MAKALAH

KIMIA MEDISINAL

“Spektrofluorometri & Spektrofotometri”

KELOMPOK

ANGGOTA

DOSEN

:

:

:

VI

1. Rizky Sintya (08121006057)

2. Titis Utami Wahyu N (08121006059)

3. M. Nuryadin (08121006061)

4. Bunga Monica Sari (08121006963)

5. Hasti Rizky Wahyuni (08121006069)

AKRIMAH, M.Si.

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SRIWIJAYA

2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Teknik analisis spektrofluorometri adalah termasuk salah satu tenik analisis

instrumental disamping teknik kromatografi dan elektroanalisis kimia. Teknik

tersebut memanfaatkan fenomena interaksi materi dengan gelombang

elektromagnetik seperti sinar-x, ultraviolet, cahaya tampak dan inframerah.

Fenomena interaksi bersifat spesifik baik absorpsi maupun emisi. Interaksi tersebut

menghasilkan signal-signal yang disadap sebagai alat analisis kualitatif dan

kuantitatif. Contoh teknik spektroflourometri absorpsi adalah UV/VIS, inframerah

(FT-IR) dan absorpsi atom (AAS). Sedang contoh spektrofluorometri emisi

adalah spektrofluorometri nyala dan inductively coupled plasma (ICP), yang

merupakan alat ampuh dalam analisis logam.

Tujuan mempelajari Analisisi spektrofluorometri yaitu mempunyai pengetahuan

dasar dan keterampilan dalam menggunakan berbagai peralatan spektrofluorometri,

Mengetahui kelebihan dan keterbatasan serta cara memperoleh data yang handal dari

berbagai cara teknik spektrofluorometri. Memahami tentang ketertelusuran metoda

analisis yang digunakan dan Mengetahui cara memvalidasi/verifikasi

metoda spektrofluorometri.

Spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisis konsentrasi suatu zat di

dalam larutan berdasarkan absorbansi terhadap warna dari larutan pada panjang

gelombang tertentu. Metode spektrofotometri memerlukan larutan standar yang telah

diketahui konsentrasinya. Larutan standarnya terdiri dari  beberapa tingkat

konsentrasi mulai yang rendah sampai konsentrasi tinggi (Khopkar,2003).

Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi

radiasi elektromagnet. Cahaya terdiri dari radiasi terhadap mana mata manusia peka,

gelombang dengan panjang berlainan akan menimbulkan cahaya yang berlainan

sedangkan campuran cahaya dengan panjang-panjang ini akan menyusun cahaya

putih. Cahaya putih meliputi seluruh  spektrum  nampak 400-760

mm. Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari tingkat

energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi (Ali,2005).

BAB IIISI

2.1 Teknik Spektofluorometri

2.1.1 Pengertian Metode Spektrofluorometri

Metode spektrofluorometri adalah suatu metode pengukuran berdasarkan

sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala dari suatu molekul setelah

radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan panjang gelombang yang

lebih panjang. Fluroresensi akan nampak jelas apabila penyerapan sinar pada

daerah ultraviolet dan melepaskannya dalam daerah gelombang

nampak. Kebanyakan bahan organik ada dalam keadaan dasar (S0 V0), pada

suhu kamar. Penyerapan energy sinar (photon) meningkatkan electron dalam

molekul organik ke tingkat yang lebih tinggi (S1 V1 dan seterusnya)

dalamwaktu kurang dari 10-15 detik.

Setelah penyerapan, tenaga berkurang karena benturan (sebagai panas)

menyebabkan tenaga pada molekul yang terangsang turun lagi dengan cepat

pada getaran terendah dalam keadaan masih terstimulus (S1 V0). Tenaga yang

dilepaskan dari molekul yang kembali ke tingkat dasar dalam waktu cepat,

kurang dari 10-8 detik akan meningkat intensitas fluoresensi, sebagai petunjuk

adanya pergeseran stokes. Meskipun banyak senyawa organik menyerap pada

daerah gelombang ultra violet dan nampak, hanya beberapa saja yang

berfluoresensi. 

Apabila struktur molekul bahan organik dapat dipakai untuk memperkirakan

spectrum serapannya, hal yang sama tidak dipakai untuk memperkirakan

senyawa apa yang berfluorosensi. Tetapi ada sedikit petunjuk bahwa senyawa

alifatis cenderung memecah sinar dan tidak berfluoresensi, senyawa aromatis

yang berisi electron tertentu yang tidak ditempat normalnya akan berfluoresensi.

Radiasi yang dilepaskan dapat berkisar pada beberapa panjang gelombang, maka

spectrum fluoresensi berupa kumpulan atau pita spectrum. Spektrum fluoresensi

biasanya tidak tergantung panjang gelombang radiasi yang terserap. Spectrum

fluoresensi hanya dapat memberikan informasi pada saat kurang dari 10 -8 detik.

Intensitas dapat berkurang antara 10 – 15 % apabila suhu sampel menurun dari

30oC menjadi 20oC, maka diperlukan pengatur suhu agar pengukuran dapat lebih

tepat. 

2.1.2 Peralatan Pokok dalam Metode Spektrofluorometri

Pengukuran intensitas fluoresensi

dapat dilakukan dengan suatu

fluorometer filter sederhana.

Instrument yang dipergunakan

bermacam-macam mulai dari yang

paling sederhana (filter fluorometer)

sampai ke yang sangat kompleks

yaitu spektrofotometer.

Peralatan pokok dalam metode ini adalah :

- Sumber spectrum yang kontinyu misalnya dari jenis lampu merkuri atau

xenon.

- Monokromator (M1) untuk menyinari sampel dengan panjang gelombang

tertentu. 

- Monokromator kedua (M2) yang pada iradiasi konstan dapat dipakai

menentukan panjang gelombang spectrum fluoresensi sampel. 

- Detector berupa fotosel yang sangat peka misalnya fotomultiplier merah

untuk panjang gelombang lebih besar dari pada 500 nm. 

- Amplifier untuk mengandakan radiasi dan meneruskan ke pembacaan. 

Penggunaan mikrosel dapat dikurangi efek prafilter dan pascafilter pada

larutan yang pekat. Absorpsi prafilter mengurangi radiasi yang sampai pada

sampel yang terjauh dari sumber sinar dan pasca filter terjadi karena

pengurangan radiasi fluoresensi yang lepas dari kuvet. Selain penyinaran dengan

arah 90oC dapat dilakukan front-face illumination dengan arah 45o sehingga efek

filtrasi dapat dicegah, namun biasanya kurang peka dibanding penyinaran 90o.

2.1.3 Kegunaan Metode Spektrofluorometri

Spektroflurometri dapat digunakan untuk:

1. Analisa kualitatif yakni perbandingan spectrum fluoresensi dalam membantu

pengenalan senyawa.

2. Analisa kuantitatif yakni pengukuran dapat dilakukan pada kadar yang

sangat rendah dengan ketepatan, keterulangan, dan kepekaan tinggi.

Misalnya pengukuran kadar vitamin E. Bila panjang gelombang emisi dan

eksitasi telah dipilih, maka dapat dibuat hubungan antara intensitas

fluoresensi dengan konsentrasi senyawa. Intensitas fluoresensi tergantung

dari tingkat konsentrasi senyawa. Hubungan tersebut berupa garis lurus

(linier) pada konsentrasi sangat rendah. Apabila kadarnya terlalu tinggi,

larutan tersebut tidak linier lagi karena akan menyerap sebagian sinar

eksitasi. 

3. Uji enzim dan analisa kinetika, Enzim hidrolase dapat dengan mudah diukur

melalui kecepatan munculnya senyawa yang berflurosensi pada 450 nm. 

Reaksi NAD+ dan NADP+ , Enzim dapat dilihat dalam keadaan aslinya

(invitro), misalnya kadar substrat enzim atau kofaktor yang sangat rendah. 

4. Uji struktur protein. Beberapa jenis protein mengandung khromofore yang

berfluoresensi (misalnya tirosin dan FAD), maka protein juga

berfluoresensi. 

5. Penunjuk fluoresensi dan uji struktur membrane, Sifat fluoresensi molekul

berubah oleh gerak maupun arah gerak (polaritas) lingkungannya, maka

deteksi senyawa fluoresensi dapat memberikan petunjuk lingkungannya. 

6. Mikrosspektrofluorimetri. Gabungan antara spektrofluorimetri dengan

mikroskop dapat dipakai untuk menunjukkan tempat senyawa berfluoresensi

pada sel yang mengikat cat fluoresensi. 

2.1.4 Kelebihan

Dapat untuk mengukur konsentrasi sampel yang rendah (pikogram).

Kepekaan fluorimetri dapat diatur dengan penguatan aliran listrik yang terbentuk

dari jalinan fotosel. Spektroflurorimetri sangat mungkin menggunakan spectrum

pilihan yang lebih luas karena geseran Stokes dan adanya dua monokhromator

yang dapat dipakai, atau untuk spectrum yang mengenai sampel dan yang lain

untuk spectrum fluroresensi yang timbul. Untuk fluorimetri tidak diperlukan

kuvet pembanding (referensi) tapi kurva kalibrasi tetap harus dibuat.

Teknik flurometri dapat diperluas untuk mendeteksi adanya perubahan

kimiawi (chemical modification) seperti oksidasi, reduksi, hidrolisa,

polimerisasi dan pembekuan. Misalnya morfin dapat diukur dengan

mengoksidasinya menjadi pseudomorfin yang berfluoresensi.

2.1.5 Kelemahan

Kelemahan yaitu ketergantungan pada keadaan lingkungan dan tidak ada

pegangan senyawa apa yang akan berfluoresensi. Masalah lain dalam fluorimetri

adalah penghapusan (quenching) yaitu energi yang seharusnya dilepas sebagai

sinar fluoresensi terserap oleh molekul lain. Atau sebaliknya bahan-bahan diluar

sampel seperti bahan pencuci (detergent), minyak pelumas, kertas saring atau

kertas lap dapat mempengaruhi pengukuran fluorimeter karena dapat melepas

sinar fluoresensi sendiri.

2.1.6 Contoh Kasus

“Analisis kuantitatif sediaan obat multikomponen dengan spektrofluorometri”

Perlaatan :

Dengan suatu pereaksi tertentu, senyawa yang tidak berfluoresensi dapat

diubah menjadi senyawa yang berfluoresensi. Metode ini penting baik untuk

senyawa organic maupun anorganik, dan banyak senyawa anorganik membentuk

kompleks yang mudah berfluoresensi dengan pereaksi organic.

Misalnya : Vitamin B1 dalam sediaan Farmasi atau makanan dapat ditetapkan

secara spektrofluorimetri setelah dioksidasi menjadi tiokrom yang mudah

berfluoresensi.

Tahapan Analisis dalam metode spektrofluorometri :

- mula-mula dibuat kurva kalibrasi (grafik hubungan fluoresensi dengan

konsentrasi).

- Tahap selanjutnya adalah mengukur intensitas fluoresensi dari zat yang

diperiksa, lalu membaca konsentrasi dari kurva kalibrasi tersebut. Selama

pengukuran, kondisi percobaan harus dijaga supaya tetap konstan. Pengotoran

dapat menurunkan efisiensi dari fluoresensi sehingga mengurangi sensifitas

(quenching).

- Analisa campuran dilakukan dengan memilih radiasi eksitasi pada panjang

gelombang yang berbeda dimana masing-masing komponen campuran

tersebut. Bila tidak mungkin, pengukuran dilakukan pada panjang gelombang

yang berbeda dimana masing-masing komponen campuran tersebut

berfluoresensi.

Kasus:

Spektrofluorometri untuk mengukur kadar Kinin Sulfat

Persiapan dan langkah kerja:

- Disiapkan larutan standard kinin yaitu 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3 ppm dengan

pengenceran dari larutan stok dengan 0,1 N H2SO4

- Larutan kinin sulfat 1 µg/ml dimasukkan ke dalam kuvet, kemudian

ditempatkan ke dalam ruang pengukuran pada spektrofluorometer.

- Besar intensitas fluororesensi maksimum untuk monokromator eksitasi dari

literatur dimasukkan pada alat spektrofluorometer.

- Besar intensitas fluororesensi maksimum monokromator emisi dari literatur

dimasukkan pada alat spektrofluorometer.

- Dilakukan pengukuran intensitas fluororesensi (pada monokromator eksitasi)

untuk blanko (asam sulfat 0,1 N).

- Dilakukan pengukuran intensitas fluororesensi (pada monokromator eksitasi)

untuk masing-masing larutan yang diencerkan.

- Dilakukan pengukuran intensitas fluororesensi (pada monokromator eksitasi)

untuk sampel.

a. Data Pengamatan

Panjang gelombang (λ) eksitasi : 350 nm

Panjang gelombang(λ) emisi : 300-400 nm

Panjang Gelombang (λ) max : 450 nm

Alat : Shimadzu Data Recorder DR-3

b. Pengolahan Data

Pengenceran

Larutan awal : 100 ppm

1. Dibuat Larutan Stok : 1 ppm

Perhitungan => V1 . M1 = V2.M2

V1.100 ppm = 100 mL. 1ppm

V1 = 1 mL

2. Larutan standar : 0,1 ppm

V1.M1 = V2.M2

V1.1 ppm = 25 mL. 0,1ppm

V1 = 2,5 mL

3. Larutan standar : 0,15 ppm

V1.M1 = V2.M2

V1.1 ppm = 25 mL. 0,15ppm

V1 = 3,75 mL

4. Larutan standar : 0,2 ppm

V1.M1 = V2.M2

Bahan Intensitas pada λ=450 nm

Blanko 0,4

Sampel 31

0,1 ppm 14

0,15 ppm 19.9

0,2 ppm 26

0,25 ppm 32

0,3 ppm 39

V1.1 ppm = 25 mL. 0,2ppm

V1 = 5 mL

5. Larutan Standar : 0,25 ppm

V1.M1 = V2.M2

V1.1 ppm = 25 mL. 0,25ppm

V1 = 6,25 mL

6. Larutan Standar : 0,3 ppm

V1.M1 = V2.M2

V1.1 ppm = 25 mL. 0,3ppm

V1 = 7,5 mL

c.

Pengolahan Data

Dari grafik didapatkan persamaan regresi:

BahanIntensitas pada λ=450

nm

Intensitas Bahan-Blanko

pada λ=450nm

Blanko 0,4 -

Sampel 31 30,6

0,1 ppm 14 13,6

0,15 ppm 19.9 19,5

0,2 ppm 26 25,6

0,25 ppm 32 31,6

0,3 ppm 39 38,6

y = bx + a

I = m.C + Io

I = 124,2 C + 0,94

Dengan perhitungan kalkulator didapat R2 = 1

Maka dapat diketahui konsentrasi sampel dengan cara substitusi nilai

intensitas sampel dikurangi blanko pada panjang gelombang 450 nm.

I sampel = 30,6

I = 124,2 C + 0,94

I = 124,2 C + 0,94

C = 0,23 ppm

Dengan faktor pengenceran : 20 kali

Maka konsentrasi sebenarnya dari larutan sampel yaitu kinin sulfat adalah sebesar

0,23 x 20 = 4,6 ppm

2.2 Teknik Spektrofotometri

2.2.1 Pengertian Spektrofotometri

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk

mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang

gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet.

Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai

absorbansi dari  cahaya  yang dilewatkan akan sebanding

dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet. Menurut Cairns (2009),

spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu

sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya

10 15 20 25 30 35 40 450

1020304050

f(x) = x − 0.400000000000009R² = 1

Grafik Hubungan

Axis Title

Axis Title

pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna

terbentuk. 

Spektrofotometri dapat dibayangkan sebagai suatu perpanjangan dari

penilikan visual dimana studi yang lebih terperinci mengenai pengabsorbsian

energi cahaya oleh spesies kimia memungkinkan kecermatan yang lebih besar

dalam pencirian dan pengukuran kuantitatif. Di samping energi biasa dari gerak

translasi, yang tidak diperhatikan di sini, molekul memiliki energi dalam yang

dapat dibagi lagi dalam tiga kelas. Pertama, molekul dapat berotasi mengelilingi

berbagai sumbu dan memiliki kuantitas tertentu energi rotasi. Kedua, atom-atom

atau gugus – gugus atom dalam molekul dapat bergetar, artinya, bergerak secara

berkala satu terhadap yang laindi sekitar posisi- posisi kesetimbangan mereka,

dengan memberikan energi getaran kepada molekul itu.

Hubungan dari hukum Bouguer dan Beer adalah jika dalam hukum

Bouguer absorpsi radiasi merupakan hasil perkalian dari konstanta dengan tebal

medium pengabsorpsi, sedangkan jika dalam hukum Beer absorpsi radiasi

merupakan hasil perkalian dari konstanta dengan konsentrasi. Sehingga dari dua

persamaan tersebut (hukum Bouguer dan Beer) kita dapat menggabungkannya

menjadi satu persamaan, yaitu absorpsi radiasi merupakan hasil perkalian dari

konstanta dengan tebal medium pengabsorpsi dan konsentrasi. Sehingga

memungkinkan kita untuk menentukan kadar senyawa dalam sistem tunggal

maupun campuran.

2.2.2 Prinsip Kerja Spektrofotometri

Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun

campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan

dipantulkan, sebagian diserap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai

yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi

karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel.

Sinar berasal dari dua lampu yang berbeda, yaitu lampu wolfram untuk

sinar Visible (sinar tampak = 38 – 780nm) dan lampu deuterium untuk sinar Ultra

Violet (180-380nm) pada video lampu yang besar. Pilih panjang gelombang yang

diinginkan/diperlukan. Kuvet, ada dua karena alat yang dipakai tipe double beam,

disanalah kita menyimpan sample dan yang satu lagi untuk blanko. Detektor atau

pembaca cahaya yang diteruskan oleh sampel, disini terjadi pengubahan data

sinar menjadi angka yang akan ditampilkan pada reader.

Yang harus dihindari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat, biasanya

pada saat menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis jumlah

cahaya yang diukur menjadi bertambah.

2.2.3 Instrumen (Peralatan) dalam Spektrofotometri

Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer

terdiri dari :

Sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read out (pembaca).

1) Sumber Cahaya

Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran

radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa

untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah

lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini

mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 –

2200 nanometer (nm). Untuk daerah UV, lampu pijar ini menghasilkan :

2) Monokromator

Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya

polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu

(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).

3) Cuvet

Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat

contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars,

plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm

dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau

plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca

mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di

daerah sinar tampak (visible).

4) Detektor

Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada

berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal

Panjang gelombang(nm)

Warna WarnaKomplementer

400 – 435 Lembayung (violet) Kuning-hijau

435 – 480 Biru Kuning

480 – 490 Hijau-biru Jingga

490 – 500 Biru-hijau Merah

500 – 560 Hijau Ungu (purple)

560 – 580 Kuning-hijau Lembayung (violet)

580 – 595 Kuning Biru

595 – 610 Jingga Hijau-biru

610 – 750 Merah Biru-hijau

listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum

penunjuk atau angka digital. Dengan mengukur transmitans larutan sampel,

dimungkinkan untuk menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum

Lambert-Beer. Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati

sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel

(Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (%

T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = - log %T

(Underwood 2002)

2.2.4 Jenis – Jenis Spektrofotometri

Gambar : Spetrofotometri UV-Vis

Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :

1. Spektrofotometri Vis (Visible)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi

adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum

elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang

gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar

yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun..

selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam

sinar tampak (visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible

adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram

merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten

mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya.

karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Sample yang

dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini

menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh

karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu

dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan

menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul

spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga

produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.

Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble

protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu,

larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa

digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan

Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan

membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada

panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru

menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti

semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.

2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV

berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang

gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu

deuterium. Deuterium merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat

berlimpah di laut dan daratan. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh

mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan

senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna

dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung

dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap

harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada

spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna.

Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika

menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna

dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample

dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap

sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak

sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein

terlarut semakin besar. Spektrofotometri UV memang lebih simple dan

mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi

sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi

interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang

gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

Gambar Spektrum UV,

Namun spektrum dari

spektrofotometer VIS dan

UV-VIS juga menyerupai

spektrum UV.

3. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV

dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya

UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih

sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis,

yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem

spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer

digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample

berwarna juga untuk sample tak berwarna.

4. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra

merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan,

dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan

pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm. Pada spektro

IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih

kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk

mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa

organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan

adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas

IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan

dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample

untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari

gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.

Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada

penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared

Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri

pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.

Gambar spektrum IR. Pita tertinggi mengarah ke bawah sedangkan pada

UV pita yang paling tinggi mengarah ke atas hal ini disebabkan

spektrofotometer IR ditulis dalam bentung bilangan gelombang

2.2.5 Kelebihan

Keuntungan dari spektrofotometer adalah :

1. Penggunaannya luas, dapat digunakan untuk senyawa anorganik, organik dan

biokimia yang diabsorpsi di daerah ultra lembayung atau daerah tampak.

2. Sensitivitasnya tinggi, batas deteksi untuk mengabsorpsi pada jarak 10-4

sampai 10-5 M. Jarak ini dapat diperpanjang menjadi 10-6 sampai 10-7 M

dengan prosedur modifikasi yang pasti.

3. Selektivitasnya sedang sampai tinggi, jika panjang gelombang dapat

ditemukan dimana analit mengabsorpsi sendiri, persiapan pemisahan menjadi

tidak perlu.

4. Ketelitiannya baik, kesalahan relatif pada konsentrasi yang ditemui dengan

tipe spektrofotometer UV-Vis ada pada jarak dari 1% sampai 5%. Kesalahan

tersebut dapat diperkecil hingga beberapa puluh persen dengan perlakuan

yang khusus.

5. Penggunaanya mudah, spektrofotometer mengukur dengan mudah dan

kinerjanya cepat dengan instrumen modern, daerah pembacaannya otomatis

(Skoog, DA, 1996).

2.2.6 Kelemahan

Kelemahan spektrofotometri adalah

1. Alat-alat yang digunakan untuk analisisnya harganya mahal, perawatannya

agak sedikit susah.

2. Hukum Beer menuntut radiasi monokromatik karena nilai absorbtivitas

bergantung pada panjang gelombang. Nilai absorbans yang terukur

mencerminkan distribusi panjang gelombang dalam radiasi yang dalam

sebuah spektrofotometer praktis, tak pernah benar- benar monokromatis.

3. Kesulitan dalam menjaga kesetimbangan analit yang melibatkan ion- ion

sering peka terhadap elektrolit yang ditambahkam, dan kegagalan

mengendalikan kuat ion dapat menimbulkan masalah dalam spektrofotometri.

2.2.7 Contoh Kasus

Dari Jurnal Analisis Kafein dalam Kopi Bubuk di Kota Manado Menggunakan

Spektrofotometri UV- Vis.

Tujuan penelitian ini yaitu menentukan kadar kafein dalam kopi bubuk kota

Manado dan kadar maksimum kopi bubuk yang dapat dikonsumsi per hari

berdasarkan SNI. Sampel kopi merupakan 6 jenis kopi bubuk yang ada di kota

Manado. Identifikasi dilakukan dengan metode parry, sedangkan kadar kafein

ditentukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Langkah-langkah dalam

penentuan kadar kafein ini, yaitu :

a) Pembuatan Larutan Baku Kafein

Ditimbang sebanyak 250 mg kafein, dimasukkan ke dalam gelas piala,

dilarutkan dengan akuades panas secukupnya, dimasukkan ke dalam labu

takar 250 mL. Kemudian diencerkan dengan akuades hingga garis tanda dan

dihomogenkan. Dipipet larutan standar kafein tadi sebanyak 2,5 mL,

dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL mL kemudian diencerkan dengan

akuades hingga garis tanda dan dihomogenkan.

b) Penentuan Panjang Gelombang

Deteksi absorbansi larutan standar pada rentang panjang gelombang 250-300

nm dengan menggunakan instrument spektrofotometer UV-Vis.

c) Pembuatan Kurva Standar

Pembuatan larutan standar didahului dengan pembuatan larutan induk

1000mg/L yang dibuat dengan melarutkan 250 mg kafein kedalam 250 mL

akuades.

d) Penentuan Kadar Sampel

Dibaca serapan sinar (absorbansi) dengan spketrofotometer pada panjang

gelombang 275 nm dengan blanko serapan akuades. Kemudian, dihitung

jumlah kafein dari angka serapan masing-masing.

Hasil Uji kuantitatif kafein metode Spektrofotometri UV-Vis

Dari hasil analisis kuantitatif pada kopi dengan menggunakan metode

spektrofotometri UV-Vis, ada 6 sampel kopi yaitu sampel A, B, C, D, E, dan F

yang dibaca dengan panjang gelombang 275 nm. Untuk membaca nilai

konsentrasi, masing-masing 100 mL sampel diambil 0,05 mL kemudian

diencerkan dalam 3 mL akuades. Nilai konsentrasi masing-masing sampel dapat

dilihat pada Tabel 3.

Dari data hasil penelitian, dapat dilihat besar kadar kafein dalam setiap

sampel. Menurut SNI 01-7152-2006 batas maksimum kafein dalam makanan dan

minuman adalah 150 mg/hari dan 50 mg/sajian. Biasanya seseorang

mengkonsumsi kopi bubuk tiap kali disajikan sekitar 3 g dalam satu cangkir. Dari

hasil survey yang dilakukan di kota Manado, penikmat kopi bubuk biasanya

mengkonsumsi sampai 6 g percangkir. Itu artinya dosis kafein yang telah

dikonsumsi mencapai lebih dari 170- 250 mg sehari melebihi batas maksimum

yang ditetapkan SNI.

2.3 Pengayaan (Jawaban Pertanyaan)

1. Apa pengaruh dari memperlebar sistem kromofor dan panjang gelombang yang lebih

panjang pada sistem auksokrom?

Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan

pergeseran pita absorpsi menuju kepada gelombang yang lebih besar (Bathokromik)

yang disertai dengan pengikatan intensitas(Hyperkromik).

2. Bagaimana bila dalam penentuan kadar, absorbansi dipenuhi namun hukum lambert

beer tidak dipenuhi?

Untuk mengetahui apakah suatu unsur memenuhi Hukum Beer atau tidak maka

perlu ditentukan grafik kalibrasi absorbansi vs konsentrasi. Hukum Beer hanya dapat

dipenuhi jika dalam range (cakupan) konsentrasi hasil kalibrasi berupa garis lurus,

jadi kita hanya bekerja pada linear range. Seringkali sampel yang dianalisa akan

memiliki absorbansi yang lebih tinggi dari pada larutan standar. Jika kita berasumsi

bahwa kalibrasi tetap linier pada konsentrasi yang lebih tinggi.

Secara umum, Hukum Lambert beer dapat terlaksana jika memenuhi kondisi berikut:

1. Tidak ada interaksi molekul (Encerkan larutan, biasanya 0,01 M, maka jarak rata-

rata antara 2 molekul menjadi cukup kecil dan tingkat interaksi zat terlarutnya

atau ikatan H dapat mempengaruhi lingkungan analit dan absorptivitas nya.

2. Berkas sinar cahaya bersifat monokromatis. Jika berkas sinar tidak bersifat

monokromatis, maka akan terjadi penyimpangan dengan berkas sinar

polikromatis.

3. analit tidak mengalami asosiasi, disosiasi, atau reaksi dengan pelarut untuk

memberikan produk dengan menyerap karakteristik yang berbeda dari analit. Jika

analit mengalami reaksi dengan pelarut, maka akan terjadi penyimpangan kimia.

Bila hukum lambert beer tidak dipenuhi, maka pengukuran kadar tidak dapat

dilakukan.

3. Contoh kasus mengenai geseran batokromik dan hipokromik?

Geseran batokromat atau geseran batokromik (Bathochromic shift) atau geseran

merah, yakni geseran atau perubahan lmaks ke arah yang lebih besar. Penyebab

terjadinya peristiwa ini adalah adanya perubahan struktur, misalnya adanya

auksokrom atau adanya pergantian pelarut. Sedangkan Geseran hipsokromat

(Hypsochromic shift) atau pergeseran hipokromik atau pergeseran biru, yakni

geseran atau perubahan lmaks ke arah yang lebih kecil. Munculnya gejala ini juga

sering disebabkan oleh adanya penghilangan auksokrom atau oleh adanya pergantian

pelarut.

Pergeseran batokromik merupakan pergeseran dari serapan ke panjang

gelombang yang lebih panjang karena sisipan atau pengaruh pelarut (geseran merah).

Geseran batokromik disertai sisipan alkil dihasilkan dari konyugasi berlebihan

dengan gugus alkil yang cukup mudah bergerak untuk berinteraksi dengan gugus

kromoforik. Pergeseran hipsokromik adalah pergeseran dari serapan ke kepanjang

gelombang yang lebih pendek karena sisipan atau pengaruh pelarut (geseran biru).

Hal ini dapat disebabkan oleh perubahan pelarut atau adanya konjugasi yang

dihilangkan sebagai contoh, konjugasi dari elektron pasangan bebas pada atom

nitrogen anillina dengan sitem ikatan phi cincin benzana dihilangkan dengan adanya

protonasi. Anillina menyerap pada 230 nm (ε 8600) tetapi dalam larutan asam

puncak utamanya hampir sama dengan benzena yaitu 203nm (ε 7500), terjadi

pergeseran biru (Gandjar dkk, 2007).

Pergeseran bathokromik dan hipsokromik berhubungan dengan transisi

elektron n, dan transisi . Pergeseran tersebut dipengaruhi oleh pelarut,

yaitu berkaitan dengan kemampuan pelarut untuk mensolvasi antara keadaan dasar

dengan keadaan tereksitasi. Pada transisi ini, molekul dalam keadaan dasar relatif

nonpolar, dan keadaan tereksitasinya lebih polar dibandingkan keadaan dasar.

4. Tujuan kalibrasi itu apa?

Kalibrasi bertujuan untuk menghilangkan spektrum gelap dalam cahaya yang

diserap larutan yang dapat mengganggu pembacaan skala sehingga pembacaan skala

lebih teliti dan kesalahan pembacaan tidak terakumulasi.

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Metode Spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisis konsentrasi suatu zat

di dalam larutan berdasarkan absorbansi terhadap warna dari larutan pada panjang

gelombang tertentu. Sedangkan Metode spektrofluorometri adalah suatu metode

pengukuran berdasarkan sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala dari suatu

molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan panjang gelombang

yang lebih panjang.kedua metode ini dapat digunakan untuk menganalisis suatu senyawa

secara kualitatif ataupun kuantitatif. Untuk penetapan kadar kuantitatif suatu senyawa,

metode spektrofotometri lebih banyak dipilih karena pelaksanaanya yang mudah dan

tingkat sensitifitas alat yang tinggi. Namun kelemahan dari metode ini adalah alat yang

digunakan relatif mahal dan membutuhkan perawatan yang khusus.

DAFTAR PUSTAKA

Basset, J. 1994. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: EGC.

Harjadi, W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta. PT Gramedia.

Kesia, Rialita Maramis, Citraningtyas, Gayatri, dan Wehantouw, Frenly. 2013. Analisis

Kafein dalam Kopi Bubuk di Kota Manado Menggunakan Spektrofotometri UV-

Vis. Jurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 2 No. 04 November 2013 ISSN 2302.

Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.

Sastrohamidjojo, Hardjono. 1992. Spektroskopi Inframerah. Yogyakarta. Liberty

Yogyakarta.

Skogg. 1965. Analytical Chemistry. Florida. Sounders College.

Underwood,A.L dan R.A day, J.R. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga. Jakarta.

http://www.scribd.com/doc/79545957/Analisis-Kuantitatif-Sediaan-Obat-Dgn-

Spektrofluorometri