Mengukur Kadar dan Memilih Metode Uji Karakteristik Enzim X

Torda Febriantika / 102014065

Kelompok C6

Mahasiswi Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Krida Wacana

Alamat Korespodensi Jl. Arjuna Utara No. 6 Jakarta Barat 11510

Abstrak

Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator atau senyawa

meningkatkan kecepatan reaksi kimia. Kecepatan suatu enzim dapat dipengaruhi oleh

konsetrasi substrat, produk, aktivator, dan inhibiator. Kerja enzim dalam mengatur

kecepatan reaksi kimia ditunjukkan dengan hubungan antara enzim dengan substratnya.

Enzim yang mengkatalisis kebanyakan reaksi kimiawi dalam sel, terbuat dari rantai-rantai

protein. Protein adalah polimer panjang yang tersusun atas asam-asam amino. Protein

membangun tubuh disebut Protein Struktural sedangkan protein yang berfungsi sebagai

enzim, antibodi atau hormon dikenal sebagai Protein Fungsional. Isolasi enzim atau proses

memisahkan enzim dari sumbernya dan melibatkan beberapa teknis sekaligus enzim yang

ditemukan berasal dari berbagai macam organisme, dengan berbagai tingkat kemurnian.

Jadi sebelum melakukan metode uji dan mengukur kadar enzim X hendaknya mengetahui

metode uji protein dengan menentukan kadar protein. Karena kebanyakan protein

merupakan enzim atau subunit enzim.

Kata Kunci : Enzim, protein, asam amino.

Abstract

Enzyme is a protein that serves as a catalystor a compound incrase the speed of

chemical reactions. The speed of an enzyme can be influenced by the concentration of

substrate, product, activator, and inhibator. Action of the enzyme in regulating the speed of a

chemical reaction is indicated by the relationship between the enzyme with substrate. Enzyme

that catalyze many chemical reactions in the cell, made of chains of protein chains. Protein is

a longpolymer of amino acids. Protein that build the body called structural proteins whereas

proteins that functions as enzymes, antibodies or hormone known as functional proteins.

1

Isolation of enzyme or enzymes separate process from the source and involves some technical

as well enzymes are found to originate from a wide variety of organisms with different levels of

purity. So before doing the test method and measure enzyme levels should know the protein

assay method to determine protein content. Because most of the ptotein is an enzyme or

enzyme subunit.

Keyword : Enzyme, protein, amino acids.

Pendahulaun

Enzim atau biokatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan oleh sel. Enzim

sangat penting dalam kehidupan, karena semua reaksi metabolisme dikatalis oleh enzim. Jika

tidak ada enzim, atau aktivitas enzim terganggu maka reaksi metabolisme sel akan terhambat

hingga pertumbuhan sel juga terganggu. Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat

memperoleh makanan/ nutriet dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke dalam sel,

memperoleh energi Kimia yang digunakan untuk biosintesis, perkembangbiakan, pergerakan,

dan lain-lain.1

Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi,

perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi pertumbuhan, cara isolasi, cara

permunian serta jenis substrat yang digunakan agar diperoleh enzim dengan tingkat kemurnian

tinggi.1

Enzim

Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator, senyawa yang meningkatkan

kecepatan reaksi kimia. Enzim katalisator berikatan dengan reaktan, yang disebut substrat,

mengubah reaktan menjadi produk, lalu melepaskan produk. Walaupun enzim dapat mengalami

modifikasi selama urutan ini, pada ahkir reaksi enzim kembali ke bentuk asalnya. Selain

meningkatkan kecepatan reaksi, enzim mengadakan cara untuk mengatur kecepatan reaksi dalam

jalur metabolik tubuh.2

Enzim sebagai katalisator. Suatu enzim berikatan dengan substrat reaksi dan mengubah

substrat menjadi produk. Substrat berikatan dengan tempat pengikatan substrat spesifik yang

terdapat di enzim melalui interaksi dengan residu asam amino enzim. Geometri ruang yang

2

diperlukan untuk semua interaksi antara substrat dan enzim menyebabkan setiap enzim selektif

bagi substratnya, dan memastikan bahwa yang dihasilkan hanyalah produk spesifik.2

Tempat pengikatan substrat bertumpang-tindih dengan katalitik enzim, daerah pada

enzim dimana reaksi berlangsung. Dalam tempat aktif, gugus fungsional residu asam amino

enzim, senyawa yang disebut koenzim, dan logam yang melekat erat berpartisipasi dalam reaksi.

Gugus fungsional di tempat aktif enzim mengaktifkan substrat dan menurunkan energi yang

dibutuhkan untuk membentuk stadium antara reaksi yang berenergi tinggi (stadium transisi).

Sebagian strategi katalitik yang digunakan enzim, misalnya katalisis asam-asam umum,

pembentukan zat antara kovalen dan stabilisasi stadium transisi, digambarkan oleh kimotripsin.2

Efektivitas berbagai obat dan toksin bergantung pada kemampuannya menghambat suatu

enzim. Inhibitor paling kuat membentuk ikatan kovalen dengan gugus reaktif di tempat aktif

enzim, atau merupakan analog dari stadium antara reaksi, misalnya stadium transisi.2

Pengaturan enzim. Kecepatan suatu enzim dapat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat,

produk, aktivator, dan inhibator. Bagi banyak enzim, hubungan antara kecepatan reaksi dan

konsentrasi substrat dijelaskan oleh persamaan Michaelis Menten. Produk inhibitor fisiologis

reversible lainnya dapat berkompetisi dengan substrat untuk berikatan pada tempat aktif,

sehingga reaksi menjadi lebih lambat.2

Pengaturan fisiologis jalur metabolik bergantung pada kemampuan mengubah fluks

melalui suatu jalur dengan mengaktifkan enzim yang mengkatalisis langkah paling lambat dalam

jalur tersebut. Enzim ini sering memiliki inhibitor atau aktivator alosterik, senyawa yang

berikatan dengan tempat di luar tempat katalik aktif dan mengatur enzim melalui perubahan

konfirmasi enzim.2

Aktivitas enzim juga dapat diatur oleh fosforilasi atau oleh protein modulator. Sebagian

enzim disintesis sebagai suatu precursor yang tidak aktif, yang disebut zimogen. Zimogen ini

diaktifkan oleh penguraian proteolitik ( misal, protein pembekuan darah).2

Enzim yang memiliki urutan asam amino yang berbeda tetapi mengkatalisis reaksi yang

sama disebut sebagai isoenzim. Isoenzim spesifik-jaringan sering memiliki sifat yang konsisten

dengan peran yang berbeda di jaringan yang berbeda( misal, glukokinase dan heksokinase).2

3

Kerja enzim dalam mengatur kecepatan reaksi kimia ditunjukkan dengan kekhususan

hubungan enzim dengan substratnya. Kecocokan hubungan enzim dengan substratnya ditentukan

oleh bagian aktifnya yaitu gugusan prostetiknya (permukaan untuk mengikat/melekatnya

substrat), disebut juga sisi katalik.3 Ada dua pendapat yaitu:

1. Hipotesa lock and key( kunci dan anak kunci) yang dikemukan oleh Emil Fisher

Antara enzim dan substrat terjadi persatuan yang kaku seperti kunci dan anak

kunci.3

Selama reaksi berjalan, enzim dan substrat bergabung sementara membentuk

kompleks enzim substrat.3

2. Hipotesa Induced – Fit yang dikemukan oeh Koshland

Enzim dan sisi aktifnya merupakan struktur yang secara fisik lebih fleksibel

daripada hipotesis diatas.3

Terjadi interaksi dinamis antara enzim dengan substrat.3

Jika substrat bergabung dengan enzim, akan terjadi perubahan dalam struktur

(konfirmasi) sisi aktif enzim sehingga fungsi berlangsung efektif.3

Struktur molekul substrat juga berubah selama di induksi sehingga kompleks

enzim-substrat lebih berfungsi.3

Protein

Protein berfungsi dalam nyaris setiap aspek kehidupan selular, dan bisa terdapat ribuan

(atau bahkan puluhan) protein berbeda dalam sebuah sel tunggal. Enzim, yang mengkatalisis

kebanyakan reaksi kimiawi dalam sel, terbuat dari rantai-rantai protein. Sejumlah hormon,

misalnya insulin, juga terbuat dari protein. Fungsi-fungsi lain yang melibatkan protein adalah

pensinyalan sel, respons-respons imun ( misalnya antibodi ) faktor-faktor pengumpulan darah,

struktur kromatin (misalnya histon), pergerakan (misalnya motor-motor molekuler), unsur-unsur

sitoskeletal (misalnya tubulin), protein-protein kontraktil (misalnya myosin dan aktin pada

serabut-serabut otot), matriks ekstraselular (misalnya kolagen), dan lain-lain.4

Protein adalah polimer panjang yang tersusun atas asam-asam amino, yang seringkali

disebut sebagai residu (terutama selama degradasi protein untuk memastikan sekuens-sekuens

asam aminonya) yang terikat secara kovalen oleh ikatan-ikatan peptida. Secara alamiah, terdapat

4

dua jenis asam amino berbeda pada protein. Semua asam amino yang terionisasi secara biologis

dengan sempurna, kecuali prolin, memiliki struktur umum.4

Ikatan peptida menggabungkan dua asam amino yang bersebelahan saat sintesis protein

adalah sebuah ikatan kovalen yang kuat, di mana atom-atom berpasangan melalui penggunaan

bersama sebuah elektron. 4

Struktur dan metabolisme

Asam amino merupakan komponen penyusun protein, setiap asam amino terdiri dari

gugus karboksilat (-COOH) dan gugus amino serta yang membedakan asam amino satu dengan

asam amino lainnya yaitu dengan adanya rantai samping (R).5 Strukturnya yaitu seperti yang

digambarkan dibawah ini.6

Gambar 1

Sumber : pendidikan-bio.blogspot.com

Dari gambar tersebut terlihat bahwa: Atom C pusat tersebut dinamai atom Cα (“C-alfa”)

sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung

dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom Cα ini, senyawa

tersebut merupakan asam α- amino. Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat

5

kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam

amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar.5

Metabolisme asam amino ini dapat terjadi dalam beberapa proses, diantaranya adalah:

a. Katabolisme

- Katabolisme nitrogen asam amino menjadi urea

- Katabolisme kerangka karbon asam amino menjadi senyawa amfibolik.7

b. Anabolisme

- Terjadi dalam proses sintesis protein

- Terdapat 20 macam jenis asam amino dasar, 10 macam diantaranya adalah

asam amino esensial.7

c. Pembentukan produk khusus.7

Fungsi Protein

Protein membangun tubuh disebut Protein Struktural sedangkan protein yang berfungsi

sebagai enzim, antibodi atau hormon dikenal sebagai Protein Fungsional.8

Protein struktural pada umumnya bersenyawa dengan zat lain di dalam tubuh mahluk

hidup, contoh protein struktural antara lain nukleoprotein yang terdapat di dalam inti sel dan

lipoprotein yang terdapat di dalam membran sel. Ada juga protein yang tidak bersenyawa dengan

komponen struktur tubuh, tetapi terdapat sebagai cadangan zat di dalam sel-sel mahluk hidup.

Contoh protein seperti ini adalah protein pada sel telur ayam,burung, kura-kura, dan penyu.8

Semua jenis protein yang kita makan akan dicerna di dalam saluran pencernaan menjadi

zat yang siap diserap di usus halus, yaitu berupa asam amino - asam amino. Asam amino - asam

amino yang di hasilkan dari proses pencernaan makanan berperan sangat penting di dalam tubuh,

untuk:

Bahan dalam sintesis subtansi penting seperti hormon, zat antibodi, dan organel sel

lainnya.8

Perbaikan, pertumbuhan dan pemeliharaan struktur sel, jaringan dan organ tubuh.8

Sebagai sumber energi, setiap gramnya akan menghasilkan 4,1 kalori.8

6

Mengatur dan melaksanakan metabolism tubuh, misalnya sebagai enzim(protein

mengaktifkan dan berpartisipasi pada reaksi kimia kehidupan).8

Menjaga keseimbangan asam basa dan keseimbangan cairan tubuh. Sebagai senyawa

penahan/ bufer, protein berperan besar dalam menjaga stabilitas pH cairan tubuh. Sebagai

zat larut dalam cairan tubuh, protein membantu dalam pemeliharaan tekanan osmotik di

dalam sekat-sekat rongga tubuh.8

Membantu tubuh dalam menghancurkan atau menetralkan zat-zat asing yang masuk ke

dalam tubuh.8

Penggolongan Protein

1) Berdasarkan Bentuknya

Berdasarkan bentuknya protein digolongkan menjadi dua,yaitu potein globular

dan protein serabut. Protein globular memiliki rantai polipeptida berlipat ganda menjadi

bentuk bulat pada(globular), yang memiliki fungsi gerak, contoh: Hemoglobin dan

enzim.8

Protein serabut memiliki fungsi pelindung, contoh: L-keratin pada rambut dan kolagen

pada urat.8

2) Berdasarkan Komposisi Kimia

Berdasakan komposisi kimianya, protein dibedakan menjadi protein sederhana

dan protein terkonjugasi. Protein sederhana hanya tersusun dari asam-asam amino.

Contoh: enzim ribunoklease.8

Pada protein terkonjugasi asam amino juga terikat gugus lain

Contoh:

Lipoprotein, protein yang terkonjugasi lipid (lemak)

Glikoprotein, protein yang terkonjugasi karbohidrat

Fosfoprotein, protein yang terkonjugasi gugus fosfat

Ikatan peptida

7

Didalam protein, asam-asam amino diikat bersama melalui ikatan peptida, yaitu

ikatan C-N hasil reaksi kondesasi anatara gugus karboksil dengan gugus amino dari asam

amino lain. Perhatikan reaksi kondesasi beikut.8

Reaksi tersebut merupakan contoh dipeptida, yaitu molekul yang dibentuk melalui

ikatan peptida dari dua asam amino. Suatu polieptida(protein) adalah polimer yang

dibentuk oleh sejumlah besar asam amino melalui ikatan peptida membentuk rantai

polimer.8

Penamaan dipeptida atau tripeptida disesuaikan dengan nama asam amino yang

berikatan. Huruf ahkir dari nama asam amino yang disatukan diganti dengan huruf I’.

Contoh, jika alanin dan glisin menjadi dipeptida, nama dipeptidanya adalah alaniglisin.8

Metode Uji Protein

Kadar protein yang ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl disebut sebagai kadar protein

kasar (crude protein) karena terikut senyawaan N bukan protein, misalnya urea, asam nukleat,

asam ammonia, nitrat, nitrit, asam amino, amida, purin, dan pirimidin. Protein akan mengalami

kekeruhan terbesar pada saat mencapai pH isoelektris yaitu pH dimana protein memiliki muatan

positif dan negatif yang sama, pada saat inilah protein berubah wujud menjadi padatan dan

kehilangan daya kelarutnya.9

Metode Kjeldahl. Analisis protein dalam bahan pangan dapat dilakukan dengan dua

metode kuantitatif dan kualitatif. Kadar protein yang ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl

disebut sebagai kadar protein kasar (crude protein) karena terikut senyawaan N bukan protein.

Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organik dalam sempel

didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan

menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam borat.

Selanjutnya ion-ion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl. Metode

Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino,

protein dan senyawa yangb mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan

dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan ammonium sulfat. Setelah

pembebasan dengan alkali kuat, ammonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke

dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini teah banyak mengalami

8

modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah

sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek.9

Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu

proses destruksi, protein destilasi dan tahap titrasi.9

1. Tahap destruksi

Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi

destruksi menjadi unsur - unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi

CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4 dan

HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan

penambahan katalisator tersebut titik didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga

destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-

kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena

zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari

valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya.9

2. Tahap destilasi

Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan

penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi

tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas

yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang disebabkan

selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4% dalam jumlah

yang berlebihan. Agar supaya kontak anatara asam dan ammonia lebih baik maka

diusahkan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk

mengetahui asam dalam keadaan berlebihan makan diberi indicator misalnya BCG +

MR atau PP.9

Apabila penampung destilasi digunakan asam khlorida maka sisa asam khlorida yang

bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Ahkir titrasi ditandai

dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30

detik bila menggunakan indikator PP.9

9

%N = x N. NaOH x 14,008 x 100%

Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi

dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan

indicator (BCG=MR). Ahkir titrasi dengan perubahan warna larutan yang biru menjadi merah

muda.9

%N= x N.Hcl x 14,008 x 100%

Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor.

Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada presentase N yang menyusun

protein dalam suatu bahan.9

Metode Lowry. Reagen pendeteksi gugus – gugus fenolik seperti reagen folin dan

ciocalteu telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang

kemudian dikenal sebagai metode Lowry. Dalam bentuk yang paling sederhana reagen folin

ciocalteu dapat mendeteksi residu tirosin ( dalam protein ) karena kandungan fenolik dalam

residu tersebut mampu mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibdat, yang merupakan konstituen

utama reagen foin ciocalteu menjadi tungsten dan molybdenum yang berwarna biru. Hasil

reduksi ini menunjukkan puncak absorbs yan lebar pada daerah merah. Sensitifitas dari metode

folin ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion

Cu.9

Beberapa zat yang dapat menganggu penetapan kadar protein dengan menggunakan

metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nukleat, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol,

Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfide, fenolat, asam urat, guanine,

xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan

menghilangkan interfensi tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk

mengoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat

dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan

protein.9

10

Tahapan Isolasi

Isolasi enzim adalah proses memisahkan enzim dari sumbernya dan melibatkan beberapa

teknis sekaligus enzim yang ditemukan dipasaran berasal dari berbagai macam organism, dengan

berbagai tingkat kemurnian, contoh : α – Amilase, Glukoamilase, Protase. 10

Berdasarkan fungsinya hayati, ada dua jenis enzim yaitu enzim intraseluler dan enzim

ekstraseluler. Enzim esktraseluler lebih mudah diisolasi dan tidak memerlukan proses

pemecahan dinding sel, contohnya adalah papain dan tripsin dan berdasarkan sifat fisik dan

kimiawainya dengan cara penyaringan. Enzim yang masih melekat pada dinding sel atau sisa

polimer substrat dipisahkan dengan menggunakan senyaw yang dapat melepskan interaksi ini,

misalnya Triton X100, sodium laurel sulfat, tween 80. Enzim Intraseluler dan enzim yang

melekat pada membrane harus melalui pemecahan sel. Stabilitas struktur sel harus tetap di jaga

dengan cara pemilihan jenis buffer dan lingkungan media ekstrasi yang sesuai, menjaga suhu

ekstraksi, mencegah kontaminasi logam dan sering terkontaminasi oleh protein intraseluler.10

Isolasi Enzim Intraseluler merupakan proses pelepasan enzim dari sel. Isolasi enzim dari

tumbuhan memiliki tingkat kesulitan yang tinggi, karena dinding selnya keras, cenderung

menimbun zat-zat racun dalam vacuole (missal fenol), sehingga ketika dinding pecah, racun dan

enzim akan bercampur dan berinteraksi. Cara mengatasi adalah dengan ditambahkan zat

pereduksi, seperti β – merkaptoetanol, askorbat, atau tioglikolat. Isolasi dalam proses produksi

enzim meliputi 4 tahapan utama, yaitu:

1. Pemecahan sel

Beberapa metode pemecahan sel cara fisik

a. Dengan alat homognizer, seperti waring blender,atau hammer mill.

Biasa digunakan untuk memecah dinding sel jaringan hewan dan tubuhan.

Namun cara ini kurang baik untuk sel mikroba karena dinding selnya lebih keras. Untuk

membantu proses pemecahan digunakan : bubuk alumina, pasir atau silica dan untuk

preparatkecil digunakan mortar dan penumbuk. Untuk skalabesar digunakan homogenizer atau

penggiling bertekanan ditambah bubuk metal sebagai pemecah dengan cara sel dibasahi dengan

11

buffer untuk mempermudah pemecahan dan dapat ditabah denganproses agitasi. Letak enzim di

dalam sel mempengaruhi waktu pemecahan.10

b. Pembekuan dan pencairan

Jika pasta sel didinginkan pada -20 oC, maka ia akan mengalami perusakan

dinding sel akibat anomaliair (volume membesar ketika air membeku). Sekitar 50% protein

periplasma akan dilepaskan ke dalam medium, tetapi hanya ± 10% protein telarut total. Bila

enzim dapat dilepaskan dengan cara ini, umumnya enzi tersebut memiliki derajat kemurnian

yang tinggi. Senyawa kriopektan (laktosa, dekstran, rafinosa, gliserol) yang digunakan pada

proses pemebekuan akan menghambat pemecahan sel. Sel yang sudah tua lebih mudah dipecah

daripada sel muda. Bakteri garam negatif lebih mudah dipecah daripada garam positif.10

c. Kejutan osmosis

Bakteri garam lebih rentan terhadap perubahan tekanan osmosa yang besar

dibandingkan bakteri garam positif. Bila bakteri diletakkan dalam media dengan

tekanan osmosa tinggi (misalnya larutan sukrosa 20%) smpai dicapai keadaan

seimbang, kemudian dipindahkan ke dalam air, maka akan timbul aliran air dari

media ke dalam sel, sehingga akan menyebabkan pecahnya dinding sel.10

d. Sonifikasi

Caranya yaitu dalam media cair diberi getaran di atas frekuensi batas

pendengaran manusia (> 20kHz, ultrasonik).Getaran ini menimbulkan perapatan dan

perengangan yang menimbulkan perubahan periodik tekanan dalam cairan medium dan plsama

sel.10

e. Agitasi dengan abrasi

Pasta ditempatkan padawadah yang mengandung butir – butir gelas dan

digetarkan dengan cepat. Timbulnya gaya gesek akibat gradien kecepatan oleh tumbukan antar

butiran dan antara butiran dengan mikroorganisme menyebabkan pecahnya sel.10

12

2. Klarifikasi

Proses pemisahan partikel non enzim yang tercampur dengan enzim dengan cara

pengadapan. Partikel non enzim berasal dari penambahan buffer, air atau cairan fisiologis

pada proses pemecahan dinding sel, atau molekul-molekul kompleks yang berkaitan

dengan enzim. Dapat dilakukan dengan penambahan senyawa yang dapat

menggumpalkan seperti: amonium fosfat, asam askorbat, garam-garam kalsium, serat

selulose, sisten, tanah diatom, gelatin, asam fosfat, garam Na- pospat, na-sulfat dan Na-

sitrat, atau senyawa penggumpal dalam pemurnian air (polielektrolit seperti poliamin).

Menggumpalkan struktur koloid cairan. Dapat ditambahkan bahan pengawet pada tingkat

yang aman untuk dikosumsi , misal: fenol, amomnium kuartener dan florida. Konsentrasi

senyawa penggumpal harus tepat, agar enzim tidak ikut menggumpal garam amonium

sulfat pada konsentrasi tinggi menyebabkan salting out protein termasuk enzim.10

3. Presipitasi

Pengendapan dilakukan berdasarkan pada perbedaan kelarutan. Dalam larutan garam

yang pekat, biasanya amonium sulfat, protein-protein dapat dipisahkan. Teknik ini sering

digunakan pada tahap awal pemurnian protein. Secara umum protein kecil lebih larut dari

pada protein besar. Dan semakin banyak jumlah muatan pada rantai samping, kelarutan

protein semakin besar. Dan semakin banyak jumlah muatan pada rantai samping,

kelarutan protein semakin besar. Kelarutan protein A sama sekali tidak tergantung pada

protein B – kelarutan hanya tergantung pada sifat masing – masing individu protein.10

2 jenis metode untuk menggumpulkan enzim :

Pelarut prganik

Menurunkan konstanta dielektrik

Medium kurang sesuai dengan permukaan enzim yang polar

Adanya residu asam amino hidrofobik yang terikat secara longgar

Pada molekul enzim menyebabkan pelipatan molekul baru dan menjadi tidak aktif

Proses inaktivasi enzim mungkin terjadi

Memperbesar kemungkinan denaturasi terutama pada suhu tinggi

13

Fraksinasi dilakukan pada suhu rendah

Mudah terbakardan harganya mahal

Garam

Pengendapan dengan garam

Ion garam mempengaruhi kelarutan protein. Pada konsetrasi rendah ion-ion garam

melingkungi molekul proteindan mencegah bersatunya molekul protein sehingga protein melarut

disebut SALTING IN.10

Pada konsentrasi tinggi, terjadi peningaktan muatan listrik di sekitar protein yang akan

menarik mantel air dan koloid protein. Interaksi hidrofobik diantara sesama melekul protein pada

suasana ionik akan menurunkan kelarutan protein disebut SALTING OUT.10

Enzim – enzim dan beberapa protein mempunyai kemampuan untuk membentuk garam dengan

penambahan logam. Terbentuknya garam akan menurunkan kelarutan protein ion garam yang

ditambahakan mempengaruhi kelarutan protein.10

Pengendapan dengan pelarut organik

Pelarut organik akan mengurangi tetapan dielektrik air, dengan demikian dapat mengurangi

kelarutan protein karena interaksi antar molekul protein lebih disukai dibandingkan antara

molekul protein dengan air. Atau dengan kata lain: “ Protein diendpkan dengan pelarut organik

tanpa merusak struktur protein bila diendapkan pada suhu di bawah 4 oC. Pelarut organik yang

biasa digunakan adalah isopropanol, metanol, etanol, dan aseton. Penggunaan pelarut – pelarutini

dalam skala industri jarang digunakan karena selain mudah terbakar juga harganya mahal.10

Etanol terdapat keseimbangan antara efek melarutkan dan sifat hidrofilik yang cukup untuk

mengurangi denaturasi.10

Isopropanol digunakan untuk presipitasi enzim ekstraseluler seperti amiloglukooksidase,

mempunyai sifat mudah terbakar dan cenderung hidrofobik.10

Aseton harus ditambahkan secara perlahan melalui sisi samping wadah.10

14

Kesimpulan

Sebelum melakukan metode uji dan mengukur kadar enzim X hendaknya mengetahui metode

uji protein dengan menentukan kadar protein. Karena kebanyakan protein merupakan enzim atau

subunit enzim. Kadar protein yang di tentukan berdasarkan cara Kjeldahl disebut sebagai kadar

protein kasar (crude protein) dan metode Lowry.

Daftar Pustaka

1. Maulana F. Isolasi dan pemurnian enzim.

http://kamuskimia29.blogspot.com/2013/12/isolasi-dan pemurnian-enzim.html. Diunduh

tanggal 15 Desember 2014.

2. Marks DB, Marks AD, Smith CM. Biokimia kedokteran dasar, Jakarta: EGC, 2000; h.96.

3. Utami M. Cara kerja enzim. http://mutiarautami27.blogspot/2012/12/enzim.html.

Diunduh tanggal 17 Desember 2014.

4. Elord SL, Stansfield WD. Schaum’s genetika, Jakarta: Penerbit Erlangga, 2002; h.55-6.

5. Mulyaman D. Struktur dan metabolisme asam amino.

http://chemde.blogspot.com/2014/10/baiklah-teman-teman-skarang-saya-akan.html?m=1.

Diunduh tanggal 16 Desember 2014.

6. Gambar struktur asam amino.

http://4.bp.blogspot.com/-YeUjJ4xFnvC/uOxXBM8dDd9I/AAAAAAAAMc/y9ZYlbiF4

s/s320/asam=amino.gif. Diunduh tanggal16 Desember 2014.

7. Nuriyanto A. Metabolisme asam amino.

http://nuriyantoandy.blogspot.com/2012/12/metabolisme-asam-amino_4572.html?m=1.

Diunduh tanggal 17 Desember 2014.

8. Equetinh. Fungsi dan penggolongan protein.

http://equentinh.wordpress.com/2014/03/03/protein-struktural-protein-penggolongan-

protein-fungsi-protein-asam-amino-esensial-non-esenssial/. Diunduh tanggal 17

Desember 2014.

9. Himka. Metode uji protein.

http://himka1polban.wordpress.com/laporan/kimia-pangan/penentuan-kadar-protein-

metode-kjeldahl-dan-lowry/. Diunduh tanggal 15 Desember 2014.

15

10. Ferlina R. Tahapan isolasi enzim.

http://www.refninoferlina.blogspot.com/2012/11/tahapan isolasi-enzim.html. Diunduh

tanggal 15 Desember 2014.

16