Maduracin y Activacin de Linfocitos TLic TM Alejandro Retamal Salazar

Maduracin y Activacin de LT

CD4+ TCRTCR2(, )MHC TCR1(, ) CD8+MADURACIONLa enorme diversidad antignica potencial se reduce a un 2%. Durante la maduracin intratmica de los timocitos: slo llegan a madurar aquellas clulas restringidas a reconocer lo no-propio en el contexto del haplotipo MHC propio (autorrestriccin y autotolerancia). Las fases finales de la maduracin ocurren por dos rutas de desarrollo diferentes que generan dos subpoblaciones: LTCD4+(restringidos por MHC-II) y LTCD8+ (restringidos por MHC-I).

Activacin de LT

La activacin de LT maduras perifricas se inicia con la interaccin entre el TCR y un pptido antignico enclavado en el MHC. La baja afinidad (10-5M) de esta interaccin ternaria se ve potenciada por la presencia decorreceptores y otras molculas de membrana, que funcionan para fortalecer la unin TCR-pptido-MHC, y para transducir la seal activadora al interior de la clula T. Desencadena la proliferacin clonal y diferenciacin en 2 subpoblaciones:T efectoras y otra de T de memoria.

Fases y elementos de la RIEn funcin del tiempo y [Ag]...

Tipos de respuestaA nivel celular...APCAPCaAg - derivadosTTVirgenEfectorMemoriaTh (CD4+)Tc (CD8+) CitotoxicidadTh1 FagocitosisTh2 RI humoralT

Desarrollo de LT

Bhandoola A et al., Immunity, 2007Los LT se desarrollan a partir de precursores hematopoyticos (clulas madre) y maduran en el timo Linfocito T CD4+Linfocito T CD8+Los timocitos DN se localizan en la zona subcapsular de la corteza. Los DP se localizan en la corteza. Los timocitos maduros CD4+ y CD8+ se ubican en la mdula. En la corteza, las clulas epiteliales corticales establecen contactos por sus largos procesos de membrana con los timocitos

El 95% de los timocitos que alcanzan el estado DP (doble positivo) son eliminados porque su receptor de antgeno (TCR) reacciona con demasiada intensidad a Ags propios (son demasiado autoreactivos) o no es capaz de reconocer a las CPA (seran intiles ya que no podrn ver ningn tipo de Ag ms adelante).

Los que superan este proceso se convierten en positivos simples (expresan CD4 o CD8 en la superficie) y son capaces de reconocer molculas especficas (MHC) en las CPA, que ms adelante les servirn para activarse en respuesta a Ags.Linfocito T CD4+Linfocito T CD8+

Reconocimiento de Ags por los LT. Clulas Presentadoras de Ags

Los Ags son estructuras tridimensionales que encajan con alta afinidad en el receptor de la clula T (TCR) cuando son presentados por el MHC.

Generalmente son fragmentos cortos de Pr- que pueden proceder de componentes de nuestro organismo o externos, que pueden ser patgenos o sustancias inocuas.

Estas pr- han sido procesadas dentro de las CPA y sus fragmentos se unen al MHC, que los transporta a la superficie celular donde son expuestos.

Otros tipos de molcula (no slo pptidos) tambin pueden funcionar como antgeno.

Clula presentadoraLinfocito TMHCTcRantgenohttp://stratikos.googlepages.com/mhc

www2.cnrs.fr/sites/en/image/810color.jpgwww.immunity.com/.../immuni/immuni.24.5.gif El tipo de respuesta que desarrolle el LT depender de la informacin que reciba de la CPALa mayora de los linfocitos producidos en el organismo se encuentran en un estado de reposo y tienen una vida corta.

Para poder activarse y responder a Ags, necesitan de CPA

Ambos tipos de clulas expresan molculas de superficie que al contactar con sus ligandos en la clula vecina emiten seales intracelularesAdems, durante el contacto las clulas secretan pequeas molculas solubles, (citoquinas, interleuquinas), que tambin actan sobre receptores que trasducen seales LinfocitoClula presentadora (dendrtica, macrfago)

TcRL TClula presentadora (CPA)Sinapsis inmunolgicaDustin M., Arthritis Research, 2002. S119. www.pasteur.fr/icono/RAR/RAR2004/photo2_Ubic.jpg

TCRMolculas de adhesinTCRLos receptores de Ag se agrupan y concentran en la sinapsisDustin M., Arthritis Research, 2002. S119.

Diferentes combinaciones de seales intracelulares resultantes de la activacin del TCR: molculas coestimuladoras y citoquinas regulan a su vez combinaciones de factores de transcripcin que promueven la diferenciacin de los linfocitos hacia distintas subpoblaciones con funciones especficas.

citoquinacitoquinacitoquinawww.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

CD4 o CD8APCClula TcitoquinacitoquinacitoquinaTcRCD28CD80MHCpptidowww.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

CD4 o CD8APCClula TcitoquinacitoquinacitoquinaTcRCD28CD80www.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

CD4 o CD8APCClula TcitoquinacitoquinacitoquinaTcRCD28CD80www.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

CD4 o CD8APCClula TcitoquinacitoquinacitoquinaTcRCD28CD80www.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

CD4 o CD8APCClula TcitoquinacitoquinacitoquinaTcRCD28CD80www.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

Diferenciacin de LT. Linfocitos efectores, reguladores y anrgicos. Tolerancia perifrica

Diferenciacin de LT hacia T cooperadores (Th) o reguladores/supresores (Treg)Linfocito T CD4+ naveClula presentadora (APC)Linfocito T Th1Linfocito T Th2Linfocito T TregcitoquinasLinfocito T anrgicoLinfocito T Th17No recibe seal coestimuladora de la APC (AUTOINMUNIDAD)

Diferenciacin de linfocitos T hacia T cooperadores (Th) o reguladores/supresores (Treg)IFNg, TNFa IL-2 (IgG1)IL-13, IL-4 (IgE)IL-10,TGF-b1(IgG4, IgA)citoquinasNo produce citoquinas, no proliferaLinfocito T CD4+ naveIL-17Clula presentadora (APC)No recibe seal coestimuladora de la APC

Desequilibrios en la proporcin de subpoblaciones T se asocian a inmunodeficiencias, alergias, o autoinmunidadNormalInmunodeficienciaAlergiaAutoinmunidad

Las CPA determinan la diferenciacin de los L hacia distintas subpoblaciones en funcin del entorno que las rodea (lesiones o traumatismos en tejidos, presencia de agentes infecciosos, contexto inflamatorio)

CD4 o CD8APCClula TcitoquinacitoquinacitoquinaTcRCD28CD80www.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

Las CPA determinan la activacin y diferenciacin de los LTSt Clair EW et al., Annu Rev Medicine, 2007

Las CPA determinan la activacin y diferenciacin de los LT hacia distintas subpoblacionesSt Clair EW et al., Annu Rev Medicine, 2007-Th3 supresoras-FoxP3 regula el desarrolllo y expresin de Tr-factor activador de linfocitos B perteneciente a la familia TNF

Rutas de sealizacin intracelularEl TCR tiene colas citoplsmicas cortas que por s mismas son incapaces de sealizacin intracelular. Una vez que el TCR se une al pptido:MHC, esta seal se transduce al interior del LT por medio de los dominios citoplsmicos de CD3, el correceptor CD4 y varias molculas accesorias (CD2, CD45). Dicha transduccin de seal se realiza por medio de una serie de proten-quinasas y proten-fosfatasas.

Rutas de sealizacin intracelular

Protena p56lckProtena p59 fyn

Fosforilasa ZAP-70

Fosfatasa CD45 (=LCA=T200)

Rutas de sealizacin intracelular

1. Protena p56lckes una proten-quinasa que se une a membrana mediante cido mirstico engarzado a la glicocola en posicin 2 (Gly2).Posee dos secuencias homlogas con otras protenas (SH2 y SH3). La SH2 participar en el reconocimiento de tirosinas fosforilables en la protena diana. La porcin carboxiterminal es la que tiene actividad de quinasa. La tirosina que est en la posicin 394 (Tyr de regulacin +) es la tirosina que se fosforila al activarse el LT, En los LT en reposo la Tyr que est en posicin 505 (Tyr de regulacin -) est fosforilada (Tyr-P), y se desfosforila cuando las clulas se activan. En el primer tercio se encuentra una cistena que ser la encargada de unirse por puente disulfuro con CD4 (o en el caso de TC, con CD8). Tambin se asocia fsicamente con las cadenas x y e del CD3.

Rutas de sealizacin intracelular

2. Protena p59fynSu estructura es muy parecida a la de p56lck. Tambin se encuentra anclada a la membrana por miristilacin.Posee una Tyr cerca del extremo carboxi-terminal, que cuando est fosforilada hace que la p59fyn est inactiva. Otro sitio Tyr capaz de recibir fosfato por autofosforilacin de esta quinasa, hace que la protena pueda fosforilar a otras protenas.Est fsicamente asociada a cadenas x del CD3.

Rutas de sealizacin intracelular

3. Fosforilasa ZAP-70No est asociada por miristilacin a la membrana. Contiene una Tyr capaz de autofosforilarse, carece de Tyr de regulacin (-). En LT en reposo, la ZAP-70 no se encuentra asociada al complejo TCR-CD3; sin embargo, cuando se inicia el proceso de activacin celular, y una vez que las cadenas x y e de CD3 quedan fosforiladas por otras proten-quinasas, la ZAP-70, por medio de sus dominios SH2 se une a estas cadenas fosforiladas, y entonces queda activada en su capacidad de fosforilasa

Rutas de sealizacin intracelular

4. Fosfatasa CD45 (=LCA=T200)El CD45 es en realidad una familia de fosfatasas especficas de tirosina, se expresa en todas las clulas del linaje hematopoytico excepto en los eritrocitos. Existen varias isoformas, de entre 180-200 kDa: - CD45RA se expresa en T vrgenes- CD45R0 en T cebados. Tiene un dominio extracelular, que est glucosilado; se une a la CD22. Su porcin citoplsmica es larga, y cuenta con dos dominios dotados de actividad fosfatasa de tirosinas (PTP). Parece ser que una de sus funciones es desfosforilar la Tyr-P situada cerca del extremo carboxi-terminal de las proten-quinasas (PTK) p56lck y p59fyn

Modelo actual de la activacin del LTh

Los numerosos conjuntos TCR-CD3-CD4 interaccionan simultneamente con muchos complejos pptido:MHC-II (se dan al menos unos 100 de tales complejos). Cada TCR se une al pptido enclavado en el MHC-II . Al mismo tiempo, el CD4 interacciona (por su dominio extracelular) con el dominio 2 de la MHC-II. Esta interaccin provoca un cambio conformacional que se transmite a las colas citoplsmicas de los polipptidos del CD3 y del CD4. Ello induce la yuxtaposicin de p56lck con las secuencias ARAM (=ITAM) de las protenas de CD3. Entonces, la actividad fosfatasa de CD45 provoca la desfosforilacin de la tirosina fosforilada (Tyr-P) carboxi-terminal de p56lck y de p59fyn, lo que supone la activacin de estas dos proten-tirosnquinasas (PTK): se autofosforilan en la otra tirosina (la de regulacin+ ).

La activacin de las dos PTK (p56lck y de p59fyn) por autofosforilacin provoca que a su vez stas fosforilen las cadenas del complejo CD3, reconociendo las secuencias ARAM en x y en e . A las colas fosforiladas de CD3 y CD4 se une ahora la ZAP-70, de modo que sta adquiere a su vez su actividad de protenquinasa, con lo que puede fosforilar a cadenas del CD3 y a otras pr-. La ZAP-70 activa y la Fyn activa, fosforilan a la fosfolipasa Cg 1 (PLCg 1), que originalmente es una pr- citoplsmica; al fosforilarse la PLCg1 se activa y emigra al lado citoplsmico de la membrana, reconociendo otras pr- que tienen tirosinas fosforiladas. Al hacer esto, se facilita que la PLCg 1 entre en contacto con su sustrato: el fosfatidil-inositol-bifosfato (PIP2). Entonces, la PLCg 1 hidroliza a este PIP2, generando inositol-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG), cada uno de los cuales suponen el arranque de sendas rutas dentro de esta compleja cascada activadora:

Ruta del inositol-trifosfato (IP3)

El IP3 se une a un receptor especfico situado en el REr, provocando la salida al citoplasma de grandes cantidades de Ca++, y junto con IP4 provoca tambin la entrada desde el exterior celular, a travs de canales de Ca de la membrana citoplsmica, El aumento intracelular de Ca++ estimula a la enzima calmodulina, que es una sern/treonn-quinasa. La calmodulina activada activa a su vez a la calcineurina, que es una fosfatasa. La calcineurina activada cataliza la desfosforilacin del factor NF-AT citoplsmico fosforilado (NF-ATc-P). Una vez desfosforilado, el NF-AT emigra al ncleo, donde se junta con el factor nuclear AP1, formando entre ambos un factor de activacin transcripcional de varios genes, entre ellos el que codifica la citoquina IL-2.

Ruta del diacilglicerol (DAG)

El DAG, + Ca++, estimula a la proten-quinasa C (PKC), que hasta ese momento resida en el citoplasma.

Al activarse, la PKC emigra a la cara interna de la membrana citoplsmica; all, en presencia de los fosfolpidos, ejerce su funcin como sern/treonn-quinasa: fosforila una amplia variedad de pr-, entre las cuales esta una pr- codificada por el protooncogn ras.

La protena Ras, inicia otra cascada de fosforilaciones que llega hasta las quinasas MAP. Estas quinasas parece que emigran al ncleo, donde activan por fosforilacin a factores de transcripcin:

c-fos y c-jun se unen para formar el AP1, que se une solo o junto con NF-AT, reconociendo en cada caso secuencias especficas de la zona promotora/intensificadora de ciertos genes.

La seal coestimulatoria

Adems de las seales suministradas a partir del contacto entre el complejo TCR-CD3-pptido-MHC, la activacin del LTh requiere una seal adicional, coestimulatoria, que puede provenir de:la citoquina IL-1, suministrada por la CPA, la citoquinaIL-6, de la CPA, La seal + potente es la que supone el contacto entre la molcula B7 (=CD80) de la CPA y la CD28 o la CTLA-4 del LTh.

B7 (=CD80) consta de dos cadenas idnticas con dos dominios de tipo Ig. Se expresa exclusivamente en CPA capaces de estimular a LT. Se puede presentar en dos versiones estructuralmente parecidas, denominadas B7.1 y B7.2.La CD28 es una glucoprotena homodimrica, cuyo monmero pesa 44 kDa, presente en LTh en reposo. Cada cadena presenta un dominio de tipo V-Ig, y est muy glucosilada. Tiene afinidad baja hacia la B7 La CTLA-4 est codificada por un gen cercano al de la CD28, presentando gran homologa. Pero la CTLA-4 slo se expresa en LTh activados, siendo su afinidad muy alta hacia la molcula B7

Activacin gnica

Genes de expresin inmediata (una media hora). Genes de expresin temprana (1 a 2 horas): son esencialmente los que codifican las citoquinas IL-2 (as como el gen de su receptor IL-2R), IL-3, IL-6 e interfern gamma (IFN-g ). 3. Genes de expresin tarda (hasta 2 das o ms): los que codifican ciertas molculas de adhesin intercelular. Para que se produzca la expansin clonal de los LTh se necesita un incremento en la expresin del gen de la IL-2 y de su receptor (IL-2R). En esta tarea interviene una serie de pr- reguladoras y factores de transcripcin que se unen a secuencias especficas de la zona 5 no codificadora (promotor/intensificador) de los correspondientes genes:

Activacin gnica

complejo AP1 (c-Fos+c-Jun): se une al elemento TRE factor nuclear NF-AT factor {AP1+NF-AT}, que es especfico de las clulas T: se une al elemento ARRES complejo Oct-1+Oct-2+OAP: se une a OBM factor NF-kB: se une a la secuencia kB-RE.La forma fosforilada (citoplsmica) de NF-AT, al activarse el LT, se desfosforila por la accin de la calcineurina, con lo que se activa y migra al ncleo; all forma complejo con AP1, reconociendo una secuencia especfica (ARRES) del promotor de los genes de IL-2 y de IL-2R.Esta desfosforilacin del NF-AT se puede inhibir por la accin de drogas como la ciclosporina A (Cs-A) o el FK506

Anergia clonal

La anergia clonal es la incapacidad proliferativa de un linfocito tras un contacto con el complejo pptido-MHC, y se debe a la carencia de la seal coestimulatoria proporcionada por la interaccin entre CD28 del LTh y B7 de la APC. No se trata de una mera no-respuesta pasiva, sino que la anergia es un estado activo de no proliferacin. Si ponemos en contacto linfocitos TH con APC fijadas por glutaraldehido (y que por lo tanto no expresan molculas B7 en su membrana), el linfocito entra en anergia. Esto se debe a que aunque ha contactado por su complejo TCR-CD3 con el pptido-MHC (seal #1), la APC no le ha suministrado la seal coestimultoria (seal #2), con lo que el TH produce poca IL-2. .

Poblaciones de LT madurasLinfocitos T , : Un 90-95% de los LT perifricas son de tipo , (o sea, TCR-2), existiendo una proporcin de CD4+ doble que las CD8+. En general, las CD4+ funcionan como clulas T coadyuvantes (TH) y las CD8+ lo hacen como T citotxicas (TC), aunque parece que ambas poblaciones expresan el mismo repertorio de segmentos variables (Va y Vb ).La poblacin circulante (perifrica) de clulas T consiste en T vrgenes, T efectoras y T memoria.

Regulacin de la diferenciacin de LT por factores de transcripcin en respuesta al TCR, molculas coestimuladoras y citoquinas.Factores de transcripcin en linfocitos T naveClula presentadora (APC)Citoquinas producidas por linfocitos TSubpoblacinIL-12IL-18TGF-b1IL-6NFATcAP-1T-betGATA3Foxp3RORgIL-2IFNgIL-4IL-10IL-17TGF-b1IL-10Th1Th2TregTh17

Regulacin de la diferenciacin de LT por factores de transcripcin en respuesta al TCR, molculas coestimuladoras y citoquinas.Mark S Sundrud and Anjana Rao. Curr Opin Immunol, 2007

Akdis M., Curr Opin Immunol, 2007

Activacin de factores de transcripcin por seales producidas por el TCR en la sinapsis inmunolgica

El contacto linfocito-clula presentadora activa seales intracelulares (IP3-quinasa y entrada de Ca++, entre otras) www.nature.com/.../fig_tab/nature02762_F4.html

Combinaciones de factores de transcripcin dirigen la diferenciacin de los LT a clulas efectoras, reguladoras y anrgicas

Los factores NFATc son fundamentales en la activacin de la clula T por el TCR y regulan la diferenciacin hacia distintas subpoblacionesC. Garrison Fathman & Neil B. Lineberry

Nature Reviews Immunology 7, 599-609 (2007)

Los factores NFATc son fundamentales en la activacin del LT por el TCR y regulan la diferenciacin hacia distintas subpoblacionesNature Immunology - 7, 906 - 908 (2006)Lena Ho & Gerald Crabtree

Los factores NFATc pueden actuar sobre diferentes regiones reguladoras de diversos genes en funcin de su asociacin con otros factoresNFAT(RHR-N)NFAT(RHR-C)FosJunHeterodmero NFATc-AP-1 (Fos/Jun)(clulas Th1 y Th2)Wu Y et al., Cell, 2006

Los factores NFATc pueden actuar sobre diferentes regiones reguladoras de diversos genes en funcin de su asociacin con otros factoresNFAT(RHR-C)NFAT(RHR-N)Homodmero NFATc(posiblemente clulas anrgicas) Wu Y et al., Cell, 2006

Los factores NFATc pueden actuar sobre diferentes regiones reguladoras de diversos genes en funcin de su asociacin con otros factoresHeterodmero NFATc-Foxp2 (clulas Treg, posiblemente tambin Th17)Wu Y et al., Cell, 2006

Alteracin de la diferenciacin de los LT mediante la manipulacin de factores de transcripcin.

La manipulacin de la interaccin entre las clulas presentadoras (APC) y los linfocitos T para alterar sus respuestas a antgenos (cmo son presentados distintos antgenos y cmo responden a ellos las clulas T) puede servir para modificar el desarrollo de respuestas patolgicas del sistema inmunitarioRalph M. Steinman & Jacques Banchereau, Nature Reviews Immunol, 2007