.700-707.

- Hue Univerity Journal of Science: Natural Science, 2018, Vol.127, No. 1A,

pp. 51-59.

Cấu trúc của luận án gồm các phần sau:

- Mở đầu

- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Những kết luận chính của luận án

- Định hướng nghiên cứu tiếp theo

- Danh mục các công trình liên quan đến luận án

- Tài liệu tham khảo

- Phụ lục

5

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan nghiên cứu về sensor huỳnh quang

1.1.1. Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang

Trong hóa học phân tích, phương pháp huỳnh quang có ưu điểm hơn các

phương pháp quang học khác, đó là độ nhạy cao. Điều này là do sự phát xạ tín hiệu

huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích; trong khi ở phương pháp

trắc quang nồng độ của chất tỉ lệ thuận với độ hấp thụ, mà độ hấp thụ lại liên quan

đến tỉ lệ giữa cường độ đo trước và sau khi chùm ánh sáng đi qua mẫu. Do đó, đối

với huỳnh quang, sự tăng cường độ của chùm tia tới sẽ dẫn đến sự phát ra tín hiệu

huỳnh quang mạnh, trong khi đó điều này không xảy ra ở phương pháp đo độ hấp

thụ. Các kỹ thuật đo huỳnh quang có thể xác định nồng độ nhỏ hơn một triệu lần so

với phương pháp đo độ hấp thụ. Năm 1992, Anthony W. Czarnik lần đầu tiên đưa ra

khái niệm chemodosimeter như là phân tử phi sinh học và đề xuất cách tiếp cận mới

trong lĩnh vực sensor quang học để nhận dạng chất phân tích. Ông và nnc đã trình

bày một chemodosimeter phát hiện ion Cu(II) dựa trên phản ứng mở vòng dẫn xuất

rhodamine-B [17].

Thời gian đầu, các công trình nghiên cứu về chemosensor và chemodosimeter

(gọi chung là sensor huỳnh quang) chủ yếu được thiết kế để xác định ion kim loại,

sau đó chúng được phát triển để xác định các anion. Trong thời gian gần đây, các nhà

khoa học đã thiết kế được những chemosensor và chemodosimeter để xác định các

phân tử, đặc biệt là phân tử sinh học. Đến nay, trên thế giới hầu như tuần nào cũng

có sensor huỳnh quang mới được công bố [138]. Điều này là do các sensor huỳnh

quang thường nhạy, dễ thực hiện và ít tốn kém [120] so với các phương pháp truyền

thống như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp phổ khối lượng,

phương pháp sắc ký khí, phương pháp phân tích điện hóa, phương pháp quang phổ

hấp thụ phân tử - phương pháp phân tích UV-Vis, phương pháp quang phổ hấp thụ

nguyên tử (AAS) trong việc phân tích các chất.

Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm mục đích phân tích nhiều đối

6

tượng khác nhau. Những nghiên cứu đã công bố có thể phát hiện chọn lọc các ion

kim loại như Hg(II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Al(III),…[63], [74], [75], [78], [82],

[120]. Một số sensor huỳnh quang có thể phát hiện các ion kim loại trong tế bào

sống như ion Fe(III) trong tế bào gan [82], ion Cu(II) trong tế bào HepG2 [63], ion

Hg(II) trong tế bào PC3 [78],… Ngoài ra, các sensor huỳnh quang còn có thể phát

hiện các anion như bisulfite [111], sulfite [47], acetate, benzoate, cyanide, fluoride

[26],…So với ion kim loại và anion, tuy việc phát triển chemosensor và

chemodosimeter ứng dụng trong phân tích phân tử, đặc biệt là phân tử sinh học bắt

đầu muộn hơn, nhưng số lượng các công trình đặc biệt tăng lên trong thời gian gần

đây, kết quả nghiên cứu về chemosensor và chemodosimete cho thấy các sensor

huỳnh quang này phát hiện nhanh, nhạy, chọn lọc các biothiol [33], [35], [45], [60],

[65], [89], [90], [93], [141], [144], [169], [177], [178],[180], [181],[185], [187].

Các công trình khoa học liên quan đến lĩnh vực chemodosimeter và

chemosensor huỳnh quang của các nhà khoa học Việt Nam công bố trên các tạp chí

quốc tế còn rất ít. Sensor huỳnh quang đã được tác giả Dương Tuấn Quang nghiên

cứu kể từ năm 2007. Đến nay đã có một số tác giả khác nghiên cứu về lĩnh vực này.

Các sensor huỳnh quang đã được tác giả Dương Tuấn Quang và nnc công bố bao

gồm: chemosensor phát hiện ion Fe(III) dựa trên sự biến đổi tỉ lệ phát xạ

monomer/excimer từ các nhóm pyren gắn với calix[4]arene [73]; chemosensor phát

hiện ion F(I) và ion Cs(I) dựa trên calix[4]arene với 2,3-naphthocrown-6 và

coumarin amide [84]; chemosensor phát hiện ion Cu(II) dựa trên calix[4]arene và

coumarin [119]; chemosensor chứa vòng 1,2,3-triazole dùng để phát hiện ion Al(III)

[75]; và chemosensor phát hiện ion Hg(II) dựa trên dẫn xuất của rhodamine [121].

Tác giả Nguyễn Khoa Hiền và nnc đã thiết kế và tổng hợp chemosensor huỳnh

quang từ dẫn xuất của dimethylaminocinnamaldehyde với aminothiourea để xác

định đồng thời ion Ag(I), ion Hg(II) và ion Cu(II) [42] và chemodosimeter dựa trên

hệ liên hợp dansyl-diethylenetriamine-thiourea phát hiện chọn lọc ion Hg(II) [43],

các sensor này hoạt động theo kiểu ON-OFF; tác giả Phan Tứ Quý và nnc đã thiết

kế và tổng hợp chemosensor huỳnh quang từ dẫn xuất của rhodamine phát hiện chọn

lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức và phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và

7

chemodosimeter từ dẫn xuất của fluorescein phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên

phản ứng tạo phức và phản ứng đặc trưng của ion Hg(II), tất cả hoạt động kiểu tắt-

bật (OFF-ON) huỳnh quang theo các cơ chế khác nhau.

1.1.2. Nguyên lý hoạt động của sensor huỳnh quang

Năm 2010, tác giả Dương Tuấn Quang và Jong Seung Kim trình bày nguyên

lý hoạt động của chemosensor và chemodosimeter [120] được mô tả ở Hình 1.1.

Theo các tác giả, khi chemosensor tương tác với chất phân tích, đã xảy sự phối trí

giữa chemosensor với chất phân tích, kết quả tạo thành một cấu trúc phát tín hiệu duy

nhất (Hình 1.1a), hoặc hình thành một cấu trúc phát tín hiệu và một cấu trúc không

phát tín hiệu (Hình 1.1b). Các phản ứng này là thuận nghịch. Trong khi đó, khi

chemodosimeter tương tác với chất phân tích gây ra phản ứng không thuận nghịch,

trong đó chất phân tích liên kết cộng hóa trị với một hay nhiều nguyên tử hình thành

một cấu trúc phát tín hiệu và một cấu trúc không phát tín hiệu, các cấu trúc này khác

về mặt hóa học so với chemodosimeter ban đầu. Chất phân tích có thể liên kết với

một trong hai cấu trúc trên (Hình 1.1c và 1.1d).

Hình 1.1. Nguyên lý hoạt động chemosensor (a, b) và chemodosimeter (c, d) [120]

Các sensor huỳnh quang hoạt động theo nguyên lý trên đã biến đổi từ trạng

thái không phát huỳnh quang sang phát huỳnh quang (hay còn gọi là kiểu “tắt-bật”

hoặc “turn on”, “OFF-ON”). Bên cạnh đó, công bố [142] gần đây cho thấy, một số

sensor huỳnh quang hoạt động theo kiểu ngược lại (hay còn gọi là kiểu “bật-tắt”

hoặc “turn off”, “ON-OFF”). Vì vậy, có thể khái niệm, sensor phân tử (gồm

chemodosimeter và chemosensor) dùng để phát hiện các chất phân tích dựa trên sự

8

thay đổi tín hiệu huỳnh quang trước và sau khi phản ứng với chất phân tích. Nếu

sensor huỳnh quang phản ứng thuận nghịch với chất phân tích được gọi là

chemosensor. Trái lại, sensor huỳnh quang phản ứng không thuận nghịch với chất

phân tích được gọi là chemodosimeter.

1.1.3. Cấu tạo của sensor huỳnh quang

Hình 1.2 trình bày cấu tạo thông thường của một sensor huỳnh quang. Theo

đó, gồm ba thành phần chính “fluorophore-spacer-receptor”. Trong đó, fluorophore

là tiểu phần liên quan đến sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang; receptor là tiểu phần

phản ứng hoặc tạo liên kết với chất phân tích; spacer là tiểu phần cầu nối và truyền

dẫn tín hiệu giữa receptor và fluorophore [138]. Các sensor loại này thường hoạt

động theo cơ chế PET, FRET. Một ví dụ về sensor huỳnh quang có cấu tạo đầy đủ

ba thành phần (Hình 1.3), được Nguyễn Khoa Hiền và nnc báo cáo dùng để phát

hiện ion Hg(II) [43].

Hình 1.2. Cấu tạo của một sensor huỳnh quang [138]

Hình 1.3. Sensor huỳnh quang kiểu “fluorophore-spacer-receptor” [43]

Dựa trên nguyên tắc đó, các sensor huỳnh quang có thể được cấu tạo gồm

9

nhiều fluorophore hoặc nhiều receptor theo kiểu fluorophore-[spacer-receptor]n,

[fluorophore-spacer]n-receptor hoặc [fluorophore]n-spacer-[receptor]n…[117],

[183]. Ngoài ra, một số sensor huỳnh quang có thể chỉ được cấu tạo bởi

fluorophore-receptor [188], các sensor loại này thường hoạt động theo cơ chế ICT.

1.1.4. Nguyên tắc thiết kế các sensor huỳnh quang

Để thiết kế các sensor huỳnh quang phù hợp vào việc ứng dụng phân tích các

chất thì tính chất huỳnh quang của nó (bao gồm cả hiệu suất lượng tử huỳnh quang,

bước sóng và thời gian sống) phải thay đổi sau khi tương tác với chất phân tích. Do

đó, cần khảo sát tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất huỳnh quang. Những yếu

tố đó chủ yếu dựa trên các nguyên tắc sau (chi tiết được trình bày ở Phụ lục 1) [51],

[146], [172]: Mức độ liên hợp của hệ thống electron π; Ảnh hưởng của nhóm thế;

Sự chuyển điện tích nội phân tử (ICT); Sự chuyển điện tích nội phân tử xoắn

(TICT); Sự chuyển electron do cảm ứng ánh sáng (PET); Sự chuyển proton nội

phân tử ở trạng thái kích thích (ESIPT); Sự chuyển năng lượng cộng hưởng

Forster (FRET).

1.2. Vai trò của các biothiol trong tế bào và các phương pháp phát hiện

1.2.1. Các biothiol và vai trò của chúng

Các hợp chất hữu cơ có chứa nhóm sulfhydryl hay nhóm thiol (nhóm -SH)

được gọi là các hợp chất thiol, trước đây thường gọi là mecaptan. Biothiol là các

phân tử thiol sinh học, trong đó quan trọng nhất gồm cysteine (Cys), glutathione

(GSH) và homocysteine (Hcy) (Hình 1.4). Các biothiol đóng vai trò quan trọng

trong các quá trình sinh học. Quá trình trao đổi chất và vận chuyển các hợp chất

biothiol trong các hệ thống sinh học có liên quan chặt chẽ đến một loạt các enzyme

và protein quan trọng. Sự thiếu hụt hoặc quá mức nồng độ nội sinh các biothiol dẫn

đến thay đổi các điều kiện bệnh lý khác nhau. Sự dao động này còn thể hiện trạng

thái chức năng của các enzymn tương ứng và có liên quan đến các bệnh lý [13],

[24], [75], [96], [162].

Ví dụ, Cys được xem như là một nucleophile lý tưởng trong xúc tác enzyme

cho phản ứng (oxy hóa khử) chuyển đổi thuận nghịch để duy trì giữa cấu trúc

10

protein bậc ba và bậc bốn thông qua hình thành disulfide trong điều kiện sinh lý

[114]. Sự thiếu hụt Cys có thể gây ra các bệnh lý như tăng trưởng chậm, hôn mê,

tổn thương gan, tổn thương da và phá hủy sắc tố tóc [18]; GSH đóng vai trò quan

trọng trong việc duy trì môi trường oxy hóa trong các tế bào sống [52], [122] [177].

GSH có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại các chất bài tiết, cũng như các chất độc hại

tự nhiên như các gốc tự do và hydroperoxide. Sự suy giảm nồng độ GSH có liên

quan đến một số bệnh ở người như bệnh ung thư, thoái hóa thần kinh và bệnh tim

mạch [5]; Nồng độ Hcy trong huyết thanh cao là yếu tố dẫn đến nguy cơ cao mắc

bệnh Alzheimer, bệnh tim mạch, viêm đại tràng, dị tật bẩm sinh và bệnh suy giảm

trí nhớ ở người cao tuổi [124], [134], [147].

(H) (C) (N) (S) (O)

Hình 1.4. Hình học bền của Cys (a), Hcy (b) và GSH (c) ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ

1.2.2. Phương pháp phát hiện các biothiol

Do tầm quan trọng của các phân tử thiol sinh học, việc nghiên cứu các

phương pháp mới để phát hiện các biothiol đã và đang được các nhà khoa học quan

tâm. Có rất nhiều phương phân tích khác nhau đã được sử dụng để phát hiện các

biothiol, chẳng hạn như sắc ký lỏng hiệu năng cao, phổ khối lượng [36], sắc ký khí

(a) (b)

(c)

11

[14], phân tích điện hóa [44], [103] và phân tích UV-Vis [4], [57]. Ngoại trừ,

phương pháp UV-Vis sử dụng máy móc thiết bị đơn giản, rẻ tiền và dễ thực hiện,

song thường kém nhạy hơn; các phương pháp còn lại thường dùng máy móc thiết bị

hiện đại, đắt tiền và thực hiện bởi những chuyên gia được đào tạo, có kinh nghiệm.

Trong khi đó, phương pháp phân tích huỳnh quang thường sử dụng máy móc thiết

bị rẻ tiền, đơn giản, dễ thực hiện, đặc biệt có thể tầm soát các chất này trong các tế

bào sống [120].

1.3. Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát hiện ion Hg(II)

1.3.1. Nguồn ô nhiễm, độc tính của ion Hg(II)

Trong số các kim loại nặng độc hại, thủy ngân là mối quan tâm lớn trong

các kim loại nặng độc hại và phong phú nhất trong lớp vỏ của Trái Đất [132].

Thủy ngân (Hg) tồn tại trong môi trường gồm các dạng nguyên tố, vô cơ và hữu

cơ. Thủy ngân nguyên tố và thủy ngân vô cơ thải vào môi trường chủ yếu từ khai

thác mỏ, luyện kim, hoạt động công nghiệp và quá trình đốt cháy nhiên liệu hóa

thạch. Thủy ngân hữu cơ trong môi trường chủ yếu là do quá trình vi sinh vật

phân giải thủy ngân vô cơ ở trầm tích biển thành methylmercury [6]. Ngoài ra,

thủy ngân còn phát thải vào môi trường từ các nguồn khác như hỗn hống nha

khoa, mỹ phẩm và dược phẩm [56].

Ở nồng độ mức ppb, các ion thủy ngân có thể gây ra những tác động tiêu

cực đến môi trường, động vật, thực vật và con người. Đối với con người, thủy

ngân có thể gây ra những thay đổi trong cấu trúc của ADN và gây hại cho não,

viêm nướu, viêm miệng, hệ tiêu hóa và rối loạn thần kinh, thậm chí tử vong. Nó

cũng được cho là có liên quan với sẩy thai và dị tật bẩm sinh [6].

1.3.2. Phương pháp phát hiện ion Hg (II)

Có nhiều phương pháp phát hiện ion này như phương pháp quang phổ hấp

thụ phân tử [26], phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [32], phương

pháp von-ampe hòa tan [95],… Các phương pháp AAS, von-ampe hòa tan,…

thường nhạy, có thể phát hiện ion Hg(II) đến nồng độ ppb. Tuy nhiên, các phương

pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền và các thao tác mất nhiều thời gian. Phương pháp

quang phổ hấp thụ phân tử sử dụng máy móc thiết bị đơn giản, rẻ tiền và dễ thực

12

hiện, song thường kém nhạy hơn. Để phát hiện ion Hg(II) ở mức nồng độ ppb

bằng quang phổ hấp thụ phân tử thường phải kết hợp với các phương pháp làm

giàu như tách chiết [145], hoặc động học xúc tác,… [123].

1.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol

1.4.1. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng tạo vòng

với các aldehyde

Phản ứng tạo vòng giữa Cys/Hcy với aldehyde tạo thành thiazolidines/

thiazinanes (Hình 1.5) đã được sử dụng để thiết kế các sensor huỳnh quang phát

hiện Cys/Hcy trong sự có mặt của GSH.

Hình 1.5. Phản ứng giữa fluorophore có chứa aldehyde với Cys/Hcy tạo

thành thiazolidines/thiazinanes [92]

Hình 1.6. Sensor 1 phát hiện Cys/ Hcy dựa trên phản ứng đóng vòng

với aldehyde [108]

Năm 2004, Strongin và nnc đã thiết kế sensor 1 phát hiện chọn lọc Cys/Hcy

so với GSH (Hình 1.6). Sensor 1 được dùng để phát hiện Cys và Hcy trong huyết

tương. Khi thêm Cys vào mẫu huyết tương có chứa 1 và một lượng dư GSH, phổ

hấp thụ có sự chuyển dời đỏ từ bước sóng 480 nm về bước sóng 505 nm và giảm

cường độ huỳnh quang với sự gia tăng nồng độ Cys. Cường độ huỳnh quang của

Huỳnh quang yếu Huỳnh quang mạnh

1

13

huyết tương chứa sensor 1 có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Hcy trong

phạm vi từ 2,9 µM đến 2,5 mM) [108].

Hình 1.7. Sensor 2 và 3 phát hiện Cys/Hcy dựa trên phản ứng đóng vòng

với aldehyde [108]

Với cơ chế này, Barbas và nnc đã thiết kế sensor 2 và 3 (Hình 1.7) phát hiện

Cys và Hcy. Cys phản ứng với sensor 2 và làm tăng cường độ huỳnh quang của

dung dịch ở bước sóng 380 nm, hoạt động theo kiểu OFF-ON, phát hiện Cys ở

khoảng nồng độ từ 100 µM đến 5 mM trong sự có mặt của GSH. Ở trạng thái tự do,

sensor 3 có sự chuyển dịch điện tử nội phân tử (ICT) mạnh từ tiểu phần

phenanthroimidazole giàu electron sang tiểu phần aldehyde thiếu hụt electron, phổ

huỳnh quang có bước sóng phát xạ cực đại ở 519 nm. Khi thêm Cys/Hcy vào dung

dịch chứa sensor 3, phổ huỳnh quang của sensor 3 có bước sóng cực đại chuyển từ

519 nm về 394 nm (dịch chuyển mạnh đỉnh phát xạ phát 125 nm), hoạt động dựa

trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang. Điều này là do phản ứng giữa Cys/Hcy

với sensor 3 tạo vòng thiazolidine/thiazinane và loại bỏ nhóm -CHO, dẫn đến dập

tắt ICT. Tỷ lệ cường độ huỳnh quang (I394nm/I519nm) có quan hệ tuyến tính tốt với

nồng độ Cys từ 6 µM đến 800 µM [163].

1.4.2. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng

cộng Michael

Phản ứng cộng Michael giữa Cys/Hcy vào acrylate hình thành thioester với

vòng dị tố S, N chứa 7 hoặc 8 nguyên tử (1,4-thiazepane) đã được sử dụng từ năm

Huỳnh quang yếu Huỳnh quang mạnh

2

14

1966 trong tổng hợp hữu cơ (Hình 1.8). Đến năm 2011, phản ứng này được nhóm

Strongin ứng dụng rộng rãi để phát hiện Cys/Hcy, với việc sử dụng acrylic ester của

các fluorophore phổ biến như fluorescein, hydroxylated coumarin, naphthalimide và

cyanine. Trong sự hiện diện của Cys, Hcy hoặc GSH, một thioester được hình thành

bằng phản ứng cộng vào liên hợp acrylic este. Đối với Cys và Hcy, quá trình xảy ra

tiếp sau đó là giải phóng fluorophore tự do, ngược lại với GSH thì thioester được

hình thành thường bền. Sự khác biệt giữa Cys và Hcy thường được dựa trên thời

gian của phản ứng, trong đó Cys thường giải phóng fluorophore nhanh hơn so

với Hcy [92].

Hình 1.8. Các sensor phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng

liên hợp với acrylic ester [108]

Trên cơ sở đó, các nnc đã thiết kế các sensor 4-6 từ dẫn xuất của fluorescein

có chứa vòng spirocyclic (không màu và không phát huỳnh quang) để phát hiện Cys

(Hình 1.9). Khi bổ sung Cys vào dung dịch chứa sensor 4 hoặc 5, quá trình cộng

vào liên hợp acrylic este xảy ra, tiếp theo là sự hình thành vòng dị tố và giải phóng

fluorophore tự do. Đó là một hợp chất với cấu trúc mở vòng spirolacton, phát huỳnh

quang mạnh mẽ ở bước sóng phát quang 518 nm, bước sóng kích thích 478 nm.

Sensor 4 thể hiện sự chọn lọc đối với Cys tốt hơn so với sensor 5, điều này có thể là

do sensor 4 trải qua quá trình cộng - tách kép (có hai nhóm thioether với acrylic).

Giới hạn phát hiện của sensor 4 đối với Cys là 77 nM [53].

Sau khi sensor 6 phản ứng với Cys, dung dịch trở nên có màu hồng (bước

sóng hấp thụ cực đại 550 nm) và phát huỳnh quang mạnh mẽ (bước sóng phát xạ

621 nm), trong khi đó sự có mặt của các amino acids khác và GSH đã không gây ra

một sự thay đổi nào trong phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang. Điều này cho thấy

sensor 6 có thể sử dụng để phát hiện chọn lọc Cys [165].

n=1: nhanh n=2: chậm

15

Hình 1.9. Sensor 4-6 phát hiện Cys dựa trên phản ứng cộng liên hợp

với acrylic ester [53], [165]

1.4.3. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng ghép nối

peptide (Native chemical ligation, NCL)

Hình 1.10. Cơ chế của quá trình Native chemical ligation [92]

4 5

6

λabs=478 nm λem =515 nm

λabs=550 nm λem =621 nm

Không màu và không phát huỳnh quang

Không màu và không phát huỳnh quang

Sự trao đổi giữa các dạng thioester

Chuyển đổi N→S acyl nội phân tử

hoặc

16

Trong phương pháp này (Hình 1.10), nhóm thiol (-SH) và cặp electron không

liên kết trên nguyên tử N trong tiểu phần cystein ở phần cuối của peptide B không

được bảo vệ, tấn công vào nguyên tử C ở nối đôi trong tiểu phần thioester ở phần

cuối của peptide A không được bảo vệ, dẫn đến tạo thành một thioester trung gian

C. Tiếp đến, thioester trung gian C trải qua quá trình chuyển đổi N→S acyl nội

phân tử để tạo nên sản phẩm D với việc hình thành một liên kết peptide [92].

Dựa trên cơ chế này, sensor huỳnh quang 7 hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ

lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng đã được thiết kế với fluorophore là sự kết

hợp giữa coumarin và benzopyrylium (Hình 1.11). Trong đó, nhóm phenyl thioester

là nhóm phản ứng với Cys/Hcy do phản ứng NCL của nó nhanh hơn nhiều so với

nhóm alkyl thioester.

Hình 1.11. Sensor 7 phát hiện Cys/ Hcy dựa trên quá trình NCL [27]

Khi bổ sung Cys vào dung dịch 7 trong ethanol/phosphate (40/60, v/v, pH=

7,4), dải hấp thụ ban đầu của sensor 7 tự do tại bước sóng 669 nm dần dần giảm,

đồng thời xuất hiện và gia tăng một dải hấp hấp thụ mới ở bước sóng 423 nm. Màu

của dung dịch đổi dần từ màu xanh đậm đến màu vàng-xanh lá cây, cho phép sử

dụng để phát hiện Cys bằng mắt thường. Trong khi đó ở phổ huỳnh quang, dải phát

Dạng hở, λem=694 nm

Dạng hở, λem=694 nm

Spirolactam λem=474 nm

7

17

xạ ở bước sóng 694 nm giảm dần, đồng thời xuất hiện và tăng dần một dải phát xạ

mới ở bước sóng 474 nm (ứng với đỉnh phát xạ của coumarin). Khoảng cách hai

đỉnh phát xạ lên đến 220 nm, thuận lợi trong sử dụng 7 như là một sensor hoạt động

dựa trên sự biến đổi tỉ lệ phát xạ huỳnh quang để phát hiện Cys/Hcy. GSH chỉ gây

ra sự trao đổi thiol-thioester, dẫn đến không có sự thay đổi trong phổ huỳnh quang.

Sự có mặt của các amino acids và ion kim loại hầu như không làm thay đổi

đến phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của dung dịch 7. Kết quả, sensor 7 đã được sử

dụng như một sensor huỳnh quang hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ

huỳnh quang dùng để phát hiện Cys/Hcy ở tế bào HepG2 trong cơ thể sống [27].

1.4.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng sắp xếp lại

nhóm thế ở nhân thơm

Phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm đã được nghiên cứu như là một

chiến lược trong thiết kế các sensor huỳnh quang dùng để phát hiện chọn lọc

Cys/Hcy trong sự có mặt của GSH. Ở cơ chế này, chất huỳnh quang chứa một nhóm

thế không ổn định (Leaving group, LG) phản ứng với thiol (Cys/Hcy) để tạo ra một

thioether theo cơ chế thế nucleophilic vào nhân thơm (SNAr). Tiếp đến, các nhóm

amino và thioether của Cys/Hcy xảy ra quá trình chuyển đổi để hình thành dẫn xuất

amine, thông qua một trạng thái chuyển tiếp với vòng 5 hoặc 6 nguyên tử. Sự khác

biệt tính chất quang lý giữa chất phát quang ban đầu, sản phẩm thiother thế, amino

thế, cho phép phát hiện có chọn lọc GSH, Cys và Hcy (Hình 1.12).

Hình 1.12. Cơ chế các sensor phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng sắp

xếp lại các nhóm thế ở nhân thơm [92]

n=1: nhanh n=2: chậm

LG: nhóm thế không ổn định

18

Theo cơ chế này, các sensor 8-10 (Hình 1.13) đã được thiết kế dựa trên

fluorophore là chất huỳnh quang boron-dipyrromethene (BODIPY).

Hình 1.13. Sensor 8-10 phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng sắp xếp lại

các nhóm thế ở nhân thơm [93], [94]

Huỳnh quang mạnh λem=588 nm

Huỳnh quang mạnh λem=556 nm

Huỳnh quang yếu, λem=564 nm

8-S 8 8-N

9-M

9a. X=S 9b. X=O

10

Không có huỳnh quang

Huỳnh quang mạnh λem=588 nm

Huỳnh quang mạnh λem=564 nm

Huỳnh quang mạnh λabs=568 nm, λem=588 nm

Huỳnh quang mạnh λabs=443 nm, λem=530 nm

Không có huỳnh quang

(a) Sensor phát hiện chọn lọc GSH trong sự có mặt của Cys/Hcy

(b) Sensor phát hiện riêng biệt GSH, Cys và Hcy

(c) Sensor phát hiện đồng thời GSH, Cys và Hcy

Cys: nhanh Hcy: chậm

nhanh

19

Khi ở trạng thái tự do, trong dung dịch acetonitrile/HEPES (5/95, v/v, pH=

7,4), phổ huỳnh quang của sensor 8 phát xạ cực đại ở bước sóng 556 nm. Sensor 8

phản ứng với GSH tạo ra thioether 8-S phát xạ mạnh mẽ ở bước sóng cực đại là 588

nm. Tỷ lệ cường độ huỳnh quang tại các bước sóng phát xạ cực đại của 8-S và

sensor 8 (I588nm/I556nm) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ GSH (0 µM -60

µM). Sensor 8 có thể phát hiện định lượng GSH với giới hạn phát hiện là 0,086 µM.

Ngược lại, sensor 8 phản ứng với Cys/Hcy tạo ra một amine 8-N với huỳnh quang

hầu như không đáng kể ở bước sóng 564 nm. Điều này cho phép nó được sử dụng

để xác định GSH trong sự có mặt của Cys/Hcy trong tế bào sống [93].

Các sensor 9a và 9b được thiết kế dựa trên việc thay thế nhóm thế Cl của

sensor 8 bằng nitrophenol hoặc nitrothiophenol. Quá trình này dẫn đến dập tắt

huỳnh quang của lõi BODIPY thông qua quá trình PET. Các sensor này phản ứng

với Cys/Hcy để hình thành các dẫn xuất amine phát huỳnh quang mạnh mẽ ở bước

sóng 564 nm. Trong đó, phản ứng với Hcy mất nhiều thời gian hơn so với Cys.

Khác với Cys/Hcy, GSH phản ứng và thay thế nhóm nitrophenol, hoặc

nitrothiophenol của sensor, hình thành sản phẩm thế phát huỳnh quang mạnh mẽ ở

bước sóng 588 nm. Các kết quả này cho thấy có thể sử dụng các sensor 9a và 9b

phát hiện riêng biệt GSH, Cys và Hcy [94].

Sensor 10 được thiết kế bằng cách gắn một nhóm rút electron imidazolium

vào lõi BODIPY để tăng khả năng phản ứng thế nucleophilic ở vòng thơm. Nhờ đó,

phản ứng giữa sensor 10 với Cys và Hcy lần lượt xảy ra chỉ trong vòng 5 giây và 2

phút, phát huỳnh quang mạnh với cường độ ổn định ở bước sóng 530 nm (bước

sóng kích thích 443 nm). Trong khi đó, GSH phản ứng và thay thế cả nhóm

imidazolium và nhóm nitrophenol/nitrothiophenol của sensor 10, hình thành sản

phẩm dithioether phát huỳnh quang mạnh ở bước sóng 588 nm (bước sóng kích

thích 568 nm). Sensor 10 có thể sử dụng để phát hiện đồng thời GSH, Cys và Hcy

bằng cách sử dụng các bước sóng kích thích khác nhau tương ứng là 568 nm

và 443 nm [94].

1.4.5. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng phân tách

sulfonamide ester hoặc sulfonate ester bởi thiol

20

Các phản ứng phân tách sulfonamide hoặc sulfonate ester bởi thiol (Hình

1.14) cũng được sử dụng như là một chiến lược quan trọng trong thiết kế các sensor

huỳnh quang phát hiện các biothiol [12], [58], [64], [99], [100], [135]. Đối với các

sensor này, thông thường ban đầu khi ở dạng sulfonamide hoặc sulfonate ester

thường không màu, không phát huỳnh quang. Quá trình phân tách chúng bởi thiol

sẽ tạo ra các hợp chất màu và phát huỳnh quang mạnh mẽ.

Hình 1.14. Cơ chế hoạt động của sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa

trên phản ứng phân tách sulfonamide hoặc sulfonate ester

Hình 1.15 trình bày sensor 11 đã được thiết kế dựa trên phản ứng phân tách

sulfonate ester bởi thiol. Ở trạng thái tự do trong dung dịch đệm HEPES (10 mM,

pH=7,4), sensor 11a và 11b hầu như không phát huỳnh quang, với hiệu suất lượng

tử huỳnh quang xác định được lần lượt là 0,0007 và 0,0003 (so với 0,85 của chất

chuẩn là X trong NaOH 0,1M). Phản ứng giữa sensor 11a và 11b với GSH, Cys

hình thành X xảy ra khá nhanh, khoảng 10 phút. X phát xạ huỳnh quang mạnh mẽ ở

bước sóng 560 nm, bước sóng kích thích 460nm. Hiệu suất lượng tử huỳnh quang

của các chất Xa, Xb (a: R=H, b: R= CH3) là khá lớn, lần lượt là 0,75 và 0,58. Giới

hạn phát hiện GSH, Cys bởi sensor 11 đã được xác định, lần lượt là 2 pM và 2 pM [99].

Sensor huỳnh quang 13 được thiết kế dựa trên phản ứng phân tách

sulfonamide dùng để phát hiện các biothiol (Hình 1.16). Ở trạng thái tự do trong

dung dịch methanol/nước (4/1, v/v), sensor 13 hầu như không phát huỳnh quang.

Cys phản ứng khá nhanh (5 phút) với 13 và giải phóng 14 là một chất phát huỳnh

quang mạnh ở bước sóng 562 nm (bước sóng kích thích 441 nm). Sensor 13 đã

được nghiên cứu sử dụng để phát hiện Cys trong tế bào sống [58].

21

Hình 1.15. Sensor huỳnh quang 11 phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng

phân tách sulfonate ester [99]

Hình 1.16. Sensor huỳnh quang 13 phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng

phân tách sulfonamide [58]

1.4.6. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng phân tách

disulfide bởi thiol

Hình 1.17. (A) Sự chuyển đổi thuận nghịch giữa thiol và disulfide; (B) glutathione

(GSH) và glutathione disulfide (GSSG) [104]

Nhóm liên kết disulfide (-S-S-) là một nhóm chức năng có giá trị vô cùng

13 Không có huỳnh quang

14 Huỳnh quang mạnh

Sự oxy hóa

Sự khử

22

quan trọng trong các quá trình sinh, hóa ở cơ thể sống. Liên kết disulfide có trong

protein chủ yếu ở không gian bên ngoài tế bào; còn bên trong các tế bào, hiếm khi

tìm thấy các liên kết disulfide, điều này là do chúng dễ bị phân tách bởi các thiol tự

do phong phú ở bên trong tế bào. Hình 1.17 mô tả quá trình oxy hóa GSH tạo thành

glutathione disulfide (GSSG). Ngược lại, GSSG có thể bị khử trở lại GSH với sự có

mặt của enzyme, điều này giúp duy trì cân bằng thế oxy hóa khử trong tế bào, rất

cần thiết cho sự phát triển và chức năng của tế bào [104].

Từ phản ứng phân tách disulfide bởi thiol trong thực tế, nhiều sensor huỳnh

quang đã được thiết kế để phát hiện các biothiol. Năm 2010, Xiaoqing Zhuang và

nhóm nghiên cứu đã thiết kế một sensor 15 (Hình 1.18) dựa trên dẫn xuất của

naphthalimide có chứa nhóm chức disulfide, có thể phát hiện định lượng GSH ở

mức nồng độ sinh lý và đã áp dụng thành công trong sử dụng hình ảnh để phát hiện

thiol trong tế bào sống HeLa.

Hình 1.18. Sensor huỳnh quang 15 phát hiện GSH dựa trên phản ứng phân tách

disulfide [8]

Ở trạng thái tự do, dung dịch 15 trong ethanol/nước (1/9, v/v), đệm PBS (20

mM, pH= 7,4), phổ phát xạ huỳnh quang đạt cực đại ở bước sóng 485 nm (bước

sóng kích thích 400 nm). Khi tăng dần nồng độ GSH vào dung dịch 15, trong phổ

huỳnh quang thu được có đỉnh phát xạ ở bước sóng 485 nm dần dần biến mất, thay

vào đó xuất hiện một đỉnh phát xạ mới ở bước sóng 533 nm và tăng dần theo nồng

độ GSH. Tỷ lệ cường độ huỳnh quang I533nm/I485nm quan hệ tuyến tính chặt chẽ với

nồng độ GSH trong khoảng nồng độ 0,5 mM đến 10 mM. Sensor 15 có thể phát

hiện chọn lọc GSH trong sự hiện diện của chất khử sinh lý quan trọng là acid

ascorbic (Vc) và các amino acids khác không chứa nhóm thiol bao gồm: arginine

2 2

15 16

23

(Arg), alanine (Ala), tyrosine (tyr), lysine (Lys), histidine (His), aspartic (asp),

valine (val), leucine (Leu), tryptophane (Try), methionine (Met), proline (pro),

phenylalanine (Phe), serine (ser), threonine (Thr), glutamic (Glu) và glycine

(glyly) [8].

Murthy và nnc đã báo cáo sensor huỳnh quang 17 (Hình 1.19) dựa trên dẫn

xuất của coumarin, có thể xác định được cân bằng thiol-disulfide trong nội bào. Ở

trạng thái khử, sensor 17 chứa hệ thống liên hợp π mở rộng với thiolate, có phổ hấp

thụ cực đại ở bước sóng 448 nm. Sản phẩm phản ứng của 17 với thiol là 17-SR, có

phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 380 nm. Do đó, tỷ lệ nồng độ giữa 17 với 17-SR

có thể được ước lượng từ tỷ lệ phát xạ huỳnh quang ở 490 nm với 2 bước sóng kích

thích tương ứng là 448 và 372 nm (Fex448/Fex380). Dạng khử thiolate (17) có tỷ lệ

phát xạ (Fex448/Fex380) bằng 5, trong khi đó đối với dạng oxy hoá disulfide (17-SR) tỷ

lệ này chỉ có 0,5. Sự thay đổi tỷ lệ huỳnh quang như trên của sensor 17 đã được áp

dụng để đo lường “trạng thái oxy hóa động” của toàn bộ tế bào [71].

Hình 1.19. Sensor huỳnh quang 17 phát hiện tỷ lệ GSH/GSSH dựa trên phản ứng

phân tách disulfide [71]

1.4.7. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng hình

thành và phân hủy phức

Gần đây, một chiến lược đặc biệt hấp dẫn đã được nghiên cứu để thiết kế các

sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol, đó là sử dụng phức (thường là phức của

ion kim loại với một chất huỳnh quang) có khả năng tương tác thuận nghịch tạo

phức và phân hủy phức với các biothiol. So với các sensor dựa trên các phản ứng

đặc trưng với thiol, sensor dựa trên phản ứng tạo phức thường nhạy hơn. Hơn nữa,

Thiolate-hệ thống liên hợp π được mở rộng Disulfide -hệ thống liên hợp π bị giảm

Sự trao đổi thiol-disulfide trong nội bào

17 λmax=448 nm

17-SR λmax=380 nm

24

quá trình tạo phức là có thể đảo ngược, vì vậy có thể sử dụng sensor lặp lại trong

nhiều chu kỳ.

Năm 2015, Juyoung Yoon và nnc đã công bố sensor 18 dựa trên dẫn xuất của

bis-pyrene, trong đó hai hydroxypyrenes được nối với nhau thông qua mối liên kết

2,2'-oxydiethanamino (Hình 1.20).

Hình 1.20. Sensor huỳnh quang 18 phát hiện GSH dựa trên phản ứng tạo

phức với ion Cu(II)[174]

Trong dung dịch HEPES/DMSO (95/5, v/v, 10 mM, pH= 7,4), sensor 18

phát huỳnh quang mạnh ở bước sóng cực đại 450 nm, với bước sóng kích thích 355

nm. Sensor 18 phản ứng tạo phức với Cu(II) theo tỷ lệ mol 1:1 và dẫn đến dập tắt

gần như hoàn toàn huỳnh quang, trong khi đó các ion kim loại khác hầu như không

làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch 18, bao gồm ion Li(I), Na(I), K(I),

Cs(I), Ag(I), Ca(II), Mg(II), Mn(II), Al(III), Fe(II), Fe(III), Cr(III), Cd(II), Sr(II),

Pb(II). Ngoại trừ ion Hg(II) có làm thay đổi khoảng 50% cường độ huỳnh quang

của dung dịch 18. GSH, Cys, Hcy phản ứng với phức 18-Cu(II) và làm phục hồi

cường độ huỳnh quang trở lại như ban đầu của dung dịch sensor 18 tự do. Trong khi

đó các amino acids và các protein khác hầu như không làm thay đổi tín hiệu huỳnh

quang của dung dịch 18-Cu(II), bao gồm Ala, Arg, Gln, Glu, Gly, Lys, Met, Phe,

Ser, Tyr, Thr, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Asp, Asn, HSA, Insulin, Lactoferrin,

Lysozyme. Sự phục hồi huỳnh quang được cho là do sự dịch chuyển phối tử (sensor

18) từ phức 18-Cu(II) sang hình thành phức mới với các biothiol. Phương pháp này

có thể phát hiện định lượng GSH trong khoảng nồng độ từ 0 µM đến 8 µM, với giới

25

hạn phát hiện ở mức 0,16 µM. Phương pháp này đã được ứng dụng để phát hiện

GSH nội sinh trong tế bào và các mô sống, với nhiều ưu điểm như ít gây tổn

thương, giảm thiểu ảnh hưởng huỳnh quang nền và khả năng phát hiện hình ảnh các

mô sâu [174].

Năm 2016, Zhiqiang Zhang và nnc đã báo cáo một sensor huỳnh quang, 2-

hydroxy-1-naphthaldehyde azine (19), được thiết kế và tổng hợp để phát hiện cả ion

Cu(II) và các biothiol dựa trên cơ chế phản ứng trao đổi phức (Hình 1.21).

Hình 1.21. Sensor huỳnh quang 19 phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng

tạo phức với ion Cu(II) [59]

Sensor 19 phản ứng tạo phức với ion Cu(II) theo tỷ lệ mol 1:1, đi kèm với

việc dập tắt hoàn toàn huỳnh quang của dung dịch 19 trong DMF/EPES (20 mM,

pH=7,4, 3/7, v/v). Sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch 19 ở bước sóng

phát xạ cực đại 513 nm quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ ion Cu(II) trong

khoảng 0 µM đến 35 µM. Giới hạn phát hiện ion Cu(II) là 15 nM. Các ion kim loại

khác bao gồm Fe(III), Hg(II), Cd(II), Pb(II), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Cr(III),

Ag(I), Ca(II), Mg(II), Ba(II), Li(I), K(I), Na(I), không ảnh hưởng đến việc xác định

ion Cu(II) bởi 19. Phức 19-Cu(II) phản ứng với các biothiol, bao gồm Hcy, Cys và

GSH, dựa trên phương pháp trao đổi phức, tạo ra sự phục hồi nhanh chóng của phổ

huỳnh quang và phổ UV-Vis. Kết quả khảo sát cho thấy, phức 19-Cu(II) có thể sử

dụng như là một sensor huỳnh quang theo kiểu OFF-ON để phát hiện chọn lọc các

biothiol trong sự hiện diện của các amino acids bao gồm Leu, Ala, Arg, Asn, Asp,

Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Try and Val. Giới hạn phát

hiện của phức 19-Cu(II) đối với Hcy, Cys và GSH lần lượt là 1,5 μM, 1,0 μM và 0,8

19 19-Cu2+

26

μM, điều này cho thấy 19-Cu(II) đủ nhạy để xác định thiol trong các hệ thống sinh

học. Khả năng sử dụng 19-Cu(II) để phát hiện các biothiol trong tế bào ung thư phổi

ở người A549 đã được kiểm chức bằng phương pháp phân tích hình ảnh hiển vi

huỳnh quang [59].

1.4.8. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên các cơ chế khác

Ngoài các chiến lược đã trình bày, một số ít sensor huỳnh quang dùng để

phát hiện các biothiol đã được thiết kế dựa trên các cơ chế khác như như liên kết

hydrogen, tương tác tĩnh điện,... [66], [106], [107], [116], [164], [168], [175], [176].

1.5. Sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II)

Để thiết kế các sensor huỳnh quang phát hiện chọn lọc ion Hg(II), các phản

ứng đặc trưng của nó đã được nghiên cứu sử dụng, nhất là các phản ứng mà sự hiện

diện của các ion kim loại khác không xảy ra.

1.5.1. Sensor huỳnh quang dựa trên các phản ứng tạo phức với ion Hg(II) bởi

các phối tử -N, -S, -O trong vòng và mạch hở

Ion Hg(II) có khả năng tạo phức mạnh với nhiều phối tử, đặc biệt là với -O, -

S và -N, nên các hợp chất vòng chứa các nguyên tố này đã được ứng dụng để thiết

kế các sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II). Nhiều sensor huỳnh quang phân

tích ion Hg(II) đã được công bố [49], [72], [98] dựa trên các phản ứng tạo phức

giữa ion Hg(II) và các phối tử -N, -S, -O trong vòng và mạch hở.

Cũng có nhiều công trình công bố về các sensor huỳnh quang phát hiện ion

Hg(II) dựa trên phản ứng mở vòng spirolactam của rhodamine. Sự mở vòng

spirolactam của rhodamine là do ion Hg(II) tạo phức với các phối tử -N và -O, tuy

nhiên sự thay đổi huỳnh quang của các sensor này xảy ra với cơ chế đặc biệt. Điều

này là do rhodamine có hệ số hấp thụ phân tử và hiệu suất lượng tử huỳnh quang

lớn, phát xạ huỳnh quang trong vùng khả kiến. Dẫn xuất rhodamine kiểu vòng

spirolactam không màu và không phát huỳnh quang, trong khi đó dẫn xuất mở vòng

spirolactam có màu hồng và phát huỳnh quang mạnh mẽ. Để thúc đẩy phản ứng mở

vòng spirolactam, các nhóm thế có ái lực mạnh với ion Hg (II) như -N, -O, và -S đã

được gắn vào vị trí R1 của các dẫn xuất rhodamine (Hình 1.22a). Sensor huỳnh

quang 20, 21 phát hiện ion Hg(II) theo cơ chế này được trình bày ở Hình 1.22b.

27

O

N R1

N N

O

O

N R1

N N+

O-

Hg2+

Fluorescence-OFF

(a)

O

N

N N

O

NH

ON

NH

NH2

47

(b)

O

N

N N

O

N

N

HO

48

Fluorescence-ON

Hình 1.22. Sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) dựa trên phản ứng mở vòng

spirolactam của rhodamine [25], [80]

Ngoài những sensor huỳnh quang nói trên, những công bố gần đây về các

sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) dựa trên tạo phức với các phối tử -N, -O

và -S ở mạch hở cho thấy, giới hạn phát hiện của các sensor ngày một được cải

thiện. Tuy đa số các sensor kiểu này đã công bố có giới hạn phát hiện ion Hg(II) ở

mức nồng độ trên 100 ppb [98], [101], [152], [153], [173], song đã có một số sensor

công bố phát hiện được ở mức nồng độ dưới 10 ppb [49], [50], [118], [128]. Tuy

nhiên, điểm hạn chế của các sensor này là phải sử dụng một lượng lớn các dung môi

hữu cơ [49], [50], [98], [101], [102], [118], [152], [153], [173].

1.5.2. Sensor huỳnh quang dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II)

Ion Hg(II) có ái lực mạnh với lưu huỳnh và oxi nên các công trình nghiên

cứu đã thiết kế các sensor dựa trên các fluorophore chứa lưu huỳnh hoặc oxi. Dưới

tác dụng của ion Hg(II) đã gây ra các phản ứng đặc trưng như phản ứng tách loại

lưu huỳnh và đóng vòng guanidine, phản ứng chuyển đổi nhóm thiocarbonyl thành

nhóm carbonyl, phản ứng tách loại thiol.

Theo các tài liệu thu thập được, đến nay có nhiều sensor huỳnh quang phát

hiện ion Hg(II) dựa trên các fluorophore là naphthamide, coumarin,

benzothiadiazole, Nile Blue và tricarbocyanine, hoạt động theo phản ứng dẫn xuất

thiourea với amin tạo thành guanidine khi có mặt ion Hg(II) đã được công bố [38],

20 21

28

[83], [85], [86], [91], [97], [136], [143], [161], [190]. Tùy thuộc vào việc sử dụng

fluorophore, các sensor huỳnh quang được thiết kế theo kiểu này, dưới tác dụng của

ion Hg(II) đã thúc đẩy quá trình tách loại lưu huỳnh và đóng vòng guanidine, dẫn

đến có sự thay đổi màu huỳnh quang hoặc quá trình tách loại lưu huỳnh và đóng

vòng guanidine đã làm xuất hiện quá trình PET từ tiểu phần aniline đến

fluorophore, dẫn đến dập tắt huỳnh quang hoặc sự tách loại lưu huỳnh và đóng

vòng guanidine đã làm giảm khả năng cho electron của các nhóm -NH trong tiểu

phần thiourea, đồng thời tăng khả năng cho electron của các nhóm amin trong

tiểu phần benzoindole, tạo nên sự gia tăng mức độ liên hợp hệ thống electron π,

kết quả các sensor này hoạt động theo kiểu OFF-ON. Sự hiện diện các ion kim

loại khác, bao gồm Co(II), Cu(II), Ni(II), Pb(II), Zn(II), Cd(II), Mn(II), Sn(II),

Ca(II), K(I), Na(I), Mg(II), Fe(III), không làm thay đổi đáng kể tín hiệu huỳnh

quang dung dịch của các sensor trên. Tuy nhiên, các phản ứng xảy ra trong dung

dịch với lượng lớn dung môi hữu cơ. Giới hạn phát hiện ion Hg(II) trong khoảng

0,6 µM đến 8,0 µM. Đó là những hạn chế khi áp dụng các sensor này vào phân tích

các mẫu trong thực tế, đặc biệt là trong các đối tượng sinh học.

Ngoài phản ứng đóng vòng guanidine, ion Hg(II) còn thúc đẩy các phản ứng

như: tách loại lưu huỳnh tạo hợp chất dị vòng, tách loại thiol từ thioether, chuyển

đổi nhóm thiocarbonyl thành nhóm carbonyl,... Dựa trên các phản ứng này, một số

sensor huỳnh quang được thiết kế để ứng dụng trong việc phát hiện ion Hg(II) [19],

[20], [64], [172], [184].

1.6. Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa trên

fluorophore là cyanine và coumarin

1.6.1. Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa trên

fluorophore là cyanine

Các dẫn xuất cyanine bao gồm 3 dạng: streptocyanines hoặc cyanine mạch

hở R2N+=CH[CH=CH]n-NR2 (I); hemicyanines Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2 (II);

và cyanine mạch vòng Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl (III) (Hình 1.23). Các dẫn

xuất cyanine đều có cấu trúc kiểu: nhóm đẩy electron (donor) - hệ liên hợp π - nhóm

rút electron (acceptor). Trong đó, nhóm đẩy electron là một nhóm amino, nhóm rút

29

electron là ion amoni. Chúng được biết đến là những hợp chất màu, phát huỳnh

quang mạnh mẽ, được sử dụng nhiều để phát triển các sensor huỳnh quang, trong đó

có các sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) và biothiol [11], [40], [61], [88],

[126], [170], [179], [182], [186].

Hình 1.23. Các dạng dẫn xuất cyanine

Hình 1.24. Các sensor phát hiện Hg2+/MeHg+ dựa trên fluorophore là cyanine, sử

dụng phản ứng desulfurization và tạo vòng guanidine bởi xúc tác Hg2+/MeHg+[186]

Dựa trên fluorophore là cyanine, Tian và nhóm nghiên cứu đã công bố các

sensor 22-24 dùng để phát hiện ion Hg2+ và MeHg+ (Hình 1.24). Ở trạng thái sensor

ban đầu, quá trình ICT diễn ra mạnh mẽ bởi sự hiện diện của nhóm đẩy electron

(nhóm amin bậc 2). Sự hiện diện của ion Hg2+ hoặc MeHg+ đã thúc đẩy quá trình

desulfurization và tạo vòng guanidine, làm giảm quá trình ICT, tạo nên sự dịch

chuyển đỏ (red shift) mạnh mẽ trong phổ hấp thụ và phố phát xạ huỳnh quang. Kết

quả, các sensor 22-24 có thể phát hiện ion Hg2+ và MeHg+ theo kiểu dựa trên sự

biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang giữa hai bước sóng F830 nm/F780nm (ratiometric

sensor). Giới hạn phát hiện ion Hg2+ ở mức nồng độ nM, trong dung môi

methanol/nước (80/20, v/v) [186].

30

Hình 1.25. Sensor phát hiện ion Hg(II) dựa trên fluorophore là cyanine, sử dụng

3,9-dithia-6-monoazaundecane làm receptor tạo phức với Hg(II) [11]

Năm 2008, Tang và nhóm nghiên cứu thiết kế sensor 25 dựa trên fluorophore

là tricarbocyanine, một dẫn xuất cyanine gắn với receptor là 3,9-dithia-6-

monoazaundecane có khả năng tạo phức với ion Hg(II) (Hình 1.25). Ở trạng thái tự

do, quá trình PET từ tiểu phần 3,9-dithia-6-monoazaundecane đến tiểu phần

tricarbocyanine làm cho sensor 25 không phát huỳnh quang. Sau khi sensor 25 phản

ứng tạo phức với ion Hg(II), ngăn chặn quá trình PET, dẫn đến phức phát huỳnh

quang mạnh mẽ ở bước sóng 783 nm (bước sóng kích thích 685 nm). Sensor 25 có

thể sử dụng để phát hiện chọn lọc ion Hg(II) theo kiểu tắt-bật huỳnh quang với giới

hạn phát hiện là 13,9 nM, trong đệm pH=7,4 [11].

Sensor 26 đã được Zeng và nhóm nghiên cứu công bố dùng để phát hiện

Hg(II) ion dựa trên fluorophore là cyanine, sử dụng phản ứng tạo phức với các

nguyên tử N, O và Se có mặt trong sensor 26 (Hình 1.26). Sự hình thành phức đã

dập tắt quá trình ICT trong sensor, dẫn đến phổ hấp thụ dịch chuyển về bước sóng

ngắn hơn (từ 542 nm về 412 nm), đồng thời làm dập tắt huỳnh quang (bước sóng

phát quang 590 nm). Sensor 26 có thể phát hiện ion Hg(II) với giới hạn phát hiện là

50 nM, trong dung dịch ethanol/nước (1/1, v/v) [182].

Hình 1.26. Sensor phát hiện ion Hg(II) dựa trên fluorophore là cyanine, sử dụng

phản ứng tạo phức của Hg(II) với các nguyên tử N, O, Se [182]

31

Hình 1.27. Các sensor phát hiện biothiol dựa trên fluorophore là cyanine, sử dụng

các phản ứng phân cắt receptor bởi biothiols [61], [88], [126], [170], [179]

Các sensor 27-32 đã được thiết kế dựa trên fluorophore là cyanine dùng để

phát hiện các biothiol (Hình 1.27). Quá trình PET từ receptor đến fluorophore dẫn

đến các sensor này không phát huỳnh quang. Các biothiol phản ứng với các sensor

này dẫn đến sự phân cắt các receptor (phân cắt carbamate trong sensor 27, phân cắt

liên kết S-N trong sensor 28, phân cắt liên kết C-O trong sensor 29 và 32, phân cắt

liên kết Se-N trong sensor 30 và 31), ngăn chặn quá trình PET, tạo các sản phẩm

phát huỳnh quang mạnh mẽ. Do đó, các sensor này có thể sử dụng để phát hiện các

biothiol (Cys, Hcy và GSH) theo kiểu tắt-bật huỳnh quang. Trong đó, sensor 27 có

thể phát hiện GSH, Cys và Hcy với giới hạn phát hiện lần lượt là 0,20 μM, 0,29 μM

và 0,21 μM, trong đệm HEPES pH=7,4 chứa 5% DMSO [61]. Sensor 28 có thể phát

hiện GSH, Cys và Hcy trong tế bào HeLa ở mức nồng độ 100 µM bằng phương

pháp hình ảnh huỳnh quang, với thời gian đáp ứng khoảng 20 phút [179]. Sensor 29

có thể phát hiện chọn lọc GSH trong sự có mặt Cys và Hcy; giới hạn phát hiện GSH

là 26 nM, trong môi trường đệm HEPES, pH=7,4. Tuy vậy, tốc độ phản ứng chậm,

thời gian phản ứng lên đến 3 giờ [88]. Sensor 30 và 31 có thể phát hiện các thiol

không thuộc về protein như GSH, Cys, N-acetylcysteine và dithiothreitol ở mức

32

nồng độ 5 mM; phát hiện các thiol thuộc về protein như thioredoxin, glutathione

reductase và metallothionein ở mức nồng độ 10 µM. Cả hai sensor này đều có thời

gian phản ứng nhanh, khoảng pH làm việc rộng (4-8,6), phát xạ ở vùng hồng ngoại

gần, có thể sử dụng để phát hiện biothiol trong tế bào đại thực bào chuột RAW

264.7 và mô gan của chuột [126]. Sensor 32 phản ứng với GSH và làm gia tăng

mạnh mẽ cường độ huỳnh quang ở bước sóng 805 nm. Trong khi đó, sensor 32

phản ứng với Cys làm gia tăng mạnh mẽ cường độ huỳnh quang ở bước sóng 775

nm; ngược lại, sự có mặt của Hcy không làm thay đổi đáng kể cường độ huỳnh

quang (trong cùng một bước sóng kích thích là 710 nm). Kết quả là, sensor 32 có

thể phát hiện đồng thời GSH và Cys trong cùng một bước sóng kích thích là 710

nm, kể cả sự hiện diện của Hcy. Sensor 32 đã được ứng dụng để phát hiện GSH và

Cys trong tế bào Hela. Hạn chế của sensor này là thời gian phản ứng chậm, lên đến

2 giờ [170].

1.6.2. Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa trên

fluorophore là coumarin

Coumarin có cấu tạo gồm một dị vòng pyrone gắn liền với một vòng benzen.

Trong đó, nhóm cacbonyl ở vị trí tạo nên cấu trúc tran-stilbene, các liên kết đôi

được cố định bởi cấu trúc lactone. Điều này tránh được quá trình chuyển đổi tran-

cis của các liên kết đôi dưới bức xạ của tia cực tím, dẫn đến coumarine và các dẫn

xuất của nó là những hợp chất phát huỳnh quang mạnh mẽ, được sử dụng nhiều để

phát triển các sensor huỳnh quang, trong đó có cả các sensor huỳnh quang phát hiện

ion Hg(II) và biothiol [46].

Hình 1.28. Sensor phát hiện Hg(II) có fluorophore là dẫn xuất coumarin và dựa

trên vài trò thúc đẩy phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ dithioacetals của Hg(II) [166]

33

Năm 2018, Xiaohong Cheng và nhóm nghiên cứu đã thiết kế sensor 33 và

34, sử dụng dẫn xuất của coumarin làm fluorophore, phát hiện chọn lọc ion Hg(II)

dựa trên phản ứng đặc trưng của ion Hg(II), phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ

dithioacetals (Hình 1.28). Sensor 33 có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) theo kiểu

bật-tắt huỳnh quang, với bước sóng kích thích 380 nm, bước sóng phát quang 470

nm, trong dung dịch HEPES/DMSO (9:1, v/v), pH=7,4. Sensor 34 phản ứng với ion

Hg(II) làm phổ huỳnh quang chuyển dịch từ bước sóng 440 về 500 nm. Sensor 34

có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) theo kiểu biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang

ở hai bước sóng 500 và 440nm, với giới hạn phát hiện ion Hg(II) là 90 nM trong

dung dịch HEPES/DMSO (9:1, v/v), pH=7,4 [166].

Từ một tính chất đặc trưng khác của ion Hg(II) đó là thúc đẩy phản ứng tách

loại lưu huỳnh và đóng vòng oxadiazole, Kun Huang và nnc đã thiết kế sensor 35 từ

dẫn xuất của coumarin (Hình 1.29). Ở trạng thái ban đầu, sensor 35 có cấu trúc

vòng spirolactam nên không phát huỳnh quang. Ion Hg(II) phản ứng với sensor 35

dẫn đến tách loại lưu huỳnh và đóng vòng oxadiazole, tạo sản phẩm mở vòng

spirolactam và phát huỳnh quang mạnh mẽ. Sensor 35 có thể phát hiện chọn lọc ion

Hg(II) theo kiểu tắt-bật huỳnh quang trong dung dịch CH3CN/H2O (1/1, v/v), với

khoảng pH từ 5 đến 9, thời gian phản ứng 3 phút. Sensor 35 có thể phát sử dụng để

phát hiện Hg(II) trong tế bào HeLa ở nồng độ 9 µM [79].

Hình 1.29. Sensor phát hiện Hg(II) có fluorophore là dẫn xuất coumarin và dựa

trên vài trò thúc đẩy phản ứng tách loại lưu huỳnh và đóng vòng oxadiazole [79]

Banu Babür và nhóm nghiên cứu đã công bố sensor 36 từ dẫn xuất của

coumarin dùng để phát hiện Cys và GSH (Hình 1.30). Ở trạng thái ban đầu, quá

trình ICT từ nhóm cho electron N-methyl pyrrole đến nhóm nhận electron

34

pyrazolone đã dẫn đến sensor 36 không phát huỳnh quang. Phản ứng cộng Michael

của Cys/GSH vào β-carbon (nối đôi C=C) của sensor 36 đã ngăn chặn quá trình

ICT, dẫn đến tạo sản phẩm phát huỳnh quang mạnh mẽ. Sensor 36 có thể phát hiện

Cys và GSH trong dung dịch đệm PBS (10 mM, pH 7,4, chứa 0,05% DMSO). Mặc

dù sensor 36 đã được sử dụng thành công để phát hiện biothiol trong tế bào ung thư

CRL-2638, nhưng khả năng sử dụng sensor 36 để phát hiện định lượng biothiol là

rất khó, vì để đạt được cường độ huỳnh quang cực đại, lượng biothiol sử dụng phải

gấp 500 lần so với lượng phản ứng [7].

Hình 1.30. Sensor phát hiện biothiol từ dẫn xuất coumarin và dựa trên phản ứng

cộng Michael của Cys/GSH vào nối đôi C=C [7]

Yan-Fei Kang và nhóm nghiên cứu đã công bố sensor 37, sử dụng dẫn xuất

của coumarin làm fluorophore. Phản ứng cộng Michael giữa Cys vào acrylate trong

sensor 37 đã tạo nên thioester và giải phóng fluorophore tự do, làm cho cường độ

huỳnh quang gia tăng mạnh mẽ (Hình 1.31).

Hình 1.31. Sensor phát hiện Cys từ dẫn xuất coumarin và dựa trên phản ứng

cộng Michael của Cys vào acrylate hình thành thioester [171]

Trong khi đó, GSH và Hcy làm gia tăng không đáng kể cường độ huỳnh

quang. Sensor 37 có thể phát hiện chọn lọc Cys trong sự hiện diện của các amino

acids khác, kể cả GSH và Hcy, trong dung dịch đệm PBS (pH 7,4, chứa 20%

35

acetonitrile). Giới hạn phát hiện Cys là 60 nM. Sensor 37 có thể phát hiện Cys trong

tế bào HeLa bằng phương pháp ảnh huỳnh quang [171].

Hình 1.32. Sensor phát hiện biothiol từ dẫn xuất coumarin và dựa trên phản ứng

cộng Michael [54]

Các sensor 38-43 cũng sử dụng fluorophore là dẫn xuất của coumarin và dựa

trên phản ứng cộng Michael giữa biothiol vào nối đôi (Hình 1.32). Phản ứng cộng

Michael của biothiol vào các sensor này dẫn đến phá vỡ hệ thống liên hợp electron

π, ngăn chặn quá trình ICT, dẫn đến tạo các sản phẩm cộng với sự gia tăng mạnh

mẽ cường độ huỳnh quang. Kết quả các sensor này có thể phát hiện các biothiol

theo kiểu tắt-bật huỳnh quang [54]. Trong đó, sensor 38 hoạt động trong điều kiện

dung dịch đệm DMSO–HEPES (1/2, v/v; 0,10 M, pH=7,4) [54]. Sensor 39 hoạt

động trong điều kiện dung dịch đệm PBS (pH =7,4, chứa 1% DMF), có thể phát

hiện Cys trong nước tiểu của người ở mức nồng độ 19,2 nM, cũng như phát hiện

Cys trong máu người ở mức nồng độ 302 mg/L [191]. Sensor 40 có thể phát hiện

GSH ở nồng độ 0,5 nM trong đệm pH=7,4, cũng như có thể sử dụng để phát hiện

GSH trong tế bào sống do khả năng xâm nhập tốt vào màng tế bào, phản ứng nhanh

với GSH ở mức nồng độ trong tế bào bình thường của con người [178]. Sensor 41

có thể phát hiện chọn lọc các biothiol trong dung dịch đệm DMSO/HEPES (4/1,

v/v, pH =7,4); có khả năng phát hiện GSH trong tế bào sống bằng phương pháp

hình ảnh huỳnh quang, sử dụng kính hiển vi quét laser đồng tiêu [37]. Sensor 42 có

thể phát hiện GSH trong dung dịch DMF/HEPES (3/1, v/v, pH=7,4) với giới hạn

phát hiện 0,18 mM; nó cũng có thể phát hiện GSH di động trong tế bào sống [139]. Cả

Cys, Hcy và GSH đều phản ứng với sensor 43 và làm gia tăng cường độ huỳnh quang,

36

tuy nhiên, chỉ có Cys là làm gia tăng mạnh mẽ cường độ huỳnh quang (gấp 21 lần so với Hcy

và GSH). Do đó, sensor 43 có thể phát hiện Cys trong sự hiện diện của Hcy và GSH, cùng

các amino acids không chứa thiol khác. Giới hạn xác định Cys bởi sensor 43 là 30 nM [67].

1.7. Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu các sensor

huỳnh quang

1.7.1. Ứng dụng hóa tính toán trong nghiên cứu khoa học

Với sự phát triển ngày càng cao các kỹ thuật hóa học tính toán trong một

thập kỷ qua, hóa học tính toán đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên

cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và tính chất quang phổ của các phân tử hữu cơ, cũng

như giải thích các dữ liệu thực nghiệm phát sinh từ kết quả nghiên cứu. Nhờ đó, các

nghiên cứu lý thuyết về thiết kế mô hình tổng hợp các loại vật liệu, dược liệu ngày

càng phổ biến; nhiều đặc tính vật lý, hóa học của các hệ thống hóa học và sinh học

cũng có thể dự đoán được bằng các kỹ thuật tính toán khác nhau [51].

1.7.2. Ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu cấu trúc và thuộc tính

electron của các chất

Venkatachalam S, Karunathana R, Kannappan V đã công bố những kết quả

thu được khi sử dụng phương pháp phiếm hàm mật độ 3 thông số của Becke

(B3LYP) với bộ hàm cơ sở 6-311++G(d,p) để nghiên cứu cấu trúc phân tử

benzothiazole-một hợp chất đã được sử dụng làm fluorophore cho nhiều sensor

huỳnh quang và các thuộc tính electron của nó. Kết quả cho thấy, các giá trị tính

toán khá tương đồng với các dữ liệu thực nghiệm [150]. Những tính toán này đã

được áp dụng đối với các phức, trong đó có phức của ion Hg(II) và ion Cu(II) với

flurbiprofen và thu được kết quả tốt khi đối chiếu với dữ liệu thực nghiệm, kể cả về

cấu trúc và các thuộc tính electron [133]. Ngoài ra, các phương pháp phân tích

nguyên tử trong phân tử (AIM) và orbital liên kết thích hợp (NBO) đã được sử dụng

kết hợp và cho các kết quả tốt trong nghiên cứu thuộc tính electron và bản chất các

liên kết trong phân tử [21].

Phổ hấp thụ của các chất có thể thu được từ tính toán lượng tử phụ thuộc thời

gian, phương pháp hay được sử dụng là TD-DFT (phiếm hàm mật độ phụ thuộc thời

gian). Phân tử sau khi tối ưu hóa, thực hiện tính TD-DFT, kết quả sẽ cho biết các

37

bước chuyển electron khả dĩ trong phân tử với các cường độ tương ứng. Vikas

Padalkar và nnc đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu huỳnh quang theo

cơ chế ESIPT của 2-(1,3-benzothiazol-2-yl)-5-(N,N-diethylamino) phenol với

benzoxazole và benzimidazole tương tự. Các bước sóng hấp thụ và phát xạ phù hợp

tốt với những bước sóng đã được dự báo khi sử dụng phương pháp TD-B3LYP/6-

31G (d) [149].

Ngoài phổ hấp thụ, thì phương pháp TD-DFT cũng cho phép tính toán phổ

huỳnh quang của các chất. Hình 1.33 trình bày giản đồ tính toán năng lượng hấp thụ

(Evert-abso), năng lượng phát xạ huỳnh quang (Evert-fluo) giữa trạng thái cơ bản (GS) và

trạng thái kích thích (EES). Trong đó: EGS là năng lượng ở trạng thái cơ bản; EEES là

năng lượng ở trạng thái kích thích; EZPVE là năng lượng dao động điểm không; E0-0

là năng lượng kích thích; RGS là cấu hình bền ở trạng thái cơ bản; REES là cấu hình

bền ở trạng thái kích thích.

Hình 1.33. Giản đồ tính toán năng lượng hấp thụ, năng lượng phát xạ huỳnh quang

giữa trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích [15]

Sự khác nhau giữa năng lượng trạng thái EES với trạng thái GS tại vị trí hình

học tối ưu của trạng thái GS là năng lượng hấp thụ (thẳng đứng):

Evert-abso = EEES(RGS) – EGS(RGS) (1.1)

Sự khác nhau giữa năng lượng trạng thái EES với trạng thái GS tại vị trí hình

Dạng hình học

EG

S

RGS REES

GS

EES

Eve

rt-a

bso

Ev

ert-

fluo

E0-

0

EE

ES

EZPVE (REES)

EZPVE (RGS)

Năn

g lư

ợng

38

học tối ưu của trạng thái EES là năng lượng phát xạ huỳnh quang (thẳng đứng):

Evert-fluo = EEES(REES) – EGS(REES) (1.2)

Như vậy, phổ huỳnh quang được tính toán qua các bước sau: (1) Tối ưu hóa

cấu trúc phân tử ở trạng thái cơ bản (GS); (2) Tính TD -DFTcủa trạng thái cơ bản;

(3) Tối ưu hóa cấu trúc phân tử (singlet) ở trạng thái kích thích (EES) S1, S2; (4)

Tính TD -DFT của trạng thái S1, S2.

Từ kết quả, xây dựng giản đồ năng lượng của trạng thái GS và EES (S1 và

S2) và tính toán năng lượng hấp thụ và phát xạ huỳnh quang.

1.7.3. Ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu các phản ứng

Trong quá trình tổng hợp sensor huỳnh quang, các phản ứng hữu cơ có thể

xảy ra theo nhiều hướng, tạo các sản phẩm khác nhau. Tính toán lượng tử trên các

chất thu được các giá trị nhiệt động enthanpy (ΔH), năng lượng tự do Gibbs (ΔG).

Sử dụng lý thuyết nhiệt động học, sẽ tính được các giá trị biến thiên ΔH và ΔG của

phản ứng, từ đó dự đoán được khả năng xảy ra phản ứng và sản phẩm nào chiếm ưu

thế về mặt nhiệt động, từ đó định hướng cho thực nghiệm. Điều này rất có ý nghĩa,

trong việc tối ưu kinh phí về hóa chất, đo đạc và giảm thiểu thời gian nghiên cứu.

Năm 2015, khi nghiên cứu chemosensor DA phát hiện đồng thời ion

Hg(II), ion Cu(II) và ion Ag(I), từ kết quả tính toán theo thuyết phiếm hàm mật

độ, Nguyễn Khoa Hiền và nnc [42] đã xác định được thông số nhiệt động của các

phản ứng hình thành DA có thể có từ dẫn xuất của 4-N,N-dimethylamino

cinnamaldehyde với aminothiourea, qua đó đã đánh giá so sánh độ bền của các sản

phẩm phản ứng bằng lý thuyết nhiệt động học.

Qua phần tổng quan các kết quả nghiên cứu cho thấy: cho đến nay, các dẫn

xuất của cyanine và coumarin đã được sử dụng khá nhiều trong nghiên cứu phát

triển các sensor huỳnh quang, trong đó có các sensor huỳnh quang phát hiện Hg(II),

cũng như biothiol. Bên cạnh đó, các sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol và

ion Hg(II) được công bố đều sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát

hiện còn khá cao, và phản ứng giữa sensor với chất phân tích xảy ra chậm. Ngoài ra,

rất ít sensor huỳnh quang được nghiên cứu theo hướng kết hợp linh hoạt giữa

nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm.

39

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

- Thiết kế sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol và ion Hg(II) dựa trên

fluorophore là dẫn xuất của cyanine: sử dụng phản ứng tạo phức giữa ion Hg(II) với

dẫn xuất cyanine để phát hiện chọn lọc ion Hg(II); phức chất của Hg(II) sau khi

hình thành có thể phản ứng với biothiol và phản ứng này được sử dụng để phát hiện

chọn lọc biothiol.

- Thiết kế sensor huỳnh quang dựa trên fluorophore là dẫn xuất của

coumarin, sử dụng phản ứng đặc trưng của biothiol - phản ứng cộng Michael để

phát hiện chọn lọc biothiol.

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor huỳnh quang

L từ dẫn xuất của cyanine để phát hiện chọn lọc các biothiol và ion Hg(II):

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp và đặc trưng của sensor L.

+ Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L.

+ Nghiên cứu lý thuyết về ứng dụng của sensor L phát hiện ion Hg(II).

+ Nghiên cứu sử dụng phức (tạo bởi ion Hg(II) với sensor L) phát hiện các

biothiol. Trong đó, nghiên cứu lý thuyết được tiến hành trước để định hướng cho

việc nghiên cứu ứng dụng của phức tiếp theo.

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor AMC từ

dẫn xuất của coumarin để phát hiện chọn lọc các biothiol:

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng của

sensor AMC với các biothiol.

+ Nghiên cứu thực nghiệm về tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của

sensor AMC.

+ Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của sensor AMC.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tính toán lý thuyết

40

2.3.1.1. Cơ sở phương pháp hóa học tính toán [1]

Hóa học tính toán là một ngành học mà ở đó sử dụng phương pháp toán học,

máy tính và kết hợp các định luật vật lý để nghiên cứu các vấn đề hóa học.

Với hệ lượng tử, phương trình Schrödinger có dạng:

Ĥ Ψ(x) = E.Ψ(x)

Trong đó, Ĥ=Ĥ(x,t): toán tử Hamilton, Ψ= Ψ(x,t): hàm trạng thái, E: năng

lượng của hệ.

Trong hóa học, năng lượng E là đại lượng quan trọng nhất. Thông qua năng

lượng E, cũng như sự biến thiên của năng lượng theo tọa độ, áp dụng các nguyên lí

của nhiệt động học và động học sẽ xác định được chiều hướng phản ứng, cơ chế

phản ứng, … Tuy nhiên, phương trình (2.1) cho hệ từ hai electron trở lên không thể

giải chính xác về mặt toán học. Để khắc phục trở ngại này, rất nhiều các phương

pháp tính toán gần đúng đã được đề xuất, trong đó sự gần đúng Born-Oppenheimer

là sự gần đúng đầu tiên và “chính xác” trong nhiều sự gần đúng để làm đơn giản

việc giải phương trình Schrödinger.

Phát triển lý thuyết để cải thiện sự gần đúng là nhiệm vụ của hóa học lượng

tử. Việc cải thiện chất lượng của Ψ(x) và E luôn được tiếp tục bằng các phương

pháp tính toán hoàn thiện hơn để đạt được những trị số có độ chính xác cao hơn.

Các phương pháp tính toán dựa trên nhiều mô hình lý thuyết khác nhau, thường

được gọi là mô hình hóa học. Các mô hình hóa học được đặc trưng bởi phương

pháp lý thuyết và hệ hàm cơ sở. Các phần mềm tính toán thường chứa một hệ thống

từ thấp đến cao các thủ tục tính toán, bộ hàm cơ sở, cùng với các phương pháp hóa

học lượng tử khác nhau, còn được gọi là mức lý thuyết. Một số phương pháp gần

đúng thường được áp dụng như: phương pháp Hartree-Fock (HF), phương pháp

Roothaan, phương pháp nhiễu loạn Moller-Plesset (MPn), phương pháp tương tác

cấu hình, phương pháp chùm tương tác và phương pháp lý thuyết hàm mật độ,…

Trên cơ sở các phương pháp gần đúng, hai phương pháp phổ biến trong hóa

học tính toán bao gồm phương pháp orbital phân tử (MO) và phương pháp phiếm

hàm mật độ (DFT). Phương pháp MO dựa trên cơ sở mô tả electron trong các hàm

sóng orbital, trong khi phương pháp DFT dựa trên cơ sở mật độ electron.

(2.1)

41

Phương pháp MO bán kinh nghiệm (semi-empirical methods) dựa trên quan

điểm thuần kinh nghiệm của Hückel, nhưng nhiều thông số thực nghiệm đã được

thay thế bằng tính toán. Phương pháp này chỉ dừng lại cho một số khá giới hạn các

đại lượng và tính chất hóa học, độ chính xác không cao, nhưng vì tính đơn giản nên

có thể áp dụng cho hệ chứa nhiều phân tử và khi máy tính không đủ mạnh.

Khác với phương pháp bán kinh nghiệm, phương pháp tính từ đầu (ab initio

method) không sử dụng các thông số thực nghiệm, thay vào đó, các tính toán chủ

yếu dựa vào các định luật cơ học lượng tử và một số hằng số vật lý như vận tốc ánh

sáng, khối lượng, điện tích của electron và hạt nhân, hằng số Planck,... Nhờ sự phát

triển vượt bậc của ngành công nghệ máy tính, các phương pháp tính lượng tử phức

tạp hơn ngày càng được triển khai và đạt độ chính xác ngày càng cao. Tuy nhiên,

trên thực tế, sức tính của máy tính vẫn còn là trở ngại trong việc áp dụng cho các

phân tử lớn (>100 nguyên tử).

Trước những thực thế khó khăn của phương pháp hàm sóng, phương pháp

DFT đã phát triển nhanh chóng và được áp dụng rộng rãi. Phương pháp DFT dựa

trên mật độ electron thay vì hàm sóng Ψ(r) để tính năng lượng E

của hệ. Các phép tính DFT được thực hiện nhanh hơn nhiều (>102 -105 lần) so với

phương pháp MO cho cùng một hệ phân tử. Tuy vậy, độ chính xác về năng lượng

cũng không thua kém và cũng có đủ tính chất các loại phổ khác nhau. Nhờ tính

nhanh, nên DFT được áp dụng ngày càng rộng rãi và chủ yếu cho các phân tử có số

lượng nguyên tử lớn (phương pháp MO không thể thực hiện được).

2.3.1.2. Bộ hàm cơ cở [22], [30], [41], [151], [156]

Bộ hàm cơ sở là hàm toán học biễu diễn các orbital phân tử (MO). Một bộ

hàm cơ sở có thể xem là giới hạn không gian có mặt của electron trong phân tử. Bộ

hàm cơ sở càng lớn thì electron càng ít bị giới hạn về không gian, bởi vậy nó càng

mô tả chính xác hành trạng của electron. Việc chọn bộ hàm cơ sở cho hệ nghiên cứu

nhằm tìm lời giải gần đúng tốt nhất cho phương trình Schrödinger ngoài việc cải

thiện phương pháp tính toán.

Bộ hàm cơ sơ mô tả MO được biễu diễn dưới dạng tổ hợp tuyến tính của một

tập hợp các hàm đơn electron, gọi là các hàm cơ sở (basis functions). Các hàm cơ sở

42

thường đặt trên các nhân nguyên tử và có những nét tương tự về toán học như các

orbital nguyên tử (AO) nhưng mang tính tổng quát hơn. Nếu bộ hàm cơ sở gồm n

hàm cơ sở Ψ1, Ψ2, Ψ3,… Ψn thì một MO Ψi có dạng:

Ψ1 = c1iΨ1 +c2iΨ2 +…. + cniΨn

Trong đó, cμi: hệ số khai triển obitan phân tử ( = 1, 2, 3, …. N)

Ψμi: các hàm cơ sở chuẩn hóa

Biểu thức (2.2) được gọi là biểu thức tổ hợp tuyến tính các orbital nguyên tử

(LCAO). Các hàm này được xây dựng dựa trên các hàm sóng s, p, d,… đã được giải

đúng trong trường hợp nguyên tử hiđro và những hệ tương tự hiđro. Với những hệ

có nhiều hơn một electron thì áp dụng thêm các cách tính gần đúng. Có 2 loại bộ

hàm cơ sở thường gặp là bộ hàm kiểu Slater - STO (Slater type orbital) và kiểu

Gaussian - GTO (Gaussian type orbital). Một số bộ hàm cơ sở thường được sử dụng

trong tính toán như: bộ hàm cơ sở tối thiểu (minimal basis set); bộ hàm cơ sở hóa trị

tách (split valence basis set); bộ hàm cơ sở double zeta (double zeta basis set); bộ

hàm cơ sở phân cực (polarized basis set); bộ hàm cơ sở khuếch tán (diffusion basis

set); bộ hàm cơ sở tương quan electron của Dunning (Dunning’s correlation

consistent basis set); hệ hàm cơ sở cho các nguyên tử có hạt nhân lớn.

Đối với những nguyên tử có hạt nhân lớn (những nguyên tử ở chu kỳ IV trở

lên) thì các electron gần hạt nhân được xét một cách gần đúng qua các thế lõi hiệu

dụng (ECP). Trong trường hợp này, bộ hàm cơ sở LanL2DZ (cho các nguyên tố H,

Li – Ba, La – Bi), LanL2MB (cho các nguyên tố H - Ba, La - Bi) thường được sử

dụng. Trong đó, bộ hàm cơ sở LanL (Los Alamos National Laboratory) hay còn gọi

là LanL2DZ (LanL Lanl-2-double zeta) được phát triển bởi Hay và Wadt, đã được

sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, đặc biệt đối với các hợp chất có chứa nguyên tử

có hạt nhân lớn.

2.3.1.3. Phương pháp phiếm hàm mật độ [9], [32], [81], [115], [160]

Lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT) được đề xuất vào những năm 1964-1965

bởi công trình của Kohn, Sham, Hohenberg và các nhà khoa học khác. Phương pháp

này đựa trên giả thuyết “Mật độ electron có thể đặc trưng cho toàn bộ tính chất

lượng tử của hệ”. Như vậy thay vì giải phương trình Schrodinger để tìm tất cả các

(2.2)

43

hàm sóng Ψ(r) của electron với 3N biến không gian (vì N electron có 3N biến tọa

độ không gian), chỉ cần tìm hàm mật độ electron của hệ với 3 biến

không gian. Từ hàm mật độ tìm được có thể suy ra mọi tính chất lượng tử của hệ.

a. Lý thuyết Hohenburg-Kohn (HK)

Năm 1964, Hohenburg và Kohn đã chứng minh hai định lý:

Định lý 1: Mật độ electron xác định thế ngoài với một hằng số cộng không

đáng kể hay năng lượng là phiếm hàm của mật độ.

Định lý 2: Đối với một mật độ thử có trị dương bất kỳ, và có

thì:

Trong đó, là năng lượng của hệ ứng với mật độ thử , Eo năng

lượng ở trạng thái cơ bản.

Định lý Honhenburg-Kohn cho thấy mật độ electron )(ri tại điểm (r) trong

không gian là đủ để đặc trưng cho trạng thái năng lượng thấp nhất (năng lượng

trạng thái cơ bản) của hệ. Định lý này rất quan trọng vì nó chỉ ra rằng chúng ta

không cần giải quyết tất cả các hàm sóng của tất cả các electron, do đó nó đã giảm

lượng tính toán từ 3N chiều không gian của N electron xuống còn 3 chiều của mật

độ electron cho cả hệ. Mặt khác, định lí 1 cho thấy, mật độ electron xác định duy

nhất 1 toán tử Hamilton. Điều này đúng khi toán tử Hamilton, xác định bởi thế

ngoài và tổng số electron, bằng tích phân mật độ electron trên toàn không gian. Về

nguyên tắc, khi biết mật độ electron sẽ xác định được duy nhất một toán tử

Hamilton và do đó sẽ tính được hàm sóng Ψ ở tất cả các trạng thái và xác định được

tính chất của hệ. Định lý này có thể phát biểu một cách tổng quát là: năng lượng là

phiếm hàm của mật độ.

Vì năng lượng là phiếm hàm của mật độ electron nên các thành

phần động năng (T), tương tác hút electron - hạt nhân (Ven), tương tác đẩy electron -

electron (Vee) cũng được xác định một cách tương tự, khi đó, năng lượng của hệ

được tính bởi công thức:

Do và là những phiếm hàm của mật độ, nên khó đạt được

sự gần đúng tốt, vì thế cần có phương pháp kế cận để giải quyết những tồn tại này.

(2.3)

(2.4) (2.4)

44

b. Lý thuyết Kohn-Sham (KS)

Để giải quyết những tồn tại của lý thuyết Hohenberg-Kohn, Kohn-Sham giả

định đưa các orbital (không tương tác) vào bài toán DFT theo cách mà động năng

có thể được tính đơn giản, chính xác, một phần hiệu chỉnh nhỏ được xử lý bổ sung

sau. Ý tưởng cơ bản của Kohn-Sham là có thể thay bài toán nhiều electron bằng một

tập hợp tương đương chính xác các phương trình tự hợp 1 electron. Ưu điểm của

phương pháp KS là bao hàm đầy đủ hiệu ứng trao đổi - tương quan của electron.

Khi đó, năng lượng ở trạng thái cơ bản của hệ có N electron đã được ghép đôi theo

KS được xác định bởi công thức sau:

Áp dụng nguyên lý biến phân cho năng lượng electron toàn phần thu được

các phương trình Kohn – Sham có dạng:

hay viết theo cách khác:

với là thế năng hiệu dụng:

Trong các biểu thức trên:

là hàm không gian 1 electron, còn gọi là orbital Kohn - Sham; là

mật độ electron trạng thái cơ bản tại vị trí ; là năng lượng obitan Kohn – Sham.

Số hạng thứ nhất biểu thị toán tử động năng của các electron; Số hạng thứ

hai biểu thị toán tử năng lượng hút hạt nhân - electron, tổng này được lấy qua tất cả

các hạt nhân theo chỉ số I, từ 1 đến M, nguyên tử số là ZI; Số hạng thứ ba biểu thị

toán tử năng lượng tương tác Coulomb giữa hai mật độ electron toàn phần

, , tại , tương ứng.

(2.5)

(2.6)

(2.8)

(2.7)

45

là năng lượng trao đổi - tương quan của hệ. Năng lượng này là một

phiếm hàm của mật độ electron.

là thế trao đổi - tương quan, là đạo hàm của phiếm hàm năng lượng trao

đổi tương quan:

Như vậy, nếu biết được thì thu được (theo 2.9), khi đó sẽ tìm được

(theo 2.8), và giải được phương trình Kohn - Sham (theo 2.6 hoặc 2.7) thu

được các orbital Kohn - Sham và cho phép tính mật độ electron theo biểu thức:

Từ mật độ electron mới thu được tiếp tục tính , …, cứ như thế cho

đến khi mật độ mới hội tụ với mật độ tại bước trước thì quá trình lặp được kết thúc.

Đây được gọi là phương pháp trường tự hợp (SCF).

Như vậy, vấn đề chính của phương pháp DFT là xây dựng các phiếm hàm

trao đổi - tương quang . Các mô hình gần đúng phổ biến hiện nay như: sự

gần đúng mật độ electron cục bộ (local density approximation, LDA), mật độ spin

cục bộ (local spin density approximation, LSDA), gradient tổng quát (generalized

gradient approximation, GGA), hoặc là phương pháp hỗn hợp - phương pháp tính

bổ sung năng lượng trao đổi Hartree-Fock (HF) vào phiếm hàm năng lượng trao đổi

- tương quan DFT thuần khiết.

Trong các phương pháp hỗn hợp, phương pháp B3LYP là phương pháp chứa

phiếm hàm hỗn hợp B3 (phiếm hàm ba thông số của Becke) và sử dụng phiếm hàm

tương quan được đề xuất bởi Lee, Yang và Parr (LYP). Hiện nay, phương pháp hỗn

hợp B3LYP là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho các

phép tính phân tử vì cho kết quả tính toán khá chính xác trên một phạm vi rộng các

hợp chất, đặc biệt là đối với các phân tử hữu cơ. Phương pháp B3LYP trong phần

mềm Gaussian 03 đã được sử dụng và thu được kết quả tốt trong nghiên cứu cấu

trúc và thuộc tính electron của các chất hữu cơ, trong đó có các sensor huỳnh quang

và phức chất của chúng.

(2.9)

(2.10)

46

2.3.1.4. Phương pháp phiếm hàm mật độ phụ thuộc thời gian [16]

Phương pháp DFT giải quyết bài toán lượng tử ở trạng thái dừng, tại đó trạng

thái của hệ lượng tử không phụ thuộc vào thời gian, hàm mật độ chỉ phụ thuộc vào

các biến không gian ρ(x,y,z, t) hay ρ(r,t). Phương pháp phiếm hàm mật độ phụ thuộc

thời gian (TD-DFT) là mở rộng của phương pháp DFT để giải quyết các bài toán

mà tại đó trạng thái lượng tử của hệ phụ thuộc vào biến thời gian, khi đó hàm mật

độ phụ thuộc vào cả biến không gian và thời gian ρ(r,t).

Về mặt lý thuyết các hệ lượng tử phụ thuộc thời gian có thể giải xấp xỉ bằng

cách đi tìm hàm sóng Ψ(r) từ phương trình Schrodinger. Tuy nhiên, do ưu thế vượt

trội của phương pháp DFT, nên trong các nghiên cứu, phương pháp TD-DFT được

ứng dụng phổ biến để khảo sát hệ ở trạng thái kích thích cũng như các trạng thái

lượng tử phụ thuộc thời gian.

2.3.1.5. Phương pháp nguyên tử trong phân tử (AIM) [77]

Phương pháp AIM là lý thuyết lượng tử về nguyên tử trong phân tử. Phân tử

được hình dung là tập hợp của các nguyên tử được gắn kết thông qua tương tác hút

của các hạt nhân nguyên tử mang điện dương với các electron liên kết phân bố xung

quanh. Ý tưởng cơ bản của AIM là dựa hàm mật độ ρ(r) để suy ra các đặc tính hóa

học của phân tử như độ bền liên kết, loại liên kết, liên kết vòng,… một cách đơn

giản và thuyết phục.

Cụ thể, mật độ electron ρ(r) dùng để xác định độ bền liên kết. Nhìn chung,

giá trị ρ(r) càng lớn thì liên kết càng bền và ngược lại. Giá trị Laplacian của mật ðộ

electron (2ρ(r)) thể hiện loại liên kết. Liên kết là cộng hóa trị nếu 2ρ(r)< 0, và

nếu 2ρ(r)> 0 thì có thể là liên kết ion, liên kết hiđro hoặc tương tác Van Der

Waals. Đại lượng2ρ(r) là tổng các trị riêng của ma trận Hessian mật độ electron

(2ρ(r) = 1 + 2 + 3). Tất cả các trị riêng 1, 2 và 3 đều khác 0 và dấu của chúng

được dùng để định nghĩa kiểu của điểm tới hạn. Khi một trong ba trị riêng dương và

hai trị riêng khác âm, điểm đó được gọi là điểm tới hạn liên kết (BCP), ký hiệu (3,-

1). Khi một trong ba trị riêng âm và hai trị riêng khác dương, điểm đó được gọi là

điểm tới hạn vòng (RCP), ký hiệu (3,+1), minh chứng có tồn tại cấu trúc vòng.

47

2.3.1.6. Phương pháp obitan liên kết thích hợp (NBO) [87], [157]

a. Obitan phân tử khu trú (LMO)

Theo góc nhìn cổ điển, những liên kết trong phân tử do xác suất tìm thấy

electron gia tăng giữa những hạt nhân tham gia liên kết, chính là đóng góp của

những AO nguyên chất. Những MO chính tắc không phản ánh khái niệm của nhóm

chức và cũng không cho phép nhận ra dễ dàng thuộc tính của liên kết trong hệ. Điều

này đòi hỏi phải có giới hạn cho những MO chính tắc.

LMO là những obitan bị giới hạn về mặt không gian với một thể tích tương

đối nhỏ, thể hiện rõ nguyên tử nào hình thành liên kết và những LMO nào có thuộc

tính gần như nhau trong cùng một đơn vị cấu trúc trong những phân tử khác nhau.

b. Obitan liên kết thích hợp (NBO)

Khái niệm orbital thích hợp được sử dụng cho việc phân bố electron trong

AO và MO, do đó điện tích nguyên tử và liên kết phân tử được xác định. Ý tưởng

về phân tích dựa trên các AO thích hợp (NAO) và NBO được Weilhold và nnc đưa

ra nhằm sử dụng ma trận mật độ 1 electron để định nghĩa hình dạng của orbital

trong môi trường phân tử và liên kết trong phân tử từ mật độ electron giữa các

nguyên tử.

Các NBO là một trong chuỗi các orbital khu trú thích hợp bao gồm: AO →

NAO → NHO → NBO → LMO → MO. Trong đó, NHO là orbital lai hóa thích

hợp. Các NBO tối ưu có thể nhận được khi tìm kiếm những orbital riêng chiếm cao

nhất trong mỗi vùng liên kết giữa hai nguyên tử A và B, ký hiệu θiA-B, với số chiếm

ni(AB). Những NBO “kiểu Lewis”, ký hiệu ΩAB, có số chiếm cao nhất (ni

(AB)=2) tương

ứng với những cặp electron khu trú của giản đồ cấu trúc Lewis, hay còn gọi là các

NBO donor (donor of natural bond orbital), ký hiệu NBO(i). Các NBO “không

Lewis”, có số chiếm thấp nhất (nj(AB)=0) (orbital trống), hay còn gọi là các NBO

acceptor (acceptor of natural bond orbital), ký hiệu NBO(j).

Năng lượng ổn định cho tương tác donor→acceptor (NBO(i)→NBO(j)) được

ước tính bởi lý thuyết nhiễu loạn bậc 2 theo công thức sau:

E(2) = -ni x (Fi,j)2/(εj – εi ) (2.11)

48

Trong đó, ni là số chiếm (orbital occupancy) trên NBO(i), εi và εj tương ứng

là năng lượng orbital của NBO(i) và NBO(j), Fi,j là phần tử ma trận Fock NBO không

chéo hóa (off-diagonal NBO Fock matrix element).

Bộ NBO “kiểu Lewis” gồm: orbital một lõi - một tâm (ký hiệu CR), cặp

electron riêng (ký hiệu LP) và orbital liên kết hai tâm (ký hiệu BD). Bộ NBO

“không Lewis” gồm: orbital không liên kết - không bị chiếm (ký hiệu LP*), orbital

vỏ hóa trị thêm vào (ký hiệu RY*) và orbital phản liên kết (ký hiệu BD*).

Phân tích NBO rất hữu ích trong việc nghiên cứu sự thay đổi và bản chất hóa

học, nhất là tính chất electron trong các hợp chất.

2.3.1.7. Các phương pháp phân tích quang học

a. Phương pháp trắc quang

Phương pháp trắc quang là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu

ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ

được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với

bước sóng khoảng từ 200 nm đến 800 nm.

Cơ sở của phương pháp trắc quang là dựa vào định luật Bouger - Lam

bert - Beer:

A = - lgT = lg (Io/It) = εlC với T = It/Io

Trong đó:

I0: cường độ ánh sáng ban đầu, It: cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung

dịch, C: nồng độ dung dịch, đo bằng mol/L, l: bề dày của cuvet đựng dung dịch, đo

bằng cm, ε: được gọi là hệ số hấp thụ phân tử.

Các đại lượng hay sử dụng biểu thức (2.12) chính là cơ sở cho phương pháp

phân tích định lượng. Tuy nhiên, quan hệ giữa cường độ ánh sáng và nồng độ của

dung dịch thông qua hàm logarit, để thuận tiện cho sử dụng, chúng ta thường sử

dụng các đại lượng sau: Độ truyền quang T là tỉ lệ giữa cường độ chùm sáng đơn

sắc sau khi đi qua dung dịch It với cường độ chùm sáng đơn sắc chiếu vào I0, lúc đó

T = It/I0 = 10-εlC (2.13). Nếu l = 1 cm thì T gọi là hệ số truyền quang. Trên các máy

phân tích, T thường được biểu diễn bằng %, thang đo T từ 0 ÷ 100; Mật độ quang

(2.12)

49

D (Dentisity) hay độ hấp thụ A (Absorption) hay độ tắt E (Extinction) được định

nghĩa theo biểu thức sau: D = A = E = - lg T = lg(I0 /It) = ε.l.C

Với các dung dịch chứa chất hấp thụ xác định, đựng trong các cuvet có kích

thước như nhau thì ε và l là không đổi, khi này có thể biểu diễn: D = A = K.C

(2.15). Hay nói cách khác, sự phụ thuộc giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là

tuyến tính, đó chính là cơ sở của phương pháp phân tích định lượng trắc quang phân

tử. Như vậy, nguyên tắc chung của phương pháp đo quang để xác định một chất X

nào đó, ta chuyển nó thành một chất có khả năng hấp thụ ánh sáng. b. Phương pháp phổ huỳnh quang [55], [146]

Phương pháp phát quang dựa trên phép đo cường độ bức xạ do chất phân tích

phát ra dưới tác dụng của năng lượng bức xạ điện từ chiếu vào nó. Cơ sở của

phương pháp này là dựa vào định luật huỳnh quang định lượng: trong khoảng nồng

độ C đủ bé (ɛlC≤ 0,01), cường độ bức xạ huỳnh quang tỷ lệ thuận với nồng độ chất

phân tích (C), hệ số hấp thụ phân tử mol (ɛ) và cường độ ánh sáng tới I0 theo biểu

thức: iF = 2,303. K.I0.ɛ.l.C (2.16).

Khi hấp thụ bức xạ (với năng lượng đủ lớn), electron chuyển đổi từ trạng thái

cơ bản lên trạng thái kích thích, ứng với mức năng lượng cao hơn. Đó là quá trình

chuyển electron từ các MO bị chiếm ở trạng thái cơ bản lên các MO không bị chiếm

và sau đó, phân tử ở trạng thái kích thích.

(2.14)

Hình 2.1. Các quá trình giải phóng năng lượng kích thích

50

Sau khi hấp thụ năng lượng bức xạ và ở trạng thái kích thích, trong một

khoảng thời gian ngắn, từ 10-8 giây đến 10-3 giây, phân tử sẽ giải phóng năng lượng

kích thích và trở về lại trạng thái cơ bản dưới nhiều con đường khác nhau (Hình 2.1)

như: huỳnh quang; chuyển đổi nội bộ hay dao động phục hồi (internal conversion,

IC), đó là chuyển trực tiếp về trạng thái cơ bản nhưng không kèm phát huỳnh

quang; chuyển ngang (intersystem crossing, ISC), kèm theo sau đó là quá trình lân

quang (phosphorescence) hoặc huỳnh quang trì hoãn (delayed fluorescence);

chuyển điện tích nội phân tử (intramolecular charge transfer); chuyển đổi cấu hình

(conformational change); hoặc là các quá trình xảy ra từ tương tác giữa trạng thái

kích thích với các phân tử khác như chuyển dịch electron, chuyển dịch proton,

chuyển dịch năng lượng, hình thành các dạng eximer, exciplex... Những con đường

giải phóng năng lượng kích thích khác có thể cạnh tranh với quá trình phát huỳnh

quang khi chúng xảy ra cùng thời điểm và có cùng thời gian sống (lifetime) của

trạng thái kích thích. Một số quá trình trên cũng có thể dẫn đến hình thành một số dạng

trung gian có thể phát huỳnh quang và ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang của chất ban đầu.

Hình 2.2 trình bày các quá trình chuyển đổi giữa các trạng thái electron có

thể có, bao gồm: hấp thụ photon, chuyển đổi nội (dao động phục hồi), huỳnh quang,

chuyển ngang, lân quang và huỳnh quang trì hoãn. Các trạng thái singlet được ký

hiệu là S0 (trạng thái cơ bản), S1, S2... (cho các trạng thái kích thích). Các trạng thái

kích thích triplet được ký hiệu là T1, T2...

Hình 2.2. Quá trình chuyển đổi bức xạ và không bức xạ giữa các trạng thái electron

51

Khi phân tử bị kích thích có thể hấp thụ năng lượng của các dải bức xạ ở các

bước sóng khác nhau như λ1, λ2..., tương ứng với các bước chuyển S0→S1 và

S0→S2, sau đó xảy ra các quá trình phục hồi dao động về trạng thái S1, rồi phát

huỳnh quang bức xạ ở bước sóng λ3 để trở về trạng thái cơ bản S0. Như vậy, phổ

huỳnh quang không phụ thuộc vào bước sóng kích thích, hay nói chính xác hơn chỉ

phụ thuộc vào sự khác biệt năng lượng giữa trạng thái cơ bản S0 và trạng thái kích

thích S1. Thông thường, phổ huỳnh quang chuyển về vùng bước sóng dài hơn so với

phổ hấp thụ do mất mát năng lượng.

Bên cạnh đó cũng có các quá trình khác cạnh tranh với quá trình phát huỳnh

quang, bao gồm: quá trình phục hồi dao động từ S1→S0 mà không phát xạ huỳnh

quang; hay quá trình chuyển ngang giữa trạng thái S1→T1, rồi sau đó phát lân quang

ở bước sóng λ4 để trở về trạng thái cơ bản S0.

Quá trình dao động phục hồi là quá trình chuyển đổi không phát xạ giữa hai

trạng thái electron cùng độ bội spin, hướng đến mức dao động nhỏ nhất, trong đó

năng lượng dư thừa thường được chuyển giao từ phân tử kích thích sang dung môi

xung quanh thông qua quá trình va chạm.

Quá trình chuyển ngang là quá trình chuyển đổi không phát xạ huỳnh quang

giữa hai trạng thái electron có độ bội spin khác nhau, ví dụ từ trạng thái S1→T1.

Quá trình này đủ nhanh (10-10 giây đến 10-8 giây) để cạnh tranh với các quá trình

khác như huỳnh quang và quá trình phục hồi dao động.

Quá trình chuyển đổi từ trạng thái T1 về trạng thái S0 (về nguyên tắc quá

cũng bị cấm do khác biệt độ bội spin, nhưng cũng có thể xảy ra thông qua ghép nối

spin-orbit) và giải phóng năng lượng kích có thể không kèm theo bức xạ (chuyển

ngang sau đó là quá trình phục hồi dao động), hoặc kèm theo bức xạ (gọi là

lân quang).

Thời gian phân tử hấp thụ bức xạ diễn ra nhanh, khoảng 10-15 giây. Quá trình

dao động phục hồi diễn ra trong khoảng 10-11 giây đến 10-9 giây. Quá trình chuyển

ngang diễn ra trong khoảng từ 10-10 giây đến 10-8 giây. Trong khi đó, thời gian sống

của trạng thái kích thích S1 khoảng từ 10-10 giây đến 10-7 giây, còn của trạng thái T1

lâu hơn nữa, từ 10-6 giây đến vài giây.

52

2.3.1.8. Các phần mềm tính toán và phương pháp áp dụng

a. Phần mềm tính toán sử dụng

Tối ưu hóa hình học và tính năng lượng điểm đơn của các phân tử được thực

hiện bởi phần mềm Gaussian 03 [32]. Phân tích NBO được thực hiện bởi chương

trình NBO 3.1 tích hợp trong Gaussian 03 [32]. Phân tích AIM được thực hiện bởi

phần mềm AIM2000 [31]. Tất cả các tính toán lý thuyết được thực hiện trên một hệ

điều hành siêu máy tính với bộ vi xử lý 32 cores và bộ nhớ 72-gigabyte tại Phòng

thí nghiệm Hóa học tính toán và Mô phỏng, Trường Đại học Quy Nhơn, Việt Nam.

b. Phương pháp tính toán áp dụng

Việc xác định cấu trúc hình học bền, năng lượng điểm đơn của các monome

và các phức được thực hiện bởi phương pháp phiếm hàm mật độ ba thông số

B3LYP với bộ hàm cơ sở LanL2DZ [9], [41], [81], [137], [152]. Tính tần số dao

động điều hòa ở cùng mức lý thuyết cũng được tiến hành sau tối ưu hình học để

đảm bảo rằng tất cả các cấu trúc tối ưu là cực tiểu năng lượng trên bề mặt thế năng

và để ước tính năng lượng điểm không (ZPE). Các thông số năng lượng tương tác

được hiệu chỉnh ZPE gồm biến thiên entanpi và biến thiên năng lượng tự do Gibbs

của các phản ứng được tính toán dựa trên sự khác biệt giữa tổng năng lượng của các

sản phẩm và tổng năng lượng các chất tham gia [32].

Các tính toán ở trạng thái kích thích và các yếu tố phụ thuộc thời gian được

thực hiện bởi phương pháp TD-DFT ở cùng mức lý thuyết với tối ưu hình học [14].

Các phân tích AIM và NBO được tiến hành ở cùng mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

[21], [31], [69], [77], [87], [157]. Độ tin cậy của mức lý thuyết áp dụng được kiểm

chứng trên hệ nghiên cứu thông qua so sánh với các dữ liệu thực nghiệm thu được

trong quá trình nghiên cứu.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.3.2.1. Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng trong luận án được trình bày ở Bảng 2.1. Tất cả

các hóa chất được sử dụng đều là hóa chất tinh khiết phân tích. Tất cả các dung môi

sử dụng là dung môi tinh khiết dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao và không chứa

các chất huỳnh quang.

53

Bảng 2.1. Các hóa chất chính sử dụng trong luận án

Hóa chất Nguồn sử dụng

2-Methylbenzothiazole (C8H7NS):

Aldrich

4-diethylamino-2-hydroxybenzaldehyde:

(C11H15NO2)

Aldrich

Axit bromoacetic: BrCH2COOH (C2H3BrO2) Aldrich

4-metyl-7-hydroxylcouramin (C8H10O3):

Aldrich

Acryloyl clorua (C3H2OCl): CH2=CHCOCl Aldrich

Các muối perchlorate hoặc chloride các ion kim loại: Zn(II),

Co(III), Cu(II), Cd(II), Pb(II), Fe(II), Ca(II), Na(I), K(I),

Hg(II), K(I), Na(I).

Các amino axit: Cys, GSH, Hcy, Alanine, Aspartic,

Arginine, Glycine, Glutamic, Isoleucine, Leucine, Lysine,

Methionine, Threonine, Serine, Tyrosine,

Tyrosine,Tryptophan, Valine, Histidine.

Aldrich

MgSO4, NaOH Merck

Dung môi hữu cơ: ethanol, ethylether, triethylamin, 4-

dimethylaminopyridin, 1,2-dicloetan

Merck

2.3.2.2. Xác định đặc trưng cấu trúc của sensor

Đặc trưng cấu trúc của các chất được khẳng định bởi kết quả phân tích các

phổ, bao gồm: phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, phổ MS. Phổ 1H-NMR và phổ 13C-

NMR được thực hiện trên thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân tần số 400 MHz Bruker-

400. Phổ MS được thực hiện trên thiết bị Waters GCT Premier.

Tất cả các thí nghiệm xác định đặc trưng của các chất đã được tiến hành tại

Phòng thí nghiệm của GS.TS. Jong Seung Kim, Khoa Hóa học Trường Đại học

Korea, Hàn Quốc.

54

2.3.2.3. Xác định đặc tính, ứng dụng của sensor

a. Phương pháp quang phổ huỳnh quang

Các phép đo quang phổ huỳnh quang được tiến hành trên thiết bị Shimadzu

RF-5301 PC series fluorescence spectrometer, tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc -

Mỹ phẩm - Thực phẩm Thừa Thiên Huế. Các dung dịch đo sau khi được chuẩn bị

theo các điều kiện thí nghiệm khác nhau được cho vào cuvet thạch anh có chiều dài

quang học 1 cm để tiến hành đo ở nhiệt độ phòng, 25 oC.

Các thí nghiệm về sensor L được tiến hành ở bước sóng kích thích 540 nm,

bước sóng phát huỳnh quang 585 nm, độ rộng khe kích thích 5 nm, khe phát xạ 5

nm (Slit Width EX 5 nm, EM 5 nm).

Các thí nghiệm về sensor AMC được tiến hành ở bước sóng kích thích 320

nm, bước sóng phát huỳnh quang 450 nm, độ rộng khe kích thích 5 nm, khe phát xạ

5 nm (Slit Width EX 5 nm, EM 5 nm).

* Xác định hiệu suất lượng tử huỳnh quang

Hiệu suất lượng tử huỳnh quang của chất nghiên cứu được xác định bằng

phương pháp so sánh với chất huỳnh quang chuẩn theo phương trình sau [129]:

Trong đó: ΦX và ΦSD tương ứng là hiệu suất lượng tử huỳnh quang của chất

nghiên cứu và chất chuẩn; nX và nSD tương ứng là chỉ số khúc xạ trong dung môi của

chất nghiên cứu và chất chuẩn; bX và bSD tương ứng là hệ số góc của phương trình

quan hệ tuyến tính (Y= a + bX) giữa cường độ huỳnh quang tích phân Y (diện tích)

với mật độ quang X của chất nghiên cứu và chất chuẩn.

b. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Các phép đo quang phổ hấp thụ phân tử được tiến hành trên thiết bị

Shimadzu UV-1800 UV-vis spectrophotometer, tại Viện Nghiên cứu Khoa học

Miền Trung - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các dung dịch đo sau khi được chuẩn bị theo các điều kiện thí nghiệm khác

nhau được cho vào cuvet thuỷ tinh có chiều dài quang học 1 cm để tiến hành đo ở

nhiệt độ phòng, 25 oC. Dung dịch so sánh là nước cất.

(2.17)

55

c. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng [105]

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp

phân tích (trắc quang và huỳnh quang) được xác định dựa trên đường chuẩn ở dãy

nồng độ bé (dãy nồng độ gần với LOD, LOQ). LOD và LOQ được xác định dựa

vào công thức sau:

LOD = 3 SD/a (2.18)

LOQ = 10 SD/a (2.19)

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn, được xác định từ đường chuẩn ở dãy

nồng độ bé; SD là độ lệch chuẩn của giá trị b (intercept), hệ số chặn của đường

chuẩn, cũng được xác định từ đường chuẩn ở dãy nồng độ bé, được làm nhiều lần

để tính SD của giá trị b.

2.3.2.4. Quy trình thực nghiệm tổng hợp các sensor

Quy trình thực nghiệm tổng hợp các sensor đã được nghiên cứu dựa trên kết

quả dự đoán từ tính toán lý thuyết và kết quả thực nghiệm công bố trước đây về các

phản ứng tương tự [2], [3], [29]. Các điều kiện để tổng hợp sensor như dung môi,

nhiệt độ, thời gian phản ứng... đã được khảo sát lại và chọn lựa để tiến hành phản

ứng một cách dễ dàng, thuận tiện và cho hiệu suất tương đối lớn. Trong nghiên cứu

này, do không chú trọng đến hiệu suất phản ứng, nên các điều kiện đã lựa chọn

chưa hoàn toàn là điều kiện tối ưu.

a. Quy trình thực nghiệm tổng hợp sensor L

Sơ đồ tổng hợp sensor L được minh họa ở Hình 2.3. Theo đó, quá trình tổng

hợp sensor L gồm 2 giai đoạn: giai đoạn I tổng hợp CBZT, giai đoạn II tổng hợp

sensor L.

N

S

N

S

-O2C

BrCH2COOH

N

S

-O2C

N

HO

OHC N

HO

LCBZTBZT

++

* Tổng hợp CBZT

2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) và acid bromoacetic (4,18 g, 0,03

Ethanol, 8h, ở 80 oC Ethanol, 10h, ở 80

oC,

xt: piperidine

Hình 2.3. Sơ đồ các phản ứng tổng hợp L

56

mol) được hòa tan trong 50 mL ethanol tuyệt đối. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi

lưu trong 8 giờ. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng và thu được kết tủa. Rửa sạch

kết tủa nhiều lần với ethanol trong môi trường kiềm, sau đó làm khô thu được chất

rắn CBZT (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%).

* Tổng hợp sensor L

CBZT (290 mg, 1 mmol) và 4-diethylamino-2-hydroxybenzaldehyde (190

mg, 1 mmol) được hòa tan trong 30 mL ethanol tuyệt đối. Thêm 1 giọt piperidine,

dung dịch phản ứng chuyển sang màu đỏ. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 10

giờ, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng. Lọc lấy kết tủa, rửa sạch nhiều lần bởi

diethyl ether và sau đó làm khô thu được sản phẩm L (khoảng 3,0 g, với hiệu suất

khoảng 38%).

b. Quy trình thực nghiệm tổng hợp sensor AMC

Sơ đồ tổng hợp AMC được minh họa ở Hình 2. 4 và được tóm tắt như sau:

OO O

O

OO OHAMC

Hình 3.24. Sơ đồ tổng hợp sensor AMC

Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) và Et3N (7,9 mL,

56,4 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL), thêm một lượng nhỏ chất xúc tác 4-

dimethylaminopyridine, thu được dung dịch. Làm lạnh và giữ dung dịch phản ứng ở

nhiệt độ 0 °C. Thêm từ từ (trong khoảng thời gian 1 giờ) vào dung dịch phản ứng

từng giọt dung dịch acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL).

Sau đó, khuấy dung dịch phản ứng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm nước vào dung

dịch thu được để hòa tan các muối amine. Tiếp tục rửa sạch pha hữu cơ thu được

bằng nước, sau đó làm khô pha hữu cơ bằng muối MgSO4 khan. Làm bay hơi dung

môi hữu cơ trên máy cô quay chân không. Sản phẩm sau đó được tinh chế bằng

cách kết tinh lại trong ethanol, thu được chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng

khoảng 1 gam, hiệu suất khoảng 45%.

+ CH2=CHCOCl

CH2Cl2, 2h, ở nhiệt độ phòng, xt: 4-dimethylaminopyridine

57

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn xuất của

cyanine phát hiện các biothiol và ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức

3.1.1. Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp và đặc trưng của sensor L

3.1.1.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L

Phương pháp phiếm hàm mật độ ba thông số của Becke (B3LYP) là một

trong những phương pháp sử dụng rộng rãi nhất cho các phép tính phân tử vì cho

kết quả tính toán khá chính xác trên một phạm vi rộng các hợp chất, đặc biệt là các

phân tử hợp chất hữu cơ [115], [160]. Kết quả nghiên cứu của nhiều công trình [42],

[43], [73], [119], [121] cho thấy, bộ hàm cơ sở LanL2DZ áp dụng tốt cho các ion

kim loại nặng, đặc biệt là ion Hg(II). Vì vậy, có thể áp dụng mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ cho hệ nghiên cứu với kết quả đáng tin cậy.

Các dẫn xuất cyanine bao gồm các dạng R2N+=CH[CH=CH]n-NR2,

Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, các dạng này đều

có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor. Trong đó, donor (nhóm đẩy electron) là

một nhóm amino; acceptor (nhóm rút electron) là ion amoni. Chúng được biết đến

là những hợp chất màu, phát huỳnh quang mạnh mẽ, và gần đây đã được nghiên cứu

sử dụng làm thuốc nhuộm huỳnh quang trong chụp ảnh y sinh học [40].

Để thiết kế một cấu trúc phù hợp cho sensor L từ dẫn xuất cyanine, dựa trên

phản ứng tạo phức giữa ion kim loại với các phối tử, các nhóm có ái lực mạnh với

ion Hg(II) bao gồm -S và -COO- đã được xem xét, sử dụng. Do đó, hai fluorophore

được lựa chọn lần lượt là 2-methylbenzothiazole (BZT) và 4-diethylamino-2-

hydroxybenzaldehyde (DHB), bởi vì thông qua phản ứng cộng andol và ngưng tụ

croton [3], BZT và DHB được ghép nối tạo fluorophore. Receptor là acid

bromoacetic với các lý do: một là phản ứng gắn receptor lên fluorophore BZT được

thực hiện thông qua phản ứng giữa 4-metyl quinoline và dẫn xuất acid carboxylic

[29]; hai là receptor này có ái lực mạnh với ion Hg(II) thông qua phản ứng tạo phức

với phối tử -O.

58

Quá trình thiết kế và tổng hợp sensor L được trình bày ở Hình 3.1.

N

S N

S

-O2C

BrCH2COOHN

S

-O2C

N

HO

OHC N

HO

LCBZTBZT

(I) (II)

Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor L

Trong đó fluorophore là cyanine, receptor là nhóm -COO-, là nhóm có ái lực

mạnh với ion Hg(II); phản ứng tổng hợp sensor L thực hiện qua hai giai đoạn: giai

đoạn (I) và giai đoạn (II).

a. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (I)

Phản ứng hình thành CBZT từ BZT và acid bromoacetic được trình bày ở

Hình 3.2 và 3.3. Để xem xét khả năng xảy ra của các phản ứng, hình học bền của

BZT, acid bromoacetic, CBZT-1, CBZT-2, CBZT-3, CBZT-4, CBZT-5, CBZT ở

mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ được trình bày ở Hình 3.4. Tọa độ XYZ các

nguyên tử trong phân tử này, ion Br-, OH-, nước, C2H5OH được trình bày từ Phụ lục

2 đến Phụ lục 13. Biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các phản ứng được tính ở

mức lý thuyết và liệt kê ở Bảng 3.1 và 3.2.

Kết quả tính toán ở Bảng 3.1 và 3.2 cho thấy, phản ứng giữa BZT với acid

bromoacetic để hình thành CBZT-3 và phản ứng giữa CBZT-3 và dung dịch kiềm

để hình thành CBZT là thuận lợi về mặt nhiệt động do biến thiên năng lượng tự do

Gibbs (∆G298) của phản ứng (3) và phản ứng (8) là âm nhất.

Một phản ứng hóa học xảy ra cần phải đáp ứng điều kiện về nhiệt động học

(như là điều kiện cần) và điều kiện về động học (như là điều kiện đủ) để tốc độ phản

ứng đủ lớn. Về nguyên tắc, trong hóa tính toán hoàn toàn có thể xác định được hằng

số tốc độ phản ứng theo thuyết trạng thái chuyển tiếp dựa trên entropi, entanpi và

năng lượng tự do hoạt hóa. Để tính toán các thông số này cần phải xác định trạng

thái chuyển tiếp và tiến trình của phản ứng [32]. Tuy nhiên, mục tiêu của nghiên

cứu này là kết hợp linh hoạt giữa tính toán và thực nghiệm, nên chỉ dừng lại ở mức

dự đoán khả năng phản ứng và hướng sản phẩm dựa trên các thông số nhiệt động,

Receptor Fluorophore

59

sau đó tiến hành thực nghiệm dựa trên dự đoán của tính toán. Sự kết hợp linh hoạt

này sẽ giảm tải khối lượng công việc tính toán hoặc thực nghiệm, tùy vào trường

hợp cụ thể, sẽ tiến nhanh đến mục đích cuối cùng.

S

N

BrCH2COOH Br-

S

N+

COOHCBZT-1

(1)

S

N

BrCH2COOH HBr

S

N+

COO-

BZT CBZT-2

(2)

S

N

BrCH2COOH

S

N+

COOH...Br-BZT CBZT-3

(3)

S

N

BrCH2COOH

S

N+

COOHBZT CBZT-4

(4)

Br-

S

N

BrCH2COOH

S

N

COOHBZT CBZT-5

Br

(5)

BZT

Hình 3.2. Các sản phẩm có thể có từ phản ứng giữa BZT với acid bromoacetic

CH3CH2OH

Br-

S

N+

COO-

CBZT

S

N+

COOH...Br-

CH3CH2OH2+

H2O

Br-

S

N+

COO-

CBZT

(7)

S

N+

COOH...Br-

CBZT-3

H3O+

OH-

Br-

S

N+

COO-

CBZT

(8)

S

N+

COOH...Br-

CBZT-3

H2O

(6)

CBZT-3

Hình 3.3. Các phản ứng hình thành CBZT từ CBZT-3

60

(H) (C) (N) (S) (O) (Br)

Hình 3.4. Hình học bền của BZT và các sản phẩm phản ứng với acid bromoacetic

ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bảng 3.1. Biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các phản ứng giữa BZT với acid

bromoacetic ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ (kcal.mol-1)

Phản ứng (1) (2) (3) (4) (5)

ΔG298 (ethanol, kcal.mol-1) -12,9 6,8 -19,4 -11,9 -7,7

ΔG298 (acetonitril, kcal.mol-1) -15,2 6,0 -20,9 -13,3 -9,3

ΔG298 (chloroform, kcal.mol-1) 7,4 10,6 -17,6 -11,5 -5,9

ΔG298 (nước, kcal.mol-1) -17,3 6,0 -20,6 -12,9 -9,1

(BZT) (CBZT-1) (CBZT-2)

(CBZT-3) (CBZT-4) (CBZT-5)

(CBZT) Acid bromoacetic

61

Bảng 3.2. Biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các phản ứng từ CBZT-3

thành CBZT ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ (kcal.mol-1)

Phản ứng (6) (7) (8)

ΔG298 (ethanol, kcal.mol-1) 24,7 29,0 -52,1

ΔG298 (nước, kcal.mol-1) 21,0 25,2 -51,6

b. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (II)

Phản ứng hình thành L từ CBZT với DHB có thể tạo ra 4 sản phẩm (Hình

3.5). Biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các phản ứng ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ đã được tập hợp ở Bảng 3.3. Hình học bền của DHB, L-1, L-2,

L-3, L ở cùng mức lý thuyết được trình thể hiện ở Hình 3.6. Tọa độ XYZ các

nguyên tử trong phân tử này được đính kèm từ Phụ lục 14 đến Phụ lục 18.

Kết quả tính toán ở Bảng 3.3 cho thấy, biến thiên năng lượng tự do Gibbs

(∆G298) của phản ứng (12) là âm. Theo đó, phản ứng giữa CBZT với DHB theo

hướng hình thành sản phẩm L là thuận lợi về mặt nhiệt động.

N+

S

COO-

N+

S

COO-

N

HO

OHC N

HO

CBZT

(9)

N+

S

COO-

L-1

(11)

HO

N

L-3

H2O

H2O

N+

S

COO-

N (10)

L-2

H2O

HO

N+

S

COO-

(12)N

L

H2O

HO

DHB

Hình 3.5. Các sản phẩm phản ứng có thể hình thành giữa CBZT với DHB

62

(H) (C) (N) (S) (O)

Hình 3.6. Hình học bền của DHB và các sản phẩm phản ứng của DHB với CBZT

ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bảng 3.3. Biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các phản ứng giữa CBZT

với DHB ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ (kcal.mol-1)

Phản ứng (9) (10) (11) (12)

ΔG298 (ethanol, Kcal.mol-1) 5,0 3,0 7,1 -2,6

ΔG298 (acetonitril, Kcal.mol-1) 6,4 4,5 8,5 -1,1

ΔG298 (chloroform, Kcal.mol-1) 7,1 1,4 7,6 -12,5

ΔG298 (nước, Kcal.mol-1) 3,6 3,0 6,3 -2,9

(L-2)

(DHB) (L-1)

(L-3)

(L)

63

3.1.1.2. Nghiên cứu lý thuyết đặc tính của sensor L

a. Cấu trúc phân tử của sensor L

Bảng 3.4 trình bày độ dài liên kết, trị số góc liên kết và góc nhị diện trong

phân tử L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ.

Bảng 3.4. Các thông số hình học của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ (đơn vị độ

dài liên kết là angstrom (Å), đơn vị góc là độ ())

Liên kết Độ dài liên kết

Liên kết Độ dài liên kết

Liên kết Độ dài liên kết

C1–C2 1,408 C14–O46 1,356 O25–H33 1,961

C1–C6 1,399 C15–C16 1,418 C15–H34 1,082

C2–C3 1,413 C16–C17 1,448 C17–H35 1,082

C3–C4 1,405 C16–N19 1,388 C20–H36 1,102

C4–C5 1,407 C17–C18 1,380 C20–H37 1,098

C5–C6 1,411 N19–C20 1,490 C21–H38 1,097

C5–N7 1,424 N19–C22 1,479 C21–H39 1,096

C6–S9 1,820 C20–C21 1,536 C21–H40 1,096

N7–C8 1,371 C22–C23 1,546 C22–H41 1,095

N7–C11 1,491 C24–O25 1,295 C22–H42 1,092

C8–S9 1,823 C24–O26 1,267 C23–H43 1,098

C10–C12 1,397 C2–H28 1,087 C23–H45 1,095

C11–C24 1,583 C3–H29 1,086 O25–H47 1,522

C12–C13 1,419 C4–H30 1,087 O46–H47 1,027

C13–C14 1,453 C11–H31 1,094 C18–H48 1,088

C13–C18 1,432 C11–H32 1,092 C10–H49 1,087

C14–C15 1,405 C12–H33 1,085 - -

Góc liên kết Độ lớn góc Góc liên kết Độ lớn góc Góc liên kết Độ lớn góc

C2–C1–H27 120,8 N7–C11–H32 107,9 N19–C20–H36 109,3

C6–C1–H27 121,3 C24–C11–H31 107,5 N19–C20–H37 108,3

C1–C2–C3 120,6 C24–C11–H32 110,9 C21–C20–H36 108,7

C1–C2–H28 119,5 H31–C11–H32 109,4 C21–C20–H37 107,6

C3–C2–H28 119,9 C10–C12–C13 129,4 H36–C20–H37 106,9

C2–C3–C4 121,4 C10–C12–H33 115,9 C20–C21–H38 108,1

C2–C3–H29 119,6 C13–C12–H33 114,6 C20–C21–H39 112,1

C4–C3–H29 119,0 C12–C13–C14 119,3 C20–C21–H40 112,7

64

Góc liên kết Độ lớn góc Góc liên kết Độ lớn góc Góc liên kết Độ lớn góc

C3–C4–C5 117,8 C12–C13–C18 123,8 H38–C21–H39 107,5

C3–C4–H30 122,2 C14–C13–C18 116,9 H38–C21–H40 107,5

C5–C4–H30 119,9 C13–C14–C15 120,0 H39–C21–H40 108,7

C4–C5–C6 120,7 C13–C14–O46 124,5 N19–C22–C23 113,7

C4–C5–N7 126,1 C15–C14–O46 115,5 N19–C22–H41 108,7

C6–C5–N7 113,2 C14–C15–C16 122,3 N19–C22–H42 108,6

C1–C6–C5 121,6 C14–C15–H34 115,5 C23–C22–H41 110,2

C1–C6–S9 127,7 C16–C15–H34 122,2 C23–C22–H42 109,5

C5–C6–S9 110,7 C15–C16–C17 117,5 H41–C22–H42 106,0

C5–N7–C8 115,1 C15–C16–N19 121,9 C22–C23–H43 110,1

C8–N7–C11 124,4 C16–C17–C18 120,4 C22–C23–H45 111,3

N7–C8–S9 111,0 C16–C17–H35 120,7 H43–C23–H44 108,1

N7–C8–C10 129,1 C18–C17–H35 118,9 H43–C23–H45 108,1

S9–C8–C10 119,9 C13–C18–C17 122,8 H44–C23–H45 108,1

C6–S9–C8 89,6 C13–C18–H48 118,6 C11–C24–O25 115,9

C8–C10–H49 116,0 C16–N19–C20 119,0 O25–C24–O26 128,6

C12–C10–H49 121,0 C16–N19–C22 120,2 C14–O46–H47 122,3

N7–C11–C24 114,5 C20–N19–C22 120,3 - -

Góc nhị diện Độ lớn góc

Góc nhị diện Độ lớn góc

Góc nhị diện Độ lớn góc

C6–C1–C2–C3 0,9 N7–C8–S9–C6 3,4 N19–C16–C17–C18 -178,3

C6–C1–C2–H28 179,7 C10–C8–S9–C6 -176,7 N19–C16–C17–H35 1,8

H27–C1–C2–C3 -178,7 N7–C8–C10–C12 -22,0 C15–C16–N19–C20 175,6

H27–C1–C2–H28 0,2 N7–C8–C10–H49 163,4 C15–C16–N19–C22 4,2

C2–C1–C6–C5 0,7 S9–C8–C10–C12 158,1 C17–C16–N19–C20 -4,4

C2–C1–C6–S9 -178,0 S9–C8–C10–H49 -16,5 C17–C16–N19–C22 -175,8

H27–C1–C6–C5 -179,8 C8–C10–C12–C13 179,1 C16–C17–C18–C13 0,0

H27–C1–C6–S9 1,5 C8–C10–C12–H33 -3,8 C16–C17–C18–H48 179,7

C1–C2–C3–C4 -0,9 H49–C10–C12–C13 -6,6 H35–C17–C18–C13 179,9

C1–C2–C3–H29 177,8 H49–C10–C12–H33 170,5 H35–C17–C18–H48 -0,4

H28–C2–C3–C4 -179,7 N7–C11–C24–O25 -101,4 C16–N19–C20–C21 174,7

H28–C2–C3–H29 -1,1 N7–C11–C24–O26 79,4 C16–N19–C20–H36 -62,3

C2–C3–C4–C5 -0,7 H31–C11–C24–O25 140,6 C16–N19–C20–H37 53,8

C2–C3–C4–H30 174,6 H31–C11–C24–O26 -38,6 C22–N19–C20–C21 -13,9

65

Góc nhị diện Độ lớn góc

Góc nhị diện Độ lớn góc

Góc nhị diện Độ lớn góc

H29–C3–C4–C5 -179,4 H32–C11–C24–O25 21,1 C22–N19–C20–H36 109,1

C3–C4–C5–C6 2,2 C10–C12–C13–C14 179,8 C16–N19–C22–C23 80,5

C3–C4–C5–N7 -177,6 C10–C12–C13–C18 -0,2 C16–N19–C22–H41 -42,6

H30–C4–C5–N7 7,0 H33–C12–C13–C18 -177,4 C20–N19–C22–C23 -90,8

C4–C5–C6–C1 -2,3 C12–C13–C14–C15 -178,6 C20–N19–C22–H41 146,1

N7–C5–C6–C1 177,6 C18–C13–C14–C15 1,5 N19–C20–C21–H38 -179,4

N7–C5–C6–S9 -3,5 C18–C13–C14–O46 -177,8 N19–C20–C21–H39 -61,0

C4–C5–N7–C11 15,9 C12–C13–C18–H48 -1,3 H36–C20–C21–H38 57,3

C6–C5–N7–C8 6,5 C14–C13–C18–C17 -1,6 H36–C20–C21–H39 175,6

C6–C5–N7–C11 -163,9 C14–C13–C18–H48 178,7 H36–C20–C21–H40 -61,3

C1–C6–S9–C8 179,0 C13–C14–C15–C16 0,1 H37–C20–C21–H38 -58,2

C5–C6–S9–C8 0,1 C13–C14–C15–H34 -179,2 H37–C20–C21–H39 60,1

C5–N7–C8–S9 -6,2 O46–C14–C15–C16 179,5 H37–C20–C21–H40 -176,8

C5–N7–C8–C10 173,9 O46–C14–C15–H34 0,1 N19–C22–C23–H43 -178,9

C11–N7–C8–S9 163,7 C13–C14–O46–H47 2,9 N19–C22–C23–H44 61,4

C11–N7–C8–C10 -16,2 C15–C14–O46–H47 -176,4 N19–C22–C23–H45 -59,0

C5–N7–C11–C24 -85,8 C14–C15–C16–C17 -1,7 H41–C22–C23–H43 -56,6

C5–N7–C11–H31 32,8 C14–C15–C16–N19 178,2 H41–C22–C23–H44 -176,3

C5–N7–C11–H32 150,1 H34–C15–C16–C17 177,6 H41–C22–C23–H45 63,3

C8–N7–C11–C24 104,7 H34–C15–C16–N19 -2,4 H42–C22–C23–H43 59,5

C8–N7–C11–H31 -136,7 C15–C16–C17–C18 1,7 H42–C22–C23–H44 -60,2

C8–N7–C11–H32 -19,4 C15–C16–C17–H35 -178,2 H42–C22–C23–H45 179,4

Từ số liệu ở Bảng 3.4 cho thấy, chiều dài các liên kết, góc liên kết, góc nhị

diện của các tiểu phần BZT, acid bromoacetic và DHB trong L có thay đổi so với

ban đầu. Độ dài các liên kết C11-C24, C24-O25, C24-O26, N7-C8, C8-C10, C12-

C13 trong L là 1,583; 1,295; 1,267; 1,371; 1,412; 1,419 Å có sự khác biệt nhưng

không nhiều so với trong acid bromoacetic (C2-C3, C3-O5, C3-O4), BZT (N7-C8,

C8-C10), DHB (C1-C7) tự do tương ứng là 1,536; 1,371; 1,233; 1,302; 1,501 và

1,443 Å. Liên kết N7-C11 trong L có độ dài là 1,491 Å, ngắn hơn nhiều so với liên

kết Br-C2 trong acid bromoacetic tự do (2,308 Å). Liên kết mới được hình thành

C10-C12 có độ dài là 1,397 Å, có giá trị xấp xỉ với liên kết đôi C=C (khoảng 1,34

66

Å). Điều này chứng tỏ có sự hình thành liên kết đôi C10 và C12 trong L. Điều đáng

chú ý có sự hình thành liên kết O25-H47 với độ dài là 1,522 Å, dài hơn so với DHB

tự do (1,005 Å) và trong L (1,027 Å) tương ứng, đây được cho là sự hình thành liên

kết hidro nội phân tử giữa O25 và H47 trong L. Sự hình thành liên kết hidro nội

phân tử có thể gây ra quá trình tạo L là thuận lợi về mặt nhiệt động như đã phân tích ở

trên. Các góc liên kết N7-C11-C24, N7-C8-C10, C12-C13-C14 trong L tương ứng

là 114,5o; 129,1o và 119,3o, trong khi các góc này trong acid bromoacetic (Br-C2-

C3), BZT (N7-C8-C10) và DHB (C2-C1-C7) tương ứng là 116,0o; 125,6o và

121,9o. Sự hình thành liên kết đôi giữa nguyên tử C10 và nguyên tử C12 trong L đã

dẫn đến giá trị các góc liên kết C8-C10-C12, C10-12-13 trong L lần lượt là 122,7o

và 129,4o, gần với góc liên kết của cacbon ở trạng thái lai hóa sp2.

Hai tiểu phần BZT và DHB không cùng nằm trong một mặt phẳng, chúng

tạo một góc nhị diện N7-C8-C10-C12 là -22o. Các góc nhị diện N7-C11-C24-O25,

N7-C11-C24-O26 trong L lần lượt là -101,4o và 79,4o, khác nhiều so với góc nhị

diện Br-C2-C3-O4, Br-C2-C3-O5 trong acid bromoacetic tương ứng là -179,9o và -

0,3o. Điều này được giải thích có thể sự hình thành liên kết hidro nội phân tử giữa

nguyên tử O25 và nguyên tử H47 trong L.

b. Phân tích phổ UV-Vis của sensor L

Hình 3.7. Phổ UV-Vis của L trong pha khí ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

(excitation energy: năng lượng kích thích, oscillator strength: cường độ dao động)

452,6 nm

67

Phổ UV-Vis của sensor L đã được xác định bằng phương pháp TD-DFT ở

mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ. Dữ liệu thu được cho thấy rằng phổ UV-Vis của

phân tử L đạt cực đại ở bước sóng 452,6 nm với cường độ dao động khá lớn 0,57

(Hình 3.7).

Trong công trình nghiên cứu [110], nnc đã tổng hợp chất bis{4-[(E)-2-

(benzo[d]thiazol-2- yl)vinyl]phenyl} acrylonitrile (BZTVPA), có cấu trúc tương tự

sensor L (gồm hai phần benzothiazole liên kết với nhau thông qua nhóm cầu nối

bis(4-vinylphenyl)acrylonitrile). Kết quả nghiên cứu cho thấy, hợp chất này có phổ

UV-Vis đạt cực đại ở bước sóng 405 nm và phát xạ huỳnh quang ở bước sóng 495

nm trong dung môi tetrahydrofuran.

Như vậy, kết quả này dẫn đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang của sensor L

tương tự BZTVPA.

c. Phân tích đặc tính huỳnh quang của sensor L

Năng lượng kích thích và các MO biên của sensor L được xác định bằng

phương pháp TD-DFT ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ và thể hiện ở Bảng 3.5,

Hình 3.8. Giản đồ năng lượng các MO biên của L được trình bày ở Hình 3.9.

Hình 3.8 cho thấy, mật độ electron ở các MO từ MO-93 đến MO-100 chủ

yếu tập trung ở tiểu phần BZT, DHB và khu vực liên kết C10-C12.

Trạng thái kích thích và tính chất quang lý của các sensor dựa vào quy tắc

chuyển dịch electron. Sự chuyển dịch bị cấm nếu như không có sự xen phủ của các

MO đầu và cuối trong bước chuyển. Một thông số quan trọng trong việc đánh giá

quá trình chuyển đổi đó là cường độ dao động (f). Thông thường một quá trình

chuyển đổi với f > 0,01 là được phép, ngược lại f < 0,01 là không được phép; quy

tắc này cũng áp dụng tương tự đối với quá trình phát xạ [130].

Từ các số liệu Bảng 3.5 cho thấy, các quá trình chuyển đổi trạng thái S0→S3,

S0→S5 và S0→S6 đều có cường độ dao động nhỏ (f < 0,01). Do đó, các bước chuyển

này không dẫn tới huỳnh quang trong L. Thêm vào đó, các quá trình chuyển đổi

trạng thái này đều được đóng góp chủ yếu bởi sự chuyển đổi electron giữa các MO

không liên tiếp. Cụ thể: S0→S3 được đóng góp chủ yếu bởi MO-94→MO-97

(77,56%); S0→S5 được đóng góp chủ yếu bởi MO-92→MO-97 (86,61%); S0→S6

68

được đóng góp chủ yếu bởi MO-90→MO-97 (44,35%), MO-91→MO-97 (41,32%).

Do đó, luôn tồn tại MO có chứa electron nằm giữa hai MO trong mỗi bước chuyển,

nên ở các trạng thái kích thích trên sẽ xảy ra quá trình PET. Vì vậy, các bước

chuyển này không dẫn tới huỳnh quang trong L.

Các bước chuyển trạng thái S0→S1, S0→S2, tương ứng tại các bước sóng là

489,8 nm và 452,6 nm, có cường độ dao động lớn, đều có sự đóng góp khá lớn của

bước chuyển electron giữa hai MO liên tiếp là MO-96 lên MO-97 (tương ứng là

35,80% và 28,66%). Do đây là các MO liên tiếp, nên không có quá trình PET nào

can thiệp đến bước các chuyển trạng thái này. Kết quả này dẫn đến một kỳ vọng

rằng phân tử L là hợp chất phát huỳnh quang.

Bước chuyển trạng thái S0→S4 tuy có cường độ dao động khá lớn, nhưng

chủ yếu được đóng góp bởi sự chuyển đổi electron giữa các MO không liên tiếp, cụ

thể được đóng góp chủ yếu bởi MO-93→MO-97 (49,94%). Do đó, tồn tại MO có

chứa electron nằm giữa hai MO trong bước chuyển, nên ở trạng thái kích thích trên

sẽ xảy ra quá trình PET. Vì vậy, bước chuyển này không dẫn tới huỳnh quang trong

sensor L.

Bảng 3.5. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước

chuyển

MO Năng lượng

(eV)

Bước sóng

(nm)

f Tỷ lệ %

đóng góp

S0→S1 95→97 2,53 489,8 0,2566 56,44

96→97 35,80

S0→S2 93→97 2,74 452,6 0,5626 29,22

95→97 28,63

96→97 28,66

S0→S3 92→97 2,86 432,9 0,0097 5,90

93→97 8,83

94→97 77,56

S0→S4 92→97 3,00 413,2 0,5815 5,42

93→97 49,94

69

Bước

chuyển

MO Năng lượng

(eV)

Bước sóng

(nm)

f Tỷ lệ %

đóng góp

94→97 10,62

95→97 9,35

96→97 11,07

S0→S5 92→97 3,05 406,0 0,0060 86,61

93→97 7,68

S0→S6 90→97 3,92 316,7 0,0051 44,35

91→97 41,32

96→97 8,40

Hình 3.8. Các MO biên của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

MO-100 (-4,1 eV) MO-99 (-4,2 Ev)

MO-98 (-4,6 eV) MO-97 (-5,8 eV)

MO-95 (-8,1 eV) MO-96 (-7,4 eV)

MO-94 (-8,8 eV) MO-93 (-9,2 eV)

70

Hình 3.9. Giản đồ năng lượng các MO biên của L (các mức năng lượng là tương

đối, không theo tỉ lệ)

Việc nghiên cứu tính toán lý thuyết cho thấy: sensor L có thể tổng hợp được

với cấu trúc cyanine từ BZT, DHB và acid bromoacetic; L hấp thụ cực đại tại bước

sóng 452,6 nm và kỳ vọng là chất phát huỳnh quang. Để kiểm định và khẳng định

những kết quả tính toán này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu phần thực nghiệm.

3.1.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L

3.1.2.1. Thực nghiệm tổng hợp L

Sensor L được tổng hợp qua 2 giai đoạn (như đã trình bày ở Chương 2). Sau

khi tổng hợp, cấu trúc của CBZT và L được xác định bởi các phổ:

Cấu trúc của sản phẩm CBZT đã được khẳng định bởi phổ 1H-NMR và phổ

FAB-MS. Kết quả phổ 1H-NMR (300 MHz, DMS) δ: 8,51 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 8,32

(d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,87 (dt, J = 30,3; 7,7 Hz, 2H), 5,80 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 3,35-

3,13 (m, 3H); phổ khối FAB-MS: m/z = 208,04. Phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS

được trình bày ở Phụ lục 19, 20.

- 9,2

- 8,8

- 8,1

- 7,4

- 5,8

- 4,6

- 4,2

- 4,1

93

94

95

96

97

98

99

100

71

Cấu trúc L đã được khẳng định bởi phổ 1H-NMR, 13C-NMR, FAB-MS. Kết

quả phổ 1H -NMR (300 MHz, MeOD) δ: 8,16 (d, J = 13,8 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,1

Hz, 1H), 7,78 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,73 – 7,64 (m, 1H), 7,62 – 7,53 (m, 2H), 7,36 (d,

J = 14,0 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,12 (s, 2H), 3,50 (dd, J =

13,0; 6,7 Hz, 4H), 1,32 - 1,16 (m, 6H). Kết quả phổ 13C-NMR (300 MHz, MeOD)

δ: 173,44; 163,43; 155,85; 148,25; 142,99; 134,56; 127,43; 124,00; 115,49; 112,72;

107,62; 104,04; 97,55; 50,33; 45,81; 46,79; 12,83. Kết quả phổ khối FAB-MS: m/z

= 383,14. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và FAB-MS được trình bày ở Phụ lục 21, 22, 23.

3.1.2.2. Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)

a. Khảo sát phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L

Kết quả khảo sát thực nghiệm phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của dung

dịch L được thể hiện ở Hình 3.10. Theo đó, phổ hấp thụ của L đạt cực đại ở bước

sóng 540 nm trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v) ở pH =7,4 (giá trị tính toán trong pha khí

là 452,6 nm). Như dự đoán trong nghiên cứu lý thuyết, L là một hợp chất phát

huỳnh quang màu đỏ, với hiệu suất lượng tử huỳnh quang là 0,175 (so với 0,85 của

chất chuẩn tham khảo là là rhodamine B trong NaOH 0,1 N). Phổ huỳnh quang của

L đạt cực đại ở bước sóng 585 nm, ứng với bước sóng kích thích 540 nm.

Hình 3.10. Phổ hấp thụ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0

μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH =7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM) trong

C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH =7,4, bước sóng kích thích 540 nm

(a) (b)

72

b. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L phát

hiện ion Hg(II)

Hình 3.11 mô tả phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của dung dịch L

với ion Hg(II).

Trong phổ UV-Vis (Hình 3.11a), khi tăng dần nồng độ ion Hg(II) vào dung

dịch L, một đỉnh hấp thụ mới xuất hiện và tăng dần ở bước sóng 460 nm, bên cạnh

đó, cường độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm giảm dần. Đi kèm với quá trình này, màu

của dung dịch chuyển dần từ màu hồng (λmax=540 nm) sang màu vàng cam

(λmax=460nm). Mặt khác, một điểm isosbestic xuất hiện và quan sát thấy ở bước

sóng 490 nm. Điều này chỉ ra rằng có một sự chuyển đổi nồng độ của chất hấp thụ

trong dung dịch, cụ thể giữa L và Hg2L2 - sản phẩm của phản ứng giữa L với Hg(II).

Trong phổ huỳnh quang (Hình 3.11b), cường độ huỳnh quang của dung dịch

L giảm dần khi tăng nồng độ ion Hg(II) và dập tắt gần như hoàn toàn khi thêm một

đương lượng dung dịch ion Hg(II) vào dung dịch L (khoảng 95%).

c. Khảo sát phản ứng giữa sensor L với ion Hg(II)

Hình 3.12 biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ huỳnh quang của dung dịch

L với nồng độ ion Hg(II). Theo đó, cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm mạnh

Hg2+ Hg2+ (b)

Hình 3.11. Phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L bởi ion Hg(II):

(a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH =7,4, Hg(ClO4)2

(0-5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v),

pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích 540 nm

73

khi nồng độ ion Hg(II) tăng từ 0 đến 5,0 M; và sau đó giảm không đáng kể khi tiếp

tục tăng nồng độ ion Hg(II). Điều này đưa đến kết luận rằng L phản ứng với ion

Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1.

d. Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại cạnh tranh

Để đánh giá tính chọn lọc của sensor L với ion Hg(II) trong sự có mặt các

ion kim loại khác, một thí nghiệm khác cũng được tiến hành và mô tả ở Hình 3.13.

Hình 3.12. Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản ứng giữa ion Hg(II) với L

(L (5,0 M) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v) ở pH =7,4, bước sóng huỳnh

quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.13. Phổ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của L (1,5 μM) với sự hiện diện của các

ion kim loại Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (7,5 μM

cho mỗi ion kim loại) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH =7,4, bước sóng kích thích 540 nm

74

Kết quả cho thấy, khi thêm Hg(II) với nồng độ gấp 5 lần so với nồng độ L

vào dung dịch L, ở phổ hấp thụ thu được (Hình 3.13a), mật độ quang tại bước sóng

560 nm (bước sóng đặc trưng của sensor L) giảm còn không đáng kể (0,02) so với

ban đầu (0,12), mật độ quang tại bước sóng 460 nm (bước sóng đặc trưng của

Hg2L2) tăng lên đáng kể (0,06) so với ban đầu (0,01); còn ở phổ huỳnh quang (Hình

3.13b), cường độ huỳnh quang hầu như bị dập tắt hoàn toàn. Trong khi đó, khi thêm

riêng lẻ từng ion kim loại Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I),

K(I) với nồng độ gấp 5 lần so với L vào dung dịch L, không có bất kỳ sự thay đổi

đáng kể nào trong phổ UV-Vis cũng như phổ huỳnh quang. Một thí nghiệm khác,

khi thêm hỗn hợp tất cả các ion kim loại trên (nồng độ mỗi kim loại gấp 5 lần

sensor L) vào dung dịch chứa sensor L và Hg(II) (nồng độ gấp 5 lần sensor L),

cũng không có bất kỳ sự thay đổi đáng kể nào trong phổ UV-Vis cũng như phổ

huỳnh quang so với dung dịch chứa sensor L và Hg(II). Những thí nghiệm này cho

thấy L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự hiện diện của các ion kim loại

kể trên và có thể sử dụng L làm một sensor trắc quang hoặc sensor huỳnh quang để

phát hiện ion Hg(II) trong sự hiện diện các ion kim loại cạnh tranh đã được khảo sát.

Sự có mặt của các ion kim loại khảo sát không ảnh hưởng đến việc xác định

Hg(II) bằng sensor L có thể do các nguyên nhân sau: (1) các ion kim loại khảo sát

không phản ứng với sensor L; (2) các ion kim loại khảo sát phản ứng với sensor L

cho sản phẩm (ví dụ phức kim loại cạnh tranh với sensor L) nhưng không làm thay

đổi phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor L; kèm theo đó là sản phẩm này (ví

dụ phức kim loại cạnh tranh với sensor L) phản ứng với Hg(II) sẽ tạo phức Hg2L2

và giải phóng ion kim loại tự do. Bất kể nguyên nhân nào sự có mặt của các ion kim

loại khảo sát cũng không ảnh hưởng đến việc xác định Hg(II) bằng sensor L. Vì

vậy, luận án này không nghiên cứu vấn đề này.

e. Khảo sát sử dụng sensor L phát hiện định lượng ion Hg(II)

Để xem xét khả năng sử dụng sensor L phát hiện ion Hg(II), mối liên hệ giữa

biến thiên mật độ quang và biến thiên cường độ huỳnh quang của dung dịch L với

nồng độ ion Hg(II) được khảo sát và trình bày ở Hình 3.14. Kết quả trình bày ở

Hình 3.14a cho thấy, trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ 0 đến 400 μg/L, biến thiên

75

mật độ quang của dung dịch L(ΔA540) quan hệ tuyến tính với nồng độ ion Hg(II) bởi

phương trình: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)] với R=0,999

(N=9, P<0,0001). Điều này cho thấy rằng, có thể sử dụng L như là một sensor trắc

quang để phát hiện định lượng ion Hg(II).

Trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ 0 đến 400 μg/L (Hình 3.14b), có một sự

tương quan tuyến tính tốt giữa biến thiên cường độ huỳnh quang (∆I585) của dung

dịch L với nồng độ ion Hg(II), thể hiện qua phương trình: ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3

± 0,0) × [Hg(II)], với R=0,999 (N=9, P<0,0001). Điều này cũng cho thấy rằng có thể

sử dụng L như một sensor huỳnh quang để phát hiện định lượng ion Hg(II).

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ion Hg(II) đã được

xác định bằng phương pháp đường chuẩn độ ở nồng độ bé (Hình 3.15; các số liệu

thực nghiệm được đính kèm ở Bảng 1. PL52 và Bảng 2. PL53) bằng phương pháp

trắc quang tương ứng là 15,3 μg/L và 51,2 μg/L hay 0,076 μM và 0,25 μM và

phương pháp huỳnh quang tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059

μM và 0,19 μM.

Độ chính xác của phương pháp phát hiện ion Hg(II) bằng L đã được đánh giá

thông qua độ lặp lại và độ thu hồi (Rev). Kết quả khảo sát độ lặp lại (nồng độ ion

Biế

n th

iên

mật

độ

quan

g

Biế

n th

iên

cườ

ng đ

ộ hu

ỳnh

qua

ng

(a.u

)

Hình 3.14. Biến thiên mật độ quang tại 540 nm (a) và biến thiên cường độ

huỳnh quang tại 585 nm (b) của dung dịch L (3,0 μM) trong C2H5OH/H2O (1/9,

v/v), pH =7,4 với nồng độ ion Hg(II) (0-400 µg/L)

76

Hg(II) là 200 ppb, n=10) có độ lệch chuẩn tương đối RSD=8,7%, nhỏ hơn 0,5RSDH

=10,2 (RSDH là độ lệch chuẩn tương đối tính theo hàm Horwitz). Độ thu hồi trong

khoảng từ 91,0% đến 109,0%, thỏa mãn điều kiện <0,5RSDH. Điều này

cho thấy có thể sử dụng L để xác định ion Hg(II) với kết quả đáng tin cậy [105].

Hình 3.15. Đồ thị xác định LOD và LOQ ion Hg(II) bằng sensor L:

L (3,0 μM), trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH=7,4, (a): bước sóng kích thích

540 nm, (b): bước sóng huỳnh quang 585 nm

Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy: Sensor L đã được tổng hợp

như định hướng từ tính toán; sensor L hấp thụ cực đại tại bước sóng 540 nm và là

chất phát huỳnh quang (=0,175), kết quả này phù hợp với dự đoán từ tính toán;

sensor L phản ứng với Hg(II) theo tỉ lệ mol 1:1 và dẫn đến dập tắt huỳnh quang;

sensor L phát hiện được ion Hg(II) trong sự có mặt các ion kim loại cạnh tranh.

Nhằm làm sáng tỏ về khả năng ứng dụng của sensor L, chúng tôi tiếp tục nghiên

cứu về lý thuyết nội dung này.

3.1.3. Nghiên cứu lý thuyết ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)

3.1.3.1. Nghiên cứu cấu trúc phân tử phức Hg2L2

Kết quả tính toán sự hình thành phức giữa ion Hg(II) và L theo tỷ lệ mol 1:1

ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ cho thấy, có một cấu trúc hình học bền được

tìm thấy là Hg2L2 và được thể hiện ở Hình 3.16 (tọa độ XYZ các nguyên tử trong

Hg2L2, các thông số hình học của Hg2L2 được đính kèm ở Phụ lục 24 và 25).

0 30 60 90 120 150 1800,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

(a)

BiÕ

n th

iªn m

Ët ®é q

ua

ng

[Hg2+], ug/L

0 30 60 90 120 150 180 2100

10

20

30

40

50

60(b)

BiÕ

n thiª

n c

­êng ®

é h

uún

h q

uan

g (a

.u.)

[Hg2+

], ug/L

77

Phản ứng giữa L với ion Hg(II) để hình thành Hg2L2 là thuận lợi về mặt nhiệt

động, với các giá trị biến thiên enthalpy (∆H298) và năng lượng tự do Gibbs (∆G298)

của các phản ứng tính toán được trong pha khí tương ứng là -436,1 kcal mol-1 và -

410,2 kcal mol-1. Trong phức Hg2L2, khoảng cách giữa các nguyên tử O25Hg93,

O71Hg93 và S55Hg93 lần lượt là 2,25, 2,38, 2,75 (tương tự cho O26Hg94,

O72Hg94 và S9Hg94), trong khi đó tổng bán kính Van der Waals của nguyên tử

O và Hg, S và Hg lần lượt là 3,07, 3,37. Các khoảng cách này nhỏ hơn đáng kể so

với tổng bán kính Van der Waals của các nguyên tử liên quan. Vì vậy, những dữ

liệu này chứng tỏ có sự hình thành các liên kết giữa O25Hg93, O71Hg93,

S55Hg93, O26Hg94, O72Hg94 và S9Hg94 trong Hg2L2 với số phối trí là 3.

(H)

(C) (N) (S) (O) (Hg)

Hình 3.16. Hình học bền của phức Hg2L2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Ngoài ra, khoảng cách O26O71 trong Hg2L2 là 3,04 Å, bằng tổng bán

kính Van der Waals của các nguyên tử O (3,04 Å); các góc nhị diện O26-C24-

O25-Hg93, C24-O25-Hg93-S55 và C24-O25-Hg93-O71 có giá trị tương ứng là

6,625o, 158,646o và 16,015o. Điều này cho thấy các nguyên tử O26, C24, O25,

Hg93, O71, S55 gần như đồng phẳng (tương tự đối với O71, C70, O72, Hg94, O26,

S9). Đây là các yếu tố góp phần làm cho phức được bền.

78

Để khẳng định cấu trúc của phức Hg2L2, phân tích AIM đã được tiến hành ở

cùng mức lý thuyết với quá trình tối ưu hóa cấu trúc phân tử phức. Kết quả trình

bày ở Bảng 3.6. và Hình 3.17.

Bảng 3.6. Mật độ electron (ρ(r), au) và Laplacian (2(ρ(r)), au) của Hg2L2 ở mức

lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Hình 3.17. Hình học topo của Hg2L2 tại các điểm tới hạn liên kết (Bond Critical

Points, BCPs) và điểm tới hạn vòng (Ring Critical Point, RCPs): Điểm màu đỏ biểu

diễn điểm BCP, điểm màu vàng biểu diễn điểm RCP

Liên kết (r) 1 2 3 2(ρ(r)) CP

Hg93O25 0,064 -0,075 -0,071 0,400 -0,063 BCP

Hg93O71 0,043 -0,046 -0,044 0,308 -0,055 BCP

Hg93S55 0,041 -0,035 -0,034 0,164 -0,024 BCP

Hg94O26 0,065 -0,076 -0,073 0,407 -0,065 BCP

Hg94O72 0,042 -0,045 -0,043 0,302 -0,054 BCP

Hg94S9 0,041 -0,035 -0,034 0,164 -0,024 BCP

O26O71 0,009 -0,007 -0,004 0,041 -0,008 BCP

Hg93O25C24O26O71Hg93 0,008 -0,006 0,005 0,026 -0,007 RCP

Hg94O72C70O71O26Hg94 0,007 -0,005 0,007 0,020 -0,005 RCP

Hg93S55C54N53C57C70O71H93 0,009 -0,005 0,006 0,026 -0,006 RCP

Hg93S9C8N7C11C24O26Hg94 0,008 -0,004 0,007 0,023 -0,006 RCP

79

Kết quả phân tích AIM cũng chỉ ra rằng có sự tồn tại các điểm tới hạn liên

kết (BCPs) giữa các điểm tiếp xúc O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93,

O26Hg94, O72Hg94, S9Hg94, và O26O71 trong phân tử Hg2L2. Thêm vào

đó, tất cả các giá trị2(ρ(r)) tại các điểm BCP trên là khá âm. Điều này chỉ ra rằng

tất cả các liên kết trên là liên kết cộng hóa trị. Ngoài ra, kết quả phân tích AIM cũng

đã phát hiện sự tồn tại các điểm tới hạn vòng RCPs giữa các tiếp xúc Hg93 O25

C24 O26 O71 Hg93; Hg94 O72 C70 O71 O26 Hg94; Hg93 S55

C54 N53 C57 C70 O71 Hg93; Hg94 S9 C8 N7 C11 C24 O26

Hg94. Nghĩa là có sự hiện diện cấu trúc vòng trong phức (Hình 3.17).

Phân tích NBO cũng được tiến hành cho các hợp chất L và Hg2L2 nhằm giải

thích tính chất huỳnh quang dựa vào bản chất electron của các liên kết, cụ thể

nghiên cứu tương tác cho-nhận giữa các liên kết. Kết quả phân tích NBO ở cùng

mức lý thuyết trình bày ở Bảng 3.7 cho thấy, trong phân tử L, hệ thống electron π

liên hợp xuyên suốt trong cấu trúc cyanine với các giá trị năng lượng tương tác E(2)

khá lớn. Thêm vào đó, hệ thống electron π liên hợp này được tăng cường mật độ

electron từ cặp electron riêng của nguyên tử S9 và N19 với giá trị năng lượng tương

tác E(2) tương ứng là 28,43 kcal.mol-1 và 108,6 kcal.mol-1. Những phát hiện này một

lần nữa khẳng định rằng L có cấu trúc D-hệ liên hợp π-A, do đó L là một hợp chất

phát huỳnh quang như các dẫn xuất của cyanine.

Trong phức Hg2L2, liên kết giữa các phối tử L với ion Hg(II) (O25Hg93,

S9Hg94, O72Hg94) được ổn định bởi sự đóng góp mật độ electron từ cặp

electron riêng trên cả hai nguyên tử S và O với năng lượng tương tác từ

LP(O25)→LP*(Hg93), LP(S9)→LP*(Hg94), LP(O26)→LP*(Hg94) tương ứng là

33,06 kcal.mol-1; 49,05 kcal.mol-1 và 8,76 kcal.mol-1. Sự hình thành phức cũng đã

dẫn đến sự chuyển dịch mạnh electron từ cặp electron không chia trên N7 đến

orbital π*(C4-C5), π* (C8-S9) với năng lượng tương tác khá lớn. Sự hiện diện các

tương tác kim loại-phối tử và sự thiếu hụt điện tích ở N7 (do chuyển electron) đã

dẫn đến phá vỡ liên kết π(N7−C8) và hình thành liên kết π mới bao gồm

π(C8−C10), π(C12−C13), π(C14−C15), π(C17−C18) và π(C16−N19). Kết quả, cặp

80

electron không chia của N7 không còn liên hợp vào hệ liên hợp π nên có sự

chuyển dịch electron (cấu trúc D-hệ liên hợp π-A bị phá vỡ) dẫn đến dập tắt

huỳnh quang của phức.

Donor NBO

Acceptor NBO

E(2) Donor NBO

Acceptor NBO

E(2)

L L

π(C1-C2) π*(C3-C4) 19,84 LP*(C16) π*(C14-C15) 50,44

π(C1-C2) π*(C5-C6) 22,18 LP*(C16) π*(C17-C18) 43,57

π(C3-C4) π*(C1-C2) 21,87 LP(N19) LP*(C16) 108,66

π(C3-C4) π*(C5-C6) 25,38 LP(O25) σ*(C11-C24) 10,70

π(C5-C6) π*(C1-C2) 20,04 LP(O25) σ*(C24-O26) 13,64

π(C5-C6) π*(C3-C4) 16,54 LP*(O25) π*(C24-O26) 87,77

π(N7-C8) π*(C5-C6) 13,56 LP(O26) σ*(C11-C24) 19,41

π(C10-C12) LP(C13) 29,26 LP(O26) σ*(C24-O25) 20,78

π(C10-C12) π*(N7-C8) 47,30 LP(O46) σ*(C13-C14) 10,48

π(C14-C15) LP(C13) 33,14 LP(O46) π*(C14-C15) 39,33

π(C14-C15) LP*(C16) 68,02 π*(C1-C2) π*(C3-C4) 249,67

π(C17-C18) LP(C13) 29,18 π*(C5-C6) π*(C1-C2) 140,48

π(C17-C18) LP*(C16) 43,21 π*(C5-C6) π*(C3-C4) 102,47

LP(S9) π*(C5-C6) 14,40 π*(N7-C8) π*(C5-C6) 23,48

LP(S9) π*(N7-C8) 28,43 π*(N7-C8) π*(C10-C12) 35,07

LP(C13) π*(C10-C12) 93,00 LP(O25) LP*(H47) 48,56

LP(C13) π*(C14-C15) 73,90 LP(O46) LP*(H47) 359,18

LP(C13) π*(C17-C18) 68,18 - - -

Bảng 3.7. Năng lượng tương tác E(2) (kcal mol-1) giữa các obitan của phần tử cho

(donor) và nhận (acceptor) trong L và Hg2L2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

81

Donor NBO

Acceptor NBO

E(2) Donor NBO

Acceptor NBO

E(2)

Hg2L2 Hg2L2

π(C1-C6) π*(C2-C3) 14,83 LP(N7) π*(C8-C10) 17,97

π(C1-C6) π*(C4-C5) 21,67 LP(O25) σ*(C11-C24) 12,14

π(C2-C3) π*(C1-C6) 28,15 LP(O25) LP(C24) 141,27

π(C2-C3) π*(C4-C5) 23,48 LP(O26) σ*(C11-C24) 14,32

π(C4-C5) π*(C1-C6) 19,47 LP(O26) σ*(C24-O25) 19,69

π(C4-C5) π*(C2-C3) 18,61 LP(O26) LP*(C24) 175,19

π(C8-C10) π*(C12-C13) 16,19 LP(O97) π*(C17-C18) 33,04

σ(C10-H46) σ*(N7-C8) 10,31 π*(C1-C6) π*(C2-C3) 96,52

π(C12-C13) π*(C8-C10) 19,56 π*(C4-C5) π*(C2-C3) 110,00

π(C12-C13) π*(C14-C15) 16,22 σ*(C8-S9) σ*(C6-S9) 13,94

π(C12-C13) π*(C17-C18) 20,31 π*(C8-C10) π*(C12-C13) 53,05

π(C14-C15) π*(C12-C13) 16,93 π*(C12-C13) π*(C14-C15) 75,99

π(C14-C15) π*(C16-N19) 25,15 π*(C16-N19) π*(C14-C15) 34,50

π(C17-C18) π*(C12-C13) 13,68 π*(C16-N19) π*(C17-C18) 53,33

π(C17-C18) π*(C16-N19) 30,70 LP(O25) LP*(Hg93) 33,06

LP(N7) π*(C4-C5) 19,67 LP(S9) LP*(Hg94) 49,05

LP(N7) σ*(C8-S9) 12,36 LP(O26) LP*(Hg94) 8,76

Như vậy, kết quả phân tích NBO đã làm rõ bản chất của các tương tác và giải

thích đặc tính huỳnh quang của L và phức. Sự hình thành phức đã dẫn đến sự dịch

chuyển mạnh mật độ electron từ các phối tử L sang các ion kim loại trung tâm, làm

thay đổi cấu trúc D-hệ liên hợp π-A trong L, dẫn đến làm thay đổi tín hiệu huỳnh

quang. Phân tích NBO cũng cho thấy các phức ổn định chủ yếu là do sự hình thành

các liên kết từ các cặp electron riêng trên các nguyên tử O, S đến các ion kim loại.

82

3.1.3.2. Nghiên cứu phổ UV-Vis và đặc tính huỳnh quang của phức Hg2L2

Phổ UV-Vis, năng lượng kích thích và các MO biên của Hg2L2 được xác

định bằng phương pháp TD-DFT tại mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ và thể hiện ở

Hình 3.18, 3.19 và Bảng 3.8. Giản đồ năng lượng các MO biên của Hg2L2 được

trình bày ở Hình 3.20.

Hình 3.18. Phổ UV-Vis của Hg2L2 trong pha khí ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bảng 3.8. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của Hg2L2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển

MO Năng lượng (eV)

Bước sóng (nm)

f Tỷ lệ % đóng góp

S0→S1 201→203 1,29 961,2 0,0838 4,63

202→203 30,06

202→204 59,58

S0→S2 201→203 1,37 903,4 0,5913 2,41

201→204 3,99

202→203 53,12

202→204 24,77

S0→S3 201→203 1,57 788,7 0,1063 38,83

201→204 39,46

S0→S4 201→203 1,59 778,5 0,0647 32,24

201→204 43,20

202→204 3,52

903,4 nm

83

Bước chuyển

MO Năng lượng (eV)

Bước sóng (nm)

f Tỷ lệ % đóng góp

S0→S5 197→203 1,93 642,3 0,0183 2,66

199→203 50,52

199→204 10,31

200→203 25,64

S0→S5 201→205 2,29

S0→S6 198→204 1,95 636,4 0,0121 2,30

199→203 19,80

199→204

200→204

2,57

27,67

MO206 (-4,81 eV)

MO205 (-4,88 eV)

MO204(-6,17 eV)

MO203(-6,23 eV) - LUMO

MO201(-7,61 eV)

MO202(-7,60 eV) - HOMO

MO200(-8,12 eV)

MO199(-8,17 eV)

Hình 3.19. Các MO biên của Hg2L2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

84

Kết quả ở Hình 3.18 và Bảng 3.8 cho thấy, phổ hấp thụ của Hg2L2 đạt cực

đại ở bước sóng 903,4 nm với cường độ dao động lớn nhất là 0,59. So với kết quả

thực nghiệm trình bày ở Hình 3.11 và 3.13, phổ hấp thụ của Hg2L2 đạt cực đại ở

bước sóng 460 nn. Điều này có thể là do, việc giới hạn số trạng thái kích thích được

tính toán (n=6) để đảm bảo sức máy trong tính toán, đã không phát hiện hết các cực

đại hấp thụ ở các trạng thái kích thích lớn hơn (n>6). Theo kết quả tính toán ở Bảng

3.8, với giới hạn này, phổ hấp thụ chỉ tính được đến bước sóng 636,4 nm. Vì vậy,

kết quả tính toán không phát hiện được cực đại hấp thụ ở bước sóng 460 nm như

trong thực nghiệm.

Hình 3.19 cho thấy, trong tám MO của Hg2L2, có bốn MO là MO-201, MO-

202, MO-205 và MO-206 mật độ electron tập trung chủ yếu ở khu vực ion kim loại

trung tâm. Các MO còn lại bao gồm MO-199, M0-200, MO-203, MO-204 có mật

độ electron phân bố chủ yếu ở tiểu phần DHB và BZT, thuộc về fluorophore.

Kết quả tính toán ở Bảng 3.8 và Hình 3.20 cho thấy, ở trạng thái kích thích,

bước chuyển có cường độ dao động lớn nhất là từ S0 lên S2, tiếp đến là từ S0 lên S3,

S0 lên S1, và S0 lên S4. Sự hình thành phức Hg2L2 đã dẫn đến sự chuyển dịch đáng

kể mật độ electron từ các phối tử L đến các ion kim loại Hg(II) trung tâm và thu hẹp

khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO. Kết quả, ở trạng thái kích thích

chính (cường độ dao động lớn nhất và bằng 0,5913) từ S0→S2, với sự đóng góp chủ

yếu từ bước chuyển HOMO→LUMO (53,12%), có năng lượng kích thích rất nhỏ là

1,37 eV. Điều này dẫn đến bước sóng phát xạ huỳnh quang của phức sẽ chuyển về

vùng bước sóng dài, lớn hơn 900 nm. Vì vậy, trong thực tế không phát hiện được

huỳnh quang từ phức Hg2L2. Mặt khác, các trạng thái kích thích này đều xuất phát

từ các bước chuyển MO-201, MO-202 (mật độ electron tập trung ở khu vực ion kim

loại trung tâm) lên MO của fluorophore, những bước chuyển này không dẫn tới

huỳnh quang, do khoảng cách về không gian và điều này đã được nghiên cứu trong các

sensor hoạt động theo cơ chế FRET [48]. Các kết quả trên là nguyên nhân dẫn đến

dập tắt huỳnh quang trong phức Hg2L2.

Đối với các trạng thái kích thích S0 lên S5, S0 lên S6 với các bước chuyển

tương ứng hầu hết đều xảy ra trong fluorophore, tuy nhiên các trạng thái kích thích

85

trên không dẫn tới huỳnh quang trong Hg2L2 vì xảy ra quá trình PET từ MO có mức

năng lượng nằm ở giữa của mỗi bước chuyển.

Những kết quả nghiên cứu trên cho thấy: Như kết quả thực nghiệm, phản

ứng giữa L và Hg(II) theo tỉ lệ mol 1:1. Trong tính toán đã xác định được cấu trúc

hình học bền của phức theo tỉ lệ mol 1:1 giữa L và Hg(II) là Hg2L2, sự hình thành

phức là thuận lợi về nhiệt động học, cấu trúc của phức đã được khẳng định bởi phân

tích AIM. Sự dập tắt huỳnh quang của phức trong phần thực nghiệm đã được làm sáng

tỏ bởi phương pháp TD-DFT, phân tích NBO. Theo đó, sự hình thành phức đã làm giảm

khoảng cách năng lượng giữa HOMO, LUMO và thay đổi cấu trúc D-hệ liên hợp π-A.

Hình 3.20. Giản đồ năng lượng các MO biên của L và Hg2L2

(các mức năng lượng là tương đối, không theo tỉ lệ)

3.1.4. Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 phát hiện các biothiol

3.1.4.1. Nghiên cứu tính toán lý thuyết từ các phản ứng tạo phức

a. Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 làm sensor huỳnh quang phát hiện các

biothiol từ hằng số bền

Để nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 như một sensor huỳnh quang phát hiện

các biothiol, hằng số bền của phức đã được xác định bằng phương pháp chuẩn độ

huỳnh quang. Trong phương pháp này, nồng độ của phối tử (L) được giữ cố định,

- 9,2

- 8,8 - 8,1

- 7,4

- 5,8

- 4,6

- 4,2

- 4,1

93

94

95

96

97

98

99 100

- 8,17 - 8,12

- 7,61 - 7,60

- 6,23 - 6,17

- 4,88 - 4,81

199 200

201 202

203 204

205 206

L Hg2L2

86

ion kim loại (M) được thêm dần vào dung dịch phối tử. Phối tử L là hợp chất phát

huỳnh quang duy nhất, còn lại kim loại M và phức M2L2 là những chất không phát

huỳnh quang. Phổ huỳnh quang ghi nhận được là một hàm số theo biến số là nồng

độ phối tử. Giả định rằng mối quan hệ tuyến tính giữa cường độ huỳnh quang với

nồng độ luôn luôn được đáp ứng; và quá trình cân bằng tạo phức không bị ảnh

hưởng bởi proton trong dung dịch.

Quá trình cân bằng tạo phức M2L2 được biểu diễn như sau:

(3.1)

Mối quan hệ giữa hằng số phân ly (the equilibrium dissociation constant, Kd)

và hằng số liên kết (the equilibrium association, Ka) của phức được biểu diễn bởi

các công thức sau:

(3.2)

(3.3)

Nếu gọi F0 là cường độ huỳnh quang của phối tử (L) tự do tại nồng độ ban

đầu CL (bước sóng huỳnh quang cực đại), F0 tỷ lệ với nồng độ CL:

(3.4)

Trong đó, a là hằng số tỷ lệ thuận với hệ số hấp thụ phân tử (tại bước sóng

kích thích) và hiệu suất lượng tử huỳnh quang của phối tử L.

F là cường độ huỳnh quang của phối tử tự do (L) tại nồng độ [L], F tỷ lệ với

nồng độ [L]:

Từ (3.4) và (3.5) ta có:

(3.6)

Áp dụng định luật bảo toàn khối lượng cho phối tử và ion kim loại ta có:

(3.7)

(3.8)

Ở đây, CM là tổng nồng độ ion kim loại đã thêm vào dung dịch:

(3.9)

(3.5)

87

Từ (3.6), ta có: (3.10)

Từ (3.10) và (3.7), ta có: ] (3.11)

Từ (3.8), (3.9), và (3.11), ta có: (3.12)

Từ (3.2), (3.10), (3.11), và (3.12), ta có:

(3.13)

Từ (3.13), ta có:

Hay,

Sử dụng dung dịch có nồng độ phối tử L ban đầu CL = 5 (µM). Kết quả

chuẩn độ phổ huỳnh quang thu được ở Bảng 3.9. Vẽ đồ thị (đường cong (3.14) biểu

diễn mối liên hiện giữa nồng độ của ion kim loại thêm vào dung dịch (x) với y=F/F0

được trình bày Hình 3.21. Sử dụng phương pháp “đường công phi tuyến tính” (non-

linear curve fitness) để xác định được hằng số P1. Từ đó xác định Ka.

Bảng 3.9. Kết quả chuẩn độ phổ huỳnh quang xác định hằng số bền của Hg2L2

x 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

F 830 768 691 625 574 501 429 355

y 1,00 0,92 0,83 0,75 0,69 0,60 0,52 0,43

x 3,50 4,00 4,50 5,00 6,00 7,00 8,00 10,00

F 355 271 186 133 81 48 31 14

y 0,43 0,33 0,22 0,16 0,10 0,06 0,04 0,02

Kết quả tính toán: P1 = 0,59877. Từ (3.15), ta có: Ka = 1017,45 (M-3). Từ (3.3),

ta có: Kd = 3,57 x 10-18 (M3).

Như vậy, hằng số cân bằng tạo phức Hg2L2 bằng 1017,45 M-3 (2Hg2+ + 2L =

[Hg2L2]2+, Ka). Trong khi đó, hằng số cân bằng tạo phức Hg(RS)2 từ ion Hg(II) với

các biothiol RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) đối với Cys, GSH, Hcy

tương ứng là 1020,1; 1020,2 và 1019,7 [148]. Vì vậy, phản ứng giữa Hg2L2 với các

biothiol (Cys, GSH, Hcy) để tạo thành phức Hg(II) với các biothiol và giải phóng L

(3.14)

, với (3.15)

88

tự do có thể xảy ra. Điều này mở ra khả năng sử dụng phức Hg2L2 như một sensor

huỳnh quang dùng để phát hiện các biothiol theo kiểu tắt-bật (OFF-ON) huỳnh quang.

.

b. Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 làm sensor huỳnh quang phát hiện các

biothiol từ nhiệt động

Để xem xét khả năng sử dụng phức Hg2L2 để phát hiện các biothiol, nghiên

cứu về mặt nhiệt động của sự tương tác giữa ion Hg(II) với Cysteine (H2Cys) được

khảo sát. Các cấu trúc hình học bền của H2Cys và phức chất có thể của nó với ion

Hg(II) được xác định ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ, theo đó, có 6 cấu trúc hình

học bền của phức giữa ion Hg(II) và H2Cys đã được xác định (Hình 3.22). Các phản

ứng để tạo thành các phức được thể hiện trong Hình 3.23. Các biến thiên của

enthalpy (ΔH298) và biến thiên năng lượng Gibbs (ΔG298) của các phản ứng được

tính toán và trình bày trong Bảng 3.10.

Kết quả cho thấy sự biến thiên của enthalpies (ΔH298) và năng lượng tự do

(ΔG298) của phản ứng (14) là âm nhất, với giá trị ΔH298 là -841,8 kcal.mol-1 và giá trị

ΔG298 là -821,6 kcal.mol-1. Theo đó, [Hg(Cys)2]2-(4 kiểu phối trí) là sản phẩm thích

hợp của phản ứng giữa ion Hg(II) và H2Cys.

Như đã trình bày ở trên, sự biến thiên của năng lượng tự do của phản ứng tạo

Hg2L2 từ ion Hg(II) và sensor L là -410,2 kcal.mol‾1. Do đó, phản ứng sau xảy ra

(vì có ΔG298 là -1232 kcal.mol-1):

Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn mối liên hiện giữa nồng độ của ion

kim loại thêm vào dung dịch (x) với y=F/F0

Hg2L2 + 4 H2Cys+ 80H- 2-

2 + 8 H20 + 2LHg(Cys)2

89

Kết quả là, Hg2L2 có thể được sử dụng như một sensor huỳnh quang hoạt

động theo kiểu OFF-ON để phát hiện cysteine.

(H)

(C) (N) (S) (O) (Hg)

+2-

+ 4 H20 (13)Hg(II) + 4OH- Hg(Cys)22

+2-

+ 4 H20 (14)Hg(II) + 4OH- Hg(Cys)22

+4-

+ 6 H20 (15)Hg(II) + 6OH- Hg(Cys)33 H2Cys

H2Cys

H2Cys

+4-

+ 8 H20 (16)Hg(II) + 8OH- Hg(Cys)44 H2Cys

+ + 2 H20 (17)Hg(II) + 2OH-2 H2Cys Hg(HCys)2

+ + 3 H20 (18)Hg(II) + 3OH-3 H2Cys Hg(HCys)2

(b)

(c)

-1

Hình 3.23. Các phản ứng tạo thành các phức giữa H2Cys với ion Hg(II)

Hình 3.22. Các cấu trúc hình học bền của H2Cys (a) và phức chất có thể của nó

với ion Hg (II): (b) [Hg(Cys)2]2- (2 kiểu phối trí), (c) [Hg(Cys)2]2-(4 kiểu phối

trí), (d) [Hg(Cys)3]4-, (e) [Hg(Cys)4]6-, (f) [Hg(HCys)2] (2 kiểu phối trí),

(g)[Hg(HCys)3]1- ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

90

Bảng 3.10. Các biến thiên của enthalpy (ΔH298) và biến thiên năng lượng Gibbs

(ΔG298) của các phản ứng để tạo thành phức giữa ion Hg (II) với H2Cys ở mức lý

thuyết B3LYP/LanL2DZ (kcal.mol‾1)

Phản ứng ΔH298 ΔG298

(13) -821,6 -806,2

(14) -841,8 -821,6

(15) -782,4 -758,2

(16) -569,3 -536,2

(17) -707,3 -688,5

(18) -836,7 -808,9

3.1.4.2. Nghiên cứu thực nghiệm sử dụng phức Hg2L2 làm sensor huỳnh quang

để phát hiện các biothiol

a. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của phức Hg2L2

Phức chất Hg2L2 được sử dụng để xác định phân tử sinh học có chứa thiol

trong dung dịch nước. Cys được đưa vào dần dần trong dung dịch của Hg2L2, các

đường cong chuẩn độ đã được mô tả ở Hình 3.24.

Hình 3.24. Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của dung dịch Hg2L2

(2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH=~7,4, ở 25C khi thêm 0-10 μM

Cys, bước sóng kích thích 540 nm, bước sóng phát huỳnh quang 585 nm

91

Hình 3.24a cho thấy, khi tăng dần Cys vào dung dịch phức Hg2L2, trong phổ

UV-Vis thu được, đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 460 nm dần dần biến mất, đồng

thời xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại mới với cường độ hấp thụ rất mạnh ở bước

sóng 540 nm. Thêm vào đó một điểm isosbestic xuất hiện tại bước sóng 490 nm.

Khi nồng độ Cys thêm vào dung dịch đúng bằng một đương lượng so với Hg2L2,

phổ UV-Vis thu được hoàn toàn phù hợp với phổ UV-Vis của dung dịch L tự do có

cùng nồng độ. Kết quả này có thể giải thích là do Cys đã phản ứng với Hg2L2 và

giải phóng L tự do, làm thay đổi phổ hấp thụ. Tương tự, Hình 3.24b cho thấy, dung

dịch Hg2L2 hầu như không phát huỳnh quang ở bước sóng 585 nm. Khi thêm dần

Cys vào dung dịch Hg2L2, cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại. Khi lượng Cys

thêm vào đạt một đương lượng, cường độ huỳnh quang dung dịch ở bước sóng 585

nm đạt khoảng 95% so với cường độ huỳnh quang của dung dịch L tự do có cùng

nồng độ ban đầu. Kết quả này một lần nữa cho thấy Cys đã phản ứng với Hg2L2 và

giải phóng L tự do.

b. Khảo sát ảnh hưởng của các amino acids cạnh tranh và phản ứng của Hg2L2

với các biothiol

Để đánh giá độ chọn lọc của sensor (phức Hg2L2) đối với các amino acids,

tương tác giữa phức Hg2L2 (2,5 μM) với các amino acids (10 μM cho mỗi amino

acid) trong dung dịch HEPES (10 mM, pH =7,4) đã được khảo sát ở Hình 3.25. Kết

quả trình bày ở Hình 3.25a cho thấy, chỉ có các amino acids có chứa nhóm thiol,

bao gồm Cys, GHS và Hcy mới làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh quang của

dung dịch, kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết. Cys làm phục hồi cường độ

huỳnh quang đạt đến trên 95% so với cường độ huỳnh quang của dung dịch L tự do

có cùng nồng độ (5 μM). Sự phục hồi cường độ huỳnh quang giảm dần theo thứ tự

Cys > GSH > Hcy. Trong khi đó, các amino acids khác không chứa nhóm thiol bao

gồm alanine (Ala), aspartic (Asp), arginine (Arg), glycine (Gly), glutamic (Glu),

isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), threonine (Thr),

serine (Ser), tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), valine (Val), và histidine (His), hầu

như không làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch phức Hg2L2. Điều này

chỉ ra rằng có thể sử dụng phức Hg2L2 như một sensor huỳnh quang để phát hiện

92

chọn lọc các biothiol trong sự hiện diện của các amino acids không chứa

nhóm thiol.

Sự phục hồi cường độ huỳnh quang giảm dần theo thứ tự Cys > GSH > Hcy

có thể giải thích là do hằng số cân bằng tạo phức Hg(RS)2, (2Hg(II) + 2RSH =

Hg(SR)2 + 2H+, Ka) của Cys xấp xỉ bằng GSH và lớn hơn so với Hcy [148]. Ngoài

ra, đối với Cys còn có phản ứng hình thành phức [Hg(RSH)2]2+ với Ka=1061,79

(2Hg(II) + 2RSH = Hg(RSH)2, Ka) [10]; với GSH còn có phản ứng hình thành phức

Hg(RS)+ là 1035,68 (Hg(II) + RS- = Hg(RS)+, Ka) [109].

Sự thay đổi cường độ huỳnh quang của dung dịch Hg2L2 theo các nồng độ

khác nhau của từng biothiol cũng đã được khảo sát và trình bày ở Hình 3.25b. Kết

quả thí nghiệm cho thấy, khi tăng dần nồng độ Cys, GSH và Hcy từ 0 đến 5 μM vào

dung dịch Hg2L2 (2,5 μM), cường độ huỳnh quang của dung dịch tăng tuyến tính

với nồng độ các biothiol. Điều này cho thấy, có thể sử dụng Hg2L2 (2,5 μM) để phát

hiện Cys, GSH và Hcy trong khoảng nồng độ từ 0 đến 5 μM. Trong đó, cường độ

huỳnh quang tăng mạnh nhất là Cys, tiếp đến là GSH, Hcy. Sau đó, nếu tiếp tục

(μM)

Hình 3.25. (a) Phổ huỳnh quang của Hg2L2 (2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (pH

=7,4, 1/9, v/v) tại 25 oC khi thêm các amino acids khác nhau (mỗi loại 10 μM), bao gồm

Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, và His

(Others: hỗn hợp gồm tất cả các amino acids kể trên ngoại trừ Cys, Hcy và GSH).

(b) Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) của dung dịch Hg2L2

(2,5 μM) với các nồng độ khác nhau của Cys, GSH, Hcy, và các amino acids khác

93

thêm các biothiol vào dung dịch Hg2L2, cường độ huỳnh quang của dung dịch tăng

không đáng kể.

Thời gian của phản ứng giữa sensor Hg2L2 với Cys đã được khảo sát. Kết

quả, phản ứng này xảy ra rất nhanh, khoảng vài giây, nhanh hơn nhiều so với các

sensor tương tự đã công bố trước đây (10-40 phút) [39], [48], [154], [163], [189].

c. Khảo sát sử dụng Hg2L2 phát hiện định lượng Cys

Khả năng sử dụng phức Hg2L2 để

phát hiện định lượng Cys đã được

khảo sát và trình bày ở Hình 3.26.

Kết quả khảo sát cho thấy, trong

khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 5

μM, cường độ huỳnh quang dung

dịch Hg2L2 (2,5 μM) có mối quan

hệ tuyến tính rất tốt với nồng độ

Cys, thể hiện bởi phương trình

F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0)

× [Cys], với R = 0,998 (N=14,

P<0,0001).

Độ chính xác của phương pháp phát hiện Cys bằng Hg2L2 đã được đánh giá

thông qua độ lặp lại và độ thu hồi (Rev). Kết quả khảo sát độ lặp lại (nồng độ Cys là

Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ

giữa cường độ huỳnh quang dung dịch Hg2L2

(2,5 μM) với Cys tại 585 nm

Giới hạn phát hiện và giới hạn

định lượng Cys bằng phương

pháp đường chuẩn ở nồng độ bé

(Hình 3.27; các số liệu thực

nghiệm được đính kèm ở Bảng 3.

PL54 và Bảng 4. PL55) tương

ứng là 0,2 μM và 0,66 μM, thấp

hơn nhiều so với nồng độ của Cys

trong tế bào ở người (30-200 μM)

[59], nhạy hơn nhiều so với các

sensor tương tự đã công bố trước

đây [23], [112], [140], [155].

Hình 3.27. Đồ thị xác định LOD và LOQ

Cys bằng Hg2L2: 2,5 μM, trong C2H5OH/HEPES

(1/9, v/v), pH =7,4, bước sóng huỳnh quang 585 nm

(μM)

94

Độ chính xác của phương pháp phát hiện Cys bằng Hg2L2 đã được đánh giá

thông qua độ lặp lại và độ thu hồi (Rev). Kết quả khảo sát độ lặp lại (nồng độ Cys là

250 ppb, n=10) có độ lệch chuẩn tương đối RSD=7,8%, nhỏ hơn 0,5RSDH =9,9

(RSDH là độ lệch chuẩn tương đối tính theo hàm Horwitz). Độ thu hồi trong khoảng

từ 92,1% đến 107,9%, thỏa mãn điều kiện <0,5RSDH. Điều này cho

thấy có thể sử dụng Hg2L2 để xác định Cys với kết quả đáng tin cậy [105].

Kết quả khảo sát ở Hình 3.28 cho thấy rằng, quá trình hình thành phức Hg2L2

và quá trình phân ly phức giải phóng L xảy ra thuận nghịch, thể hiện qua sự đáp

ứng tắt-bật (OFF/ON) huỳnh quang rất nhanh. Cụ thể, khi thêm một đương lượng

ion Hg(II) vào dung dịch L dẫn đến sự dập tắt huỳnh quang. Tiếp theo, khi bổ sung

thêm một đương lượng Cys, huỳnh quang dung dịch trở lại gần như ban đầu của

dung dịch L tự do. Thí nghiệm cũng cho thấy, sau 5 chu kỳ luân phiên thêm một

đương lượng ion Hg(II), rồi đến một đương lượng Cys, cường độ huỳnh quang dung

dịch có giảm, nhưng không đáng kể so với dung dịch L tự do ban đầu, có thể khôi

phục được hơn 80% cường độ huỳnh quang sau 5 chu kỳ. Kết quả này cho thấy,

phương pháp này có thể tái sử dụng sensor khi xác định ion Hg(II) và Cys.

Hình 3.28. Cường độ huỳnh quang dung dịch L (5 μM) tại 585 nm khi thêm luân

phiên một đương lượng ion Hg(II) và Cys trong 10 vòng (Hg(II): 5 μM, Cys:5 μM,

Hg(II):5 μM, Cys:5 μM...), trong C2H5OH/HEPES, pH= 7,4, 1/9, v/v)

95

KẾT LUẬN CHUNG VỀ NGHIÊN CỨU SENSOR L

1. Sensor L mới dựa trên dẫn xuất của cyanine đã được nghiên cứu hoàn chỉnh

từ thiết kế tổng hợp đến ứng dụng bởi sự kết hợp linh hoạt giữa tính toán

lượng tử và nghiên cứu thực nghiệm.

2. Tính toán lý thuyết cho thấy, sensor L với cấu trúc cyanine, có thể tổng hợp

được từ các chất đầu gồm BZT, DHB và acid bromoacetic. Thực nghiệm đã

tổng hợp được sensor L dựa trên kết quả tính toán lý thuyết.

3. Cấu trúc và đặc tính của sensor L đã được nghiên cứu ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ. Sensor L được dự đoán là một chất phát huỳnh quang.

96

4. Kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, sensor L là một chất phát huỳnh

quang, có thể sử dụng để phát hiện ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức,

hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định

lượng ion Hg(II) theo phương pháp trắc quang là 15,3 μg/và 51,2 μg/L hay

0,076 μM và 0,25 μM; và theo phương pháp huỳnh quang là 11,8 μg/ và 39,3

μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM. Sensor L có thể phát hiện chọn lọc ion

Hg(II) trong sự hiện diện của các ion kim loại cạnh tranh Cd(II), Fe(II),

Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I) và K(I).

5. Tính toán lý thuyết đã xác định được cấu trúc bền và các đặc tính huỳnh

quang của phức Hg2L2, phức tạo bởi sensor L và ion Hg(II). Sự hình thành

các tương tác kim loại - phối tử trong phức, đã dẫn đến làm giảm khoảng

cách năng lượng giữa HOMO và LUMO, đồng thời làm thay đổi hệ

liên hợp electron π, là nguyên nhân dẫn đến sự dập tắt huỳnh quang

trong phức Hg2L2.

6. Nghiên cứu lý thuyết đã chỉ ra rằng phức Hg2L2 có thể sử dụng như một

sensor huỳnh quang để phát hiện Cys, hoạt động theo cơ chế phản ứng trao

đổi phức, kiểu tắt-bật huỳnh quang. Kết luận này đã được khẳng định bởi các

nghiên cứu thực nghiệm sau đó. Phức Hg2L2 có thể sử dụng như một sensor

huỳnh quang phát hiện chọn lọc Cys trong sự hiện diện các amino acids

không chứa nhóm thiol. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương

ứng là 0,2 μM và 0,66 μM.

97

3.2. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dựng của sensor huỳnh quang AMC

từ dẫn xuất coumarin phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael

3.2.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng giữa sensor

AMC với các biothiol

3.2.1.1. Nghiên cứu lý thuyết thiết kế và tổng hợp sensor AMC

Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy, các dẫn xuất của 7-

hydroxycoumarin là những hợp chất phát huỳnh quang mạnh mẽ, có bước sóng hấp

thụ cực đại trong khoảng từ 359 nm đến 413 nm, bước sóng phát xạ cực đại trong

khoảng từ 445 nm đến 515 nm. Trong đó, 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực

đại ở bước sóng 359 nm và phát xạ cực đại ở bước sóng 449 nm [159].

Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7-acryloyl-4-methylcouramin) từ dẫn

xuất của coumarin dùng để phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael,

hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin (A) đã được chọn làm fluorophore, acryloyl

chloride (B) được chọn làm receptor, vì các lý do: một là, phản ứng gắn receptor lên

fluorophore dễ dàng thực hiện thông qua phản ứng ester hóa giữa nhóm phenol với

dẫn xuất acid [2] hình thành AMC với hệ thống liên hợp electron π kiểu: liên kết π -

cặp electron không chia - liên kết π; hai là, receptor này có thể gây ra phản ứng

cộng với các biothiol, kèm theo đó là những thay đổi trong đặc tính huỳnh quang

của AMC, sensor dự kiến tổng hợp sẽ có độ nhạy và độ chọn lọc cao.

Quá trình thiết kế và tổng hợp sensor AMC được trình bày ở Hình 3.29.

OO OH OO O

O

AMC

O

Cl+

HCl+

(A)

(B)

Hình 3.29. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor AMC

Để xem xét khả năng xảy ra của phản ứng tổng hợp sensor AMC, hình học

bền của các chất được trình bày ở Hình 3.30, năng lượng của các chất tham gia và

sản phẩm phản ứng đã được tính toán ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ. Tọa độ

Fluorophore

Receptor

98

XYZ của các chất được trình bày ở phần Phụ lục 26, 27, 28 và 29. Kết quả tính toán

ΔH298 và ΔG298 của phản ứng được trình bày ở Bảng 3.11.

(H) (C) (O) (Cl)

Hình 3.30. Hình học bền của các chất tham gia và các sản phẩm của phản ứng

tổng hợp sensor AMC ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) 4-methyl-7-

hydroxycoumarin; (b) acryloyl chloride; (c) Hydrochlorine và (d) AMC

Bảng 3.11. Biến thiên Enthalpy và năng lượng tự do Gibbs của phản ứng

tổng hợp sensor AMC ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ (kcal.mol-1)

Thông số ΔH298 ΔG298

Giá trị -2,82 -0,69

(a)

(b)

(c)

(d)

99

Kết quả tính toán ở Bảng 3.11 cho thấy, biến thiên enthalpy (ΔH298) và năng

lượng tự do Gibbs (ΔG298) của phản ứng tổng hợp sensor AMC là âm, theo đó phản

ứng tổng hợp sensor AMC là thuận lợi về mặt nhiệt động.

Như trình bày ở phần trước, một phản ứng hóa học xảy ra cần phải đáp ứng

cả điều kiện về nhiệt động học và điều kiện về động học (để tốc độ phản ứng đủ

lớn). Tuy nhiên, mục tiêu của nghiên cứu này là kết hợp linh hoạt giữa tính toán và

thực nghiệm, nên chỉ dừng lại ở mức dự đoán khả năng phản ứng và hướng sản

phẩm dựa trên các thông số nhiệt động, sau đó tiến hành thực nghiệm dựa trên dự

đoán của tính toán. Sự kết hợp linh hoạt này sẽ giảm tải khối lượng công việc tính

toán hoặc thực nghiệm, tùy vào trường hợp cụ thể, sẽ tiến nhanh đến mục

đích cuối cùng.

3.2.1.2. Nghiên cứu lý thuyết về phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol

Theo các kết quả nghiên cứu đã được công bố, phản ứng cộng Michael

giữa các biothiol (Cys, Hcy và GSH) với các ester tạo bởi acid acrylic và các

ancol (thường là các fluorophore), ban đầu tạo ra các thioester, tiếp theo là hình

thành các hợp chất dị vòng của S, N, chứa 7 nguyên tử đối với trường hợp của

Cys (phản ứng thường xảy ra rất nhanh), hoặc chứa 9 nguyên tử đối với trường

hợp của Hcy (phản ứng thường xảy ra chậm hơn nhiều so với Cys) và giải phóng

các ancol là các fluorophores tự do. Trong khi đó, các thioether của GSH thường

bền, không xảy ra quá trình tạo các hợp chất vòng sau đó [92].

Để tìm hiểu vấn đề này, các phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol

(Hình 3.31) được đánh giá về mặt nhiệt động dựa trên biến thiên enthalpy

(ΔH298) và năng lượng tự do Gibbs (ΔG298) của các phản ứng.

Hình học bền ở trạng thái cơ bản của các chất liên quan cũng được xác

định ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ và trình bày ở Hình 3.32. Tọa độ XYZ

của các chất được trình bày ở Phụ lục 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 và 37. Kết quả

tính toán các thông số nhiệt động ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ được tóm

tắt ở Bảng 3.12.

100

OO O

O

S

AMC-Hcy

NH2

COOH

OO O

O

OO O

O

S

NH2

COOH

AMC AMC-Cys

SH

NH2

COOH

SH

NH2

COOH

OO O

O

S

AMC-GSH

OO OHHN

S

O

HOOC

(1)

(2)

OO O

O

AMC

OO OH

(4)

(3)

HN S

O

HOOC

OO O

O

AMC

(5)

OO O

O

S

NH2

COOH

AMC-Cys

OO O

O

S

NH2

COOH

AMC-Hcy

COOH

HN

NH

COOH

O

O

H2N

SH

HOOC

NH

HN

HOOC

O

O

NH2

Hình 3.31. Các sản phẩm có thể có của phản ứng giữa AMC

với Cys, Hcy, GSH

101

(H) (C) (O) (N) (S)

Hình 3.32. Hình học bền của các chất tạo thành giữa AMC với Cys, Hcy, GSH

ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a): AMC, (b): Cys, (c): AMC-Cys, (d): 4-

methyl-7-hydroxycoumarin, (e): axit 5-oxo-1,4-thiazepane-3-carboxylic, (f):

Hcy, (g): AMC-Hcy, (h): axit 6-oxo-1,5-thiazocane-4-carboxylic, (i): GSH, (k):

AMC-GSH

102

Bảng 3.12. Kết quả tính toán ΔH298 và ΔG298 của các phản ứng giữa AMC với

Cys, Hcy và GSH ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

(kcal.mol-1, trong dung môi ethanol)

Phản ứng (1) (2) (3) (4) (5)

ΔH298 -15,67 5,37 -15,10 11,03 -16,03

ΔG298 -2,67 -2,50 -2,16 3,07 -3,11

Kết quả tính toán ở Bảng 3.12 cho thấy: phản ứng giữa sensor AMC với Cys

để hình thành thioester (phản ứng (1)) có ΔH298 và ΔG298 của phản ứng đều âm,

trong khi đó phản ứng tạo hợp chất dị vòng và giải phóng fluorophore (phản ứng

(2)) có ΔH298 của phản ứng dương và ΔG298 của phản ứng âm. Điều này cho thấy, sự

tạo thành sản phẩm theo phản ứng (1) chiếm ưu thế hơn phản ứng (2); các phản ứng

giữa sensor AMC với Hcy và GSH để hình thành thioester (phản ứng (3) và (phản

ứng (5)) là thuận lợi về mặt năng lượng, vì các giá trị ΔH298 và ΔG298 của các phản

ứng này là âm. Các phản ứng phân tách các thioether của Hcy và GSH sau đó để

hình thành các hợp chất dị vòng là không thuận lợi về nhiệt động. Cụ thể, ΔH298 và

ΔG298 của phản ứng (4) là dương. Như vậy, tính toán lý thuyết cho thấy phản ứng

giữa AMC với Cys, Hcy và GSH tạo các thioester là thuận lợi về nhiệt động.

Qua việc nghiên cứu tính toán lý thuyết cho thấy: sensor AMC có thể tổng

hợp được từ 7-acryloyl-4-methylcouramin và acryloyl chloride; sensor AMC phản

ứng với Cys theo tỉ lệ mol 1:1 và tạo thioester. Để kiểm định và khẳng định những

kết quả tính toán này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu phần thực nghiệm.

3.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của AMC

3.2.2.1. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp sensor AMC

Sản phẩm AMC sau khi tổng hợp (như đã trình bày ở Chương 2), cấu trúc

của nó đã được khẳng định bởi phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS. Kết quả phổ 1H-

NMR (CDCl3, ppm): 2.44 (s, 3H, CH3OAr), 6.10 (d, 1H, CH=), 6.28-6.37 (m, 2H,

=CH2), 6.68 (d, 1H, ArH), 7.14 (d, H, ArH), 7.17 (d, H, ArH),7.64 (d, 1H, ArH).

Kết quả phổ khối FAB-MS: m/z = 230.1. Phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS được trình

bày ở Phụ lục 38, 39.

103

3.2.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm về đặc tính và ứng dụng của sensor AMC

a. Khảo sát phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC

Kết quả khảo sát thực nghiệm phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của dung

dịch AMC được thể hiện ở Hình 3.33. Ở phổ hấp thụ (Hình 3.33a), AMC đạt cực

đại tại bước sóng 275 và 320 nm trong ethanol/HEPES, với hệ số hấp thụ mol xác

định được là 104 M-1.cm-1. Khi thêm Cys vào dung dịch của AMC, phổ hấp thụ thay

đổi không đáng kể. Ở phổ huỳnh quang, AMC hiển thị một dải phát xạ huỳnh

quang vai với hai đỉnh cực đại ở bước sóng 375 nm và 450 nm trong

ethanol/HEPES (Hình 3.33b). Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ) của sensor

AMC đã được xác định là khá nhỏ, bằng 0,05 so với chất chuẩn là 9,10-

diphenylanthracene (Φ = 1).

Khi thêm Cys vào dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng

dần ở cả hai đỉnh phát xạ. Trong đó, cường độ huỳnh quang tăng mạnh mẽ ở

bước sóng 450 nm, trong khi đó cường độ huỳnh quang ở bước sóng 375 nm có

sự gia tăng không đáng kể. Cuối cùng, khi thêm một lượng vừa đủ Cys vào dung

dịch sensor AMC để phản ứng kết thúc, cường độ huỳnh quang ở bước sóng 450

nm tăng gấp 8 lần, trong khi đó cường độ phát xạ ở bước sóng 375 nm chỉ tăng

Hình 3.33.(a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM) trong C2H5OH/HEPES (pH=7,4, 1/4,

v/v) tại 25C khi thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang, AMC (10 μM) khi thêm 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys trong

C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) tại 25C, bước sóng kích thích 320 nm

104

2,2 lần. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang ở cả hai bước sóng 375 và 450 nm

như trên dẫn đến một khả năng có thể sử dụng AMC để làm sensor huỳnh quang

hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng

(ratiometric fluorescent sensor) để xác định Cys. Một kiểu sensor huỳnh quang

có nhiều ưu điểm vượt trội, nhất là khắc phục sự ảnh hưởng của tín hiệu huỳnh

quang nền khi ứng dụng phân tích trong thực tế.

b. Khảo sát phản ứng giữa sensor AMC với Cys

Mối quan hệ giữa tỷ lệ cường độ huỳnh quang của dung dịch thu được ở

hai bước sóng 450nm và 375 nm (F450/375) với nồng độ Cys đã được khảo sát và

trình bày ở Hình 3.34a. Kết quả cho thấy, khi thêm Cys trong khoảng nồng độ từ

0 đến 10 μM vào dung dịch AMC (10 μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai

bước sóng 450nm và 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng

độ Cys. Sau đó, tỷ lệ này thay đổi không đáng kể nếu tiếp tục tăng nồng độ Cys.

Điều này cho thấy phản ứng giữa AMC với Cys xảy ra theo tỷ lệ mol 1:1.

Hình 3.34. (a) Mối quan hệ giữa tỷ lệ cường độ huỳnh quang của AMC ở hai bước

sóng 450 nm và 375 nm(F450/375) ở 3.33b với nồng độ Cys;(b) Đồ thị xác định hệ số

tỷ lượng phản ứng giữa AMC với Cys

Quá trình xác định thành phần của phản ứng giữa AMC với Cys được thực

hiện theo phương pháp đồng phân tử gam trong C2H5OH/HEPES (1/4, v/v) ở pH

=7,4, bước sóng huỳnh quang 450 nm, bước sóng kích thích 320 nm, với

[AMC]+[Cys] = 10 µM được trình bày ở trình bày ở Hình 3.34b. Kết quả cũng chỉ

ra rằng AMC phản ứng với Cys theo tỉ lệ mol 1:1.

F45

0/37

5

Cư

ờn

g độ

huỳ

nh q

uang

tại

45

0 nm

[Cys]/x10 μM [AMC]/AMC+[Cys] (μM)

105

Kết luận trên cũng được khẳng định khi nghiên cứu phổ khối lượng của

sản phẩm phản ứng giữa AMC và Cys, bằng chứng trong phổ khối lượng xuất

hiện các mũi: m/z = 352,08 (ứng với AMC-Cys+H+) và m/z = 374,07 (ứng với

AMC-Cys+Na+) (Hình 3.35).

Hình 3.35. Phổ khối của AMC-Cys

Những dữ liệu phân tích trên khẳng định rằng AMC phản ứng với Cys

theo tỉ lệ mol 1:1. Sơ đồ phản ứng giữa AMC và Cys hình thành thioester được

trình bày ở Hình 3.36.

OO O

O H2N SH

HOOC

OO O

O

S

NH2

COOH

AMC AMC-Cys

Hình 3.36. Sơ đồ phản ứng giữa AMC với Cys

Tương tự như Cys, khi thêm GSH và Hcy trong khoảng nồng độ từ 0 đến

10 μM vào dung dịch AMC (10 μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước

sóng 450 nm và 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ

GSH và Hcy (Hình 3.37). Sau đó, tỷ lệ này thay đổi không đáng kể nếu tiếp tục

tăng nồng độ GSH và Hcy. Điều này cũng cho thấy phản ứng giữa AMC với

106

GHS và Hcy xảy ra theo tỷ lệ mol 1:1.

c. Khảo sát ảnh hưởng của các amino acids cạnh tranh

Để đánh giá tính chọn lọc của sensor AMC đối với các biothiol khác

nhau, phản ứng giữa AMC (10 μM) với các amino acids khác nhau (50 μM)

trong dung dịch HEPES (10 mM, pH = 7,4) đã được khảo sát và trình bày

ở Hình 3.38.

Kết quả khảo sát cho thấy, tương tự như Cys, khi bổ sung các amino acids có

chứa thiol gồm GSH và Hcy, cường độ huỳnh quang của dung dịch AMC cũng tăng

lên rõ rệt ở cả hai dải phát xạ, trong đó tăng mạnh mẽ ở bước sóng 450 nm và tăng

không đáng kể ở bước sóng phát xạ 375 nm. Tuy nhiên, mức độ gia tăng cường độ

huỳnh quang ghi nhận được không giống nhau, theo đó mức độ gia tăng cường độ

huỳnh quang theo thứ tự như sau: Cys> GSH> Hcy (Hình 3.38a).

Đối với các amino acids khác không có chứa nhóm mercapto như Arginine

(Arg), Glycine (Gly), Alanine (Ala), Aspartic acid (Asp), Glutamic acid (Glu),

Leucine (Leu), Lysine (Lys), Isoleucine (Ion), Methionine (Met), Threonine (Thr),

Serine (Ser), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) và Valine (Val); các amino acids

này hầu như không làm thay đổi cường độ huỳnh quang của dung dịch sensor AMC

F45

0/37

5

Nồng độ biothiols/x10 μM

Hình 3.37. Mối quan hệ giữa tỷ lệ cường độ huỳnh quang (F450/375) của

dung dịch AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC)

với nồng độ Cys, GSH và Hcy

107

(Hình 3.38a). Sự có mặt của amino acids này cũng không làm ảnh hưởng đến phản

ứng giữa các biothiol (Cys, GSH và Hcy) với AMC, bằng chứng là không có sự

khác biệt đáng kể giữa phổ huỳnh quang của các dung dịch gồm AMC + biothiol +

các amino acids so với phổ huỳnh quang của các dung dịch gồm AMC + biothiol

(Hình 3.38b).

Hình 3.38. (a) Phổ huỳnh quang của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH =7,4,

1/4, v/v, tại 25 oC) khi thêm Cys, Hcy, GSH, các amino acids khác (bao gồm Arg,

Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val);(b) Phổ huỳnh

quang của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) trong sự

hiện diện của hỗn hợp các amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu,

Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val) khi thêm Cys, Hcy và GSH

Những kết quả trên cho thấy rằng, có thể sử dụng sensor AMC để phát

hiện chọn lọc các biothiol trong sự hiện diện của các amino acids đã khảo sát.

d. Khảo sát sử dụng sensor AMC phát hiện định lượng Cys

Để sử dụng sensor AMC xác định định lượng nồng độ Cys, phương trình

quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ cường độ huỳnh quang của dung dịch thu được ở

hai bước sóng 450 nm và 375 nm (F450/375) với nồng độ Cys đã được xác định

(Hình 3.34a). Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến

10 μM, tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 nm và 375 nm (F450/375)

có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys theo phương trình: F450/375 =

1,5431 + 2,257 × [Cys], với hệ số tương quan tuyến tính R = 0,982. Kết quả này

cho thấy có thể sử dụng sensor AMC để xác định định lượng nồng độ Cys.

108

0 1 2 3 4 5 616

18

20

22

24

26

28

30

32

F450/373

[C ys]

Hình 3.39. Đồ thị xác định LOD và LOQ Cys bằng AMC: AMC (10 μM),

trong C2H5OH/HEPES (1/4, v/v), pH=7,4, bước sóng huỳnh quang 450 nm

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Cys bằng sensor

AMC đã được xác định bằng phương pháp đường chuẩn ở nồng độ bé (Hình 3.39;

các số liệu thực nghiệm được đính kèm ở Bảng 5. PL56 và Bảng 6. PL57), tương

ứng là 0,5 μM và 1,65 μM, thấp hơn nhiều so với nồng độ Cys trong tế bào nội bào

(30-200 μM) [59]. Kết quả này cũng thấp hơn nhiều so với một số sensor huỳnh

quang đã công bố [23], [112], [140], [155].

Thời gian của phản ứng giữa sensor AMC với Cys đã được khảo sát. Kết

quả, phản ứng này xảy ra khá nhanh, khoảng 5 phút, trong khi đó các sensor công

bố trước đây cho các biothiol dựa trên phản ứng tương tự phải cần đến 10-40 phút

[39], [48], [154], [166], [189].

Độ chính xác của phương pháp phát hiện Cys bằng AMC đã được đánh giá

thông qua độ lặp lại và độ thu hồi (Rev). Kết quả khảo sát độ lặp lại (nồng độ Cys là

5 μM, n=10) có độ lệch chuẩn tương đối RSD=5,8%, nhỏ hơn 0,5RSDH =6,28

(RSDH là độ lệch chuẩn tương đối tính theo hàm Horwitz). Độ thu hồi trong khoảng

từ 93,9% đến 106,1%, thỏa mãn điều kiện <0,5RSDH. Điều này cho thấy

có thể sử dụng AMC để xác định Cys với kết quả đáng tin cậy [105].

Những kết quả nghiên cứu về thực nghiệm cho thấy: sensor AMC đã được

tổng hợp như dự đoán tính toán; sensor AMC hấp thụ cực đại tại hai bước sóng 275

nm và 320 nm và phát huỳnh quang yếu (=0,05) tại hai bước sóng 375 nm và 450

(μM)

109

nm. AMC-thiol phát huỳnh quang tại hai bước sóng 375 nm và 450 nm trong đó

cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài mạnh hơn bước sóng ngắn; sensor AMC

phản ứng với Cys theo tỉ lệ mol 1:1 tạo thioester, kết quả này phù hợp với tính toán;

sensor AMC phát hiện chọn lọc Cys trong sự có mặt các amino acids cạnh tranh.

Để làm sáng tỏ về đặc tính huỳnh quang của AMC và sản phẩm cộng của nó với

các biothiol cũng như khả năng ứng dụng của sensor AMC, chúng tôi tiếp tục

nghiên cứu về lý thuyết nội dung này.

3.2.3. Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của sensor AMC

3.2.3.1. Nghiên cứu hình học tối ưu của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-

GSH ở trạng thái cơ bản (GS) và trạng thái kích thích electron (EES)

Để hiểu rõ bản chất và giải thích sự thay đổi đặc tính huỳnh quang của sensor

AMC và các sản phẩm từ phản ứng cộng giữa các biothiol với AMC, các nghiên

cứu lý thuyết về trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích đã được thực hiện bằng

phương pháp TD-DFT ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ.

Hình học tối ưu ở trạng thái cơ bản S0 và trạng thái kích thích electron S1, S2

của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH được trình bày từ Hình 3.40 đến

Hình 3.43. Tọa độ XYZ của các chất ở trạng thái cơ bản và các trạng thái kích thích

S1, S2 được trình bày từ Phụ lục 40 đến Phụ lục 51.

(H) (C) (O)

Hình 3.40. Hình học tối ưu ở trạng thái cơ bản (RGS) (a) và trạng thái kích thích

electron S1 (b) và S2 (c) (REES1, REES2) của AMC ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

110

(H) (C) (O) (N) (S)

Hình 3.41. Hình học tối ưu ở trạng thái cơ bản (RGS) (a) và trạng thái kích thích

electron S1 (b) và S2 (c) (REES1, REES2) của AMC-Cys ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ

111

(H) (C) (O) (N) (S)

Hình 3.42. Hình học tối ưu ở trạng thái cơ bản (RGS) (a) và trạng thái kích thích

electron S1 (b) và S2 (c) (REES1, REES2) của AMC-Hcy ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ

112

(H) (C) (O) (N) (S)

Hình 3.43. Hình học tối ưu ở trạng thái cơ bản (RGS) (a) và trạng thái kích thích

electron S1 (b) và S2 (c) (REES1, REES2) của AMC-GSH (d) ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ

113

Bảng 3.13. Góc xoắn nhị diện (độ) giữa tiểu phần acryloyl và tiểu phần coumarine ở

trạng thái cơ bản (RGS), và trạng thái kích thích electron (REES1, REES2) của AMC,

AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Trạng thái C1-C2-O3-O4

(α)

O3-C2-O4-C5

(β)

C1-C2-C5-C6

(γ)

O3-C2- C5-C6

(δ)

S0 (AMC) 180,0 0,0 180,0 0,0

S1 (AMC) 108,8 73,3 96,4 69,8

S2 (AMC) 121,7 60,9 100,5 61,4

S0 (AMC-Cys) 178,0 2,6 132,3 47,1

S1 (AMC-Cys) 179,3 0,4 116,5 64,1

S2 (AMC-Cys) 178,9 1,0 177,6 1,9

S0 (AMC-Hcy) 177,6 3,1 129,8 49,3

S1 (AMC-Hcy) 178,3 1,0 135,1 43,3

S2 (AMC-Hcy) 179,4 0,7 176,2 3,6

S0 (AMC-GSH) 177,8 2,9 131,9 47,4

S1 (AMC-GSH) 178,5 1,0 119,9 58,7

S2 (AMC-GSH) 179,0 0,9 175,6 3,8

Bảng 3.13 trình bày tóm tắt góc xoắn nhị diện giữa tiểu phần acryloyl và tiểu

phần coumarine ở trạng thái S0, S1, S2 của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-

GSH. Kết quả cho thấy, đối với sensor AMC, ở trạng thái S0, tiểu phần coumarin và

114

acryloxy gần như đồng phẳng với số đo các góc nhị diện α, β, γ và δ lần lượt là

180o, 0o, 180o và 0o. Trong khi đó, trong trạng thái S1 và S2, tiểu phần coumarin và

acryloxy gần như ở trong hai mặt phẳng vuông góc với nhau; số đo các góc nhị diện

α, β, γ và δ trong S1 lần lượt là 108,8o; 73,3o; 96,4o và 69,8o; trong S2 lần lượt là

121,7o; 60,9o; 100,6o và 61,4o.

Khác với AMC, đối với AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, ở trạng thái

S0 và trạng thái S1, có sự xoắn góc giữa tiểu phần coumarin và acryloxy, với số đo

góc δ nằm trong khoảng từ 43,3o đến 64,1o. Trong khi đó, ở trạng thái S2, tiểu phần

coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng với số đo các góc α, β, γ và δ gần như

bằng 180o hoặc 0o.

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy có sự khác nhau về cấu trúc giữa trạng

thái S0 và các trạng thái S1 và S2 trong AMC cũng như sản phẩm cộng của AMC

với các biothiol. Cấu trúc các trạng thái S0, S1 và S2 của AMC cũng có sự khác biệt

với AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH. Đây có thể là nguyên nhân làm xuất hiện

sự khác biệt về đặc tính huỳnh quang như trình bày ở phần thực nghiệm, giữa

sensor AMC và các sản phẩm từ phản ứng cộng các biothiol với AMC.

3.2.3.2. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích và phổ huỳnh quang

a. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích

Năng lượng kích thích, cường độ dao động, các MO có liên quan đến quá

trình kích thích chính và các MO biên của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-

GSH đã được xác định bằng phương pháp TD-DFT ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ. Kết quả được tóm tắt từ Bảng 3.14 đến Bảng 3.17 và từ Hình

3.44 đến Hình 3.47.

Từ số liệu ở Bảng 3.14 cho thấy, trong sensor AMC, bước chuyển electron

singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích thích S1 là bước chuyển chính, với

cường độ dao động (f) lớn nhất là 0,5348, tại bước sóng 320,9 nm. Bước chuyển

trạng thái S0→S1 chủ yếu là do sự đóng góp của bước chuyển electron từ

HOMO→LUMO, với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21%. Bên cạnh đó, kết quả trình

bày ở Hình 3.44 cho thấy, sự xen phủ giữa HOMO và LUMO là rất lớn, điều này

cho thấy việc chuyển electron từ HOMO sang LUMO là thuận lợi. Bước chuyển

115

trạng thái từ S0→S3 có cường độ dao động (f) nhỏ hơn (0,1155), với tỷ lệ đóng góp

của bước chuyển electron từ HOMO→LUMO+1 là 87,62%, song giữa HOMO và

LUMO+1 không có sự xen phủ, điều này cho thấy việc chuyển electron từ HOMO

lên LUMO+1 là bị cấm. Các bước chuyển trạng thái khác đều có cường độ dao

động (f) nhỏ không đáng kể.

Trong khi đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH, số liệu tính toán ở

Bảng 3.15, 3.16 và 3.17 cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản

S0 lên trạng thái kích thích S2 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lần

lượt là 0,3723; 0,3694 và 0,3801 (lớn hơn rất nhiều so với các bước chuyển khác),

tại các bước sóng tương ứng là 300,6 nm; 300,4 nm và 300,7 nm. Trong các bước

chuyển trạng thái này, bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO là bước chuyển

chính, với tỷ lệ đóng góp tương ứng là 89,17%; 89,05% và 89,24%. Mặt khác, kết

quả trình bày ở Hình 3.45, 3.46 và 3.47 cho thấy, sự xen phủ giữa HOMO-1 và

LUMO là rất lớn, nên việc chuyển electron từ HOMO-1 lên LUMO là thuận lợi.

Bước chuyển trạng thái từ S0→S3 trong AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH, tuy

có cường độ dao động (f) khá lớn, từ 0,1405 đến 0,1421, nhưng do không có sự xen

phủ giữa HOMO-3 và LUMO (đối với AMC-Cys, AMC-Hcy), hay giữa HOMO-4

và LUMO (đối với AMC-GSH) - là các MO đóng góp chính trong bước chuyển

trạng thái - nên việc chuyển electron giữa các MO trên là bị cấm. Các bước chuyển

trạng thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể.

Kết quả phân tích các MO biên (từ Hình 3.44 đến Hình 3.47) cũng cho thấy,

không có sự xen phủ giữa HOMO và HOMO-1, dẫn đến việc chuyển electron từ

HOMO sang HOMO-1 là bị cấm. Do đó, trong AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và

AMC-GSH không xảy ra quá trình PET từ HOMO đến HOMO-1. Kết quả, các chất

AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều phát huỳnh quang như trình bày ở

thực nghiệm.

116

Bảng 3.14. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của AMC ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước

chuyển

Năng

lượng

E(eV)

Bước

sóng

(nm)

Cường

độ dao

động

f

Đóng góp các MO

trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa

các MO

Tỷ lệ đóng góp

(%)

S0S1 3,86 320,9 0,5348 HOMOLUMO

96,21

S0→S2 4,22 293,7 0,0519 HOMO-1→LUMO 83,81

HOMO→LUMO+1 7,86

HOMO→LUMO+2 5,08

S0→S3 4,41 281,5 0,1155 HOMO-1→LUMO 6,97

HOMO→LUMO+1 87,62

S0→S4 4,42 280,2 0,0001 HOMO-4→LUMO 48,92

HOMO-4→LUMO+1 23,50

HOMO-2→LUMO 25,64

S0→S5 4,50 275,4 0,0000 HOMO-4→LUMO 21,23

HOMO-2→LUMO 46,85

HOMO-2→LUMO+1 27,61

HOMO-2→LUMO+3 2,62

S0→S6 4,71 263,0 0,0361 HOMO-1→LUMO+1 97,21

Bảng 3.15. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của AMC-Cys ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước

chuyển

Năng

lượng

E(eV)

Bước

sóng

(nm)

Cường

độ dao

động

f

Đóng góp các MO

trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa

các MO

Tỷ lệ đóng góp

(%)

S0S1 3,83 323,8 0,0003 HOMOLUMO 99,55

S0→S2 4,12 300,6 0,3723 HOMO-3→LUMO 6,15

HOMO-1→LUMO 89,17

117

Bước

chuyển

Năng

lượng

E(eV)

Bước

sóng

(nm)

Cường

độ dao

động

f

Đóng góp các MO

trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa

các MO

Tỷ lệ đóng góp

(%)

S0→S3 4,43 280,0 0,1405 HOMO-3→LUMO 83,12

HOMO-1→LUMO 6,42

HOMO-1→LUMO+1 2,50

HOMO-1→LUMO+2 2,70

S0→S4 4,52 274,5 0,0004 HOMO-4→LUMO 93,00

HOMO-4→LUMO+1 2,42

HOMO-4→LUMO+4 2,86

S0→S5 4,75 261,1 0,0000 HOMO-2→LUMO 99,26

S0→S6 4,79 258,8 0,0081 HOMO→LUMO+1 91,65

HOMO→LUMO+2 5,77

Bảng 3.16. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của AMC-Hcy ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước

chuyển

Năng

lượng

E(eV)

Bước

sóng

(nm)

Cường

độ dao

động

f

Đóng góp các MO

trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa

các MO

Tỷ lệ đóng góp

(%)

S0S1 3,78 328,4 0,0000 HOMOLUMO 99,59

S0→S2 4,13 300,4 0,3694 HOMO-3→LUMO 6,27

HOMO-1→LUMO 89,05

S0→S3 4,43 279,8 0,1421 HOMO-3→LUMO 83,55

HOMO-1→LUMO 6,53

HOMO-1→LUMO+1 2,49

HOMO-1→LUMO+2 5,13

S0→S4 4,52 274,4 0,0005 HOMO-4→LUMO 93,01

HOMO-4→LUMO+1 2,29

HOMO-4→LUMO+3 2,85

S0→S5 4,63 267,9 0,0000 HOMO-2→LUMO 99,91

118

Bước

chuyển

Năng

lượng

E(eV)

Bước

sóng

(nm)

Cường

độ dao

động

f

Đóng góp các MO

trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa

các MO

Tỷ lệ đóng góp

(%)

S0→S6 4,75 261,1 0,0068 HOMO→LUMO+1 90,45

HOMO→LUMO+2 7,00

Bảng 3.17. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của AMC-GSH ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển

Năng lượng E(eV)

Bước sóng (nm)

Cường độ dao động

f

Đóng góp các MO trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa các MO

Tỷ lệ đóng góp (%)

S0S1 3,96 313,2 0,0017 HOMOLUMO 99,28

S0→S2 4,12 300,7 0,3801 HOMO-4→LUMO 6,10

HOMO-1→LUMO 89,24

S0→S3 4,43 280,0 0,1412 HOMO-4→LUMO 83,40

HOMO-1→LUMO 6,35

HOMO-1→LUMO+1 2,44

HOMO-1→LUMO+2 5,31

S0→S4 4,52 274,5 0,0006 HOMO-8→LUMO 22,74

HOMO-7→LUMO 68,69

HOMO-7→LUMO+5 2,10

S0→S5 4,53 273,7 0,0000 HOMO-2→LUMO 98,21

S0→S6 4,76 260,4 0,0000 HOMO-3→LUMO 99,95

119

LUMO+3 (-3,70 eV) LUMO+2(-4,23 eV)

LUMO+1(-5,40 eV) LUMO(-5,78 eV)

HOMO(-8,87 eV) HOMO-1(-9,38 eV)

HOMO-2(-10,20 eV) HOMO-3(-10,32 eV)

Hình 3.44. Các MO biên của AMC ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

120

LUMO+3 (-3,55 eV) LUMO+2(-3,90 eV)

LUMO+1(-4,26 eV) LUMO(-5,58 eV)

HOMO(-6,61 eV) HOMO-1(-8,92 eV)

HOMO-2(-9,40 eV) HOMO-3(-9,43 eV)

Hình 3.45. Các MO biên của AMC-Cys ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

121

LUMO+3 (-3,55 eV) LUMO+2(-3,90 eV)

LUMO+1(-4,26 eV) LUMO(-5,58 eV)

HOMO(-6,70 eV) HOMO-1(-8,93 eV)

HOMO-2(-9,36 eV) HOMO-3(-9,43 eV)

Hình 3.46. Các MO biên của AMC-Hcy ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

122

LUMO+3 (-3,91 eV) LUMO+2(-3,96 eV)

LUMO+1(-4,26 eV) LUMO(-5,58 eV)

HOMO(-6,77 eV) HOMO-1(-8,92 eV)

HOMO-2(-9,12 eV) HOMO-3(-9,43 eV)

Hình 3.47. Các MO biên của AMC-GSH ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

123

b. Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang

Năng lượng, cường độ dao động, các MO có liên quan đến quá trình giải

phóng năng lượng kích thích, giản đồ năng lượng các quá trình kích thích và giải

phóng năng lượng kích thích và các đặc tính chuyển đổi chính của AMC, AMC-

Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đã được xác định bằng phương pháp TD-DFT ở

mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ và tóm tắt ở Bảng 3.18 và Hình 3.48 và 3.49.

Bảng 3.18. Năng lượng, cường độ dao động và các MO có liên quan đến quá trình

giải phóng năng lượng kích thích chủ yếu của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy, AMC-

GSH ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển

Năng lượng E(eV)

Bước sóng (nm)

Cường độ dao động

f

Đóng góp các MO trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa các MO

Tỷ lệ đóng góp

(%)

S1củaACM S1S0 1,89 654,6 0,0006 LUMOHOMO 98,65

S2S0 3,06 405,6 0,0041 LUMO→HOMO-1 99,13

S2 của ACM S1S0 2,64 469,5 0,0137 LUMOHOMO 96,05

S2S0 2,97 417,4 0,0152 LUMO→HOMO-1 96,77

S1 của ACM-Cys S1S0 3,21 386,3 0,0001 LUMOHOMO 99,92

S2S0 3,82 324,5 0,3171 LUMO→HOMO-1 85,92

S2 của ACM-Cys S1S0 3,49 355,2 0,0018 LUMOHOMO 99,40

S2S0 3,64 340,3 0,5122 LUMO→HOMO-1 94,74

S1 của ACM-Hcy S1S0 3,22 384,8 0,0000 LUMOHOMO 99,80

S2S0 3,80 326,7 0,3777 LUMO→HOMO-1 88,27

S2 của ACM-Hcy S1S0 3,45 359,3 0,0017 LUMOHOMO 99,39

S2S0 3,64 340,7 0,5167 LUMO→HOMO-1 94,87

S1 của ACM-GSH S1S0 1,95 637,0 0,0002 LUMOHOMO 99,90

S2S0 3,49 355,4 0,0029 LUMO+1→HOMO 42,49

LUMO+2→HOMO 50,14 S2 của

ACM-GSH S1S0 1,99 623,5 0,0003 LUMOHOMO 99,72

S2S0 3,37 368,3 0,0021 LUMO+1→HOMO 94,73

S3S0 3,59 345,0 0,0097 LUMO+2→HOMO 50,00

124

Bước chuyển

Năng lượng E(eV)

Bước sóng (nm)

Cường độ dao động

f

Đóng góp các MO trong các bước chuyển

Bước chuyển giữa các MO

Tỷ lệ đóng góp

(%)

LUMO+5→HOMO 30,51

S4S0 3,77 328,7 0,4469 LUMO→HOMO-1 84,65

Hình 3.48. Giản đồ năng lượng các quá trình kích thích và giải phóng năng lượng

kích thích tại hình học bền ở trạng thái cơ bản (RGS) và trạng thái kích thích

electron (REES1, REES2,...) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ:

(a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

(c) (d)

(a) (b)

Năng lượng Năng lượng

Dạng hình học Dạng hình học

Dạng hình học Dạng hình học

Năng lượng Năng lượng

125

Hình 3.49. Các đặc tính chuyển đổi chính (năng lượng (E), bước sóng (λ),

cường độ dao động (f), và các MO biên) của quá trình kích thích và giải phóng

năng lượng kích thích tại hình học bền ở trạng thái cơ bản (RGS) và trạng thái

kích thích electron (REES1, REES2,...) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ:

(a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

PET

126

Từ kết quả tính toán ở Bảng 3.14 đến 3.17, kết hợp với các kết quả tính toán

ở Bảng 3.18, Hình 3.48 và Hình 3.49 cho thấy:

Đối với sensor AMC, tại cấu hình REES1, các quá trình chuyển electron từ S1

về S0 (quá trình (5) ở Hình 3.48a) và S2 về S0 (quá trình (6) ở Hình 3.48a) đều có

cường độ dao động (f) là rất nhỏ, thêm vào đó, không có sự xen phủ giữa các MO

trong bước chuyển này. Do đó, các quá trình chuyển electron từ S1 và S2 về S0 tại

cấu hình REES1 của AMC là bị cấm. Tại cấu hình REES2, các quá trình chuyển

electron từ S1 về S0 (quá trình (3) ở Hình 3.48a) và S2 về S0 (quá trình (4) ở Hình

3.48a) có cường độ dao động (f) lớn hơn, tương ứng là 0,0137 và 0,0152, thêm vào

đó, có sự xen phủ giữa các MO trong bước chuyển này. Do đó, các quá trình chuyển

electron từ S1 và S2 về S0 tại cấu hình REES2 của AMC là xảy ra. Năng lượng phát

huỳnh quang tính toán tương ứng là 2,64 eV và 2,97 eV; với bước sóng huỳnh

quang tương ứng là 469,5 nm và 417,4 nm. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f)

của cả hai quá trình (3) và (4) ở trên là lớn không đáng kể (0,0137 và 0,0152), điều

này dẫn đến cường độ huỳnh quang của AMC là nhỏ như quan sát được trong thực

nghiệm. Ngoài ra, do quá trình kích thích từ S0→S1 (quá trình (1) ở Hình 3.48a) có

cường độ dao động lớn hơn nhiều so với quá trình kích thích từ S0→S2 (quá trình

(2) ở Hình 3.48a), nên quá trình chuyển electron từ S1 về S0 (quá trình (3) ở Hình

3.48a) sẽ chiếm ưu thế hơn từ S2 về S0 (quá trình (4) ở Hình 3.48a). Điều này có thể là

nguyên nhân dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (469,5 nm) mạnh hơn

cường độ huỳnh quang ở bước sóng ngắn (417,4 nm) như quan sát trong thực nghiệm.

Đối với AMC-Cys, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0 tại cấu hình

REES1 (quá trình (5) ở Hình 3.48b) và cấu hình REES2 (quá trình (3) ở Hình 3.48b)

đều có cường độ dao động (f) là rất nhỏ, thêm vào đó, không có sự xen phủ giữa các

MO trong bước chuyển này. Do đó, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0 của

AMC-Cys tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 là bị cấm. Trong khi đó, các quá

trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu hình REES1 (quá trình (6) ở Hình 3.48b) và

cấu hình REES2 (quá trình (4) ở Hình 3.48b) có cường độ dao động (f) là rất lớn,

tương ứng là 0,3171 và 0,5122; thêm vào đó, có sự xen phủ giữa các MO trong

bước chuyển này. Do đó, các quá trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu hình

127

REES1 và cấu hình REES2 của AMC-Cys là xảy ra. Năng lượng phát huỳnh quang tính

toán tương ứng là 3,82 eV và 3,64 eV; với bước sóng huỳnh quang tương ứng là

324,5 nm và 340,3 nm. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình

này là rất lớn, trong đó cường độ dao động (f) ở bước sóng 340,3 nm là 0,5122, lớn

hơn ở bước sóng 324,5 nm là 0,3171; điều này dẫn đến cường độ huỳnh quang của

AMC-Cys quan sát được trong thực nghiệm là rất mạnh, và ở bước sóng dài 340,3

nm là mạnh hơn nhiều so với ở bước sóng ngắn 324,5 nm. Ngoài ra, do quá trình

chuyển electron từ S2 về S1 (quá trình (6) ở Hình 3.48b) tại cấu hình REES1, với cấu hình

S2 tương ứng không phải là cấu hình có năng lượng cực tiểu, nên quá trình (6) ở Hình

3.48b ít chiếm ưu thế hơn so với quá trình (4) ở Hình 3.48b. Đó có thể là một nguyên

nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (340,3) nm mạnh hơn rất

nhiều so với ở bước sóng ngắn (324,5 nm) như quan sát trong phần thực nghiệm.

Sự sai khác về bước sóng phát huỳnh quang tính toán (324,5 nm và 340,3

nm) so với bước sóng phát huỳnh quang thực nghiệm (375 nm và 450 nm) của

AMC-Cys có thể là do các tính toán được thực hiện trong ethanol, trong khi thực

nghiệm tiến hành trong dung dịch C2H5OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v. Đặc biệt với

cấu trúc các trạng thái S0, S1 và S2 của AMC-Cys có sự quay xoắn góc giữa tiểu

phần acryloyl và tiểu phần coumarine, thì dung môi đóng vai trò rất lớn đến độ ổn

định của cấu trúc [146]. Đó có thể là lý do dẫn đến có sự khác biệt giữa bước sóng

phát huỳnh quang tính toán so với bước sóng phát huỳnh quang thực nghiệm. Điều

này cũng giải thích tương tự cho các chất AMC-Hcy, AMC-GSH.

Tương tự AMC-Cys, đối với AMC-Hcy, các quá trình chuyển electron từ S1

về S0 tại cấu hình REES1 (quá trình (5) ở Hình 3.48c) và cấu hình REES2 (quá trình (3)

ở Hình 3.48c) cũng có cường độ dao động (f) là rất nhỏ, thêm vào đó, không có sự

xen phủ giữa các MO trong bước chuyển này. Do đó, các quá trình chuyển electron

từ S1 về S0 của AMC-Hcy tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 cũng bị cấm. Trong

khi đó, các quá trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu hình REES1 (quá trình (6) ở

Hình 3.48c) và cấu hình REES2 (quá trình (4) ở Hình 3.48c) có cường độ dao động (f)

là rất lớn, tương ứng là 0,3777 và 0,5167; thêm vào đó, có sự xen phủ giữa các MO

trong bước chuyển này. Do đó, các quá trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu

128

hình REES1 và cấu hình REES2 của AMC-Hcy là xảy ra. Năng lượng phát huỳnh

quang tính toán tương ứng là 3,80 eV và 3,64 eV; với bước sóng huỳnh quang

tương ứng là 326,7 nm và 340,7 nm. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của cả

hai quá trình này là rất lớn, trong đó cường độ dao động (f) ở bước sóng 340,7 nm là

0,5167, lớn hơn ở bước sóng 326,7 nm là 0,3777; điều này dẫn đến cường độ huỳnh

quang của AMC-Hcy quan sát được trong thực nghiệm là rất mạnh, và ở bước sóng

dài 340,7 nm là mạnh hơn nhiều so với ở bước sóng ngắn 326,7 nm. Ngoài ra, do

quá trình chuyển electron từ S2 về S1 (quá trình (6) ở Hình 3.48c) tại cấu hình REES1,

với cấu hình S2 tương ứng không phải là cấu hình có năng lượng cực tiểu, nên quá

trình (6) ở Hình 3.48c ít chiếm ưu thế hơn so với quá trình (4) ở Hình 3.48c. Đó có

thể là một nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài

(340,7) nm mạnh hơn rất nhiều so với ở bước sóng ngắn (326,7 nm) như quan sát

trong thực nghiệm.

Đối với AMC-GSH, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0 tại cấu hình

REES1 (quá trình (5) ở Hình 3.48d) và cấu hình REES2 (quá trình (3) ở Hình 3.48d),

cũng như các quá trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu hình REES1 (quá trình (6)

ở Hình 3.48d) và cấu hình REES2 (quá trình (4) ở Hình 3.48d) đều có cường độ dao

động (f) là rất nhỏ. Quá trình phát xạ huỳnh quang không xảy ra từ trạng thái kích

thích S1 và S2, mà xảy ra từ trạng thái kích thích S4.

Như đã trình bày, kết quả nghiên cứu về hình học tối ưu các trạng thái kích

thích của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH cho thấy, đối với sensor

AMC, có sự xoắn góc mạnh giữa tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy tại cấu

hình REES1 và REES2, điều này dẫn đến sự phá vỡ hệ thống electron π liên hợp giữa

hai tiểu phần, kéo theo đó là mật độ electron giữa tiểu phần coumarin và tiểu phần

acryloxy bị phân tách mạnh. Kết quả là có sự xen phủ rất ít giữa các MO trong các

bước chuyển đổi electron ở trạng thái kích thích của sensor AMC. Ngược lại, tại

REES2 của AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, tiểu phần coumarin và tiểu phần

acryloxy nằm trong cùng một mặt phẳng. Đây là một yếu tố thuận lợi cho sự xen

phủ giữa các MO trong các bước chuyển đổi trạng thái. Như vậy, việc nghiên cứu

về hình học tối ưu các trạng thái kích thích của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và

129

AMC-GSH đã cung cấp minh chứng, qua đó làm sáng tỏ thêm về có sự xen phủ

hoặc không có sự xen phủ giữa các MO trong quá trình chuyển đổi trạng thái và kết

quả này phù hợp với kết quả phân tích phổ huỳnh quang như đã phân tích trên.

Những phân tích ở trên cho thấy, sự phát huỳnh quang của sensor AMC và

các sản phẩm cộng của nó với các biothiol không bắt nguồn từ trạng thái S1. Đây là

một trường hợp ngoại lệ của quy tắc của Kasha [113]. Theo quy tắc Kasha, sự phát

quang photon (huỳnh quang hoặc lân quang) xảy ra chỉ từ trạng thái kích thích có

năng lượng thấp nhất (S1) trong một số lượng nhất định các trạng thái kích thích. Ba

trường hợp ngoại lệ của quy tắc của Kasha đã được dự đoán gồm:

Thứ nhất, khi khoảng cách năng lượng giữa trạng thái kích thích điện tử

singlet ở mức cao (Sn, n> 1) và trạng thái kích thích điện tử S1 là lớn, cường độ dao

động của quá trình chuyển đổi S0→Sn lớn, quá trình chuyển đổi nội bộ từ Sn→S0 là

tương đối chậm, dẫn đến huỳnh quang xảy ra từ trạng thái kích thích Sn cạnh tranh

với quá trình chuyển đổi nội bộ Sn→S0 (không phát huỳnh quang).

Thứ hai, khi khoảng cách năng lượng giữa trạng thái kích thích Sn và S1 là

nhỏ, cường độ dao động của chuyển đổi S0→S1 nhỏ, nhưng cường độ dao động của

quá trình chuyển đổi S0→Sn lớn, các yếu tố này dẫn đến thời gian sống của trạng

thái S1 kéo dài và huỳnh quang sẽ xảy ra từ Sn.

Thứ ba, huỳnh quang yếu có thể xảy ra từ Sn bởi các yếu tố chủ quan, khi các

“nguồn sáng bẩn” chưa được loại bỏ cẩn thận (nguồn sáng bẩn là nguồn sáng khả

kiến hoặc hồng ngoại), tạo huỳnh quang nền không mong muốn và giảm độ nhạy.

Ví dụ như sử dụng quá trình phân hủy triplet-triplet thay vì kích thích trực tiếp để

quan sát sự huỳnh quang bị trì hoãn từ một số hydrocarbon thơm [111].

Như vậy, kết quả tính toán lý thuyết đã chứng minh được AMC và AMC-

thiol đều phát huỳnh quang; lý thuyết đã làm sáng tỏ AMC phát huỳnh quang yếu ở

hai bước sóng, AMC-thiol phát huỳnh quang tại hai bước sóng, trong đó cường độ

huỳnh quang ở bước sóng dài mạnh hơn bước sóng ngắn; tính toán lý thuyết cũng

giải thích được sự phát xạ huỳnh quang của AMC, AMC-thiol đều xuất phát từ

trạng thái kích thích electron mức cao.

130

KẾT LUẬN CHUNG NGHIÊN CỨU VỀ SENSOR AMC

1. Sensor AMC mới dựa trên dẫn xuất của coumarin đã được nghiên cứu hoàn

chỉnh từ thiết kế, tổng hợp, đặc trưng đến ứng dụng, với sự kết hợp linh hoạt

giữa tính toán lượng tử và thực nghiệm.

2. Dựa trên những dự đoán từ tính toán lý thuyết, thực nghiệm đã tổng hợp

được sensor AMC từ fluorophore và receptor tương ứng là 4-metyl-7-

hydroxylcoumarin và acryloyl chloride.

3. Phản ứng cộng giữa sensor AMC với Cys, Hcy và GSH để hình thành các

thioester đã được nghiên cứu và cho thấy sự phù hợp tốt giữa kết quả tính

toán lý thuyết và nghiên cứu thực nghiệm.

4. Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, sensor AMC có thể phát hiện chọn lọc

các biothiol trong sự hiện diện các amino acids không chứa nhóm thiol (bao

gồm Arginine, Glycine, Alanine, Aspartic, Glutamic, Leucine, Lysine,

Isoleucine, Methionine, Threonine, Serine, Tryptophan, Tyrosine và Valine);

hoạt động theo kiểu biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới

hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,50 μM và 1,65 μM.

5. Đặc tính huỳnh quang của sensor AMC và các sản phẩm cộng AMC-Cys,

AMC-Hcy và AMC-GSH đã được nghiên cứu bởi phương pháp TD-DFT,

dựa trên hình học tối ưu trạng thái cơ bản và các trạng thái kích thích. Kết

quả tính toán đã làm sáng tỏ những thay đổi huỳnh quang trong thực nghiệm.

Kết quả tính toán đã cho thấy, sự phát xạ huỳnh quang của AMC, AMC-

Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều xuất phát từ các trạng thái kích thích

electron ở mức cao (S2, S4) về trạng thái cơ bản S0. Đây là một trường hợp

ngoại lệ của quy tắc Kasha.

OO O

O

AMC

OO O

O

AMC- thiol

S

R

Fluorophore Receptor

+ Thiol

131

NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN

1. Đã kết hợp linh hoạt giữa tính toán hóa học lượng tử và nghiên cứu thực

nghiệm để phát triển thành công hai sensor huỳnh quang mới là L và AMC.

Sự kết hợp linh hoạt này đã giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết và

điều tra thực nghiệm, tiết kiệm thời gian và chi phí hóa chất, tăng khả năng

thành công, làm sáng tỏ được bản chất các quá trình, tạo cơ sở khoa học cho

các nghiên cứu tiếp theo. Cụ thể:

Đối với sensor L, tính toán đã dự đoán và định hướng cho thực nghiệm trong

giai đoạn thiết kế, tổng hợp và đặc trưng sensor L; nghiên cứu thực nghiệm

sau đó đã kiểm chứng và khẳng định lại các kết quả tính toán. Đến phức tạo

bởi L và ion Hg(II), thực nghiệm được khảo sát trước; tính toán lý thuyết sau

đó để giải thích và làm sáng tỏ ứng dụng của sensor L trong phát hiện ion

Hg(II). Tiếp đến, việc sử dụng phức Hg2L2 để xác định biothiol lại được dự

đoán trước từ tính toán; điều tra thực nghiệm sau đó để kiểm chứng và khẳng

định lại kết quả tính toán.

Đối với sensor AMC, tính toán đã dự đoán và định hướng cho thực nghiệm ở

giai đoạn thiết kế, tổng hợp và phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol.

Các đặc tính và ứng dụng của sensor AMC được nghiên cứu từ thực nghiệm

trước; tính toán lý thuyết sau đó đã giải thích và làm rõ bản chất các kết quả

thực nghiệm.

2. Các phản ứng tổng hợp sensor L và sensor AMC đã được nghiên cứu dự

đoán và định hướng từ tính toán; thực nghiệm sau đó đã kiểm chứng và

khẳng định các kết quả tính toán.

3. Cấu trúc, đặc tính của sensor L và sensor AMC đã được xác định ở mức lý

thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết quả đáng tin cậy, thông qua kiểm tra, đối

chiếu và khẳng định từ các kết quả thực nghiệm.

4. (a). Sensor L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự có mặt các ion

kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh quang. Giới hạn phát hiện

và giới hạn định lượng ion Hg(II) theo phương pháp trắc quang là 0,076 μM

132

và 0,25 μM; theo phương pháp huỳnh quang là 0,059 μM và 0,19 μM. Phức

Hg2L2 có thể phát hiện chọn lọc Cys trong sự hiện diện các amino acids

không có nhóm thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang. Giới hạn phát

hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. Sensor L

phát hiện ion Hg(II) và phức Hg2L2 phát hiện Cys dựa trên phản ứng trao đổi

phức giữa ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử là L và Cys.

(b). Sensor AMC có thể phát hiện chọn lọc các biothiol (Cys, GSH, Hcy)

trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol, hoạt động dựa trên

sự biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới hạn phát hiện

và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. Sensor AMC

phản ứng với các biothiol (Cys, GSH, Hcy) theo cơ chế phản ứng cộng

Michael.

(c). Các sensor huỳnh quang Hg2L2 và AMC đều có thể phát hiện Cys trong

dung dịch với lượng nhỏ dung môi hữu cơ, thời gian của phản ứng xảy ra

nhanh, có thể phát hiện được Cys với nồng độ thấp hơn trong nội bào và thấp

hơn so với các sensor đã công bố.

5. Đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu đặc tính huỳnh quang của

các chất dựa trên hình học tối ưu tại trạng thái cơ bản và các trạng thái kích

thích; kết hợp với sử dụng phương pháp phân tích NBO để xem xét sự biến

đổi đặc tính huỳnh quang của các chất dựa trên nghiên cứu bản chất các liên

kết. Kết quả tính toán cho thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L

dẫn đến làm giảm khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO, đồng

thời làm thay đổi hệ liên hợp electron π, là nguyên nhân dẫn đến sự dập tắt

huỳnh quang trong phức Hg2L2. Sự phát xạ huỳnh quang của AMC, AMC-

Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều xuất phát từ các trạng thái kích thích

electron ở mức cao (S2, S4) về trạng thái cơ bản S0. Đây là một trường hợp

ngoại lệ của quy tắc Kasha.

133

ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Những kết quả đạt được trong luận án đã mở ra những định hướng nghiên

cứu triển vọng có thể tiếp cận trong thời gian đến. Cụ thể:

1. Thiết lập một cơ sở cho việc phát triển của các phức giữa ion kim loại với

các phối tử huỳnh quang mới, cũng như các phối tử huỳnh quang đã được

công bố trước đây để phát hiện cysteine.

2. Nghiên cứu cơ chế thay đổi đặc tính hấp thụ, huỳnh quang của các sensor

trước và sau khi tương tác với chất phân tích, nhằm xây dựng cơ sở để định

hướng thiết kế các sensor mới, nhất là tăng độ nhạy, độ chọn lọc và độ tan

của các sensor. Đặc biệt, nghiên cứu phát triển các sensor huỳnh quang phát

xạ ở vùng bước sóng dài, hoặc các sensor hoạt động dựa trên sự biến đổi tỉ lệ

huỳnh quang ở hai bước sóng, nhằm hạn chế các ảnh hưởng khi dùng các

sensor để phát hiện các chất trong tế bào sống.

3. Phát triển, mở rộng việc sử dụng L để phân tích ion Hg(II) trong các đối

tượng:

- Nghiên cứu ứng dụng phân tích trong các mẫu nước ăn uống sinh hoạt, các

mẫu nước thải công nghiệp, nước thải y tế (đặc biệt các phòng nha), các mẫu

thực phẩm tươi sống (đặc biệt cá biển ăn thịt), các mẫu thực phẩm chế biến

có sử dụng bao bì đóng gói bảo quản.

- Nghiên cứu ứng dụng phân tích các ion kim loại Hg(II) trong các tế bào sống.

4. Phát triển, mở rộng việc sử dụng Hg2L2 và AMC để phân tích các biothiol

trong các tế bào sống.

5. Nghiên cứu gắn kết các sensor huỳnh quang, trắc quang trên các vật liệu

silica mao quản, sản xuất các bộ KIT dùng để phát hiện nhanh ion Hg(II) và

các biothiol.

134

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

LIÊN QUAN LUẬN ÁN

1. Doan Thanh Nhan, Nguyen Khoa Hien, Hoang Van Duc, Nguyen Thi Ai

Nhung, Nguyen Tien Trung, Dang Ung Van, Weon Sup Shin, Jong Seung

Kim, Duong Tuan Quang (2016), A hemicyanine complex for the detection

of thiol biomolecules by fluorescence, Dyes and Pigments., 131, pp. 301-

306.

2. Doan Thanh Nhan, Nguyen Thi Ai Nhung, Vo Vien, Nguyen Tien Trung,

Nguyen Duc Cuong, Nguyen Chi Bao, Dinh Quy Huong, Nguyen Khoa

Hien, Duong Tuan Quang (2017), A benzothiazolium-derived colorimetric

and fluorescent chemosensor for detection of Hg2+ ions, Chemistry Letters.,

46, pp. 135-138

3. Doan Thanh Nhan, Nguyen Thi Ai Nhung, Nguyen Khoa Hien, Duong

Tuan Quang (2017), A quantum chemical study on the use of complexs

between Hg(II) ions and fluorescencet ligands for detection cysteine,

Vietnam Journal of Chemistry, International Edition., 55(6), pp. 700-707.

4. Nguyen Khoa Hien, Doan Thanh Nhan, Won Young Kim, Mai Van Bay,

Pham Cam Nam, Dang Ung Van, In-Taek Lim, Jong Seung Kim,Duong

Tuan Quang (2018), Exceptional case of Kasha's rule: Emission from higher-

lying singlet electron excited states into ground states in coumarin-based

biothiol sensing, Dyes and Pigments., 152, pp. 118-126.

5. Le Thi My Hoang, Doan Thanh Nhan, Mai Van Bay, Nguyen Thi Ai

Nhung, Nguyen Khoa Hien, Duong Tuan Quang (2018), An investigation of

the excitation and emission properties of fluorescence compounds using DFT

and TD-DFT methods, Hue University Journal of Science: Natural Science.,

Vol. 127, No. 1A, pp. 51-59.

135

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1] Phạm Xuân Yêm, Nguyễn Xuân Xanh, Trịnh Xuân Thuận, Chu Hảo, Đào Vọng

Đức (2009), Max Planck - Người khai sáng thuyết lượng tử, Nhà xuất bản Tri

Thức, Hà Nội.

Tiếng Anh

[2] Ajay K.K., Renuka N., Pavithra G., Vasanth K. G. (2015), Comprehensive

review on coumarins: Molecules of potential chemical and pharmacological

interest, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research., 7(9), pp. 67-81.

[3] Amaresh M., Rajani K. B., Pradipta K. B., Bijaya K. M., and Gopa B. B. (2000),

Cyanines during the 1990s: A Review, Chemical Reviews., 100, pp. 1973-2011.

[4] Amarnath K., Amarnath V., Amarnath K., Valentine HL., Valentine WM.

(2003), A specific HPLC-UV method for the determination of cysteine and

related aminothiols in biological samples, Talanta., 60, pp. 1229-1238.

[5] Anna P., Giorgio F., Enrico B., Fiorella P. (2003), Analysis of glutathione:

implication in redox and detoxification, Clinica Chimica Acta., 333, pp. 19-39.

[6] Bampidis V.A., Nistor E., Nitas D. (2013), Arsenic, cadmium, lead and mercury

as undesirable substances in animal feeds, Scientific Papers: Animal science and

biotechnologies., 46 (1), pp. 17-22.

[7] Banu B., Nurgül S., Müge Ö., Gizem S., Hakan A., Zeynel S. (2016), A novel

fluorescence turn-on coumarin-pyrazolone based monomethine probe for biothiol

detection, Tetrahedron., 72(30), pp. 4498-4502.

[8] Baocun Z., Xiaoling Z., Yamin L., Pengfei W., Hongyan Z. and Xiaoqing Z.

(2010), A colorimetric and ratiometric fluorescent probe for thiols and its

bioimaging applications, Chemical Communications., 46, pp. 5710-5712.

[9] Becke A.D. (1993), Density-functional thermochemistry. III. The role of

exactexchange, Journal of Chemical Physics., 98, pp. 5648-5652.

[10] Berthon G. (1995), Critical evaluation of the stability constants of metal

complexes of amino acids with polar side chains (Technical Report),

Pure and Applied Chemistry., 67(7), pp. 1117-1240.

136

[11] Bo T., Li J.C., Ke H. X., Li L.T., Gui W.Y., Li G.A. (2008), A Sensitive

and selective near-infrared fluorescent probe for mercuric ions and its

biological imaging applications, ChemBioChem., 9, pp. 1159-1164.

[12] Bouffard J., Kim Y., Swager TM., Weissleder R., Hilderbrand SA. (2008),

A highly selective fluorescent probe for thiol bioimaging, Organic

Letters,.10(1), pp. 37-40.

[13] Calonge M.J., Gasparini P., Chillaron J., Chillon M., Gallucci M., Rousaud

F., Zelante L., Testar X., Dallapiccola B., Disilverio F., et al (1994),

Cystinuria caused by mutations in rbat, a gene involved in the transport of

cystine, Nature genetics ., 6, pp. 420-425.

[14] Capitan P., Malmezat T., Breuille D., Obled C. (1999), Gas

chromatographic-mass spectrometric analysis of stable isotopes of cysteine

and glutathione in biological samples, Journal of Chromatography B., 732,

pp. 127-35.

[15] Carlo A., and Denis J. (2013), The calculations of excited-state properties

with time-dependent density functional theory, Chemical Society Reviews.,

42, pp. 845-856.

[16] Casida M.E. (2009), Time-dependent density-functional theory for

molecules and molecular solids, Journal of Molecular Structure

(Theochem)., 914, pp. 3-18.

[17] Chae M.Y., Czarnik A.W. (1992), Fluorimetric chemodosimetry Hg(II) and

Ag(I) indication in water via enhanced fluorescence signalling, Journal of

the American Chemical Society., 114(24), pp. 9704-9705.

[18] (a) Chen X., Ko SK., Kim MJ., Shin I., Yoon J. (2010), A thiol-

specific fluorescent probe and its application for bioimaging, Chemical

Communications., 46, pp. 2751-27533. (b) Jung HS., Han JH., Pradhan

T., Kim S., Lee SW., Kang C., Kim JS. (2012), A cysteine-selective

fluorescent probe for the cellular detection of cysteine,

Biomaterials.,33, pp. 945-953. (c) Jung HS., Pradhan T., Han J., Heo

KJ., Kang C., Kim JS. (2012), Molecular modulated cysteine-selective

137

fluorescent probe, Biomaterials.,.33, pp. 8495-8502.

[19] Cheng X., Li Q., Qin J., Li Z. (2010), A new approach to design ratiometric

fluorescent probe for mercury(II) based on the Hg2+-promoted deprotection

of thioacetals, ACS Applied Materials and Interfaces., 2(4), pp. 1066-1072.

[20] Cheng X., Li S., Zhong A., Qin J., Li Z. (2011), New fluorescent probes for

mercury(II) with simple structure, Sensors and Actuators B., 157(1), pp. 57-63.

[21] Dai H.Q., Tri N.N., Trang N.T.T., Trung N.T. (2014), Remarkable effects of

substitution on stability of complexes and origin of the C-H•••O(N)

hydrogen bonds formed between acetone’s derivative and CO2, XCN (X = F,

Cl, Br), Royal Society of Chemistry Advances., 4, pp. 13901-13908.

[22] David C.Y., (2001), Computational chemistry: A practical guide for

applying techniques to real-world problems, John Wiley & Sons, Inc.

[23] De la Torre P., García-Beltrán O., Tiznado W., Mena N., Saavedra L.A.,

Cabrera M.G., Trilleras J., Pavez P., Aliaga M.E. (2014), (E)-2-

(Benzo[d]thiazol-2-yl) -3-heteroarylacrylonitriles as efficient Michael

acceptors for cysteine: Real application in biological imaging, Sensors and

Actuators B Chemical., 193, pp. 391-399.

[24] Droge W., Eck H.P., Mihm S. (1992), Hiv-induced cysteine deficiency and

T-cell dysfunction-a rationale for treatment with N-acetylcysteine, Immunol

Today., 13, pp. 211-214.

[25] Du J., Fan J., Peng X., Sun P., Wang J., Li H., and Sun S. (2010), A new

fluorescent chemodosimeter for Hg2+: selectivity, sensitivity, and resistance

to Cys and GSH, Organic Letters., 12(3), pp. 476-479.

[26] El-Ballouli A.O., Zhang Y.D., Barlow S., Marder S.R., Al-Sayah M.H.,

Kaafarani B.R. (2012), Fluorescent detection of anions by

dibenzophenazine-based sensors, Tetrahedron Letters., 53 (6), pp. 661-665.

[27] Erik C. B. J., Stephen B. H. K. (2006), Insights into the Mechanism and

Catalysis of the Native Chemical Ligation Reaction, Journal of the

American Chemical Society., 6, 128, pp. 6640–6646.

138

[28] Farhadi K., Forough M., Molaei R., Hajizadeh S., Rafipour A. (2012), Highly

selective Hg2+ colorimetric sensor using green synthesized and unmodified silver

nanoparticles, Sensors and Actuators B Chemical., 161(1), pp. 880-885.

[29] Fei X., Yang S., Zhang B., Liu Z., Gu Y. (2007), Solid-phase synthesis and

modification of thiazole orange and its derivatives and their spectral properties,

Journal of Combinatorial Chemistry., 9, pp. 943-950.

[30] Frank J., (2007), Introduction to computational chemistry, (Second Edition),

John Wiley & Sons Ltd.

[31] Friedrich B.K. (2000), AIM 2000, University of applied sciences. Germany:

Bielefeld.

[32] Frisch M.J., et al. (2004), Gaussian 03, Revision D.01, Wallingford CT:

Gaussian Inc.

[33] Gao Y., Li Y., Zou X., Huang H., Su X.G. (2012), Highly sensitive and

selective detection of biothiols using graphene oxide-based "molecular beacon"-

like fluorescent probe, Analytica Chimica Acta.,731, pp.68-74.

[34] Gentscheva G., Petrov A., Ivanova E., Havezov I. (2012), Flame AAS

determination of trace amounts of Cu, Ni, Co, Cd and Pd in waters after

preconcentration with 2-nitroso-1-naphthol, Bulgarian Chemical

Communications., 44, pp. 52–56.

[35] Guan-Ying L., Jiang-Ping L., Huai-Yi H., Ya W., Hui C., Liang-Nian J. (2013),

Colorimetric and luminescent dual-signaling responsive probing of thiols by a

ruthenium(II)-azo complex, Journal of Inorganic Biochemistry., 121, pp. 108-113.

[36] Guan X., Hoffman B., Dwivedi C., Matthees DP. (2003), A simultaneous

liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine,

homocysteine and their disulfides in biological samples, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysisl., 31, pp. 251-261.

[37] Gun-Joong K., Kiwon L., Hyockman K., Hae-Jo K. (2011), Ratiometric

fluorescence imaging of cellular glutathione, Organic Letters., 13(11), pp. 2799-2801.

[38] Guo Z., Zhu W., Zhu M., Tian H. (2010), Near-infrared cell-permeable Hg2+-

selective ratiometric fluorescent chemodosimeters and fast indicator paper for

139

MeHg+ based on tricarbocyanines, Chemistry - A European Journal., 16(48), pp.

14424-14432.

[39] Guo Z., Nam S., Park S., Yoon J. (2012), A highly selective ratiometric

near-infrared fluorescent cyanine sensor for cysteine with remarkable shift

and its application in bioimaging. Chemical Science., 3, pp. 2760-2765.

[40] Hamer F. (2008), In Chemistry of heterocyclic compounds, John Wiley &

Sons, Inc.

[41] Hay P.J., Wadt W.R. (1985), Ab initio effective core potentials for

molecular calculations. Potentials for K to Au including the outermost core

orbitals, Journal of Chemical Physics., 82, pp. 299-310.

[42] Hien N.K., Bao N.C., Nhung N.T.A., Trung N.T., Nam P.C., Duong T., Kim

J.S., Quang D.T. (2015), A highly sensitive fluorescent chemosensor for

simultaneous determination of Ag(I), Hg(II), and Cu(II) ions: Design,

synthesis, characterization and application, Dyes and Pigments, 116, pp. 89-96.

[43] Hien N.K., Nhung N.T.A., Dai H.Q., Trung N.T., Quang D.T. (2015), A

fluorescent sensor base on dansyl-diethylenetriamine-thiourea conjugate:

design, synthesis, characterization, and application, Vietnam Journal of

Chemistry., 53(5e), pp. 541-547.

[44] Hiraku Y., Murata M., Kawanishi S. (2002), Determination of intracellular

glutathione and thiols by high performance liquid chromatography with a

gold electrode at the femtomole level: comparison with a spectroscopic

assay, Biochim Biophys Acta., 1570, pp. 47-52.

[45] Hongda L., Longyi J., Yuhe K., Bingzhu Y. (2014), A visual and “turn-on”

fluorescent probe for rapid detection of cysteine over homocysteine and

glutathione, Sensors and Actuators B., 196, pp. 546-554.

[46] Hongqi L., Li C., Zhen C. (2012), Coumarin-derived fluorescent

chemosensors, Advances in Chemical Sensors, Prof. Wen Wang (Ed.),

ISBN: 978-953-307-792-5, InTech, Available from:

http://www.intechopen.com/books/advances-in-chemical-sensors/coumarin-

derived-fluorescent-chemosensors.

140

[47] Hou X., Zeng F., Du F., and Wu S. (2013), Carbon-dot-based fluorescent

turn-on sensor for selectively detecting sulfide anions in totally aqueous

media and imaging inside live cells, Nanotechnology., 24(33),

https://doi.org/10.1088/0957-4484/24/33/335502.

[48] Hou J.T., Yang J., Li K., Yu K.K., Yu X.Q., (2015), A colorimetric and red

emissive fluorescent probe for cysteine and its application in bioimaging,

Sensors and Actuators B Chemical., 214, pp. 92-100.

[49] Hu J.H., Li J.B., Qi J. and Chen J.J. (2015), Highly selective and effective

mercury(II) fluorescent sensors, New Journal of Chemistry., 39, pp. 843-848.

[50] Huang S., He S., Lu Y., Wei F., Zeng X. and Zhao L. (2011), Highly sensitive

and selective fluorescent chemosensor for Ag+ based on a coumarin–Se2N

chelating conjugate, Chemical Communications., 47, pp. 2408-2410.

[51] Hussain S.A. et. al. (2012), An introduction to fluorescence resonance

energy transfer (FRET), Science Journal of Physics, Volume 2012, Article

ID sjp-268, 4 Pages, Doi: 10.7237/sjp/268

[52] Hwang C., Sinskey AJ., Lodish HF. (1992), Oxidized redox state of

glutathione in the endoplasmic reticulum, Science., 257, pp. 1496-1502.

[53] Huilin W., Guodong Z., Hongwei G., Xiaoqiang C. (2012), A fluorescein-

based probe with high selectivity to cysteine over homocysteine and

glutathione, Chemical Communications., 48, pp. 8341-8343.

[54] Hyockman K., Kiwon L., Hae-Jo K.. (2011), Coumarin-malonitrile

conjugate as a fluorescent turn-on probe for biothiols and its cellular

expression, Chemical Communications., 47(6), pp. 1773-1775.

[55] Iain J., Michelle T.Z.S. (2010), The molecular probes handbook - A guide to

fluorescent probes and labeling technologies, 11th edition, Life

Technologies.

[56] Ibrahim D., Froberg B., Wolf A., Rusyniak D.E. (2006), Heavy metal

poisoning: clinical presentations and pathophysiology, Clinics in Laboratory

Medicine., 26, pp. 67-97.

[57] Ivanov AR., Nazimov IV., Baratova L. (2000), Determination of

141

biologically active low-molecular-mass thiols in human blood I. Fast

qualitative and quantitative, gradient and isocratic reversed-phase high-

performance liquid chromatography with photometric and fluorescence

detection, Journal of Chromatography A.,89, pp. 157-166.

[58] Ji S., Yang J., Yang Q., Liu .S, Chen M., Zhao J. (2009), Tuning the

intramolecular charge transfer of alkynylpyrenes: effect on photophysical

properties and its application in design of off-on fluorescent thiol probes,

Journal of Organic Chemistry., 74(13), pp. 4855-4865.

[59] Jia H,. Yang M., Meng Q., He G., Wang Y., Hu Z., Zhang R., Zhang Z.

(2016), Synthesis and application of an aldazine-based fluorescence

chemosensor for the sequential detection of Cu2+ and biological thiols in

aqueous solution and living cells, Sensors., 16 (1), 79,

doi:10.3390/s16010079.

[60] Jinmin S., Yujiao W., Xiaoliang T., Wei L., Huie J., Wei D., Weisheng L.

(2014), A colorimetric and fluorescent probe for thiols based on 1, 8-

naphthalimide and its application for bioimaging, Dyes and Pigments., 100,

pp. 255-260.

[61] Jianjian Z., Bianfei Y., Lulu N., Xinyue Z., Jianxi W., Zhenjie C., Xiaoyan

L., Xiaojun Y., Xiaoyu Z., Haixia Z. (2015), A near-infrared fluorescence

probe for thiols based on analyte-specific cleavage of carbamate and its

application in bioimaging, European Journal of Organic Chemistry., 8, pp.

1711-1718.

[62] Jiang W., Wang W. (2009), A selective and sensitive “turn-on” fluorescent

chemodosimeter for Hg2+ in aqueous media via Hg2+ promoted facile

desulfurization–lactonization reaction, Chemical Communications., 45, pp.

3913-3915.

[63] Jung H.S., Han J.H., Habata Y., Kang C. and Kim J.S. (2011), An

iminocoumarin–Cu(II) ensemble-based chemodosimeter toward thiols,

Chemical Communications., 47, pp. 5142-5144.

[64] Jiang W., Fu Q., Fan H., Ho J., Wang W. (2007), A highly selective

142

fluorescent probe for facile detection of thiophenols, Angewandte Chemie

International Edition., 46:8445–8448.

[65] Jiasheng W., Ruilong S., Weimin L., Pengfei W., Jingjin M., Hongyan Z.,

Xiaoqing Z. (2011), Reversible fluorescent probe for highly, selective and

sensitive detection of mercapto biomolecules, Inorganic Chemistry., 50(14),

pp. 6543-6551.

[66] Jing L., Yuan-Qiang S., Hongxing Z., Yingying H., Yawei S., Heping S.,

Wei G. (2014), A carboxylic acid-functionalized coumarin-hemicyanine

fluorescent dye and its application to construct a fluorescent probe for

selective detection of cysteine over homocysteine and glutathione, RSC

Advances., 4, pp. 64542-64550.

[67] Jung HS., Ko KC., Kim GH., Lee AR., Na YC., Kang C., Lee JY., Kim JS.

(2011), Coumarin-based thiol chemosensor: synthesis, turn-on mechanism,

and its biological application, Organic Letters., 13(6), pp. 1498-1501.

[68] Karabacak M., Cinar M., Kurt M., Poiyamozhi A., Sundaraganesan N.

(2014), The spectroscopic (FT-IR, FT-Raman, UV and NMR) first order

hyperpolarizability and HOMO–LUMO analysis of dansyl chloride,

Spectrochimiac Acta Part A., 117, pp. 234-244.

[69] Keawwangchai T., Morakot N., Wanno B. (2013), Fluorescent sensors

based on BODIPY derivatives for aluminium ion recognition: an

experimental and theoretical study, Journal of Molecular Modeling., 19, pp.

1435-1444.

[70] Keawwangchai T., Wanno B., Morakot N., Keawwangchai S. (2013),

Optical chemosensors for Cu(II) ion based on BODIPY derivatives: an

experimental and theoretical study, Journal of Molecular Modeling., 19, pp.

4239-4249.

[71] Khalilah G. R., William H. H., Charlo P. B., Christine K. P., Melissa L. K.,

Niren M. (2012), Fluorescent coumarin -thiols measure biological redox

couples, Organic Letters.,14(3), pp. 680–683.

[72] Kim H.J., Kim S.H., Kim J.H., Lee E.H., Kim K.W., and Kim J.S. (2008),

143

BODIPY appended crown ethers: selective fluorescence changes for Hg2+

binding, Bulletin of the Korean Chemical Society., 29(9), pp. 1831-1834.

[73] Kim H.J., Quang D.T., Hong J., Kang G., Ham S., Kim J.S. (2007),

Ratiometry of monomer/excimer emissions of dipyrenyl calix[4]arene in

aqueous media, Tetrahedron., 63(44), pp. 10788-10792.

[74] Kim J.S., and Quang D.T. (2007), Calixarene-derived fluorescent probes,

Chemical Reviews., 107, pp. 3780-3799.

[75] Kim S.H., Choi H.S., Kim J., Lee S.J., Quang D.T., and Kim J.S. (2010),

Novel optical/electrochemical selective 1,2,3-triazole ring-appended

chemosensor for the Al3+ ion, Organic Letters., 12(3), pp. 560-563

[76] Kluijtmans L.A.J., van den Heuvel L.P.W.J., Boers G.H.J., Frosst P.,

Stevens E.M.B., vanOost B.A., den Heijer M., Trijbels F.J.M.; Rozen R.,

Blom H.J. (1996), Molecular genetic analysis in mild

hyperhomocysteinemia: A common mutation in the

methylenetetrahydrofolate reductase gene is a genetic risk factor for

cardiovascular disease, American Journal of Human Genetics., 58, pp.

35-41.

[77] Koch U., Popelier P.L.A. (1995), Characterization of C-H-O hydrogen

bonds on the basis of the charge density, Journal of Chemical Physics., 99,

pp. 9747-9754.

[78] Kumar M., Kumar N., Bhalla V., Singh H., Sharma P.R., and Kaur T.

(2011), Naphthalimide appended rhodamine derivative: through bond energy

transfer for sensing of Hg2+ ions, Organic Letters., 13(6), pp. 1422-1425.

[79] Kun H., Xiaojie J., Chang L., Qing W., Xiaoying Q., Dasheng Z., Song H.,

Liancheng Z., Xianshun Z. (2017), Highly selective and sensitive fluorescent

probe for mercury ions based on a novel rhodol-coumarin hybrid dye, Dyes

and Pigments., 142, pp. 437-446.

[80] Kwon S.K., Kim H.N., Rho J.H., Swamy K.M.K., Shanthakumar S.M., and

Yoon J. (2009), Rhodamine derivative bearing histidine binding site as a

fluorescent chemosensor for Hg2+, Bulletin of the Korean Chemical Society.,

144

30(3), pp. 719-721.

[81] Lee C., Yang W., and Parr R.G. (1998), Development of the colle-salvetti

correlation-energy formula into a functional of the electron density, Physical

Review B., 37, pp. 785-789.

[82] Lee M.H., Giap T.V., Kim S.H., Lee Y.H., Kang C., Kim J.S. (2010), A

novel strategy to selectively detect Fe(III) in aqueous media driven by

hydrolysis of a rhodamine 6G Schiff base, Chemical Communications.,

46(9), pp. 1407-1409.

[83] Lee M.H., Lee S.W., Kim S.H., Kang C., Kim J.S. (2009), Nanomolar

Hg(II) detection using Nile Blue chemodosimeter in biological media,

Organic Letters., 11(10), pp. 2101-2104.

[84] Lee M.H., Quang D.T., Jung H.S., Yoon J., Lee C.H., Kim J.S. (2007), Ion-

induced FRET on-off in fluorescent calix[4]arene, Journal of Organic

Chemistry., 72(11), pp. 4242-4245.

[85] Leng B., Jiang J.B., Tian H. (2010), A mesoporous silica supported

Hg2+ chemodosimeter, American Institute of Chemical Engineers Journal.,

56(11), pp. 2957-2964.

[86] Leng B., Zou L., Jiang J.B., Tian H. (2009), Colorimetric detection of

mercuric ion (Hg2+) in aqueous media using chemodosimeter-functionalized

gold nanoparticles, Sensors and Actuators B Chemical., 140(1), pp. 162-169.

[87] Levine I.N. (2000), Quantum chemistry (fifth edition), Prentice-Hall, Inc.,

New Jersey, USA.

[88] Lim SY., Hong KH., Kim DI., Kwon H., Kim HJ. (2014), Tunable

heptamethine-azo dye conjugate as an NIR fluorescent probe for the

selective detection of mitochondrial glutathione over cysteine and

homocysteine, Journal of the American Chemical Society., 136, pp.

7018-7025.

[89] Lin Y.H., Tao Y., Pu, F., Ren J.S., Qu X.G. (2011), Advanced Functional

Materials, CIAC OpenIR., 21, pp. 4565-4572.

145

[90] Liu, J., Bao, C., Zhong, X., Zhao, C., Zhu, L. (2010), Highly

selective detection of glutathione using a quantum-dot-based OFF–

ON fluorescent probe, Chemical Communications., 46, pp. 2971-2973.

[91] Liu B., Tian H. (2005), A selective fluorescent ratiometric chemodosimeter for

mercury ion, Chemical Communications., pp. 3156-3158.

[92] Li-Ya N., Yu-Zhe C., Hai-Rong Z., Li-Zhu W., Chen-Ho T., and Qing-Zheng

Y. (2015), Design strategies of fluorescent probes for selective detection among

biothiols, Chemical Society Reviews., 44, pp. 6143-6160.

[93] Li-Ya N., Ying-Shi G., Yu-Zhe C., Li-Zhu W., Chen-Ho T., and Qing-Zheng

Y. (2012), BODIPY-based ratiometric fluorescent sensor for highly selective

detection of glutathione over cysteine and homocysteine, Chemical Society.,

134(46), pp. 18928-18931.

[94] Li-Ya N., Qing-Qing Y., Hai-Rong Z., Yu-Zhe C., Li-Zu W., Chen.-Ho T.,

Qing-Zheng Y. (2015), BODIPY-based fluorescent probe for the simultaneous

detection of glutathione and cysteine/homocysteine at different excitation

wavelengths, Royal Society of Chemistry Advances., 5, pp. 3959-3964.

[95] Lowe T.A., Hedberg J., Lundin M., Wold S., and Wallinder I.O. (2013),

Chemical speciation measurements of silver ions in alkaline carbonate

electrolytes using differential pulse stripping voltammetry on glassy carbon

compared with ion selective electrode measurements, International

Journal of Electrochemical Science., 8, pp. 3851-3865.

[96] Lowicka E., Beltowski J. (2007), Hydrogen sulfide (H2S)-the third gas of

interest for pharmacologists, Pharmacological Reports., 59, pp. 4-24.

[97] Lu Z.J., Wang P.N., Zhang Y., Chen J.Y., Zhen S., Leng B., Tian H. (2007),

Tracking of mercury ions in living cells with a fluorescent chemodosimeter

under single -or two-photon excitation, Analytica Chimica Acta., 597, pp.

306-312.

[98] Maity S.B., Bharadwaj P.K. (2015), A polyamide receptor based

benzothiazole derivative: highly selective and sensitive fluorescent sensor

for Hg2+ ion in aqueous medium, Journal of Luminescence., 161, pp. 76-81.

146

[99] Maeda H., Matsuno H., Ushida M., Katayama K., Saeki K., Itoh N. (2005),

2,4-dinitrobenzenesulfonyl fluoresceins as fluorescent alternatives to

Ellman’s reagent in thiol-quantification enzyme assays, Angewandte Chemie

International Edition., 44, pp. 2922–2925.

[100] Maeda H., Katayama K., Matsuno H., Uno T. (2006), 3'-(2,4-

dinitrobenzenesulfonyl)-2',7'-dimethylfluorescein as a fluorescent probe for

selenols, Angewandte Chemie International Edition., 45(11), pp. 1810-1813.

[101] Malkondu S., Erdemir S. (2015), A novel perylene-bisimide dye as “turn

on” fluorescent sensor for Hg2+ ion found in DMF/H2O, Dyes and Pigments.,

113, pp. 763-769.

[102] Mallajosyula S.S., Usha H., Datta A., and Pati S.K. (2008), Molecular

modelling of a chemodosimeter for the selective detection of As(III) ion in

water, Journal of Chemical Sciences., 120(6), pp. 627–635.

[103] Melnyk S., Pogribna M., Pogribny I., Hine RJ., James SJ. (1999), A new

HPLC method for the simultaneous determination of oxidized and reduced

plasma aminothiols using coulometric electrochemical detection, Journal of

Nutritional Biochemistry., 10, pp. 490–497.

[104] Min H. L., Zhigang Y., Choon W. L., Yun H. L., Sun D. C. K., and Jong S.

K. (2013), Disulfide-cleavage-triggered chemosensors and their biological

applications, Chemical Reviews.,113, pp. 5071-5109.

[105] Miller J.C. and Miller J.N. (1998), Statistics for analytical chemistry,

Second ed, Chichester, England: Ellis Horwood Limited.

[106] Murat I., Ruslan G., Safacan K., Yigit A., Berna S., Turgay T., Engin

U. A. (2014), Designing an intracellular fluorescent probe for glutathione:

Two modulation sites for selective signal transduction, Organic Letters.,

16(12), pp. 3260-3263.

[107] Na S., Jianyu J., Hao W., Jing Z., Ronghua ., Winghong C., and Zeper A.

(2010), Design of bis-spiropyran ligands as dipolar molecule receptors and

application to in vivo glutathione fluorescent probes, Journal of the

American Chemical Society., 132(2), 725–736.

147

[108] Oleksandr R,, Nadia N. St. L., Rezik A. A., Jorge O. E., Shan J., Isiah M.

W., Fareed B. D., Kun L., Robert M. S. (2004), Visual detection of cysteine and

homocysteine, Journal of the American Chemical Society., 126(2), pp. 438-439.

[109] Oram P.D., Fang X., Fernando Q., Letkeman P., and Letkeman D (1996),

The formation constants of mercury(II)−glutathione complexes, Chemical

Research in Toxicology., 9(4), pp. 709–712.

[110] Peddiahgari V. G. R., Yang-Wei L., and Huan-Tsung C. (2007), Synthesis

of novel benzothiazole compounds with an extended conjugated system,

General Papers., Volume 207 (xvi), pp. 113-122.

[111] Peng M.J., Yang X.F., Yin B., Guo Y., Suzenet F., En D., Li J., Li C.W.,

Duan Y.W. (2014), A hybrid coumarin-thiazole fluorescent sensor for

selective detection of bisulfite anions in vivo and in real samples, Chemistry

Asian Journal., 9(7), pp. 1817-1822.

[112] Peng L., Zhou Z., Wei R., Li K., Song P., Tong A., (2014), A fluorescent

probe for thiols based on aggregation-induced emission and its application in

live-cell imaging, Dyes and Pigments., pp. 24-31.

[113] Petr K., Jakob W. (2009), Photochemistry of organic compounds: From

concepts to practice, A John Wiley and Sons Ltd, United Kingdom.

[114] Petsko G.A., Ringe D. (2004), Protein structure and function: From

sequence to consequence, New Science Press Ltd.: London, UK.

[115] Pratim K.C., (2009), Chemical reactivity theory: A density functional view,

CRC Press, Taylor & Francis Group.

[116] Pi W., Jing L., Xin L., Yunlong L., Yun Z., and Wei G. (2012), A

naphthalimide-based glyoxal hydrazone for selective fluorescence turn-on

sensing of Cys and Hcy, Organic Letters., 14(2), pp. 520-523.

[117] Qian X., Xiao Y., Xu Y., Guo X., Qian J., Zhu W. (2010), "Alive" dyes as

fluorescent sensors: fluorophore, mechanism, receptor and images in living

cells, Chemical Communications, 46(35), pp. 6418-6436.

[118] Quan L., Sun T.T., Lin W.H., Guan X.G., Zheng M., Xie Z.G., Jing X.B.

(2014), BODIPY fluorescent chemosensor for Cu detection and its

148

applications in living cells: fast response and high sensitivity, Journal of

Fluorescence., 24, pp. 841-846.

[119] Quang D.T., Jung H.S., Yoon J.H., Lee S.Y., and Kim J.S. (2007),

Coumarin appended calix[4]arene as a selective fluorometric sensor for Cu2+

ion in aqueous solution, Bulletin of the Korean Chemical Society ., 28(4),

pp. 682-684.

[120] Quang D.T., Kim J.S. (2010), Fluoro- and chromogenic chemodosimeters

for heavy metal ion detection in solution and biospecimens,

Chemical Reviews., 110, pp. 6280-6310.

[121] Quang D.T., Wu J.S., Luyen N.D., Duong T., Dan N.D., Bao N.C., Quy

P.T. (2011), Rhodamine-derived Schiff base for the selective determination

of mercuric ions in water media, Spectrochimica Acta Part A ., 78(2), pp.

753-756.

[122] Rahman I., MacNee W. (2000), Regulation of redox glutathione levels and

gene transcription in lung inflammation: therapeutic approaches,

Free Radical Biology and Medicine ., 28(9), pp. 1405-1420.

[123] Rančić S.M., Nikolić-Mandić S.D., Bojić A.L. (2014), Analytical

application of the reaction system methylene blue B–K2S2O8 for the

spectrophotometric kinetic determination of silver in citric buffer media,

Hemijska Industrija., 68(4), pp. 429-434.

[124] Refsum H., Ueland PM., Nygard O., Vollset SE. (1998), Homocysteine

and cardiovascular disease, Annual Review of Medicine ., 49, pp. 31-62.

[125] Ruangpornvisuti. V. (2007), A DFT study of molecular structures and

tautomerizations of 2-benzoylpyridine semicarbazone and picolinaldehyde

N-oxide thiosemicarbazone and their complexations with Ni(II), Cu(II), and

Zn(II), Structural Chemistry ., 18, pp. 977-984.

[126] Rui W., Lingxin C., Ping L., Qin Z., Yunqing W. (2012), Sensitive near

infrared fluorescent probes for thiols based on Se-N bond cleavage: Imaging in

living cells and tissues, Chemistry-A European Journal., 18, pp. 11343-11349.

[127] Rurack K., Kollmannsberger M., Resch-Genger U. and Daub J. (2000), A

149

selective and sensitive fluoroionophore for Hg(II), Ag(I), and Cu(II) with

virtually decoupled fluorophore and receptor units, Journal of the American

Chemical Society ., 122(5), pp. 968-969.

[128] Sakamoto H., Ishikawa J., Osuga H., Doi K., and Wada H. (2010), Highly

silver ion selective fluorescence ionophore: fluorescent properties of

polythiazaalkane derivatives bearing 8-(7-hydroxy-4-methyl)coumarinyl

moiety in aqueous solution and in liquid–liquid extraction systems, Analyst.,

135, pp. 550-558.

[129] Salarvand Z. (2008), Quantitative analysis of Ag, Sn and Cu in dental

amalgam powder by gravimetric, AAS and ICP methods and comparing their

precisions, Research Journal of Biological Sciences, 3(6), pp. 557-561.

[130] Samb I., Bell J., Toullec P.Y., Michelet V., Leray I. (2011), Fluorescent

phosphane selenide as efficient mercury chemodosimeter, Organic Letters.,

13, pp. 1182-1185.

[131] Saita K., Nakazono M., Zaitsu K., Nanbo S., Sekiya H. (2009),

Theoretical study of photophysical properties of bisindolylmaleimide

derivatives, Journal of Physical Chemistry B., 113, pp. 8213-8220.

[132] Schacklette H.T., Boerngen J.G. (1984), Element concentrations in soils

and other surficial materials of the conterminous United States. U. S.

Geological Survey Professional Paper 1270. Washington: United States

Government Printing Office.

[133] Seda S., Hacer P. (2009), Spectroscopic and DFT studies of flurbiprofen as

dimer and its Cu(II) and Hg(II) complexes, Spectrochimica Acta Part A., 73,

pp. 181-194.

[134] Seshadri S., Beiser A., Selhub J., Jacques PF., Rosenberg IH., D’Agostino

RB., et al.(2002), Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and

Alzheimer’s disease, New England Journal of Medicine., 346, pp. 476-483.

[135] Shibata A., Furukawa K., Abe H., Tsuneda S., Ito Y. (2008), Rhodamine-

based fluorogenic probe for imaging biological thiol,

Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters.,18(7), pp. 2246-2249.

150

[136] Shiraishi Y., Sumiya S., Hirai T. (2010), A coumarin–thiourea conjugate

as a fluorescent probe for Hg(II) in aqueous media with a broad pH range 2–

12, Organic and Biomolecular Chemistry., 8, pp. 1310-1314.

[137] Sholl D.S., Steckel J.A. (2009), Density functional theory: A practical

introduction. Published online: 11 AUG 2009. Print ISBN: 9780470373170.

Online ISBN: 9780470447710. DOI: 10.1002/9780470447710. Published by

John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey.

[138] Silva A.P.D., Moody T.S. and Wright G.D. (2009), Fluorescent PET

(Photoinduced Electron Transfer) sensors as potent analytical tools, Analyst.,

134, pp. 2385-2393.

[139] Soo-Yeon L., Sanghee L., Seung Bum P., Hae-Jo K. (2011), Highly

selective fluorescence turn-on probe for glutathione, Tetrahedron Letters.,

52(30), pp. 3902-3904.

[140] Su D., Teoh C.L., Sahu S., Das R.K., Chang Y.T., (2014), Live cells

imaging using a turn-on FRET-based BODIPY probe for biothiols.

Biomaterials, 35, pp. 6078-6085.

[141] Stobiecka M., Molinero A.A., Chalupa A., Hepel M. (2012),

Mercury/homocysteine ligation-induced ON/OFF-switching of a T-T

mismatch-based oligonucleotide molecular-beacon, Analytical Chemistry., 84,

pp. 4970-4978.

[142] Su H., Chen X., and Fang W. (2014), ON–OFF mechanism of a fluorescent

sensor for the detection of Zn(II), Cd(II), and Cu(II) transition metal ions,

Analytical Chemistry., 86 (1), pp. 891-899.

[143] Sumiya S., Sugii T., Shiraishi Y., Hirai T. (2011), A benzoxadiazole–

thiourea conjugate as a fluorescent chemodosimeter for Hg(II) in aqueous

media, Journal of Photochemistry and Photobiology., 219, pp. 154-158.

[144] Tang, B., Xing, Y., Li, P., Zhang, N., Yu, F., Yang, G. (2007), A

rhodamine-based fluorescent probe containing a Se−N bond for detecting

thiols and its application in living cells, Journal of the American Chemical

Society., 129(38), pp. 11666-11667.

151

[145] Ulusoy H.I. (2014), Determination of trace inorganic mercury species in

water samples by cloud point extraction and UV-vis spectrophotometry,

Journal of AOAC International ., 97(1), pp. 238-244.

[146] Valeur B. (2001), Molecular Fluorescence: Principles and Applications.

Wiley-VCH: Weinheim-New York- Chichester -Brisbane- Singapore -

Toronto.

[147] Van Meurs JBJ., Dhonukshe-Rutten RAM., Pluijm SMF., van der Klift M.,

de Jonge R., Lindemans J., de Groot LCPGM., Hofman A., Witteman JCM.,

van Leeuwen JPTM., Breteler MMB., Lips P., Pols HAP., Uitterlinden AG.

(2004), Homocysteine levels and the risk of osteoporotic fracture, New

England Journal of Medicine., 350(20), pp. 2033-2041.

[148] Van L.N., Ulf S., Kwangho N., Erik B. (2017), Thermodynamic stability

of mercury(II) complexes formed with environmentally relevant low-

molecular-mass thiols studied by competing ligand exchange and density

functional theory, Environmental Chemistry., 14(4), pp. 243-253.

[149] Vikas P., Ponnadurai R., Nagaiyan S. (2013), TD-DFT Study of excited-state

intramolecular proton transfer (ESIPT) of 2-(1,3-benzothiazol-2-yl)-5-(N,N-

diethylamino)phenol with benzoxazole and benzimidazole analogues,

Procedia Computer Science., 18, pp. 797 – 805

[150] Venkatachalam S., Karunathana R., Kannappan V. (2013), Molecular

Modeling and Spectroscopic Studies of Benzothiazole, Journal of Chemistry.,

Volume 2013, Article ID 258519, 14 pages

http://dx.doi.org/10.1155/2013/258519.

[151] Wadt W.R., Hay P.J. (1985), Ab initio effective core potentials for molecular

calculations. Potentials for main group elements Na to Bi, Journal of

Chemical Physics., 82, pp. 284-298.

[152] Wang H.F., Wu S.P. (2013), A pyrene-based highly selective turn-on

fluorescent sensor for copper(II) ions and its application in living cell imaging,

Sensors and Actuators B-Chemical., 181, pp. 743-748.

152

[153] Wang H.F., Wu S.P. (2013), Highly selective fluorescent sensors for

mercury(II) ions and their applications in living cell imaging, Tetrahedron, 69,

pp. 1965-1969.

[154] Wang H., Zhou G., Gai H. and Chen X. (2012), A fluorescein-based probe

with high selectivity to cysteine over homocysteine and glutathione, Chemical

Communications., 48, pp. 8341-8343.

[155] Wang L., Zhou Q., Zhu B., Yan L., Ma Z., Du B., Zhang X. (2012), A

colorimetric and fluorescent chemodosimeter for discriminative and

simultaneous quantification of cysteine and homocysteine,

Dyes and Pigments, 95(2), pp. 275-279.

[156] Warren J.H., (2003), A Guide to molecular mechanics and quantum chemical

calculations, Wavefunction, Inc.

[157] Weinhold F., Landis C.R. (2001), Natural bond orbitals and extensions of

localized bonding concepts, Chemistry Education Research and Practice., 2,

pp. 91-104.

[158] Wheeler S.E. and Houk K.N. (2009), Substituent effects in cation/π

interactions and electrostatic potentials above the center of substituted

benzenes are due primarily to through-space effects of the substituents,

Journal of the American Chemical Society ., 131(9), pp. 3126–3127.

[159] William R. S., and Eli R. (1968), Fluorescence of substituted 7-

hydroxycoumarins, Analytical Chemistry., 40 (4), pp 803–805.

[160] Wolfram K., Max C.H. (2001), A chemist’s guide to density funtional theory,

Villey-VCH.

[161] Wu J.S., Hwang I.C., Kim K.S., Kim J.S. (2007), Rhodamine-based Hg2+-

selective chemodosimeter in aqueous solution: fluorescent OFF-ON, Organic

Letters., 9, pp. 907-910

[162] Wu G.Y., Fang Y.Z., Yang S., Lupton J.R., Turner N.D. (2004),

Glutathione metabolism and its implications for health, Journal of

Nutrition., 134, pp. 489-492.

153

[163] Weiying L., Lingliang L., Lin Y., Zengmei C., Bingbing C., and Wen T.

(2008), A ratiometric fluorescent probe for cysteine and homocysteine

displaying a large emission shift, Organic Letters., 10(24), pp. 5577-5580.

[164] Xiong X., Song F., Chen G., Sun W., Wang J., Gao P., Zhang Y., Qiao B., Li

W., Sun S, Fan J., Peng X., (2013), Construction of long-wavelength

fluorescein analogues and their application as fluorescent probes,

Chemistry European Journal., 19, pp. 6538-6545.

[165] Xiaofeng Y., Yixing G., and Robert M. S. (2012), A seminaphthoflu-

orescein-based fluorescent chemodosimeter for the highly selective detection

of cysteine, Organic and Biomolecular Chemistry ., 10(14), pp. 2739-2741.

[166] Xiaohong C., Shaohua Q., LiXiao, Wangnan L., Ping H. (2018),

Thioacetalized coumarin-based fluorescent probe for mercury(II): ratiometric

response, high selectivity and successful bioimaging application, Journal of

Photochemistry and Photobiology A: Chemistry., 364, pp. 503-509.

[167] Xin Z., Xuejun J., Guangyan S., Dan L., and Xuesong W. (2012),

A cysteine probe with high selectivity and sensitivity promoted by response-

assisted electrostatic attraction, Chemical Communications., 48, pp. 8793-8795.

[168] Xin Z., Xuejun J., Guangyan S., and Xuesong W. (2013), A sensitive and

selective fluorescent probe for cysteine based on a new response-assisted

electrostatic attraction strategy: The role of spatial charge configuration,

Chemistry European Journal., 19, pp. 7817-7824.

[169] Xu H., Hepel M. (2011), “Molecular beacon”-based fluorescent assay for

selective setection of glutathione and cysteine, Analytical Chemistry., 83(3),

pp. 813-819.

[170] Xu W., Jianzheng Lv., Xueying Y., Yong L., Fang H., Mengmeng

L., Jie Y., Xiuyun R., Bo T. (2014), Screening and investigation of a

cyanine fluorescent probe for simultaneous sensing of glutathione and cysteine

under single excitation, Chemical Communications., 50, pp. 15439-15442.

[171] Yan-Fei K., Hai-Xia Q., Ya-Li M., Zhen-Hui X., Li-Ping G., Jin-Nan Z.,

Yi-Na W. (2017), A simple and sensitive fluorescent probe for specific

154

detection of cysteine, Journal of Chemical Sciences., 129(8), pp. 1219-1223.

[172] Yang Y., Zhao Q., Feng W., and Li F. (2013), Luminescent

chemodosimeters for bioimaging, Chemical Reviews., 113, pp. 192-270.

[173] Yin C.X., Qu L.J., Huo F.J. (2014), A pyridoxal-based chemosensor for

visual detection of copper ion and its application in bioimaging, Chinese

Chemical Letters., 25, pp. 1230-1234.

[174] Ying H., Cheol H. H., Gyoungmi K., Eun J. J., Jun Y., Hwan M. K., and

Juyoung Y. (2015), One-photon and two-photon sensing of biothiols using a

bis-pyreneCu(II) ensemble and its application to image GSH in the cells and

tissues, Analytical Chemistry., 87 (6), pp. 3308–3313.

[175] Yinhui L., Yu D., Jishan L., Jing Z., Huan Y., and Ronghua Y. (2012),

Simultaneous nucleophilic-substituted and electrostatic interactions for

thermal switching of spiropyran: A new approach for rapid and selective

colorimetric detection of thiol-containing amino acids, Analytical

Chemistry., 84(11), pp. 4732-4738.

[176] Yawei L., Song Z., Xin L., Yuan-Qiang S., Jing L., and Wei G.

(2014), Constructing a fluorescent probe for specific detection of cysteine

over homocysteine and glutathione based on a novel cysteine-binding group

but-3-yn-2-one, Analyst., 139, pp. 4081-4087.

[177] Yin J., Kwon Y., Kim D., Lee D., Kim G., Hu Y., Ryu JH., Yoon J. (2015),

Preparation of a cyanine-based fluorescent probe for highly selective detection

of glutathione and its use in living cells and tissues of mice, Nature

Protocols.,10, pp. 1742-1754.

[178] Yi L., Li H., Sun L., Liu L., Zhang C., Xi Z. (2009), A highly sensitive

fluorescence probe for fast thiol-quantification assay of glutathione reductase,

Angewandte Chemie International Edition., 48, pp. 4034-4037.

[179] Yin J., Kwon Y., Kim D., Lee D., Kim G., Hu Y., Ryu JH., Yoon J. (2014),

Cyanine-based fluorescent probe for highly selective detection of glutathione in

cell cultures and live mouse tissues, Journal of the American Chemical Society.,

136, pp. 5351-5358.

155

[180] Yong G.S., Jian H.Y., Yu L.D., Qi L. M., Jian H.C., Quan Q.X.,Ying Z., Jun

F. Z., Gao Z.G. (2013), 1,8-Naphthalimide–Cu(ІІ) ensemble based turn-on

fluorescent probe for the detection of thiols in organic aqueous media,

Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters., 23, pp. 2538-2542.

[181] Yuan X., Tay Y.Q., Dou X.Y., Luo Z.T., Leong D.T., Xie J.P.(2013),

Glutathione-protected silver nanoclusters as cysteine-selective fluorometric and

colorimetric probe, Analytical Chemistry., 85, pp. 1913-1919.

[182] Yuanyuan L., Song H., Yan L., Xianshun Z. (2011), Novel

hemicyanine dye as colorimetric and fluorometric dual-modal chemosensor for

mercury in water, Organic and Biomolecular Chemistry., 9, pp. 2606-2609.

[183] Yordanova S., Stoianov S., Grabchev I., and Petkov I. (2013), Detection of

metal ions and protons with a new blue fluorescent bis(1,8-naphthalimide),

International Journal of Inorganic Chemistry, Article ID 628946,

http://dx.doi.org/10.1155/2013/628946.

[184] Zhao Y.G., Lin Z.H., He C., Wu H.M., Duan C.Y. (2006), A “turn-on”

fluorescent sensor for selective Hg(II) detection in aqueous media based on

metal-induced dye formation, Inorganic Chemistry., 45(25), pp. 10013-10015.

[185] Zhao C., Qu K.G., Song Y.J., Xu C., Ren J.S., Qu X.G. (2010), A reusable

DNA single-walled carbon-nanotube-based fluorescent sensor for highly

sensitive and selective detection of Ag+ and cysteine in aqueous solutions,

Chemistry European Journal., 16(27), pp. 8147-8154.

[186] Zhiqian G., Weihong Z., Mingming Z., Xumeng W., He T. (2010), Near-

infrared cell-permeable Hg2+ - selective ratiometric fluorescent

chemodosimeters and fast indicator paper for MeHg+ based on

tricarbocyanines, Chemistry - A European Journal., 16 (48), pp. 14424-14432.

[187] Zhou L., Lin Y.H., Huang Z.Z., Ren J.S., Qu X.G. (2012), Carbon nanodots

as fluorescence probes for rapid, sensitive, and label-free detection of Hg2+ and

biothiols in complex matrices, Chemical Communications., 48, pp. 1147-1149.

156

[188] Zhou C., Xiao N., Li Y. (2014), Simple quinoline-based “turn-on” fluorescent

sensor for imaging copper (II) in living cells, Canadian Journal of Chemistry,

92(11)., pp. 1092-1097.

[189] Zhu B., Guo B., Zhao Y., Zhang B., Du B., (2014), A highly sensitive

ratiometric fluorescent probe with a large emission shift for imaging

endogenous cysteine in living cells, Biosens Bioelectron., 55, pp. 72-75.

[190] Zou Q., Zou L., Tian H. (2011), Detection and adsorption of Hg2+ by new

mesoporous silica and membrane material grafted with a chemodosimeter,

Journal of Materials Chemistry., 21, pp. 14441-14447.

[191] Zuo QP., Li B., Pei Q., Li Z., Liu SK. (2010), A highly selective

fluorescent probe for detection of biological samples thiol and its application

in living cells, Journal of Fluorescence., 20(6), pp. 1307-1313.