MEDInPROT Konferencia

2017. 04. 22.

Budapest

Magas mortalitású tumoros betegségek

célzott kezelésére alkalmas biokonjugátumok

és moduljaik fejlesztése

NVKP_16-1-2016-0036

Mező Gábor

MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport

„A” alprogram (Kiemelkedő halálozási kockázattal járó betegségek gyógyításának

eredményességét lényegesen javító nemzeti program)

„B” alprogram (Anyagtudományi, technológia nemzeti program)

„C” alprogram (Víz-egészség-élelmiszer nemzeti program)

PÁLYÁZATI FELHÍVÁS

NEMZETI VERSENYKÉPESSÉGI ÉS KIVÁLÓSÁGI PROGRAM

KÓDSZÁM: NVKP_16

Miért foglalkozunk a daganatos megbetegedésekkel?

Évente kb. 33000 ember hal meg rákos megbetegedésben Magyarországon;

A daganatos betegségekben meghaltak 40 százaléka 65 év alatti;

A 65 év alattiak esetében a vezető halálok;

Az elmúlt harminc évben közel 30 százalékkal nőtt, miközben az Unió országaiban

folyamatosan csökkent;

A tíz leggyakoribb daganatos megbetegedés és

leggyakoribb halált okozó rák típus

A rák terápiás kezelései

Sebészeti beavatkozás:

Jól hozzáférhető, jól körülhatárolt tumorokra

Nem alkalmas:

hematológiai tumorokra (leukémia)

metasztázisok kezelésére

Sugárkezelés (radioterápia):

szilárd tumorok

leukémia esetén is

Kemoterápia

cisplatin

doxorubicin

5-fluoruracil

vinblasztin

metotrexáttaxol

kamptotecin

Kemoterápiás szerek:

a gyorsan osztódó sejtekre hatnak (tumorsejtek)

de hatnak a normális körülmények között gyorsan osztódó sejtekre is

és károsítják azokat

pl. csontvelő (vérképző szerv) sejtjei,

emésztőszervek

hajhagymákat tartalmazó tüsző

A kemoterápia legáltalánosabb mellékhatásai:

- mieloszuppresszió (vérsejtek képződésének csökkenése)

- immunszuppresszió (érzékenység fertőző betegségekre)

- mukozitisz (bél és emésztő rendszer gyulladása, hányás)

- alopecia (foltos hajhullás)

A kemoterápia mellékhatásai

Egyedi toxikus hatások: kardiotoxicitás, veseelégtelenség, ödémásodás,

májfunkció zavarai, terratogén (magzat károsító) hatás

A terápia fokozott szelektivitásának lehetősége

az egészséges sejtek és a tumorsejtek különbségén alapul

Néhány különbség az egészséges és tumorsejtek, szövetek között:

Sejtfelszíni (pl. tumorspecifikus vagy túltermelődött receptor)

Sejtbeni (pl. enzimek, egyéb fehérjék eltérő mennyiségben, minőségben)

Lokalizálható „szilárd” tumorok (pl. újonnan kialakult vérerek)

(MMP9)

mátrix metallopeptidáz 9katepszin B

egészséges sejt tumorsejt

Gélelektroforézis – Western Blot fehérje analízis

HT-29 vastagbél tumorsejteken a GnRH-III kezelés

nem befolyásolja szignifikánsan az EGFR szintet.

Műszerpályázat

Monoklonális antitestek terápiás alkalmazása

bevacizumab (Avastin®)

- monoklonális VEGF antitest

- angiogenezis gátlása

Új erek képződésének feltétele:

VEGF (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor) kötődése receptorához (VEGF-R)

Új erek képződésének gátlása:

VEGF mennyiségének csökkentése

a receptorhoz kötődés megakadályozása

Regisztrált molekulárisan irányított szerek

Név Típus Támadás-

pont

Indikáció

Alemtuzumab

(Mabcampath)

Daclizumab

(Zenapax)

Basiliximab

(Simulect)

Rituximab

(Rituxan/Mabthera)

Trastuzumab

(Herceptin)

Gemtuzumab

Ibritumomab (Y90)

Edrecolomab

Gefitinib

Imatinib

Monoclonal antibody,

humanized

Monoclonal IgG1, chimeric

Monoclonal IgG1, chimeric

Monoclonal IgG1, chimeric

Monoclonal IgG1, humanized

Monoclonal IgG4, humanized

Calicheamicinnel konjugált

Monoclonal IgG1, murine

Monoclonal IgG2, murine

EGFR-TKI

KIT-TKI

CD52

IL-2 R

IL-2 R

CD20

HER2/neu

CD33

CD20

EpCAM

EGFR TK

TK

CLL, CML

rák, leukemia

rák, lymphoma

emlő-, prosztatarák,

NSCLC

rák, leukemia

rák, lymphoma

CRC

NSCLC

GIST, CML

Gonadotropin Releasing Hormon - GnRH

Human GnRH-I (LH-RH): Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Andrew Victor Schally Roger Guillemin

"for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain"

1977-ben megosztott orvosi Nobel Díj

165000 disznó hipotalamuszából kivonva és tisztítva: 800 mg

Peptide hormon, hipotalamuszban termelődik és pulzálva kiválasztódik

A reprodukciót kontrollálja, a hipofízisben lévő gonadotróp sejtek stimulálása útján

A gonadotropin hormonok termelődésének és kiválasztásának stimulálása

- luteinizáló hormon (LH) (sárgatest hormon)

heterodimer glikoprotein (92 + 121 aminosav)

- follikulusz stimuláló hormon (FSH)

heterodimer glikoprotein (92 + 118 aminosav)

A Gonadotropin Releasing Hormon szerepe

Férfiaknál tesztoszteron

Szex-szteroidok

tesztoszteron ösztrogén

Hormonfüggő tumorok kialakulásában fontos szerepük van

Agonista és antagonista peptidek alkalmazása a tumorterápiában

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Agonista: [D-Lys6]-GnRH-I

Antagonista: Cetrorelix

Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

X

Nal: 2-naftilalanin

Cpa: p-klór-fenilalanin

Pal: 2-piridilalanin

Cit: citrulin

nem természetes aminosavak

GnRH antagonista

4 8 12 24 óra

szé

rum

ho

rmo

n s

zin

t

B

2010 nap

GnRH agonista

szé

rum

ho

rmo

n s

zin

t

A

GnRH antagonista

4 8 12 24 óra

szé

rum

ho

rmo

n s

zin

t

B

2010 nap

GnRH agonista

szé

rum

ho

rmo

n s

zin

t

A

2010 nap

GnRH agonista

szé

rum

ho

rmo

n s

zin

t

A

A szérum hormon szint

csökkentése a kasztrációs

szint alá (kémiai kasztráció)

> 50% emlődaganat

~ 100% melanoma

> 70% petefészekrák

> 90% prosztatarák

> 75% méhtestrák

> 80% vesedaganat

> 40% agytumor

> 90% non-Hodgkin limfóma

tartalmaz GnRH receptorokat.

GnRH receptorok megtalálhatók egészséges szövetekben is, különösen a szaporító szervekben,

de sokkal kisebb mértékben, mint a tumorsejteken.

Tumorspecifikus célbajuttatás GnRH (LHRH) receptoron keresztül

GnRH receptorok tumorsejteken:

GPCR

GnRH receptorok a tumorsejteken

Számos tumorsejten nagy mennyiségben

Egészséges sejteken nem vagy csak kis

mennyiségben fordul elő

GnRH-R

GnRH-I GnRH-II

Gai

PTP

JNK

c-Jun

p38

AP-1

Sejt osztódás

RPTK

P GRB2 SOS

RAS

RAF

MAPKK P

MAPK P

TCF Pc-fos

PI3K

AKTEGFR

P

A GnRH peptidek hatása

a tumorsejteken egy

bonyolult folyamat

hatás helye

szabad hatóanyag

irányító molekula

összekötő

konjugált hatóanyag

lizoszóma

endoszóma

vezikula

receptor

irányító molekula

összekötőreceptor-közvetített

endocitózis

szabad

hatóanyag

hatás helye

konjugált hatóanyag

tumorsejt egészséges sejt

Célzott tumorterápia:

szelektív hatóanyag célba juttatás irányító molekulákkal

Mező G, Manea M. Expert Opinion on Drug Delivery 7, 79-96 (2010)

Adcetris (Seattle Genetics, Bothell, WA)

brentuximab vedotin

antimitotikus hatású

(tengeri kagylóból izolálták)

Antibody Drug Conjugates (ADCs)

Trastuzumab

(HER2 receptor

ellenanyag)

Mertansine (emtansine, tubulin inhibítor)

4-(maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate

Kadcyla (Genentech, South San Francisco, CA)

DM1

DM1/Mab ~ 3,5

Antibody Drug Conjugates (ADCs)

Doxorubicin-[D-Lys6]-GnRH-I (AEZS-108, AN-152)

[D-Lys6]-GnRH-I egy GnRH-I agonist analog

Észter-kötéssel kapcsolják a Doxorubicinhez

Klinikai Fázis II-ben vizsgálják, emlő, petefészek és méh daganatokra

Észter-kötés gyors lebomlása humán szérumban (t1/2 ~ 2 óra)

karboxil-észterázok hatására

Doxorubicin

[D-Lys6]-GnRH-I

Zoptarelin doxorubicin (AEterna Zentaris Inc.)

GnRH-III a nagy tengeri ingolából izolált GnRH analog

A GnRH receptor(ok)hoz kötődik a tumor sejteken

500 – 1000-szor kisebb az endokrin hatása emlősökön, mint a humán GnRH-I

Tumorellenes hatását kimutatták emlő, prosztata, méh, hasnyálmirigy, vastagbél

daganat sejeteken

GnRH-III: Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

GnRH-I: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

GnRH-III: Hatásos szállító molekula lehet az irányított

tumorterápiában

Daunorubicin (Daunomicin)

O

CH3O O OH

OHO

O

O

CH3

OH

NH2

OH

CH3

kemoszelektív ligáció:

oxim-, hidrazon-kötés

amid-kötés

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

eNH2

GnRH-III:

a Lys8 e-aminocsoportja felhasználható konjugálásra

a Lys8 bázikus oldalláncának módosítása nem eredményezi a receptor kötődés és az

antiproliferatív hatás elvesztését, de tovább csökken a hormon hatása

Toxikus mellékhatások:

- emésztőrendszer, vese, máj, bőr toxicitás, stb.

- immunszupresszió, mieloszupresszió

- kardiotoxicitás

antraciklin antibiotikum, a rák gyógyításában

alkalmazott szer (e.g., leukémia, neuroblastoma)

DNA interkaláció; topoizomeráz II inhibitor

Daunorubicin-GnRH-III konjugátumok tervezése

Kovács M., et al. Peptides 28, 821-829 (2007) Mező, G., Manea M.: Prot. Pept. Lett. 24, 479-488 (2013)

O

CH3O O OH

OH

O

O

CH3

OH

NH2

OH

N-O-CH2-CO-Gly-Phe-Leu-Gly-

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

O

CH3O O OH

OH

O

O

CH3

OH

NH2

OH

N-O-CH2-CO-

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

Az oxim-kötést tartalmazó Dau-GnRH-III konjugátumok

lebomlása Katepszin B enzim hatására

O

CH3O O OH

OH

O

O CH3OH

NH2

OH

N-O-CH2-CO-

H-Lys-OH

O

CH3O O OH

OH

O

O

CH3

OH

NH2

OH

N-O-CH2-CO-Gly-OH

Citosztatikus hatás (IC50 mM)

MCF-7 (humán emlő): 7,8 ± 2,1

HT-29 (humán vastagbél): 17,9 ± 4,0

MCF-7 (humán emlő): 3,9 ± 1,2

HT-29 (humán vastagbél): 22,5 ± 1,7

Szabó, I., et al. Bioconjug. Chem., 20, 656-665 (2009)

Anyag K (x 105) (M-1) n

Dau 11,70 2,5

Dau=Aoa-OH 2,21 3,8

H-Lys(Dau=Aoa)-OH 6,80 3,0

Dau=Aoa-Gly-OH 6,74 3,5

Dau=Aoa-Arg-OH 6,78 3,2

Dau=Aoa-Tyr-OH 4,40 3,5

Dau=Aoa-Leu-OH 3,23 3,6

GnRH-III(Dau=Aoa) 0,83 4,2

Daunorubicin és daunorubicint tartalmazó metabolitok kötődése

csirke eritrocita DNS-hez

Orbán E., et al. Amino Acids 41(2): 469-483 (2011)

Orbán E., et al. Bioconjugate Chemistry 22(10): 2154-2165 (2011)

K: kötődési állandó; n: kizárási paraméter

Dau – COOH közelsége gátolja a kötődést

Bázisos aminosav (esetleg ikerionos szerkezet miatt) segíti a kötődést

Nagy térkitöltésű oldalláncot tartalmazó aminosav gátolja a kötődést

Antraciklinek konjugálása GnRH-III hormon peptidhez

Mező, G., Manea, M. et al. (2008) Curr. Med. Chem. 15, 2366

O

CH3O O OH

OH

O

O

CH3

OH

NH2

OH

<EHWSHDWKPG-NH2

N-O-CH2-CO-GFLG-

oxim-kötés

hasadás

lizoszómális enzimekkel

észter-kötés

O

CH3O O OH

OH O

O

O

CH3

OH

NH2

OH

O-CO-(CH2)3-CO-

<EHWSHDWKPG-NH2

hasadás

észterázokkal

O

CH3O O OH

OH

O

O

CH3

OH

NH2

OH

<EHWSHDWKPG-NH2

N-NH-CO-CH2-CH2-CO-

hidrazon-kötés

savlabilis

lizoszómákban pH < 5

O

CH3O O OH

OH O

O

O

CH3

OH

OH

NH-CO-(CH2)3-CO-Y-

<EHWSHDWKPG-NH2

amid-kötés

Ac-Cys

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

O

O

O

NS Phe-Lys-

O

O

NH

O

HN

HO

O

OH

O

O

O

OMe

OH

(CH2)5

O

O

H2N

O

HN

HO

O

OH

O

O

O

OMe

OHKatepszin B

37°C , pH 5

1,6-elimináció +

CO2

+

Dau

GnRH-III p-aminobenziloxikarbonil (PABC)

Daunorubicin (Dau)

+ H2O

H2NOH

Katepszin B

Ac-Cys

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

O

O

O

NS Phe-Lys-

O

O

NH

O

HN

HO

O

OH

O

O

O

OMe

OH

(CH2)5

O

O

H2N

O

HN

HO

O

OH

O

O

O

OMe

OHKatepszin B

37°C , pH 5

1,6-elimináció +

CO2

+

Dau

GnRH-III p-aminobenziloxikarbonil (PABC)

Daunorubicin (Dau)

+ H2O

H2NOH

Katepszin B

PABC spacert tartalmazó konjugátum lebomlása

Katepszin B enzim hatására

VegyületCitosztázis (MCF-7)

IC50 (µM)

Citosztázis (HT-29)

IC50 (µM)

Daunorubicin 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,2

Dau-GnRH-III (hidrazon) 0,5 ± 0,2 2,4 ± 0,5

Dau-PABC-GnRH-III 0,4 ± 0,0 1,7 ± 0,2

Dox-GnRH-III (észter) 0,1 ± 0,1 2,4 ± 0,2

Dox-[D-6Lys]-GnRH-I (észter) 0,2 ± 0,1 1,9 ± 0,3

Dau-GnRH-III (amid) > 100 > 100

A szabad Dau és hatóanyag - GnRH-III konjugátumok in vitro

citosztatikus hatása MCF-7 and HT-29 tumorsejtvonalakon

Az in vitro citosztatikus hatást (IC50 értékek) MTT teszttel mértük.

MTT = 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid

Mező, G. et al. (2008) Curr. Med. Chem., 15(23):2366-2379;

Szabó, I et al. (2009) Bioconjug. Chem., 20(4):656-665;

Orbán, E. et al. (2010), Amino Acids, 41(2), 469-483;

Schlage, P. et al. (2011) J. Control. Release 156(2), 170–178.

Daunorubicin-GnRH-III biokonjugátumok

rövidszénláncú zsírsavakkal

Hegedüs, R. et al. (2012) Eur. J. Med. Chem. 56(10):155-165Manea, M. et al. (2011) Bioconjug. Chem. 22(7):1320-1329

acetil

propionil

izo-butiril

butiril

krotonil

izo-valeril

hexanoil

mirisztoil

Glp-His-Trp-Lys(X)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2

Dau-GnRH-III konjugátumok antitumor hatása

orthotopikus HT-29 vastagbél modellen

Daunorubicin: heti egy alkalommal (7x1 mg/ttkg)

Konjugátumok: heti két alkalommal (5x15 mg Dau-tartalom/ttkg, 8x 7,5 mg/ttkg)

Kontroll Dau Lys-Ac Lys-nBu0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

P=0,0350

60,6 %

92,9 %

70,3 %

100 %

Pri

mer

tum

or

töm

eg

(g

)

Tumorok tömege a terminálás napján (50. nap) Máj tömegek a terminálás napján (50. nap)

Kontroll Dau Lys-Ac Lys-nBu0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

105,0 %102,2 %100 %

89,1 %Máj tö

meg

ek (

g)

Proliferációs index: konjugátumok (15%-kal csökken), Dau (nincs változás)

Vaszkularizáció: konjugátumok (30-40%-kal csökken), Dau (12%-kal nő)

Metasztázis gátlás: nincs

Hogyan növelhető a hatóanyag – peptid konjugátumok hatása?

Korlátok:

A receptorok száma a tumorsejteken limitált.

Ezért a biokonjugátumok mennyiségének növelése önmagában nem megoldás.

Lehetséges megoldások:

Azonos vagy különböző hatóanyagok kapcsolása egy irányító molekulához.

Több különböző receptoron keresztül történő sejtbe juttatás két vagy több

hatóanyag – irányító molekula konstrukcióval.

receptor 1

receptor 2

irányító molekula 1

irányító molekula 2

hatóanyag molekula 1

hatóanyag molekula 2

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

Lys

aNH

O O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

N

OH

O

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

Lys

aNH

O O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

N

OH

O

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

N

OH

O

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

O

Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

eNH eNH

O

N

OH

O

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

eNH eNH

O

N

OH

O

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

N

OH

O

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

O

OCH3O

OH

OH OO

NH2

HO

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

Biokonjugátum tervezés

biokonjugátumok két azonos tumorellenes hatóanyaggal

AnyagokMCF-7

IC50 [µM]

HT-29

IC50 [µM]

LNCaP

IC50 [µM]

Daunorubicin 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,2 0,1 ± 0,1

GnRH-III[4,8Lys(Dau=Aoa)] 2,9 ± 0,9 6,8 ± 1,0 4,9 ± 0,3

GnRH-III[8Lys(Dau=Aoa-Lys(Dau=Aoa))] 3,0 ± 0,4 5,6 ± 2,0 3,8 ± 1,6

GnRH-III[8Lys(Dau=Aoa)] 6,7 ± 1,9 29,9 ± 0,6 15,2 ± 2,4

Leurs, U. et al. (2012) Biopolymers Pept. Sci. 98:1–10

O

OH

O

N

N

N

N

N

NH

NH2H2N

O

eNH

Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

OH

O

N

N

N

N

N

NH

NH2H2N

O

eNHO

OH

O

N

N

N

N

N

NH

NH2H2N

O

eNH

Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

Lys

O

OH

O

N

N

N

N

N

NH

NH2H2N

O

aNH

O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

Lys

O

OH

O

N

N

N

N

N

NH

NH2H2N

O

aNHO

OH

O

N

N

N

N

N

NH

NH2H2N

O

aNH

O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

eNH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

N

HO

O

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

O

O OCH3

OH

OHOO

NH2

OH

AnyagokMCF-7

IC50 [µM]

LNCaP

IC50 [µM]

HT-29

IC50 [µM]

Daunorubicin 0,4 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,2

Methotrexate n,d, 0,3 ± 0,2 1,4 ± 0,6

GnRH-III[4Lys(MTX),8Lys(Ac)] > 50 > 50 > 50

GnRH-III[4Lys(MTX),8Lys(Dau=Aoa)] 5,8 ± 1,1 28,8 ± 4,7 3,6 ± 1,5

GnRH-III[8Lys(MTX-Lys(Dau=Aoa)] 5,4 ± 0,7 11,3 ± 0,5 5,6 ± 3,0

GnRH-III[8Lys(Dau=Aoa)] 6,7 ± 1,9 15,2 ± 2,4 29,9 ± 0,6

Leurs, U. et al. (2012) Eur. J. Med. Chem. 52:173-183

Biokonjugátum tervezés

biokonjugátumok két különböző tumorellenes hatóanyaggal

Horizon 2020 - MAGICBULLET

MSCA-ITN-2014-ETN:

Marie Skłodowska-Curie

Innovative Training Networks (ITN-ETN)https://www.uni-bielefeld.de/chemie/oc3sewald/magicbullet/

ELTE, Országos Onkológiai Intézet

Univeristy of Helsinki

Bielefeld

Cologne

Milan

Como

Bayer, Heidelberg Pharma, Exiris,

Italpharmaco,

KontrollN=11

DauN=5

K2N=5

P19-HN=5

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

45,0%

9,0%

100%

73,6%

P = 0,0127

Átlag ± SD, Mann-Whitney teszt

P = 0,0005Pri

me

r tu

mo

r tö

me

ge

(g

)

KontrollN=11

DauN=5

K2N=7

P19-HN=5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

104,8%

51,7%

115,7%100%

Átlag ± SD, Mann-Whitney teszt

P = 0,0005

Má

j tö

meg

ek (

g)

Terminálás a tumor transzplantációt követő 34. napon

A Dau csoportot előbb - a 30. napon - kellett terminálni

K2: Glp-His-Trp-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2

P19-H: Glp-D-Tic-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2

1,2,3,4-tetrahidroizokinolin-3-karbonsav (Tic)

Új hatékonyabb GnRH-III – daunomicin konjugátum

a-anamitinkriptoficin

paclitaxel auristatin

GnRH, szomatosztatin

RGD- , NGR- peptidek

Potenciális konjugátumok a MAGICBULLET projekt keretében

Konzorcium az NVKP_16-1-2016-0036 pályázat megvalósítására

Kőhidai László

Semmelweis Egyetem

Csámpai Antal

ELTE Kémiai Intézet

Mező Gábor

MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport

Bertók Béla

ComInnex Zrt

1 019 321 884 Ft

támogatás

A projekt célja

Kiemelkedő halálozási kockázattal járó betegségek gyógyításának

eredményességét lényegesen javító nemzeti program

Hazánk versenyképességének szempontjából stratégiai jelentőségű kutatás-

fejlesztési és innovációs tevékenységeket, illetve az azok keretében jelentős

szellemi hozzáadott értéket tartalmazó piacképes termékek, szolgáltatások,

technológiák létrehozását támogatja

Célzott tumorterápia

hatóanyagirányító

molekula

kapcsoló elem

linker

funkcio-

nalizált

hatóanyag

funkcio-

nalizált

irányító

molekula

bifunkciós

linker

funkcio-

nalizált

hatóanyag

funkcio-

nalizált

irányító

molekula

bifunkciós

linker

funkcio-

nalizált

hatóanyag

funkcio-

nalizált

irányító

molekula

bifunkciós

linker

Vegyülettárak, amelyek számos, nagy variációs lehetőséget tartalmazó modult

tartalmaznak és alkalmasak személyre szabott, illetve kombinációs célzott

tumorterápiára

Eluálás

E. coli-ban való

kifejeztetés

Ismétlés

2-3-szor

Szekvencia

2-3 szelekciós lépés után

Vastagbél

tumorsejt

Fág könyvtár

Mosás

Kötődés

Nem

kötődött

fágok

Kötődött

fágok

Vastagbél tumorsejthez (HT-29) kötődő peptidek kiválasztása

fág-bemutatás technikával

VHLGYAT

kiválasztott peptid

Dau=Aoa-VHLGYAT-NH2

Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2

Dau=Aoa-GFLG-VHLGYAT-NH2

Dau: daunomicin

Aoa: aminooxiacetil

GFLG, LRRY:

Katepszin B enzim

által hasítható szekvenciák

1011 fág klón felhasználásával, 50 kiválasztott, amelyek

kevés és csak dipeptid szakasz homológiát mutattak

Zhang Y., et al. (2007) J. Biomol. Screen. 12, 429-435

Dau=Aoa-LRRY- -NH2

V

A

V

V

V

V

V

H

H

A

H

H

H

H

L

L

L

A

L

L

L

G

G

G

G

A

G

G

Y

Y

Y

Y

Y

A

Y

A

A

A

A

A

A

A

T

T

T

T

T

T

A

Kód KonjugátumCitosztázis (IC50 (mM))

(24 órás kezelés

+ 48 óra)

KK06/2 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2 50,5 ± 5,5

KK11 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAA-NH2 60,9 ± 3,1

KK12 Dau=Aoa-LRRY-VHLGAAT-NH2 > 100

KK13 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2 14,0 ± 1,5

KK14 Dau=Aoa-LRRY-VHAGYAT-NH2 > 100

KK15 Dau=Aoa-LRRY-VALGYAT-NH2 26,8 ± 0,4

KK16 Dau=Aoa-LRRY-AHLGYAT-NH2 > 100

Hatékonyabb konjugátum kiválasztása Ala-szken segítségével

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16

flu

ore

szcen

cia

in

t.

HT-29 20 mM

100 mM

Konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása

áramlási citométerrel (3 órás kezelés)

0

20

40

60

80

100

KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16

Dau

+ s

ejt

ek [

%]

HT-29 20 mM

100 mM

KK13 15 perc

KK13 30 perc

c=20 mM

KK06/2 15 perc

KK06/2 30 perc

c=20 mM

Konjugátumok sejtfelvételének vizsgálata fluoreszcens mikroszkóppal

c=20 mMc=20 mM

Dau=Aoa-LRRY- -NH2

V

V

V

V

V

V

V

H

H

H

H

H

H

L

L

L

L

L

L

A

S

P

F

K

E

Y

Y

Y

Y

Y

Y

A

A

A

A

A

A

A

T

T

T

T

T

T

H

L

Y

T

L

További módosítások a 4. pozícióban a hatás fokozása érdekében

In vitro citosztázis

Konjugátum

Citosztázis*

24 óra

(IC50 SD; mM)

Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2 39,4 5,9

Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2 27,9 6,4

Dau=Aoa-LRRY-VHLKYAT-NH2 50,3 3,0

Dau=Aoa-LRRY-VHLEYAT-NH2 29,5 6,2

Dau=Aoa-LRRY-VHLLYAT-NH2 7,5 3,5

Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH2 6,6 2,9

Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH2 24,8 7,4

Dau=Aoa-LRRY-VHLTYAT-NH2 21,7 6,5

Dau=Aoa-LRRY-VHLNYAT-NH2 28,0 19,4

Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH2 >50

F L T S A N E G K P

In vitro sejtbejutási vizsgálatok

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

6,25 12,5 25 50 100

Flu

ore

szce

ncia

in

t.

c / mM

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

6,25 12,5 25 50 100

Da

u+

se

jte

k [

%]

c / mM

Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2

Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH2

Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH2

Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH2

ClAc-GFLG-PABC-ONp

ciklo[RGDfC]

daunomicin

ciklo[RGDfC(CH2CO-GFLG-PABC-Dau)]

„Egy üst” reakcióban kialakított konjugátum

DMF - 0,1 M Tris puffer

8:2 (V/V)

pH 8, szobahő, 5 óra

Támogatók

NVKP_16-1-2016-0036

Szinergia program

Műszer pályázat

MSCA-ITN-2014-ETN:

Marie Skłodowska-Curie

Innovative Training Networks (ITN-ETN)

NK 77485

K 104045

K 119552

Köszönöm a figyelmet!