MÀNG SINH VẬT (BIOFILM) Ở VIỆT NAM - hus.vnu.edu.vn · các sự cố tràn dầu, ứng dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như các nghiên cứu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Trần Thúy Hằng

PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA

MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO

MÀNG SINH VẬT (BIOFILM) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Trần Thúy Hằng

PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA

MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO

MÀNG SINH VẬT (BIOFILM) PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2011

Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng

Trường Đại học KHTN i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.

Nguyễn Quang Huy, người thầy mẫu mực đã tận tụy hướng dẫn và truyền đạt kiến

thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như luôn quan tâm, động viên

và giúp đỡ chúng tôi trong cuộc sống.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm

huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho chúng tôi trong suốt khóa học này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh, chị, em trong Phòng

Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công

nghệ Protein và Enzyme; Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Bộ môn Vi sinh vật

học đã nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đặc biệt là chồng

tôi đã luôn ở bên động viên, chia sẻ khó khăn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và

thực hiện luận văn này.

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2011

Học viên cao học

Trần Thúy Hằng


Trường Đại học KHTN ii

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ................................................................................................................1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................2

1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm)................................................................2

1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật..................5

1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên..............5

1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật .................................................................7

1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật............................................8

1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật .......................................11

1.3.1 Mạng lưới ngoại bào.....................................................................................11

1.3.2 Các thành phần khác .....................................................................................13

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của màng sinh vật ........15

1.4.1 Các giai đoạn tạo thành màng sinh vật ..........................................................15

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật ................................20

1.4.3 Điều hòa quá trình hình thành màng sinh vật ................................................22

1.5 Nghiên cứu ứng dụng màng sinh vật................................................................24

1.5.1 Ứng dụng màng sinh vật trong việc xử lý nước thải ......................................24

1.5.2 Ứng dụng màng sinh vật trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại ................25

1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác ................................................................26

Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................29

2.1 Nguyên liệu .....................................................................................................29

2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu........................................................................29

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định....................................................................................29

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ..........................................................30

2.2.1 Môi trường nuôi cấy .....................................................................................30

2.2.2 Máy móc, thiết bị..........................................................................................31

2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................31

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn ....................................................................31


Trường Đại học KHTN iii

2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.......................................................32

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng

vi sinh vật..............................................................................................................32

2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật...................................................33

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt...........................35

2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn...............................................35

2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram ...........................................................................36

2.3.8 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét

..............................................................................................................................37

2.3.9 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA...............................37

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................39

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật ......39

3.1.1 Phân lập vi sinh vật.......................................................................................39

3.1.2 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng phân lập.................40

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo màng sinh vật của các chủng phân lập..........42

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................................................42

3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường .....................................................................43

3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon .......................................................................44

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ............................................................................46

3.2.5 Ảnh hưởng của giá thể ..................................................................................47

3.3 Một số đặc tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật phân lập ..............50

3.3.1 Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt.............................................................50

3.3.3 Đặc điểm hình thái........................................................................................53

3.3.4 Phân loại các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên gen 16S rDNA .................55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................59

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................60

PHỤ LỤC..............................................................................................................69


Trường Đại học KHTN iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi

sinh vật phân lập....................................................................................................44

Bảng 2: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi

sinh vật phân lập....................................................................................................45

Bảng 3: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi

sinh vật phân lập....................................................................................................47

Bảng 4: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu ......................52


Trường Đại học KHTN v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông qua mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ..............................................3 Hình 2. Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên.................4 Hình 3. Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 ..........................................................................................................................5 Hình 4. Một số ví dụ về màng sinh vật ....................................................................8 Hình 5. Mô hình phát triển của màng sinh vật .......................................................16 Hình 6. Khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch ..........39 Hình 7. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng miến Lại Trạch ...............................................................................40 Hình 8. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia..............................................................................41 Hình 9. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng nghề bún Phú Đô............................................................................42 Hình 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh vật từ các chủng phân lập.................................................................................................................43 Hình 11. Màng nổi của 4 chủng vi sinh vật sau 5 ngày nuôi cấy ............................48 Hình 12. Màng sinh vật trên bề mặt nhựa ..............................................................48 Hình 13. Cấu trúc màng sinh vật của các chủng phân lập ......................................49 Hình 14. Khả năng nhũ tương hóa dầu ăn của các chủng vi sinh vật ......................51 Hình 15. Hình thái khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học .54 Hình 16. Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn trong màng sinh vật ........................55 Hình 17. Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA .............................................................................56 Hình 18. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA .............................................................................57


Trường Đại học KHTN vi

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

Acyl - HSL Acyl - homoserine lactone

COD Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học)

dd NTP Dideoxynucleotide

đvC đơn vị Cacbon

E24 Emulsion index (chỉ số nhũ tương hóa)

OD Optical Density (Mật độ quang học)

SDS Sodium dodecyl sulfate

SEM Scanning electron microscopy

TCA Tricarboxylic acid

TOC Total Organic Carbon

w/v Khối lượng (g)/thể tích (ml)


Trường Đại học KHTN 1

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu vi sinh vật học là mô hình nghiên cứu ưu việt để tìm hiểu bản

chất của các quá trình sống, đồng thời nó cũng đóng vai trò quan trọng trong các

lĩnh vực y học, nông nghiệp, công nghiệp và môi trường.

Tuy nhiên, trong tự nhiên vi sinh vật ít khi tồn tại dưới dạng các tế bào đơn

lẻ mà chúng thường được tìm thấy dưới dạng tập hợp các tế bào liên kết chặt chẽ

với nhau và với các bề mặt thông qua mạng lưới chất ngoại bào gọi là màng sinh vật

(biofilm).

Nghiên cứu về màng sinh vật giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát hơn về

sự tăng trưởng, phát triển và thích nghi của vi sinh vật trong mối quan hệ với nhau

cũng như với các điều kiện môi trường. Đồng thời, việc tìm hiểu về màng sinh vật

cũng giúp chúng ta có những hiểu biết sâu hơn về mối liên hệ bên trong của các tế

bào trong một màng sinh vật cũng như các cơ chế điều hòa quá trình tạo màng sinh

vật.

Nghiên cứu về màng sinh vật góp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụng cao

trong cuộc sống như tạo các công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường, xử lý

các sự cố tràn dầu, ứng dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như

các nghiên cứu trong công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm v.v… mà hiện nay tại

Việt Nam các nghiên cứu về vi sinh vật tạo màng sinh vật và ứng dụng của chúng

còn rất mới mẻ.

Chính từ những ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài:

“Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả

năng tạo màng sinh vật phân lập ở Việt Nam”.



Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm)

Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ,

muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Vi sinh vật không phải là

một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật

khác nhau và giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau [1].

Lịch sử nghiên cứu và phát triển của vi sinh vật học đã ghi nhận người có

công phát hiện ra thế giới vi sinh vật và cũng là người đầu tiên mô tả hình thái nhiều

loại vi sinh vật - Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Với việc tự chế tạo ra

trên 400 chiếc kính hiển vi, ông đã lần lượt quan sát mọi thứ có xung quanh mình,

trong đó có cả các vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà ông đã gọi là những “động

vật vô cùng nhỏ bé”. Ông là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng bám dính và

phát triển phổ biến của vi khuẩn trên bề mặt răng tạo thành các mảng bám răng, một

dạng của màng sinh vật sau này [1].

Cùng với sự ra đời của kính hiển vi quang học hoàn chỉnh vào đầu thế kỷ 19,

đặc biệt là việc chế tạo thành công chiếc kính hiển vi điện tử đầu tiên (1934) đã góp

phần tạo nên những cống hiến lớn lao của các nhà khoa học trong lĩnh vực vi sinh

vật học [1]. Năm 1936, Zobell và cộng sự [87] đã nghiên cứu cho thấy số lượng vi

khuẩn bám dính tại vị trí tiếp xúc giữa nước biển và bề mặt vật rắn lớn hơn nhiều so

với các vị trí xung quanh. Lợi ích của bề mặt chất rắn mang lại được đánh giá như

một nơi cư trú của các vi khuẩn giúp tập trung hấp thụ chất dinh dưỡng, tăng cường

hoạt động của các enzyme và hấp thụ các chất chuyển hóa. Trong những nghiên cứu

về hiệu quả của bề mặt rắn đối với hoạt tính của vi khuẩn, Zobell [86] đã chỉ ra rằng

bên cạnh việc cung cấp nơi khu trú và tập trung chất dinh dưỡng, bề mặt chất rắn

còn làm chậm sự khuếch tán của các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sự đồng hóa các

chất dinh dưỡng thông qua quá trình thủy phân trước khi chúng được hấp thụ.

Một loạt những nghiên cứu tiếp theo đó cũng đề cập đến khả năng hoạt động

và tăng trưởng đáng kể của vi sinh vật bằng cách bám dính vào một bề mặt xác



định. Nghiên cứu của Heukelekian và cộng sự [39] cho thấy giới hạn nồng độ chất

dinh dưỡng không cố định mà phụ thuộc vào tổng diện tích bề mặt tiếp xúc với môi

trường.

Jones và cộng sự [43] đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để chỉ ra

sự xuất hiện của màng sinh vật trong bộ lọc nhỏ giọt của một nhà máy xử lý nước

thải và cho thấy rằng chúng bao gồm nhiều loại, nhóm các vi sinh vật khác nhau

(dựa trên đặc điểm hình thái tế bào). Bằng cách sử dụng chất nhuộm màu

polysaccarit đặc biệt là đỏ Ruthenimum và cố định bởi Osmium tetroxide (OsO4),

các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng vật liệu chất nền bao xung quanh và kết

dính các tế bào trong cấu trúc màng sinh vật chính là polysaccarit.

Hình 1. Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông qua

mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ( 57700) [43].

Dựa trên những quan sát ở mảng bám răng và một số thí nghiệm khác, năm

1978, Costerton và cộng sự [14] đã đưa ra giả thuyết về màng sinh học: “Trong tự

nhiên, các tế bào vi khuẩn gắn kết với nhau và bám dính trên một bề mặt nhất định

nhờ hệ thống sợi glycocalyx”. Giả thuyết này đã góp phần giải thích cơ chế bám

dính của vi sinh vật trên các vật liệu vô sinh và hữu sinh và những lợi ích thu được

nhờ phương thức sinh thái thích hợp này.



Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng sinh

vật được đưa ra ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn. Hiện nay, khái niệm màng

sinh vật được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề

mặt các môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng

tạo ra [26], [56]. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trường vô sinh

hay hữu sinh và là một hiện tượng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống

hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.

Hình 2. Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên [26]

Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống

trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với

nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trưởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các

gen đặc biệt nào đó. Khả năng bám dính của vi sinh vật là một quá trình phức tạp

được điều hòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trường nuôi cấy, chất nền ngoại

bào và bề mặt tế bào [57].

Vi khuẩn bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động

cụ thể từ môi trường sống như nguồn chất dinh dưỡng và oxy. Quá trình tạo thành

màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự



Hình 3. Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 [57]

do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuất

các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóa

học và sinh học gây hại [56].

1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật

1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên

Các vi sinh vật trong tự nhiên ít khi tồn tại riêng rẽ mà thường hình thành tập

hợp quần xã vi sinh vật với một loạt các hoạt động chức năng sinh lý và sinh hóa.

Sự tạo thành màng sinh vật diễn ra tại bề mặt rắn tiếp xúc với môi trường chất lỏng.

Tại đây, các mảnh vụn hữu cơ và chất khoáng tập trung lại tạo điều kiện cho phép

các vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển thành các vi khuẩn lạc và dần hình

thành nên màng sinh vật trưởng thành [13].

Phân tích thành phần vi sinh vật của màng cho thấy sự hiện diện của vi tảo

và vi khuẩn Gallionella spp. Đặc biệt khả năng oxi hóa sắt của chủng Gallionella

spp gây kết tủa sắt trong đường ống tạo ra những thay đổi không mong muốn về độ

đục, màu sắc và mùi của nước [58]. Các chủng vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas

putrefaciens, Escherichia coli, Bacillus sp, Serratia sp cũng được phân lập. Trong

10 m 1 m



đó, nghiên cứu cho thấy chủng P. putrefaciens có khả năng tạo chất ngoại bào giúp

gắn kết các nhóm vi sinh vật với nhau để hình thành màng sinh vật [66].

Trong công nghiệp thực phẩm, khả năng bám dính của các vi sinh vật trên bề

mặt các thiết bị chế biến có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị cảm quan của

sản phẩm thực phẩm. Nghiên cứu của Sule và cộng sự [78] cho thấy chủng E. coli

O157:H7 là tác nhân gây bệnh có thể phân lập từ các mẫu thịt tươi. Bằng kỹ thuật

Real-time PCR, 13 trong số 15 gen ở chủng E. coli này được nghiên cứu cho thấy

có liên quan đến các chức năng sống như trao đổi chất, phân chia tế bào, hình thành

màng sinh học và khả năng gây bệnh.

Nghiên cứu của Kubota và cộng sự [47] về khả năng hình thành màng sinh

vật trên 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis và

Lactobacillus fructivorans đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic gây hư hỏng thực

phẩm. Đặc điểm của sự hình thành màng sinh vật ở các chủng vi khuẩn này cung

cấp cho chúng ta một hướng nghiên cứu trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh

trong các sản phẩm thực phẩm.

Một trong những hướng nghiên cứu ứng dụng của màng sinh vật là kiểm soát

sinh học các tác nhân gây bệnh hại ở cây trồng. Các chủng vi khuẩn được phân lập

từ rễ cây hoặc đất trồng ở các khu vực canh tác nông nghiệp cũng cho thấy khả

năng hình thành màng sinh vật tương đối cao như: Bacillus subtilis, Agrobacterium

tumefaciens, Xylella fastidiosa, Rhizobium leguminosarum… Nghiên cứu của Fall

và cộng sự [30] cho thấy Bacillus subtilis bám dính ở rễ cây có khả năng hình thành

màng sinh vật tốt ở nồng độ K+ cao trong môi trường nuôi cấy. Bacillus subtilis

cũng có khả năng ức chế sự lây nhiễm của tác nhân gây bệnh Pseudomonas

syringae pv tomato DC3000 ở rễ cây Arabidopsis nhờ khả năng tạo thành màng

sinh vật và sản xuất surfactin [5]. Khả năng cộng sinh với mô thực vật cũng như sự

tạo thành màng sinh vật trên bề mặt chóp rễ của các chủng Agrobacterium

tumefaciens, Xylella fastidiosa [69] cho thấy sự tương tác cùng có lợi giữa thực vật

và vi khuẩn trong việc cung cấp chất dinh dưỡng và hạn chế các tác nhân gây bệnh.



Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn được thu thập từ khu vực nước thải của các

nhà máy, làng nghề cũng được phân lập nhằm tìm ra những chủng có khả năng hình

thành màng sinh vật tốt, ứng dụng trong việc xử lý nước thải và vệ sinh môi trường.

1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật

Trong tự nhiên, có thể bắt gặp và quan sát thấy màng sinh vật trong rất nhiều

môi trường khác nhau: từ môi trường tự nhiên như trên bề mặt của các viên đá nằm

dưới đáy sông suối, trên bề mặt nước của các hồ, ao tù đến các hệ thống nhân tạo

như vòi hoa sen, ống dẫn nước.

1.2.2.1 Trong môi trường tự nhiên

Môi trường nước trong các hồ, ao, sông, suối là điều kiện thuận lợi nhất cho

việc hình thành và phát triển một mạng lưới màng sinh vật. Màng sinh vật có thể

được tạo thành ngay trên bề mặt nước (khoảng tiếp xúc với không khí) để hình

thành nên dạng cấu trúc màng nổi (floating biofilm), có thể quan sát dưới dạng

những cặn hay váng của vi sinh vật trên mặt ao, hồ hay bể lọc nước.

Một dạng khác của màng sinh vật trong tự nhiên được tìm thấy là khi các vi

sinh vật bám dính trên bề mặt vật liệu rắn như các viên sỏi, đá trong nước tạo thành

dạng màng sinh vật bề mặt (hình 4a).

1.2.2.2 Trong các hệ thống thiết bị nhân tạo

Màng sinh vật cũng tồn tại trên bề mặt các thiết bị nhân tạo được cấu tạo chủ

yếu từ vật liệu vô sinh (nhựa, thủy tinh, thép …) như trên vỏ của tàu thuyền, trong

lòng các ống dẫn nước, ống dẫn dầu hay dẫn khí đốt, trên sàn các quầy hàng thực

phẩm.

Trong các thiết bị, đồ dùng gia đình cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật

khi các vi sinh vật bám dính trong hệ thống vòi hoa sen, bồn rửa mặt.

1.2.2.3 Trong cơ thể sinh vật sống

Ngay trong cơ thể sống con người cũng xuất hiện màng sinh vật chủ yếu là

của những loài vi sinh vật gây bệnh. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt



lớp tế bào biểu mô như biểu mô ống dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng hay trên

răng tạo thành cấu trúc màng sinh vật gọi là mảng bám răng (hình 4c). Thậm chí bề

mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể như van tim, niệu quản nhân tạo cũng

có thể là vị trí tồn tại của màng sinh vật.

(a) (b) (c)

Hình 4. Một số ví dụ về màng sinh vật

(a): Màng sinh vật trên tảng đá; (b): Màng sinh vật trên bề mặt bàn chải đánh răng;

(c): Màng sinh vật của vi khuẩn sâu răng hình thành nên mảng bám răng

1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật

Sự tạo thành màng sinh vật là một hiện tượng phổ biến trong đời sống của

các vi sinh vật và trở thành phương thức giúp chúng tồn tại và phát triển trong tự

nhiên.

1.2.3.1 Bảo vệ tế bào trước những bất lợi của môi trường

Mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật cung cấp nơi khu trú và một hằng số

nội môi thích hợp cho các vi khuẩn tồn tại. Nó đóng vai trò quan trọng trong cấu

trúc và chức năng của các màng sinh vật. Chất nền ngoại bào này cũng có khả năng

ngăn chặn sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn vào trong màng nhờ hoạt tính

trao đổi anion. Điều này cũng có nghĩa là nó sẽ làm hạn chế sự khuếch tán của một

số hợp chất từ môi trường xung quanh vào trong màng sinh vật [45].

Màng sinh vật của các chủng vi sinh vật tạo màng giúp chúng kháng lại các

tác nhân là các vi khuẩn, các chất kháng sinh hay chất sát trùng. Cơ chế bảo vệ của

màng sinh vật có thể là: ngăn chặn sự xâm nhập của các chất này vào trong màng



sinh vật; thay đổi tốc độ tăng trưởng của các vi sinh vật trong màng hay các biến đổi

chức năng sinh lý khác thông qua các phương thức tăng trưởng. Đặc tính này phần

lớn phụ thuộc vào tính chất của cả mạng lưới biofim và tác nhân kháng khuẩn và

thường thể hiện rõ với các chất kháng sinh thuộc nhóm ưa nước và tích điện dương

như các aminoglycoside [36].

Mạng lưới chất ngoại bào cũng được ghi nhận là có khả năng giúp tế bào

chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo

vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trường như sự thay đổi độ pH, bức xạ

tia cực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn [45]. Thành phần chính của màng sinh

vật chiếm tới 97% là nước. Khả năng giữ nước cao của mạng lưới ngoại bào thông

qua các liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo vệ màng chống lại sự khô hạn

trong môi trường tự nhiên. Quá trình hấp thụ các nguyên tố kim loại nặng được biết

đến do tác dụng của nhóm mang điện tích âm trong mạng lưới chất ngoại bào như

nhóm phosphate, lưu huỳnh, hay nhóm chức axit [56].

1.2.3.2 Thu nhận nguồn chất dinh dưỡng từ môi trường

Môi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh vật cung cấp phương tiện trao

đổi dinh dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn, tăng

cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất

có nguy cơ độc hại [23]. Các vi khuẩn trong mạng lưới màng sinh vật thường bao

gồm nhiều quần thể vi khuẩn khác nhau. Chúng là kết quả của mối liên hệ giữa các

loài sinh vật đồng trao đổi chất. Mối liên kết chặt chẽ này tạo điều kiện thuận lợi

cho sự trao đổi, loại bỏ và phân phối các sản phẩm trao đổi chất trung gian giữa các

loài.

Màng sinh vật cung cấp một môi trường lý tưởng cho sự thiết lập mối quan

hệ hợp dưỡng giữa các loài vi sinh vật. Hợp dưỡng là một trường hợp đặc biệt của

mối quan hệ cộng sinh, trong đó hai loài (hoặc hai chủng) vi sinh vật khác nhau phụ

thuộc lẫn nhau về mặt trao đổi chất để sử dụng một số cơ chất nhất định, đặc biệt là

cho các yêu cầu về năng lượng [31].



1.2.3.3 Thu nhận những đặc tính di truyền mới

Quá trình trao đổi gen (horizontal gene transfer) đóng vai trò quan trọng

trong sự tiến hóa và đa dạng di truyền của cộng đồng các vi sinh vật trong tự nhiên.

Trao đổi gen được biết đến là sự di chuyển vật liệu di truyền giữa các loài vi sinh

vật khác nhau. Hiện tượng này xảy ra trong vi khuẩn là cách kết hợp trực tiếp DNA

tự do của các tế bào vi khuẩn. Nhờ việc thu nhận những đặc tính di truyền mới giúp

cộng đồng vi sinh vật trong màng tiếp nhận được những gen cần thiết tham gia tích

cực trong hoạt động sống của màng sinh vật [45].

Tầm quan trọng của quá trình trao đổi gen đã được ứng dụng trong những

nghiên cứu về khả năng kháng thuốc của vi sinh vật, kỹ thuật di truyền tạo nên

chủng vi sinh vật mới trong các ngành công nghiệp. Trong đó cơ chế trao đổi gen

phổ biến ở vi sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp. Tuy nhiên

khi các vi khuẩn trong tự nhiên tồn tại dưới dạng màng sinh vật, liên kết với nhau

thông qua mạng lưới chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ

đó vi khuẩn trong màng sinh vật có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác

[26].

1.2.3.4 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài

Màng sinh vật được hình thành nhờ sự hợp tác cùng chung sống của nhiều

loài vi sinh vật tạo nên một quần xã vi sinh vật có cấu trúc không gian phức tạp. Do

đó, các loài sinh vật cùng tồn tại trong màng sinh vật thích nghi với những điều kiện

dinh dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong màng. Ngoài

ra, khả năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các vi sinh

vật tận dụng được tối đa nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hỗ trợ lẫn nhau

theo hướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất [4].

Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong màng sinh vật cũng có tác động lớn

đến chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên. Sự phối hợp của nhiều

nhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải một hợp chất

hữu cơ và việc cùng cư trú trong màng sinh vật của các nhóm vi sinh vật sẽ góp

phần thúc đẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn [45].



1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật

Quá trình tạo màng sinh vật cần có sự tham gia của nhiều yếu tố để hình

thành nên cấu trúc đặc trưng của màng. Tỷ lệ và mức độ bám dính của tế bào vi

khuẩn vào một bề mặt phụ thuộc vào đặc tính kỵ nước của bề mặt tế bào, sự hiện

diện của lông roi, tiêm mao và chất kết dính, ngoài ra còn có protein màng tế bào và

sự sản suất mạng lưới chất ngoại bào [26]. Thêm vào đó, các bằng chứng thực

nghiệm cho thấy rằng sự phát triển chủ yếu của một màng sinh vật có thể được điều

hòa bởi mật độ tế bào - phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của gen được điều khiển

bởi các phân tử tín hiệu ngoại bào.

1.3.1 Mạng lưới ngoại bào

Mạng lưới chất ngoại bào chứa hàm lượng cacbon chiếm 50 - 90% tổng

lượng cacbon hữu cơ trong màng sinh vật và được xem như là vật liệu chất nền

chính của màng sinh vật.

Mạng lưới ngoại bào có thể khác nhau về một số tính chất vật lý và hóa học

nhưng nó bao gồm chủ yếu là các polysaccarit. Một số polysaccarit là trung tính hay

mang điện tích âm, như trường hợp chất ngoại bào ở vi khuẩn gram âm. Sự hiện

diện của axit uronic (ví dụ như D - glucuronic, D - galacturonic, và axit

mannuronic) hoặc liên kết xeton trong phân tử axit pyruvic đưa đến tính chất của

ion âm [79]. Tính chất này rất quan trọng bởi nó cho phép các phân tử polysaccarit

ngoại bào liên kết được với các ion dương hóa trị II như Ca2+ và Mg2+. Từ đó hình

thành liên kết chéo giữa các sợi polymer và tạo ra lực liên kết lớn hơn trong cấu trúc

màng sinh vật. Trong trường hợp của một số vi khuẩn gram dương như

Staphylococcus, thành phần hóa học của mạng lưới ngoại bào có thể hoàn toàn khác

nhau và gồm chủ yếu là các ion dương. Hussain và cộng sự [41] đã phát hiện ra

rằng màng nhầy của tụ cầu khuẩn tạo coagulase - một loại enzyme cho phép chuyển

đổi fibrinogen thành fibrin gây đông máu - âm tính có chứa hỗn hợp axit teichoic và

một lượng nhỏ protein.



Mạng lưới ngoại bào có thể là ưa nước do kết hợp với một lượng lớn các

phân tử nước thông qua liên kết hydro hoặc cũng có thể là kỵ nước. Tuy nhiên,

phần lớn các dạng chất ngoại bào bao gồm cả ưa nước và kỵ nước. Đồng thời mạng

lưới ngoại bào cũng có thể thay đổi độ hòa tan của nó [26].

Sutherland [79] đã ghi nhận hai thuộc tính quan trọng của mạng lưới ngoại

bào. Thứ nhất, thành phần và cấu trúc của các polysaccarit xác định cấu tạo chính

của mạng lưới ngoại bào. Ví dụ, cấu trúc bộ khung của mạng lưới ngoại bào ở nhiều

vi khuẩn chứa nhiều liên kết 1,3 hoặc 1,4--D-fructan và có xu hướng làm cho nó

cứng chắc hơn, ít bị biến dạng và trong một số trường hợp trở nên kém hòa tan hoặc

không hòa tan. Các liên kết khác trong phân tử polysaccarit như liên kết 1,2 hoặc

1,6--D-glucan giúp cấu trúc mạng lưới ngoại bào trở nên linh hoạt hơn. Thứ hai,

mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật thường không đồng nhất, có thể thay đổi

theo không gian và thời gian.

Leriche và cộng sự [53] đã sử dụng liên kết đặc hiệu của lectin với một loại

đường đơn để đánh giá sự phát triển của màng sinh vật ở các vi sinh vật khác nhau.

Kết quả nghiên cứu cho thấy các sinh vật khác nhau sản xuất một lượng chất ngoại

bào khác nhau và lượng chất ngoại bào này tăng lên theo thời gian. Mạng lưới chất

ngoại bào có thể liên kết với các ion kim loại, các cation hóa trị hai hay các đại phân

tử khác như protein, DNA, lipit… Điều kiện dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy

cũng được chứng minh là có ảnh hưởng đến sự sản xuất chất ngoại bào. Nghiên cứu

cho thấy sự dư thừa nguồn carbon sẵn có và sự hạn chế của nitơ, kali, phospho

trong môi trường nuôi cấy đã thúc đẩy quá trình tổng hợp mạng lưới ngoại bào [79].

Sự tăng trưởng chậm của vi khuẩn cũng sẽ làm tăng cường sản xuất chất

ngoại bào. Sự tích nước trong mạng lưới chất ngoại bào là rất lớn, do đó nó ngăn

chặn sự khô hạn của màng sinh vật trong tự nhiên. Mạng lưới chất ngoại bào cũng

góp phần vào đặc tính kháng kháng sinh của màng sinh vật bằng cách cản trở sự

vận chuyển lượng chất kháng sinh qua màng, có lẽ là thông qua việc liên kết trực

tiếp với các chất này [25].



1.3.2 Các thành phần khác

1.3.2.1 Vai trò của lông roi, tiêm mao và các phân tử bám dính

Những nghiên cứu trước đây đã đưa ra mô hình hóa học đơn giản dựa trên

nồng độ chất điện phân và lực liên kết van der Waals để giải thích sự bám dính của

vi khuẩn lên bề mặt [55]. Nhưng trong những nghiên cứu gần đây, chủ yếu dựa trên

sự phát sinh đột biến của gen nhảy, lại cho thấy chính các thành phần cấu trúc của tế

bào vi khuẩn như lông roi, tiêm mao và các phân tử bám dính đóng vai trò quan

trọng trong sự xâm nhiễm của vi khuẩn lên một bề mặt nào đó.

Chức năng chính của lông roi trong sự hình thành màng sinh vật là giúp cho

vi sinh vật di chuyển trong môi trường nước tốt hơn, tạo nên những tương tác ban

đầu giữa bề mặt và tế bào. Thí nghiệm của De Flaun, De Weger cùng các cộng sự

[22], [24] đã chứng minh sự thiếu vắng của lông roi làm suy giảm khả năng xâm

nhiễm của Pseudomonas fluorescens lên rễ cây khoai tây, lúa mì và làm giảm độ

bám dính tế bào của P. aeruginosa và P. fluorescens lên bề mặt polystyrene [63].

Tương tự, nghiên cứu trên các chủng Vibrio cholerae và Escherichia coli đột biến

thiếu lông roi đã cho thấy không có sự hình thành màng sinh vật như ở các dạng

hoang dại của chúng vẫn thực hiện trên bề mặt nhựa polyvinylchloride (PVC) [84].

Tiêm mao và các phân tử bám dính liên kết với tiêm mao cũng có vai trò

quan trọng trong sự bám dính và xâm nhiễm bề mặt. Nghiên cứu của Schmoll và

cộng sự [73] trên chủng vi khuẩn gây bệnh E. coli cho thấy biểu hiện của gen sfaA,

một gen mã hóa cho các phân tử bám dính tiêm mao, được điều hòa tăng cường khi

có sự tiếp xúc của vi khuẩn với bề mặt. Ở E. coli, khả năng bám dính bề mặt giảm

đi khi có sự đột biến ở gen sinh tổng hợp curlin csgA và gen sinh tổng hợp tiêm mao

type I fim H, một loại tiêm mao chứa các phân tử đặc hiệu với mannose [68]. Tương

tự, đột biến gen tổng hợp tiêm mao hemagglutinin có độ nhạy cao với mannose ở

V. cholerae cũng làm giảm độ bám dính bề mặt [84].

Như vậy, có thể nói rằng các loài vi sinh vật có lông roi và tiêm mao cũng sẽ

có ưu thế hơn trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định - nơi có điều



kiện thuận lợi cho việc hình thành màng sinh vật, đồng thời giúp cho việc bám dính

ban đầu của tế bào với bề mặt tốt hơn [26].

1.3.2.2 Vai trò của protein màng

Protein màng tế bào được ghi nhận là có ảnh hưởng đáng kể trong sự bám

dính cũng như trong giai đoạn phát triển sớm của màng sinh vật. Nghiên cứu cho

thấy sự gắn kết của E. coli lên bề mặt vô sinh dẫn đến những thay đổi trong thành

phần protein ngoại vi của màng tế bào hay chính là những tương tác vật lý của tế

bào với bề mặt đã làm biến đổi đặc tính bề mặt của lớp màng ngoại bào [65].

Đột biến protein màng tế bào, bao gồm protein liên kết với Ca2+, hemolysin,

protein vận chuyển và protein bơm K+, đã gây nên khiếm khuyết trong quá trình

bám dính của P. putida KT 2440 lên hạt ngô giống [29].

Nghiên cứu của Whiteley và cộng sự [85] ở Pseudomonas aeruginosa cho

thấy biểu hiện của 2 gen tatA và tatB cùng mã hóa cho protein vận chuyển tolA,

đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc lớp lipopolysaccarit của màng. Một nghiên

cứu khác của Sauer và cộng sự [72] cũng chứng minh rằng protein porin E1 và

protein vận chuyển ABC cũng được biểu hiện tăng cường ở các tế bào màng sinh

vật P. aeruginosa.

1.3.2.3 Vai trò của sự cảm ứng mật độ tế bào

Tín hiệu giữa các tế bào với nhau gần đây đã được chứng minh là đóng vai

trò quan trọng trong sự bám dính cũng như tách rời của tế bào ra khỏi màng sinh

vật.

Xie và cộng sự [85] đã chỉ ra rằng mảng bám răng là một màng sinh học

phức tạp bao gồm hơn 30 chi đại diện cho hơn 500 loài vi sinh vật khác nhau. Mặc

dù phức tạp nhưng màng sinh vật này có tổ chức rất cao. Những khuẩn lạc đầu tiên

hình thành là các vi khuẩn Gram dương, chủ yếu là liên cầu khuẩn, kế đến là một

loạt các loài vi sinh vật khác và sự xuất hiện lên đến đỉnh điểm trong sự hình thành

màng là nhóm vi khuẩn Gram âm như Porphyromonas gingivalis chiếm ưu thế.

Nghiên cứu cho thấy những khuẩn lạc ban đầu của Streptococcus gordonii cung cấp



chất nền bám dính cho Porphyromonas gingivalis thông qua sự tương tác của các

cặp thụ thể bám dính, được biết đến là các phân tử protein FimA [11]. Ngược lại,

tương tác phân tử giữa các tế bào S. cristatus và P. gingivalis đã kìm hãm sự biểu

hiện của gen fimA và kết quả là P. gingivalis không thể tiếp tục bám dính và sẽ

được tách rời khỏi màng sinh vật [48].

Davies và cộng sự [20] đã đưa ra hai hệ thống tín hiệu ngoại bào khác nhau ở

P. aeruginosa có liên quan đến sự hình thành màng sinh vật, đó là lasR - las I và

rhlR - rhlI. Ở mật độ quần thể tế bào đủ lớn, các tín hiệu này đạt đến nồng độ cần

thiết để kích hoạt các gen liên quan đến sự khác biệt màng sinh vật. Các dạng đột

biến không thể tạo ra cả hai tín hiệu sẽ hình thành một màng khác nhiều so với

màng sinh vật của dạng hoang dại như màng mỏng hơn, các tế bào được đóng gói

dày đặc hơn và cấu trúc của màng cũng chưa hoàn thiện.

Vai trò của tín hiệu nội bào trong màng sinh vật của nhiều loài khác biệt

đáng kể so với màng sinh vật của một loài. Những tín hiệu này được phân loại như

là một sản phẩm truyền tin tích cực hay thụ động làm thay đổi trạng thái của các tế

bào vi khuẩn lân cận. Chúng bao gồm các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn, các

phân tử acyl - homoserine lactone, vật chất di truyền như DNA hay RNA, v.v…Các

tín hiệu này có thể làm thay đổi sự phân bố của các loài cụ thể trong màng sinh vật,

thay đổi sự biểu hiện protein trong các tế bào lân cận, đưa đến những đặc điểm di

truyền mới ở các tế bào lân cận và kết hợp các vi khuẩn với nhau trong màng sinh

vật [83].

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của màng sinh vật

1.4.1 Các giai đoạn tạo thành màng sinh vật

Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học

phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà

khoa học đã đưa ra một mô hình cấu trúc màng sinh học cơ bản [16]. Trong mô

hình này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và được bao quanh bởi một

mạng lưới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có



trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo

nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó, dịch tế

bào có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất

dinh dưỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải [76].

Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống như một quá trình phát triển của vi

sinh vật và cần phải trải qua một số bước. Cơ chế phân tử giữa các vi sinh vật có thể

khác nhau nhưng các giai đoạn trong sự phát triển của màng sinh vật thì luôn được

bảo tồn. Quá trình này lần lượt bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi sinh vật trôi

nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trưởng và liên kết các tế bào thành vi khuẩn lạc,

sự tạo thành màng sinh vật trưởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời

của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (hình 5).

Hình 5. Mô hình phát triển của màng sinh vật [76]

1.4.1.1 Giai đoạn 1: Giai đoạn gắn kết thuận nghịch

Trước khi vi sinh vật bám dính lên bề mặt, các phân tử hữu cơ, protein,

glycoprotein đã tiếp xúc và hình thành nên một màng điều kiện, đó là một khu vực

giàu dinh dưỡng giúp thuận lợi cho sự trao đổi chất của các tế bào vi sinh vật [8].

Gắn kết Gắn kết Hình thành Hình thành Tách rời thuận nghịch không thuận các vi khuẩn màng sinh vật nghịch lạc trưởng thành



Khi bề mặt điều kiện được hình thành, các thuộc tính của nó thay đổi để thu hút các

vi sinh vật. Sự gắn kết của các vi sinh vật lên bề mặt nhờ lực liên kết van der Waals,

lực hút tĩnh điện, tương tác ưa nước và các tương tác đặc biệt khác, hoặc bởi một sự

kết hợp các liên kết này, tùy theo mức độ gần gũi của các vi sinh vật với bề mặt

bám dính. Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử

dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ

được bao bọc trong một mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [62].

Tuy nhiên, các tế bào này chưa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh vật và

có thể rời bề mặt để tiếp tục đời sống phù du.

1.4.1.2 Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch

Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không

những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trưởng để hình thành

một màng sinh vật hoàn chỉnh. Vì vậy, giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất

ngoại bào nhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa

tế bào và giá thể [60].

Các nghiên cứu trên gen chỉ thị cho thấy biểu hiện của gen sinh tổng hợp

alginate ở Pseudomonas aeruginosa algC và algD được điều hòa tăng lên trong 15

phút ngay sau khi có sự bám dính đầu tiên của vi khuẩn lên một bề mặt. Mặc dù sự

sản xuất alginate cũng được xem như là phương thức để hình thành nên bộ khung

cấu trúc và hóa học của màng sinh vật [77], nhưng những nghiên cứu gần đây lại

chứng minh rằng chính sự hiện diện của mạng lưới chất ngoại bào chứ không phải

alginate là thực sự cần thiết cho sự hình thành màng sinh vật của P.aeruginosa [54].

Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn bám dính

không thuận nghịch được thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi bám dính.

Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi được đánh giá là quan trọng

trong bước đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận động co rút

được chỉ ra là cần thiết cho sự trưởng thành của màng sinh vật trong điều kiện tĩnh.

Cụ thể, nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong màng



sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tương tác giữa các vi khuẩn với bề

mặt để hình thành nên các nhóm tế bào, qua đó giúp tăng cường mức độ bám dính

với bề mặt [62].

1.4.1.3 Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới vi khuẩn lạc

Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục được tạo ra bởi các tế bào để liên

kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi

khuẩn lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể

là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trường. Kết quả là mật độ tế bào trong một

màng sinh vật cũng như lượng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một mạng

lưới màng sinh vật dần được hình thành [76].

1.4.1.4 Giai đoạn 4: Hình thành một màng sinh vật hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình

trưởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Trong suốt quá trình này, sự phân chia trực

phân của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp

các tế bào phân chia để lan rộng và phát triển đầy lên từ các điểm gắn kết để hình

thành các vi khuẩn lạc hay các cụm tế bào [40].

Bản chất của bề mặt là nơi bám dính của các vi khuẩn lạc và chính các điều

kiện vật lý và hóa học của môi trường sẽ quyết định cơ chế hình thành màng sinh

vật nào là chiếm ưu thế. Sự trưởng thành của màng sinh vật dẫn đến sự kế tiếp của

các cấu trúc dạng nấm hay dạng cột xen kẽ với các kênh chứa đầy dịch, và một khi

phát triển đến đầy đủ thì màng sinh vật sẽ cho thấy những mô hình biến đổi trong sự

tăng trưởng của vi khuẩn cũng như sự tương tác sinh lý và hiệu quả trao đổi chất

[82].

1.4.1.5 Giai đoạn 5: Tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dưỡng

của môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các

phân tử này được giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dưỡng,

sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH,



nguồn cung cấp cacbon, oxy [61]. Trong một số trường hợp, khi màng sinh vật đạt

đến khối lượng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách

rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc [46].

Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng quá trình tách rời là hết sức

phức tạp. Sự khác biệt về mặt tế bào và hoạt tính của nó tại các trung tâm của một

cấu trúc màng sinh vật trưởng thành dẫn đến sự phân tách tế bào từ bên trong cấu

trúc màng, chuyển sang lấp đầy các khoảng trống của một màng sinh vật khác chưa

hoàn thiện. Cơ chế tách rời của màng sinh vật liên quan đến sự phân hủy các tế bào

bên trong cấu trúc của nó. Enzyme lyase phân hủy polysaccarit đóng vai trò quan

trọng trong sự phân rã màng sinh vật ở nhiều loài vi sinh vật bằng cách phân hủy

mạng lưới chất nền ngoại bào được tạo ra từ các tế bào [44].

Boyd và Chakarabarty [9] đã chứng minh sự cảm ứng biểu hiện của enzyme

lyase phân giải alginate ở P. aeruginosa làm giảm đáng kể tổng lượng sản xuất

alginate, tương ứng với sự tăng số lượng tế bào bị phân tách. Điều này giúp các nhà

nghiên cứu khẳng định vai trò của enzyme phân giải alginate ở dạng P. aeruginosa

hoang dại có thể là nguyên nhân giải phóng các tế bào khỏi các bề mặt rắn hay các

màng sinh vật của chúng, làm phát tán những vi sinh vật vào trong môi trường nuôi

cấy.

Quá trình tách rời cũng có nguyên nhân bởi các lực tương tác vật lý. Brading

và cộng sự [10] đã nhấn mạnh tầm quan trọng của các tương tác vật lý trong sự tách

rời, bao gồm 3 quá trình chính đó là: sự xói mòn hay phân cắt (liên tục loại bỏ

những phần nhỏ của màng sinh vật), sự bóc tách (loại bỏ nhanh chóng và với lượng

lớn) và sự bào mòn (sự tách rời do va chạm của lượng lớn các hạt phân tử chất lỏng

với màng sinh vật). Characklis [12] nhận thấy rằng tỷ lệ xói mòn tăng lên cùng với

độ dày màng sinh vật và dòng chất lỏng tại bề mặt giao diện với màng sinh vật mà ở

đó màng dày lên. Với sự gia tăng của tốc độ dòng chảy, thủy động lực học của lớp

ranh giới giảm, dẫn đến sự pha trộn và nhiễu loạn ở gần bề mặt màng sinh vật. Sự

bóc tách xảy ra ngẫu nhiên hơn sự xói mòn và được cho là kết quả của sự suy giảm

chất dinh dưỡng và oxy trong cấu trúc màng sinh vật.



1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật

Trong tự nhiên, màng sinh vật có thể được hình thành trên các bề mặt khác

nhau bao gồm cả các mô sống, các thiết bị, dụng cụ y tế, các hệ thống ống nước cấu

tạo từ các vật liệu khác nhau. Do vậy, để chuyển từ dạng sống tự do sang dạng cấu

trúc màng sinh vật đòi hỏi một loạt những điều kiện nhất định. Trong đó, ba yếu tố

chính quy định nên sự hình thành màng sinh vật bao gồm:

Tính chất bề mặt giá thể

Điều kiện môi trường

Đặc tính tế bào của các chủng vi sinh vật [45]

1.4.2.1 Tính chất bề mặt giá thể

Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế

bào bởi vậy mỗi loài vi khuẩn chỉ hình thành màng sinh vật trên một số loại bề mặt

với tính chất nhất định.

Sự phát triển của các tế bào bên trong màng sinh vật đã được chứng minh là

có tăng lên khi tăng mức độ thô ráp của bề mặt. Characklis và cộng sự [12] đã ghi

nhận mức độ bám dính của khuẩn lạc vi sinh vật gia tăng khi các bề mặt càng ghồ

ghề. Điều này được giải thích là do ở bề mặt thô nhám, lực tương tác giữa các tế

bào với bề mặt giảm đi và diện tích tiếp xúc được tăng lên đáng kể so với các bề

mặt trơn nhẵn.

Tính chất hóa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ và

mức độ bám dính của tế bào lên bề mặt. Hầu hết các nghiên cứu cho thấy rằng các

vi sinh vật gắn kết với một bề mặt kị nước, không phân cực như Teflon và nhựa

nhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt một vật liệu ưa nước như thủy tinh hay kim loại

[7].

Bên cạnh đó, diện tích bề mặt là một trong những yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến sự phát triển của màng sinh vật. Theo nguyên tắc, diện tích bề mặt càng

lớn càng làm tăng khả năng tiếp xúc với tế bào, qua đó tạo điều kiện cho việc bám

dính lên bề mặt giá thể. Các hệ thống ống dẫn khác với hầu hết các môi trường tự



nhiên (ao hồ, sông …) là thường có một diện tích bề mặt khá lớn tạo điều kiện cho

việc tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn và bề mặt.

1.4.2.2 Điều kiện môi trường

Các đặc trưng hóa lý của môi trường như nhiệt độ, pH, mức độ dinh dưỡng,

nồng độ các ion, đóng một vai trò quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ gắn kết của vi

sinh vật lên bề mặt.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng bám dính của vi sinh vật và sự hình

thành màng sinh vật cũng chịu ảnh hưởng của nhịp điệu mùa ở các lưu vực nước

khác nhau [27]. Hiệu ứng này có được là do ảnh hưởng của nhiệt độ nước theo mùa

lên các thông số tăng trưởng của vi sinh vật. Fletcher và cộng sự [32] cũng đã

chứng minh sự gia tăng nồng độ của một số cation (Na+, Ca2+, Fe3+, La+) ảnh hưởng

đến khả năng bám dính của chủng Pseudomonas fluorescens lên bề mặt thủy tinh,

bằng cách làm giảm lực tương tác giữa các tế bào vi khuẩn với bề mặt kính. Nghiên

cứu của Cowan và cộng sự [17] cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ

thuận với số lượng gắn kết của các tế bào vi khuẩn lên bề mặt.

Việc tạo màng sinh vật có thể coi như là một cách thức tồn tại, phát triển của

vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của môi trường. Cơ chế của quá

trình này có thể được hiểu như sau: khi lượng chất dinh dưỡng bao gồm nguồn

cacbon, nitơ bị giảm sút thì các vi sinh vật sống trôi nổi trong môi trường nước sẽ

có xu hướng tập trung đến nơi có nguồn dinh dưỡng tích tụ. Khi các hợp chất hữu

cơ tích tụ lại trên bề mặt, chúng sẽ thu hút các vi khuẩn, tảo và động vật nguyên

sinh đến, theo thời gian sẽ phát triển thành một màng sinh vật.

1.4.2.3 Đặc tính của tế bào

Mặc dù màng sinh vật là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong môi

trường tự nhiên nhưng không phải vi sinh vật nào cũng có khả năng hình thành

màng sinh vật. Các đặc tính của tế bào bao gồm các cấu trúc phụ trợ như lông roi,

tiêm mao, khả năng di động, bám dính, khả năng tạo các chất ngoại bào (protein,

polysaccarit), cảm biến mật độ (quorum sensing) ảnh hưởng lớn đến việc hình thành



màng sinh vật. Thí nghiệm so sánh giữa hai chủng Pseudomonas fluorescens của

Davey và cộng sự [19] đã cho thấy chủng di động có khả năng hình thành màng

sinh vật nhanh hơn so với chủng không di động.

Tuy nhiên, một số loài không có phần phụ trợ tế bào nhưng vẫn có khả năng

hình thành màng sinh vật mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp các chất ngoại bào

như lipopolysaccarit, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng giáp (capsule), màng

nhày (slime) bao quanh tế bào. Đặc tính này tạo tính tự kết dính cho tế bào và chủ

yếu có trong những loài vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus mutants,

Streptococcus salivarius, Xanthomonas, Bacillus anthracis [15].

1.4.3 Điều hòa quá trình hình thành màng sinh vật

Quá trình chuyển từ dạng sống phù du sang kiểu tăng trưởng bám dính trên

bề mặt thực hiện theo một con đường phức tạp và cần một cơ chế điều hòa kiểm

soát sự hoạt động của các gen biểu hiện sự hình thành màng sinh vật. Bằng kỹ thuật

di truyền và sinh học phân tử kết hợp với phương pháp kính hiển vi tiên tiến đã góp

phần làm sáng tỏ cơ chế điều hòa và các yếu tố cơ bản của quá trình hình thành

màng sinh vật.

1.4.3.1 Con đường dẫn truyền tín hiệu hai thành phần

Sự bám dính của tế bào với bề mặt phụ thuộc vào cả yếu tố cơ hội (tức là khả

năng có hay không sự tiếp xúc trực tiếp của vi khuẩn với bề mặt) và cả sự tương tác

thuận lợi giữa tế bào và bề mặt tiếp xúc để có thể vượt qua lực đẩy giữa hai bề mặt

[35].

Mặc dù sự tiếp xúc ban đầu giữa tế bào vi sinh vật và bề mặt không nhất thiết

đòi hỏi sự điều hòa, nhưng các bằng chứng trong nghiên cứu đã cho thấy rằng sự

hình thành những tương tác ổn định giữa tế bào và bề mặt được điều hòa bởi hệ

thống tín hiệu hai thành phần. Hệ thống này bao gồm hai protein: một protein cảm

biến kinase đóng vai trò nhận biết tín hiệu từ môi trường, tự động phosphoryl hóa,

sau đó kích hoạt thành phần protein còn lại, đó là một phân tử điều hòa phản ứng.

Phân tử điều hòa phản ứng này hoạt động như là một nhân tố hoạt hóa gen, kích



thích sự phiên mã cho phép vi khuẩn nhanh chóng thích nghi với các điều kiện của

môi trường [52].

1.4.3.2 Các yếu tố điều hòa sự trao đổi Cacbon

Trong hệ gen của một số vi khuẩn có chứa gen mã hóa cho một nhân tố điều

hòa trao đổi nguồn cacbon cần thiết cho sự hình thành màng sinh vật. Ở

P.aeruginosa là gen crc còn ở E.coli là csrA. Nghiên cứu của O’Toole và cộng sự

[61] chứng minh rằng gen crc được kích hoạt bởi các sản phẩm trung gian của chu

trình TCA, là nguồn cacbon ưa thích của P. aeruginosa. Bên cạnh đó, nhân tố Crc

còn hoạt hóa sự phiên mã của gen pilA, mã hóa cho các tiểu đơn vị cấu trúc cần

thiết cho quá trình sinh tổng hợp tiêm mao type IV. Đây là một bước giúp các tế bào

nối kết với nhau để hình thành các vi khuẩn lạc, từ đó tạo thành màng sinh vật.

Nghiên cứu của Jackson và cộng sự [42] về sự ảnh hưởng của nhân tố CsrA

lên sự hình thành màng sinh vật cho thấy: Khác với chủng P. aeruginosa, sự gián

đoạn trong biểu hiện của gen csrA làm tăng khả năng hình thành màng sinh vật hơn

so với chủng hoang dại. Tác dụng chính của nhân tố CsrA được biết đến chỉ như là

một chất điều hòa sự chuyển hóa glycogen - nguồn cacbon chính trong giai đoạn

tổng hợp các yếu tố cần thiết như tiêm mao và các chất bám dính trong quá trình

hình thành màng sinh vật. Cho nên một sự tăng cường quá mức CsrA có thể dẫn

đến ức chế sự hình thành màng sinh vật.

1.4.3.3 Sự điều hòa phụ thuộc các giai đoạn

Trong nhiều nghiên cứu, người ta đã chứng minh được rằng nhân tố RpoS

đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của màng sinh vật. Tuy

nhiên yếu tố này lại xuất hiện không giống nhau trong các giai đoạn phát triển của

từng loài vi sinh vật. Nếu như ở E. coli, người ta thấy được sự xuất hiện của RpoS

với nồng độ thấp ở pha tăng trưởng lũy thừa và có sự tích tụ lại thì ở P. aeruginosa,

sự hiện diện của RpoS được ghi nhận ở đầu pha cân bằng [33].

Sự sản xuất RpoS được điều hòa ở nhiều mức độ khác nhau giúp tế bào đáp

ứng với các điều kiện stress của môi trường, bao gồm cả sự giới hạn về mặt dinh



dưỡng. RpoS điều chỉnh độ dày của cấu trúc màng sinh vật cho phép tế bào thu

nhận tối đa nguồn chất dinh dưỡng [75].

Khi màng sinh vật đạt kích thước đủ lớn, các tế bào trung tâm giảm hấp thụ

các chất dinh dưỡng, dẫn đến kích hoạt RpoS, là tín hiệu giúp tế bào nhận biết sự

giới hạn của nguồn chất dinh dưỡng trong màng sinh vật. Do đó, các tế bào liên kết

trong màng sinh vật được giải phóng ở dạng tế bào trôi nổi tự do di chuyển đến môi

trường mới thuận lợi hơn [76].

1.4.3.4 Cơ chế cảm biến tới hạn (Quorum sensing)

Thông tin liên lạc nội bào giữa các vi sinh vật được thực hiện chủ yếu thông

qua các sản phẩm của vi sinh vật khuếch tán từ tế bào này sang tế bào khác. Một

sản phẩm tiêu biểu cho các phân tử cảm biến tín hiệu được biết đến là acyl - HSL

[45].

Nghiên cứu trên chủng P. aeruginosa cho thấy các phân tử acyl - HSL chịu

trách nhiệm xác định sự tách biệt các khối tế bào vi sinh vật trong cấu trúc không

gian ba chiều của màng sinh vật, góp phần giữ cho cấu trúc màng sinh vật ổn định.

Các chủng P. aeruginosa đột biến không sản xuất được acyl - HSL dẫn đến các tế

bào trong màng sinh vật được đóng gói chặt chẽ với nhau và dễ dàng bị phá vỡ bởi

SDS. Acyl - HSL cũng là các phân tử trung gian trong bề mặt bám dính ở chủng

Pseudomonas fluorescens [83].

Mặc dù còn khá ít những hiểu biết về vai trò của các tín hiệu nội bào trong

màng sinh vật đa loài, song các nhà nghiên cứu tin rằng có một sự khác biệt đáng kể

giữa chúng với các màng sinh vật đơn loài [45]. Những nghiên cứu về các tín hiệu

nội bào ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật vẫn đang là một trong những

vấn đề vô cùng thú vị cần được nghiên cứu.

1.5 Nghiên cứu ứng dụng màng sinh vật

1.5.1 Ứng dụng màng sinh vật trong việc xử lý nước thải

Xử lý nước thải môi trường, nhất là trong tình hình thực tiễn hiện nay là một

vấn đề mang tính thời sự cấp thiết. Bởi lẽ xử lý nước thải không chỉ nhằm mục đích



cải thiện điều kiện vệ sinh môi trường sống của con người mà xa hơn còn nhằm duy

trì cân bằng sinh thái, tạo điều kiện phát triển bền vững lâu dài cho loài người. Hiện

nay, việc xử lý nước thải nói chung theo hướng áp dụng các kỹ thuật sinh học rất

được chú trọng do chúng có tính bền vững, thích nghi với nhiều điều kiện trong tự

nhiên.

Trong cấu trúc màng sinh vật, các vi sinh vật liên kết với nhau chặt chẽ, tạo

ra một cấu trúc bền vững, hoạt động có hiệu quả hơn trong việc xử lý nước thải.

Đồng thời, các vi sinh vật trong mạng lưới màng sinh vật sẽ cùng hợp tác trao đổi

chất giúp cho quá trình loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong nước diễn ra dễ dàng và

hiệu quả [76].

So sánh với việc sử dụng các chủng vi sinh vật trôi nổi để xử lý nước thải thì

công nghệ xử lý sinh học nước thải bằng màng sinh vật mang lại nhiều lợi ích đáng

kể. Một là, mật độ các chủng vi sinh vật trong màng sinh vật cao hơn nhiều, tạo

điều kiện xử lý tối đa nguồn nước thải. Hai là, ngoài việc loại bỏ các chất không

mong muốn trong nước thải thì quá trình tiếp theo là loại bỏ các vi sinh vật này khỏi

môi trường. Đối với các tế bào trôi nổi, việc khử trùng nguồn nước sẽ tốn một chi

phí lớn, do vậy việc áp dụng màng sinh vật trên các giá thể cố định thể hiện ưu thế

lớn. Với những ưu điểm này, các nhà khoa học đã đề xuất công nghệ xử lý nước

thải ứng dụng màng sinh vật được xem là giải pháp thân thiện môi trường [50].

1.5.2 Ứng dụng màng sinh vật trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại

Đấu tranh phòng trừ bệnh gây hại cho cây trồng đã và đang là hướng nghiên

cứu rất được quan tâm ứng dụng trong ngành nông nghiệp. Và một trong những

biện pháp được ưa chuộng đó là đấu tranh sinh học. Trong đó, nhiều nghiên cứu cho

thấy rằng các vi sinh vật có thể hoạt động như một tác nhân đối kháng với nhiều

mầm bệnh khác nhau ở thực vật bao gồm các loại sâu bọ và các mầm bệnh vi sinh

vật như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn.

Các vi sinh vật có thể tồn tại tự do trong đất hoặc bám dính với bề mặt mô

thực vật thành từng cụm tế bào. Mối quan hệ này phần lớn mang lại lợi ích cho cả

hai bên: thực vật là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng và nơi khu trú lâu dài cho các



quần thể vi sinh vật. Mặt khác, các vi sinh vật trong mối tương tác này có thể làm

thay đổi môi trường sống xung quanh theo hướng có lợi cho sự phát triển của thực

vật [69].

Một trong những cơ chế giúp các vi sinh vật ức chế mầm bệnh gây hại ở cây

trồng đó là thông qua chất kháng sinh. Ví dụ, chủng Bacillus cereus UW85 có khả

năng tổng hợp cả zwittermycin và kanosamine [69]. Khả năng tổng hợp chất kháng

sinh giúp làm tăng tính cạnh tranh giữa các nhóm vi sinh vật; đồng thời cũng là cơ

sở để tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có khả năng phòng trừ bệnh gây hại ở thực vật

chủ yếu dưới dạng phân bón vi sinh bổ sung vào nguồn đất trồng.

Bais và cộng sự [5] đã chứng minh rằng nhờ quá trình hình thành màng sinh

vật trên rễ cây Arabidopsis, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 6051 đã tạo ra surfactin

ức chế sự xâm nhiễm của chủng P. syringae gây hại cây trồng.

Khả năng đối kháng của chủng Bacillus thuringiensis chống lại tác nhân gây

bệnh cây trồng Erwinia carotovora đã được chứng minh qua nghiên cứu của

Morikiwa [56]. E. carotovora sản xuất các phân tử tín hiệu cảm ứng mật độ tế bào

acyl - HSL và biểu hiện gen gây độc, trong khi đó các chủng B. thuringiensis có

enzyme acyl - homoserine lactonase, làm giảm mạnh acyl - HSL. Do vậy, B.

thuringiensis làm giảm đáng kể khả năng nhiễm và phát triển của E. carotovora -

tác nhân gây bệnh thối củ ở khoai tây.

1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác

Ứng dụng của màng sinh vật làm giảm sự ăn mòn kim loại

Vi khuẩn gây ra sự ăn mòn kim loại được biết đến là các chủng vi khuẩn khử

sulfate Desulfosporosinus orientis và vi khuẩn oxy hóa sắt Leptothrix discophora

SP-6. D. orientis gây ra sự ăn mòn ở gang, thép cacbon, thép không gỉ và một số

hợp kim khác. Hằng năm, thiệt hại do sự ăn mòn kim loại gây ra ở Mỹ là 4 - 6 tỷ

USD [34]. Vi khuẩn này có chứa enzyme hydrogenase sử dụng hydrogen như một

chất cho điện tử để thu nhận năng lượng gây ra hiện tượng ăn mòn điện hóa ở các

bề mặt kim loại. Trong khi đó, vi khuẩn L. discophora SP-6 oxy hóa sắt, tự nó

không gây ra sự ăn mòn đáng kể thép nhẹ (thép ít cacbon), nhưng khi có sự kết hợp



với D. orientis và Paenibacillus polymyxa 10401 thì tốc độ ăn mòn thép nhẹ sẽ tăng

lên rất lớn [28]. Nghiên cứu của Morikawa [56] cho thấy sự hình thành màng sinh

vật ở chủng Bacillus brevis 18-3 đã tạo ra gramicidin làm giảm đáng kể tốc độ ăn

mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora

SP-6.

Trong công nghiệp lên men

Trong các bồn lên men ở quy mô công nghiệp, màng sinh vật là hình thức

hiệu quả để giữ lại sinh khối vi sinh vật [47].

Sau mỗi mẻ lên men, các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng giữ lại trong

các bồn lên men. Do đó, mỗi khi tiếp tục một quy trình mới lại phải bổ sung thêm

một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng,

phát triển tới một nồng độ nhất định mới. Quy trình này gây tốn kém ở khâu nguyên

liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành.

Ngược lại, khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới màng

sinh vật sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ

xử lý cũng như tái sử dụng được ở những lần xử lý tiếp theo mà không cần phải bổ

sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển.

Ứng dụng trong công nghiệp dầu khí

Nghiên cứu khả năng tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học

(biosurfactant) hoạt tính cao từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, được

phân lập từ nguồn nước thải nhiễm dầu [67] mở ra triển vọng ứng dụng trong công

nghiệp dầu khí với các mục đích như nâng cao hệ số thu hồi dầu, xử lý môi trường,

làm chất phân tán và nhũ hóa cặn dầu.

Nghiên cứu về màng sinh vật đã và đang là lĩnh vực thu hút sự quan tâm của

rất nhiều nhà khoa học, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về tác hại cũng như lợi ích ứng

dụng của màng sinh vật trong đời sống. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu thu nhận

được từ các công trình khoa học nước ngoài. Tài liệu về màng sinh vật ở Việt Nam

còn tương đối ít và nghiên cứu về màng sinh vật còn chưa nhiều, chưa sâu. Đề tài

nghiên cứu của chúng tôi với mục đích tạo thêm cơ sở dữ liệu khoa học về các



chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật từ môi trường nước thải giàu

nguồn cacbon ở các khu vực làng nghề và nhà máy sản xuất và đưa ra một số ứng

dụng theo hướng xử lý nước thải môi trường.



Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh

vật có khả năng tạo thành màng sinh vật và ứng dụng trong xử lý nước thải cũng

như ức chế các vi sinh vật gây hại, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn và lấy mẫu nước

thải tại một số khu vực ô nhiễm làng nghề ở Việt Nam. Mẫu được lấy vào thời điểm

các buổi sáng trong ngày, chứa trong các ống falcon đã khử trùng rồi đem về phòng

thí nghiệm để phân tích. Cụ thể, tại các địa điểm sau:

Thứ nhất, nguồn nước thải tại làng miến Lại Trạch - Yên Phú - Yên Mỹ -

Hưng Yên: Hệ thống thoát nước và hồ lắng của làng miến chứa lượng nước thải lớn

lẫn cặn bột và bã bột dong. Mẫu nước thải được lấy tại các hồ lắng này.

Thứ hai, nguồn nước thải tại làng bún Phú Đô - Mễ Trì - Từ Liêm - Hà Nội:

Toàn bộ nước thải của quá trình làm bún được thải trực tiếp ra các cống, rãnh của cả

làng. Do vậy, khu vực nước thải làng nghề nơi chúng tôi lấy mẫu có một màu trắng

đục, chua và hôi.

Thứ ba, nguồn nước thải tại nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp thực

phẩm - Thanh Xuân - Hà Nội: Nguồn nước thải được sử dụng là nước thải của

xưởng bia - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã được tách cặn thông qua bể lắng sơ

bộ. Nguồn nước thải có thành phần COD 2500 - 3000 (mg/l), BOD5 1500 - 2000

(mg/l), pH 4,5 - 5,5. Chỉ số COD cao chủ yếu là do trong thành phần nước thải có

chứa nhiều tinh bột và các chất hữu cơ.

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định

Các vi sinh vật kiểm định được sử dụng trong đề tài bao gồm:

Staphylococcus aureus; Ralstonia solanacaerum; Samonella typhi; E. coli; Vibrio

parahaemolyticus do bộ môn Vi sinh thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên -

Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cung cấp.



2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường LB (Luria - Bertani broth hay Luria broth):

Tryptone 10g

Cao nấm men 5g

NaCl 10g

Nước cất 1 lít

Môi trường LB là môi trường thường được sử dụng trong việc nuôi cấy các

chủng vi khuẩn hiếu khí. Môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng nguồn cacbon,

nitơ cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển.

Môi trường khoáng cơ bản:

(NH4)2SO4 2g

MgSO4.7H2O 0,2g

NaH2PO4.H2O 0,5g

CaCl2.2H2O 0,1g

K2HPO4 0,5g


Môi trường khoáng cơ sở:

KH2PO4 1,36g

CaCl2 0,03g

Na2HPO4 2,13g

MgSO4.7H2O 0,2g

FeSO4.7H2O 0,01g

Glucose 10g




Các môi trường đều được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120

phút. Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu, đánh giá khả năng tạo màng sinh

vật như các loại đường Fructose (Sigma - Mỹ); Arabinose (Merk - Đức), Mannose

(Merk - Đức), NaCl (Công ty cổ phần Hóa chất Đức Giang)… đều đạt độ tinh sạch

cho mục đích nghiên cứu.

2.2.2 Máy móc, thiết bị

Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản)

Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức)

Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý)

Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức)

Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ)

Máy đo pH (Horiba - Nhật Bản)

Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh)

Tủ ấm (Memmert - Đức)

Tủ sấy (Memmert - Đức)

Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA RET - Đức)

Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nước thải, sử dụng phương pháp pha

loãng mẫu trong nước cất vô trùng.

Mẫu sau khi pha loãng được cấy gạt dịch ở các nồng độ từ 10-1, 10-2 đến 10-5

trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch. Các đĩa sau khi cấy trải được nuôi

cấy trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện

và được quan sát sau thời gian ít nhất là 24 giờ. Các khuẩn lạc sau khi phát triển sẽ

được tách riêng rẽ và được nuôi cấy trên môi trường phù hợp hoặc LB có bổ sung

thạch.



2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng

Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch, các

vi sinh vật được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khử

trùng.

Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC

trong thời gian 24 giờ. Các ống giống sau khi phát triển sẽ được lấy ra và cho vào tủ

lạnh giữ ở 4oC. Hàng tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môi

trường mới.

Phương pháp bảo quản giống lâu dài

Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trong

môi trường glycerol theo tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ lạnh sâu -80oC.

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các

chủng vi sinh vật

Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một số

chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể. Việc phát

hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm

màu với dung dịch tím kết tinh 1% (w/v). Tím kết tinh (crystal violet hay Gentian

violet) là một thuốc nhuộm hóa học triarylmethane có công thức phân tử là

C25H30N3Cl, công thức cấu tạo là [C(C6H4N(CH3)2)3]Cl - Tris (4-(dimethylamino)

phenyl) methylium chloride. Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với

các tế bào sống, sự thay đổi về cường độ màu thể hiện mức độ và số lượng của các

tế bào vi sinh vật.

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [62]

Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật sau khi tách riêng rẽ sẽ được nuôi cấy kích

hoạt trong bình tam giác chứa 10ml môi trường LB lỏng trong 24 giờ ở 37oC sao

cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,3 - 0,4. Hút 100l dịch nuôi cấy vi khuẩn



bổ sung vào 700l LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều

kiện tĩnh ở 37oC.

Sau 24 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá

mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang

học ở bước sóng 620 nm (OD620) dịch nuôi cấy vi khuẩn.

Phương pháp quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật:

Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi

ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở

nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần

bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết

tinh.

Mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng độ hấp thụ ánh

sáng ở bước sóng 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]: Sau

khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được

hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng

cách đo độ hấp thụ OD 570 nm.

2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật

Mỗi chủng vi sinh vật tùy theo đặc tính sinh học của chúng chỉ có thể tạo

thành màng sinh vật tốt nhất ở những điều kiện thích hợp về nhiệt độ, pH, các

nguồn carbon, nitơ.

2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật

sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện nhiệt độ môi trường

khác nhau. Các nhiệt độ được lựa chọn nghiên cứu là: 20oC, 30oC, 37oC, 40oC, 50oC

và 60oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo thành màng

sinh vật của các chủng vi sinh vật nghiên cứu bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm

theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57].



2.3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy


sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện pH môi trường khác

nhau. Các giá trị pH môi trường khác nhau được lựa chọn nghiên cứu là: pH 4; 4,5;

5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật

tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương

pháp của Morikawa và cộng sự [57].

2.3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cacon trong môi trường

Bổ sung các nguồn cacbon vào môi trường khoáng cơ bản với nồng độ 1%.

Các nguồn carbon được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm:

Đường 5 cacbon: Arabinose, Fucose, Rhamnose

Đường 6 cacbon: Glucose, Mannose, Fructose, Galactose

Đường đôi: Saccharose, Lactose

Polysaccarit : Tinh bột

Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút


sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon

khác nhau, điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng

sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo

phương pháp của Morikawa và cộng sự [57].

2.3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường

Bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường khoáng cơ sở với nồng độ

0,1%. Chỉnh pH tới 7,0 - 7,2.

Các nguồn nitơ được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm:

(NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, (NH4)2C6H5O7, Pepton, Cao nấm men.

Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút




sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ khác

nhau với điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh

vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương

pháp của Morikawa và cộng sự [57].

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt

Khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật được

đánh giá bằng mức độ nhũ tương hóa dung dịch dầu ăn của dịch nuôi cấy tế bào

thông qua chỉ số E24 (emulsion index) theo phương pháp của Suwansukho và cộng

sự [80].


sẽ được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc với tốc độ 160 vòng/phút trong 24

giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau đó, dịch nuôi cấy lắc được ly tâm với tốc độ 10.000

vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu lấy phần dịch nổi.

Bổ sung 2ml dầu ăn vào 2ml dịch vi khuẩn thu được sau khi ly tâm trong các

ống nghiệm nhỏ, đường kính 1cm.

Vortex với tốc độ cao trong 1 phút

Sau 24 giờ, lấy ra đo mức độ nhũ tương hóa.

Chỉ số nhũ tương hóa E24 được tính theo công thức sau:

E24 = [(chiều cao cột nhũ tương hóa)/(tổng chiều cao cột)] × 100% [80].

2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn

Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm đối với các

chủng vi khuẩn kiểm định được xác định theo phương pháp của De Angelis và cộng

sự [21].

Các chủng vi sinh vật (bao gồm các chủng vi sinh vật đã phân lập được thử

nghiệm khả năng kháng khuẩn và các chủng vi sinh vật kiểm định) được nuôi cấy

qua đêm trong môi trường LB lỏng trên máy lắc với tốc độ 160 vòng/phút, ở 37oC.



Sau đó, dịch nuôi cấy vi sinh vật thử nghiệm được ly tâm ở 10.000 vòng/phút

trong 10 phút để loại bỏ hoàn toàn tế bào vi khuẩn. Dịch lắc của vi khuẩn kiểm định

được cấy trải trên các đĩa môi trường LB - thạch với thể tích 100l. Các lỗ được đục

với đường kính 6mm trên các đĩa thạch.

Dịch lọc của từng chủng vi sinh vật thử nghiệm được cho vào các lỗ thạch

với thể tích 30l. Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát và chụp ảnh trên

các đĩa thạch.

Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm được xác định

dựa vào đường kính vòng kháng khuẩn (D) xuất hiện xung quanh lỗ thạch.

D = D - d

D: đường kính vòng vô khuẩn (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm).

2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram

Nguyên tắc:

Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi

khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản

sự thất thoát của tím kết tinh. Ban đầu, vi khuẩn được nhuộm bằng tím kết tinh sau

đó được xử lý bằng iot để tăng độ giữ màu. Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co

các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tím kết tinh và iot được giữ

lại, vi khuẩn có màu tím. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ít liên kết

chéo và có lỗ lớn. Do vậy, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của

tím kết tinh - iot. Khi nhuộm lại bằng safranin thì vi khuẩn có màu hồng [3].

Tiến hành:

Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ đĩa thạch (sau

khi cấy 24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.

Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần.

Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.



Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút, rửa nước,

thấm khô.

Nhỏ dịch tẩy màu (ethanol 95%), giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô.

Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khô

trong không khí.

Quan sát dưới kính hiển vi: dùng vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần [3].

2.3.8 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử

quét

Chuẩn bị mẫu màng sinh vật nổi: dịch nuôi cấy lắc vi khuẩn phân lập có khả

năng tạo màng sinh vật tốt được bổ sung vào bình tam giác chứa 20ml môi trường

LB lỏng. Nuôi cấy tĩnh trong 24 giờ, ở 37oC.

Mẫu màng sinh vật được gắn lên lamelle, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố

định mẫu.

Rửa nhẹ mẫu gắn màng sinh vật bằng nước cất khử trùng, để khô tự nhiên.

Gắn mẫu lên đế

Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC - 1200 trong 5 phút ở 30mA

Quan sát và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật) tại

phòng chụp hiển vi điện tử quét thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu - Khoa Vật Lý

- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.3.9 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA

Phương pháp này dựa trên phương pháp Sanger có cải tiến: Dựa vào sự tổng

hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA - polymerase. Với việc sử

dụng thêm các ddNTP cùng các dNTP thông thường, kết quả là sự hình thành một

tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.

Vectơ tái tổ hợp có chứa đoạn gen 16S rRNA mang hai trình tự chuyên biệt,

mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết



phải biến tính tách rời 2 mạch rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm

trên mạch đó.

Mỗi dideoxynucleotit được đánh dấu bằng một hóa chất huỳnh quang có màu

khác nhau. Mỗi thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra một phổ ánh sáng hẹp với một

đỉnh khác biệt. Các số liệu phát ra được lưu ghi lại trong máy tính. Sau khi quá trình

chạy điện di kết thúc, chuỗi các tín hiệu huỳnh quang được chuyển ngược thành

thông tin trình tự nucleotit [71].

Kết quả được xử lý trên phần mềm PC/Gene, Gendoc, BioEdit và được so

sánh với trình tự đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế bằng chương

trình BLAST (Basic Local Aignment Search Tool) qua dữ liệu của DDGJ EMBL để

tìm xem mức độ tương đồng của các chủng nghiên cứu với loài nào là lớn nhất [2].

Kết quả đọc trình tự 16S rDNA của các chủng vi sinh vật có khả năng tạo

màng sinh vật mạnh được thực hiện với sự giúp đỡ của Viện Vi sinh vật và Công

nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.



Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật

3.1.1 Phân lập vi sinh vật

Từ mẫu nước thải khu vực làng nghề miến Lại Trạch, chúng tôi phân lập

được 23 chủng vi sinh vật, số lượng các chủng lần lượt thu được từ phần nước thải

tầng mặt là 6 chủng, phần giữa cách tầng mặt 30cm là 11 chủng và phần mặt đáy là

6 chủng, số chủng phân lập từ phần giữa chiếm 47,83%.

Phân lập mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia chúng tôi thu được 6 chủng vi

sinh vật ở tầng mặt, 8 chủng từ khu vực phần giữa cách tầng mặt 30cm và phần mặt

đáy là 11 chủng, số chủng phân lập được từ phần mặt đáy chiếm 44%.

Từ mẫu nước thải làng bún Phú Đô chúng tôi phân lập được 27 chủng vi sinh

vật với số lượng chủng hiện diện ở tầng mặt là 5 chủng, khu vực nước phần giữa

cách mặt nước 15cm là 12 chủng và phần mặt đáy là 10 chủng, số chủng phân lập

được từ phần giữa chiếm 44,44%.

Hình 6. Khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch

Kết quả thu được cho phép chúng tôi nhận định: phần lớn các chủng vi sinh

vật phân lập được từ các mẫu nước thải tập trung ở khu vực nước phần giữa và phần

mặt đáy. Các địa điểm lấy mẫu lại chủ yếu là những khu vực nước thải chứa hàm

lượng cacbon cao. Điều này phù hợp với giải thích về khả năng bám dính của các

chủng vi sinh vật ở các phần nước này. Đây là phần nước thải ít có sự biến động và



xáo trộn về dòng chảy, là một điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn gắn kết với nhau

và với các bề mặt. Đồng thời phần nước này cũng là nơi cung cấp đầy đủ chất dinh

dưỡng giúp các tế bào tăng trưởng và phát triển tốt, hứa hẹn thu nhận được nhiều

chủng có khả năng hình thành màng sinh vật tốt, phù hợp với mục đích nghiên cứu.

3.1.2 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng phân lập

Nghiên cứu khả năng phát triển và tạo thành màng sinh vật của các chủng vi

sinh vật phân lập chúng tôi nhận thấy rằng trong môi trường đầy đủ chất dinh

dưỡng, được lắc 160 vòng/phút, ở 37oC thì vi sinh vật sinh trưởng và phát triển rất

nhanh, các tế bào đều tồn tại ở dạng sống trôi nổi, tự do. Tuy nhiên, khi nuôi cấy

các vi sinh vật trong điều kiện tĩnh thì chúng tôi lại nhận thấy có một sự chuyển đổi

từ dạng sống trôi nổi tự do sang dạng gắn kết với bề mặt.

Kết quả nghiên cứu đánh giá khả năng phát triển và tạo màng sinh vật thể

hiện trên các hình 7, hình 8 và hình 9 cho thấy rõ nhận định trên.

0

1

2

3

A1.1A1.2A1.3 A1.4 A1.5A1.6 M1.1 M1.2 M1.3 M1.4 M1.5M1.6M1.7 M1.8 M1.9

M1.10

M1.11

U1.1 U1.2 U1.3 U1.4 U1.5 U1.6

Các chủng vi sinh vật

Mứ

c độ

phá

t triể

n

OD620OD570

Hình 7. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước

thải làng miến Lại Trạch

Đánh giá sự phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân

lập từ nguồn nước thải làng nghề miến Lại Trạch (hình 7), chúng tôi nhận thấy:

Trong môi trường nuôi cấy ở điều kiện tĩnh, khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng

620 nm (OD620) đặc trưng cho mật độ tế bào sống trôi nổi giảm thấp, trong khi khả

năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm (OD570) đặc trưng cho mật độ tế bào



trong cấu trúc màng sinh vật tăng lên đáng kể. Trong số đó, có 2 chủng vi sinh vật

tạo màng tốt nhất mà chúng tôi lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo đó là

M1.10 và U1.3.

Kết quả đánh giá tương tự được chúng tôi thực hiện với các chủng vi sinh vật

phân lập từ nguồn nước thải nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp Thực phẩm

(hình 8) và làng nghề bún Phú Đô (hình 9).

Từ kết quả thu được có thể nhận thấy rằng đối với mẫu nước thải nhà máy

sản xuất bia chúng tôi thu được khá nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng

sinh vật tốt, trong đó 3 chủng có hoạt tính tạo màng tốt nhất được chúng tôi lựa

chọn sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo đó là A3.3, M3.8 và U3.7 (hình 8).

0

1

2

3

A3.1 A3.2 A3.3 A3.4 A3.5 A3.6 M3.1 M3.2 M3.3 M3.4 M3.5 M3.6 M3.7 M3.8 U3.1 U3.2 U3.3 U3.4 U3.5 U3.6 U3.7 U3.8 U3.9U3.1

0U3.1

1


Mứ

c độ

phá

t triể

n

OD620OD570


thải nhà máy sản xuất bia

Kết quả thí nghiệm cho thấy trong 3 khu vực lấy mẫu thì mẫu nước thải từ

làng nghề bún Phú Đô chúng tôi phân lập được nhiều chủng vi sinh vật có khả năng

tạo màng sinh vật nhất và các chủng này cũng có hoạt tính tạo màng cao nhất.

Trong số đó, chúng tôi lựa chọn được 3 chủng có khả năng tạo màng sinh vật tốt

nhất để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo đó là M4.3, M4.9 và M4.10 (hình 9).

Quá trình chuyển từ dạng sống trôi nổi sang dạng cấu trúc màng sinh vật

bám dính bề mặt (cụ thể ở đây là bám dính bề mặt nhựa) trong điều kiện nuôi cấy



0

1

2

3

4

A4.1 A4.2 A4.3 A4.4 A4.5 M4.1 M4.2 M4.3 M4.4 M4.5 M4.6 M4.7 M4.8 M4.9M4.1

0M4.1

1M4.12 U4.1 U4.2 U4.3 U4.4 U4.5 U4.6 U4.7 U4.8 U4.9U4.1

0


Mứ

c độ

phá

t triể

n

OD620OD570


thải làng nghề bún Phú Đô

tĩnh đã chứng tỏ đây là một kiểu phản ứng thích nghi với sự thay đổi về điều kiện

sống của vi sinh vật. Khi sống trong một điều kiện không thuận lợi cho sự tăng

trưởng tự do, các tế bào sống có xu hướng gắn kết nhau trên một bề mặt hữu sinh

hoặc vô sinh thông qua mạng lưới chất ngoại bào để có thể trao đổi vật chất và

thông tin với nhau, kết thành một tổ chức vững chắc nhằm đáp ứng với những hạn

chế của môi trường, thông qua đó giúp chúng tồn tại và phát triển.

Như vậy, trong số các chủng vi sinh vật phân lập được từ các khu vực nước

thải giàu nguồn cacbon chúng tôi đã lựa chọn được 8 chủng có hoạt tính tạo màng

sinh vật mạnh nhất cho các nghiên cứu tiếp theo. Đó là các chủng được ký hiệu lần

lượt là M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9, M4.10. Các chủng này hầu hết

đều được phân lập từ mẫu nước thải khu vực phần giữa và mặt đáy. Điều này phù

hợp với nhận định ban đầu về khả năng bám dính của vi sinh vật với hoạt tính tạo

màng sinh vật của chúng.

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo màng sinh vật của các chủng phân lập

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Khảo sát sự tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật nghiên cứu

với các điều kiện nhiệt độ khác nhau để tìm ra khoảng nhiệt độ thích hợp nhất,

chúng tôi thu được kết quả như sau:



0

1

2

20°C 30°C 37°C 40°C 50°C 60°C

Nhiệt độ

Khả

năn

g tạ

o m

àng

sinh

vật

M1.10U1.3A3.3M3.8U3.7M4.3M4.9M4.10

Hình 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh vật từ các chủng phân lập

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành màng sinh vật cho

thấy: Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu hầu hết biểu hiện hoạt tính tạo màng

sinh vật mạnh nhất ở nhiệt độ 37oC. Tuy nhiên, ở 50oC một số chủng như M1.10,

U1.3, M3.8, M4.9 vẫn có hoạt tính tạo màng sinh vật tương đối tốt. Kết quả này cho

thấy một số chủng được phân lập vừa thể hiện hoạt tính màng sinh vật tốt, vừa có

khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao. Các kết quả thu được này cũng khá phù hợp

với các kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [59]. Điều này

cho thấy rằng nhiệt độ 37oC thích hợp cho nhiều chủng vi khuẩn phân lập trong môi

trường ô nhiễm ở Việt Nam phát triển và tạo màng sinh vật.

3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường

Các chủng vi sinh vật tăng trưởng phù hợp với một khoảng pH xác định. Để

khảo sát pH thích hợp cho sự tạo thành màng sinh vật của các chủng phân lập,

chúng tôi tiến hành nuôi cấy tĩnh các vi khuẩn trong những môi trường có pH khác

nhau và thu được kết quả như ở bảng 1.

Kết quả ở bảng 1 cho thấy các chủng phân lập đều có khả năng phát triển và

tạo màng sinh vật trong khoảng pH từ 4 đến 8,5. Tuy nhiên với chủng M1.10 thì pH

thích hợp nhất cho sự tạo thành màng sinh vật là 7 và 7,5 với giá trị OD570 là 1,7;



Bảng 1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật

phân lập

Giá trị pH/Khả năng tạo màng sinh vật (OD570) Ký hiệu chủng pH4 pH4,5 pH5 pH5,5 pH6 pH6,5 pH7 pH7,5 pH8 pH8,5

M1.10 0,214 0,514 0,979 1,288 1,418 1,480 1,772 1,725 1,527 0,438

U1.3 0,625 0,781 0,910 0,946 0,971 0,983 1,158 1,130 1,088 0,694

A3.3 0,468 0,525 0,612 0,615 0,806 0,817 1,245 1,066 0,835 0,412

M3.8 1,008 1,116 1,188 1,266 1,388 1,406 1,631 1,482 1,453 1,438

U3.7 0,531 0,993 1,001 1,074 1,187 1,195 1,331 1,261 1,188 1,157

M4.3 0,525 0,803 1,142 1,280 1,287 1,348 1,457 1,451 1,436 1,549

M4.9 0,326 0,362 1,128 1,419 1,551 1,603 1,825 1,732 2,142 1,956

M4.10 0,209 0,350 0,369 0,415 0,607 0,532 1,634 1,804 0,307 0,964

trong khi tại vùng axit (pH4 - pH5,5) và vùng kiềm pH8,5 thì sự phát triển và tạo

màng lại thấp hơn hẳn. Các kết quả này cũng tương tự với các chủng còn lại. Điều

này có thể lý giải tại sao những nơi phân lập các chủng cũng như trong tự nhiên,

việc phân lập các chủng vi sinh vật ưa axit, kiềm thường gặp nhiều khó khăn. Các

kết quả thu được của chúng tôi cũng phù hợp với các kết quả của một số tác giả trên

thế giới. Kết quả nghiên cứu của Oliveira và cộng sự cho thấy chủng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens tạo màng sinh vật tối ưu ở môi trường nuôi cấy pH7 [64]

còn chủng Stenotrophomonas maltophilia tạo màng sinh vật tối ưu ở môi trường

pH7,3 [38].

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy chủng M4.9 tạo màng sinh vật tốt nhất

trong môi trường pH8, là chủng vi khuẩn ưa kiềm.

3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố:

một là thành phần hóa học và tính chất lý hóa của nguồn thức ăn này, hai là đặc

điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Do vậy, chúng tôi sử dụng môi trường

khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau nhằm mục đích đánh giá

khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau của vi sinh vật nghiên cứu.



Các tế bào trong màng sinh vật được gắn kết với nhau và với bề mặt thông

qua mạng lưới chất ngoại bào mà thành phần chủ yếu là các biopolyme hay

polysaccarit. Nghiên cứu cho thấy thành phần cấu tạo chủ yếu của polysaccarit

ngoại bào là các loại đường glucose, galactose, mannose và xylose hay dẫn xuất của

chúng [38]. Vì vậy, nghiên cứu khả năng sử dụng hay lên men các loại đường khác

nhau không chỉ giúp phân loại ban đầu chủng vi sinh vật nghiên cứu mà còn đánh

giá được đặc tính của thành phần polysaccarit trong mạng lưới màng sinh vật [37].

Với những lý do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn

cacbon, đường khác nhau lên sự tạo thành màng sinh vật của các chủng phân lập

(bảng 2).

Bảng 2: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật

phân lập

Khả năng tạo màng sinh vật (OD570) Ký hiệu

chủng Nguồn Cacbon

M1.10 U1.3 A3.3 M3.8 U3.7 M4.3 M4.9 M4.10

Arabinose 0,230 0,607 0,138 1,031 1,209 0,348 1,138 0,289

Fucose 0,361 0,679 0,245 0,735 0,638 0,758 1,061 0,273

Rhamnose 0,387 0,706 0,194 0,913 0,990 0,692 1,542 0,420

Glucose 0,525 0,972 0,658 0,925 0,722 0,389 0,565 0,602

Mannose 0,479 0,422 0,526 0,862 0,815 0,811 0,849 0,453

Fructose 0,430 1,181 0,453 1,176 0,842 0,228 0,965 0,424

Galactose 0,998 0,749 0,494 1,038 0,989 0,463 1,138 0,404

Saccharose 0,357 0,218 0,315 0,726 0,846 0,321 0,968 0,341

Lactose 0,286 0,663 0,359 0,721 0,833 0,401 0,677 0,405

Glucosamine 0,325 0,618 0,430 1,309 0,858 0,359 1,069 0,387

Tinh bột tan 0,753 0,960 0,501 1,176 0,936 0,296 1,026 0,456

LB lỏng 0,456 0,227 0,694 1,253 1,389 0,660 1,206 0,354

Từ kết quả thu được ở bảng 2 chúng tôi nhận định chủng M1.10 thích hợp

với việc sử dụng nguồn cacbon là đường galactose, chủng M4.10 sử dụng tốt nhất

nguồn cacbon là đường glucose và chủng M4.3 sử dụng đường mannose tối ưu



nhất. Các kết quả này phù hợp với đánh giá của các tác giả trong nước như Nguyễn

Quang Huy và cộng sự [59] hay tác giả nước ngoài như Haggag [38]. Tuy nhiên khả

năng tạo màng sinh vật của các chủng này trong kết quả nghiên cứu là không cao

đối với từng loại đường riêng biệt.

Qua bảng kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy ngoài khả năng sử dụng

các nguồn đường đã được một số tác giả công bố, các chủng vi sinh vật phân lập

của chúng tôi còn có khả năng sử dụng nhiều nguồn khác tối ưu cho việc tạo màng

sinh vật như fructose, rhamnose hay glucosamine. Ngoài ra, trong số 8 chủng vi

sinh vật được lựa chọn nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy 4 chủng có hoạt tính tạo

màng sinh vật cao nhất là M3.8, M4.9, U1.3, U3.7; và cả 4 chủng này đều có khả

năng sử dụng tất cả các loại đường cho sự tạo thành màng sinh vật với các mức độ

khác nhau.

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Thành phần chủ yếu của mạng lưới ngoại bào trong cấu trúc màng sinh vật là

polysaccarit, bên cạnh đó còn có các đại phân tử khác như protein, axit nucleic,

glycoprotein, photpholipit. Sự tổng hợp mạng lưới ngoại bào của các tế bào vi

khuẩn phụ thuộc vào nguồn cacbon và nitơ sẵn có trong môi trường nuôi cấy. Các

nguồn nitơ vi sinh vật có thể đồng hóa được là NH3, NH4+, NO3

-, N2 [18]. Tuy

nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng hai nguồn cung cấp nitơ

là muối nitrat và muối amon để khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác

nhau của vi sinh vật nghiên cứu.

Tác giả Sleytr [74] đã chỉ ra rằng nồng độ nitơ thấp trong môi trường nuôi

cấy làm tăng khả năng hấp thụ đường và ảnh hưởng đáng kể đến sự tạo thành mạng

lưới ngoại bào giúp cho sự tạo thành màng sinh vật được thuận lợi.

Kết quả bảng nghiên cứu số 3 (bảng 3) cho thấy một số chủng như U1.3,

M3.8, M4.9, M4.10 tạo màng sinh vật tương đối tốt với nguồn nitơ từ muối

(NH4)2SO4. Kết quả này tương đối phù hợp với nghiên cứu của Lee và cộng sự [51]

cho thấy chủng Aureobasidium pullulans tạo màng sinh vật tốt với nguồn nitơ từ

muối (NH4)2SO4. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy cao nấm men là



nguồn dinh dưỡng thích hợp cho sự tạo thành màng sinh vật của nhiều chủng phân

lập.

Bảng 3: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật

phân lập

Khả năng tạo màng sinh vật (OD570) Ký hiệu chủng Nguồn nitơ M1.10 U1.3 A3.3 M3.8 U3.7 M4.3 M4.9 M4.10

(NH4)2SO4 0,301 1,577 0,228 1,251 0,659 0,149 1,273 1,076

NaNO3 0,648 1,958 0,336 1,451 1,393 0,256 1,633 0,500

KNO3 0,335 1,408 0,306 1,140 0,898 0,214 1,503 0,324

(NH4)2C6H5O7 0,284 2,024 0,298 1,268 1,220 0,122 2,104 1,051

Pepton 0,294 1,312 0,214 1,117 0,700 0,310 1,416 0,432

Cao nấm men 0,313 2,081 0,249 1,023 1,441 0,388 2,550 0,358

LB lỏng 0,425 1,965 0,322 2,236 1,302 0,329 2,016 0,440

Từ bảng kết quả 3 này chúng tôi lựa chọn được 4 chủng vi sinh vật lần lượt

ký hiệu là U1.3, U3.7, M3.8, M4.9 tạo thành màng sinh vật tốt nhất với nhiều nguồn

nitơ khác nhau được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.

3.2.5 Ảnh hưởng của giá thể

3.2.5.1 Khả năng tạo màng sinh vật trên bề mặt các giá thể khác nhau

Bốn chủng vi sinh vật phân lập có hoạt tính tạo màng sinh vật tốt nhất qua

các nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng dưới ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt

độ, pH, nguồn cacbon, nitơ lần lượt là M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 được nuôi cấy thử

nghiệm trên các vật liệu khác nhau để quan sát cấu trúc các dạng màng sinh vật

chính.

Dạng màng nổi (floating biofilm): Bổ sung dịch vi khuẩn trong môi trường

LB lỏng, nuôi cấy ở điều kiện tĩnh, 37oC. Vi khuẩn sẽ hình thành trên bề mặt nước,

phần tiếp xúc với không khí một lớp váng, đó là dạng màng sinh vật nổi.



Hình 11 cho thấy màng nổi của các chủng vi khuẩn. Sau 1 ngày nuôi cấy,

xuất hiện lớp màng mỏng, màu trắng, dạng váng nổi trên môi trường LB lỏng. Lớp

màng nổi dày thêm sau 2, 3, 4 ngày nuôi cấy và đạt tối đa sau 5 ngày nuôi cấy.

Hình 11. Màng nổi của 4 chủng vi sinh vật sau 5 ngày nuôi cấy

M3.8 M4.9 U1.3 U3.7 ĐC

Hình 12. Màng sinh vật trên bề mặt nhựa

Dạng màng sinh vật bám dính bề mặt: là dạng màng sinh vật được hình

thành trên bề mặt vật rắn. Bằng cách thực hiện các thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn

trên các bề mặt vật liệu khác nhau như nhựa, thủy tinh. chúng tôi nhận thấy rằng

khả năng bám dính và hình thành màng sinh vật trên bề mặt nhựa là tốt nhất (hình

12).



3.2.5.2 Cấu trúc màng sinh vật quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét

Quan sát cấu trúc không gian ba chiều của màng sinh vật dưới kính hiển vi

điện tử quét (hình 13) chúng tôi nhận thấy màng sinh vật của cả 4 chủng M3.8,

M4.9, U1.3, U3.7 đều được tạo thành bởi các vi khuẩn lạc, bao quanh là mạng lưới

chất ngoại bào.

M3.8 M4.9

U1.3 U3.7

Hình 13. Cấu trúc màng sinh vật của các chủng phân lập ( 1000)

Các nghiên cứu về màng sinh vật cũng đã chứng minh rằng màng sinh vật là

một hệ thống phức tạp bao gồm các tế bào vi khuẩn và các vi khuẩn lạc trong một

mạng lưới chất ngoại bào. Màng sinh vật tổng số có thể được xác định dựa trên các

thông số vật lý như khối lượng, mật độ hay độ dày và được xác định dựa cả vào

những số đo lý hóa như hàm lượng cacbon hữu cơ tổng số (TOC), nhu cầu oxy hóa



học (COD). Cấu tạo của màng sinh vật được mô tả chi tiết thông qua phương pháp

đo các thành phần cụ thể như hàm lượng polysaccarit ngoại bào, protein, tổng số tế

bào hay các thành phần tế bào khác như peptidoglycan, lipopolysaccarit, lipit [5].

Polysaccarit cũng được chứng minh chiếm trên 65% thành phần của chất nền

ngoại bào, ngoài ra còn có một số các hợp chất khác như protein, axit nucleic, lipit,

glycoprotein, glycoside hay glucophotphat. Vì vậy, có khi mạng lưới chất ngoại bào

còn có cái tên khác là “biopolymer” hay “polysaccarit” [5].

3.3 Một số đặc tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật phân lập

3.3.1 Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt

Chất hoạt động bề mặt sinh học (biosurfactant) có vai trò quan trọng trong

công nghiệp thực phẩm như khả năng nhũ tương hóa và tạo bọt trong chế biến thực

phẩm, tạo nhũ hóa cho các sản phẩm mỹ phẩm [80]. Ngoài ra, chất hoạt động bề

mặt còn được ứng dụng trong công nghệ môi trường như xử lý các sự cố tràn dầu

[6].

Chất hoạt động bề mặt thuộc 4 nhóm glycolipit, photpholipit, lipoprotein và

lipopeptit. Trong đó, chất hoạt động bề mặt do chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tạo

ra là surfactin thuộc nhóm lipopeptit có tính chất hoạt động bề mặt và khả năng

kháng khuẩn cao [80].

Nhằm mục đích đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của các chủng

vi sinh vật phân lập, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng nhũ tương hóa dầu ăn

của chúng và thu được kết quả như ở hình 14.

Kết quả nhũ tương hóa dầu ăn cho thấy một số chủng vi sinh vật có hoạt tính

hình thành màng sinh vật mạnh đồng thời cũng có khả năng tạo thành chất hoạt

động bề mặt. Chất hoạt động bề mặt sinh học do vi sinh vật tạo ra là chất có thành

phần cấu trúc đa dạng với bề mặt rất hoạt động. Bởi vậy, có một mối liên hệ giữa sự

hình thành màng sinh vật và khả năng tạo chất hoạt động bề mặt. Nhiều nghiên cứu

đã chỉ ra rằng các phân tử chất hoạt động bề mặt có thể tạo điều kiện thuận lợi cho



Hình 14. Khả năng nhũ tương hóa dầu ăn của các chủng vi sinh vật

Kết quả thu được: 4 chủng có khả năng nhũ tương hóa dầu mạnh nhất là:

Ký hiệu chủng U1.3 A3.3 M3.8 U3.7

Chỉ số nhũ hóa (%) 74,19 80,58 80,77 67,33

sự gắn kết và phát triển của các vi sinh vật trên một bề mặt. Bởi chúng làm giảm

sức căng bề mặt và nhờ đó tăng cường khả năng lan rộng và bám dính của vi sinh

vật, hình thành dạng màng nổi hay dạng màng bám dính với bề mặt rắn [71]. Đồng

thời, chất hoạt động bề mặt cũng tạo phức với các phân tử kim loại nặng, làm giảm

độc tính cho vi sinh vật trong môi trường sống của chúng [81].

3.3.2 Khả năng kháng khuẩn

Kết quả về khả năng tạo màng sinh vật dưới ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt

độ, pH, nguồn cacbon, nitơ cũng như khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của 8

chủng vi sinh vật phân lập đã giúp chúng tôi đánh giá và lựa chọn ra được 4 chủng

có hoạt tính tạo màng sinh vật tốt nhất để tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

về đánh giá khả năng kháng khuẩn cũng như phân loại các chủng vi sinh vật phân

lập cho đề tài nghiên cứu của mình.

Kết quả thu được như trình bày trong bảng 4.



Bảng 4: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Hoạt tính kháng khuẩn (Đường kính vòng kháng khuẩn: mm) Ký hiệu

chủng E. coli Vibrio

parahaemolyticus Samonella

typhi Ralstonia

solanacaerum Staphylococcus

aureus

M3.8 7 9 2 3 2

M4.9 8 10 2 2 2

U1.3 7 9 2 3 3

U3.7 3 2 7 7 8

Kết quả ở bảng 4 cho thấy trong khi các chủng M3.8, M4.9, U1.3 có hoạt

tính kháng mạnh đối với E. coli và Vibrio parahaemolyticus thì U3.7 có hoạt tính

mạnh đối với 3 chủng Samonella typhi, Ralstonia solanacaerum và Staphylococcus

aureus. Điều này chứng tỏ mỗi chủng vi sinh vật được nghiên cứu có khả năng đối

kháng với một số chủng vi khuẩn gây bệnh nhất định.

Sự phát triển của một mô hình thực vật nhạy cảm với sự nhiễm khuẩn đã

chứng minh rằng tác nhân gây bệnh trên cà chua Pseudomonas syringae pv DC3000

có thể được khống chế bởi vi khuẩn B. subtilis thông qua sự tạo thành màng sinh

vật. Bais và cộng sự [70] đã tiến hành nghiên cứu trên rễ cây Arabidopsis bằng cách

xử lý với B. subtilis và phân tích bề mặt rễ bằng kính hiển vi quét đồng tiêu laser để

khẳng định sự tạo thành một màng sinh vật với cấu trúc không gian ba chiều.

Sự tạo thành màng sinh vật này là một quá trình phức tạp bao gồm sự tiết

surfactin, một tác nhân kháng khuẩn có bản chất là một lipopeptit. Chất này hoạt

động hiệu quả như một nhân tố kiểm soát sự lây nhiễm của P. syringae trong cây

Arabidopsis cũng như quá trình tạo thành màng sinh vật ở bề mặt rễ. Bằng thí

nghiệm trên dòng B. subtilis M1 đột biến gen tổng hợp surfactin, dẫn đến sự thiếu

hụt trong quá trình sản xuất surfactin đã cho thấy dòng này không có khả năng

kháng lại sự lây nhiễm của P. syringae và tạo thành màng sinh vật trên bề mặt rễ

cây hoặc trên các bề mặt khác. Khả năng kháng khuẩn của surfactin chống lại



P. syringae cũng được xác định trong cả môi trường nuôi cấy dạng dịch và trên bề

mặt thạch.

Nghiên cứu về vai trò của màng sinh vật trong kiểm soát sinh vật dịch bệnh ở

cây trồng [5] cũng cho thấy sự tạo thành màng sinh vật trên vùng rễ cây vừa có tác

dụng như một bể chứa chất dinh dưỡng cho vùng rễ vừa giúp giảm khả năng lây

nhiễm của các mầm bệnh gây hại cho cây trồng.

3.3.3 Đặc điểm hình thái

Để phân loại các chủng phân lập có khả năng tạo thành màng sinh vật mạnh

M3.8, M4.9, U1.3, U3.7, chúng tôi quan sát hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram

các chủng, kết quả cho thấy (hình 15):

- Chủng M3.8: Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn, bóng, màu trắng đục, có diềm xung

quanh; đường kính khuẩn lạc 2 - 3 mm, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.

- Chủng M4.9: Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn, bóng, màu trắng đục, mọng nước,

thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.

- Chủng U1.3: Khuẩn lạc tròn, không lồi, màu trắng, hơi xốp, thuộc nhóm vi

khuẩn Gram dương.

- Chủng U3.7: Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn

nheo, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.



Ký hiệu Hình thái khuẩn lạc Kết quả nhuộm Gram

M3.8

M4.9

U1.3

U3.7

Hình 15. Hình thái khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học (x100)

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử màng sinh vật hình thành từ các chủng vi

khuẩn này, chúng tôi nhận thấy các tế bào vi khuẩn có dạng hình que ngắn, nằm



riêng rẽ nhau, không xếp thành chuỗi và có khả năng hình thành mạng lưới liên kết

với nhau rất chặt chẽ (hình 16).

M3.8 M4.9

U1.3 U3.7

Hình 16. Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn trong màng sinh vật

3.3.4 Phân loại các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên gen 16S rDNA

Để xác định phân loại chính xác của các chủng vi khuẩn phân lập M3.8,

M4.9, U1.3 và U3.7, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen 16S rDNA của chúng.

Kết quả hình 17 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng M3.8 tương

đồng 99,9% với đoạn 16S của chủng Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng

99,5% với đoạn 16S của chủng Bacillus aerius_AJ831843. Trình tự gen 16S rDNA

của chủng M4.9 tương đồng 100% với đoạn 16S của chủng Bacillus

licheniformis_X68416; tương đồng 99,6% với đoạn trình tự 16S của chủng Bacillus

aerius_AJ831843.



Hình 17. Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các loài có quan hệ họ hàng dựa

vào trình tự gen 16S rDNA

Kết quả hình 18 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng U1.3 tương đồng

99,9% với đoạn 16S của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis subsp

spizizenii_AF074970 và tương đồng 99,8% với chủng Bacillus subtilis_AB042061.

Trình tự gen 16S rDNA của chủng U3.7 tương đồng 99,8% với đoạn trình tự 16S

của vi khuẩn Bacillus velezensis_AY603658 và tương đồng 99,5% với chủng

Bacillus nematotocita_AY820954.

Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus idriensis_AY904033

100

Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289

Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841

100

99

100

Bacillus aerius_AJ831843

Bacillus licheniformis_X68416

M3.8 100

M4.9

80

77 Bacillus sonorensis_AF302118

72

Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus velezensis_AY603658 Bacillus nematotocita_AY820954 Bacillus amyloliquefaciens_X60605

59

Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus subtilis subsp subtilis _AB042061

Bacillus subtilis_subsp_spizizenii_ AF074970 Bacillus axarquiensis_AY603657

Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus mojavensis_AB021191 26

61 59

79 23

69

100

98

100

100

85

100

54

0.01



Hình 18. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào

trình tự gen 16S rDNA

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng 4 chủng vi khuẩn có khả năng hình thành

màng sinh vật mạnh nhất phân lập được từ các khu vực nước thải của các làng nghề

đều thuộc chi Bacillus. Chi này bao gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, có

khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao, hình thành bào tử và đa số là không gây bệnh.

Nhờ khả năng tạo được các sản phẩm thương mại có giá trị, như hầu hết các

protease và amylase, cũng như thao tác di truyền dễ dàng mà các vi khuẩn chi

Bacillus được xem là mô hình nghiên cứu hiệu quả và có tính ứng dụng cao[49].

Sự tạo thành màng sinh vật ở chủng Bacillus subtilis đóng vai trò quan trọng

ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, hóa mỹ phẩm

Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus idriensis_AY904033 100

Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289

Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841

99 100

99 Bacillus aerius_AJ831843

Bacillus licheniformis_X68416 Bacillus sonorensis_AF302118

100

Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus velezensis_AY603658

U3.7 Bacillus nematotocita_AY820954

82

Bacillus amyloliquefaciens_X60605

79

Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus axarquiensis_AY603657

Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus mojavensis_AB021191

78

Bacillus subtilis subsp spizizenii_ AF074970

59

U1.3 Bacillus subtilis_AB042061

67

54 79

70

72

100

99

100

98

77

100

66

0.01



[56]. Bằng cách tạo ra hợp chất surfactin trong quá trình tạo màng sinh vật,

B. subtilis giúp các cây trồng có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh như

Erwina, Pseudomonas, Xanthomonas. Khả năng tạo gramicidin của chủng Bacillus

brevis 18-3 có tác dụng làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế

cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6 [5]. Mặt khác, khả năng tạo

chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật trong quá trình tạo màng cũng làm

tăng mức độ nhũ tương hóa và tạo bọt trong chế biến thực phẩm và tạo nhũ hóa cho

các sản phẩm mỹ phẩm [80]. Đồng thời, đặc tính này cũng đã mở ra triển vọng mới

trong việc chế tạo chất hoạt động bề mặt sinh học hoạt tính cao từ nguồn vi sinh vật

ứng dụng cho công nghiệp dầu khí để xử lý các sự cố tràn dầu [6].



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Từ mẫu 75 chủng vi sinh vật phân lập được từ nước thải các làng nghề ở

Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn được 8 chủng M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7,

M4.3, M4.9 và M4.10 có hoạt tính tạo màng sinh vật cao hơn các chủng còn lại.

2. Tám chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh

vật tốt nhất ở 37oC và pH từ 7 - 7,5. Trong số các chủng này, bốn chủng M3.8,

M4.9, U1.3, U3.7 có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất trong môi

trường khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon (fructose, rhamnose,

glucosamine) và trong môi trường khoáng cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ

((NH4)2SO4, cao nấm men) khác nhau.

3. Các chủng M3.8, M4.9 và U1.3 có hoạt tính kháng mạnh đối với E. coli và

Vibrio parahaemolyticus, với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm và 9

mm; 8 mm và 10 mm; 7 mm và 9 mm; trong khi đó chủng U3.7 có hoạt tính kháng

mạnh đối với 3 chủng Staphylococcus aureus, Samonella typhi và Ralstonia

solanacaerum với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm, 7 mm và 8 mm.

4. Những phân tích về đặc điểm hình thái và phân tích gen 16S rDNA của 4

chủng cho phép chúng tôi nhận định 4 chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 là vi khuẩn

Gram dương thuộc chi Bacillus. Trong đó, chủng M3.8, M4.9 gần với loài Bacillus

licheniformis; chủng U1.3 gần với loài Bacillus subtilis còn chủng U3.7 gần với loài

Bacillus velezensis.

Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt và

đặc tính kháng khuẩn của bốn chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 để

ứng dụng trong công nghệ xử lý nước thải và trong phòng chống dịch hại gây bệnh

trên cây trồng.

Tìm hiểu thành phần protein và vai trò của sự điều hòa biểu hiện gen trong

quá trình tạo thành màng sinh vật của bốn chủng vi khuẩn phân lập.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học,

Nxb Giáo dục, Hà Nội.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

3. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc Gia,

Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh:

4. Allison D. G., Gilbert P., Wilson M. (2000), Community ctructure and

co-operation in biofilms, Cambridge University Press, Cambridge, England.

5. Bais H. P., Fall R., Vivanco J. M. (2004), “Biocontrol of Bacillus subtilis against

infection of arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by

biofilm formation and surfactin production”, Plant Physiology, 134(1),

pp. 307-319.

6. Banat I. M. (1995), “Characterization of biosurfactants and their use in pollution

removal-state of the art”, Acta biotechnologica, 15, pp. 251-267.

7. Bendinger B., Rijnaarts H. H. M., Altendorf K., Zehnder A. J. B. (1993),

“Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform

bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids”, Applied

and Environmental Microbiology, 59, pp. 3973-3977.

8. Beveridge T. J., Makin S. A., Kadurugamuwa J. L., Li Z. (1997), “Interactions

between biofilms and the environment”, FEMS Microbiology Reviews, 20,

pp. 291-303.

9. Boyd A., Chakrabarty A. M. (1994), “Role of alginate lyase in cell detachment of

Pseudomonas aeruginosa”, Applied and Environmental Microbiology, 60,

pp. 2355-2359.



10. Brading M. G., Jass J., Lappin-Scott H. M. (1995), “Dynamics of bacterial

biofilm formation”, Microbial biofilms, Cambridge University Press,

Cambridge, pp. 46-63.

11. Brooks W., Demuth D. R., Gil S., Lamont R. J. (1997), “Identification of a

Streptococcus gordonii SspB domain that mediates adhesion to

Porphyromonas gingivalis”, Infection and Immunity, 65, pp. 3753-3758.

12. Characklis W. G. (1990), “Biofilm processes”, Biofilms, Wiley-Interscience,

New York, pp. 195-231.

13. Characklis W. G., Marshall K. C. (1990), “Biofilms: a basis for an

interdisciplinary approach”, Biofilms, John Wiley & Sons, New York,

pp. 3-15.

14. Costerton J. W., Geesey G. G., Cheng K. J. (1978), “How bacteria stick”,

Scientific American, 238(1), pp. 86-95.

15. Costerton J. W., Ingram J. M., Cheng K. J. (1974), “Structure and function of

the cell envelope of gram-negative bacteria”, Bacteriological Reviews, 38(1),

pp. 87-110.

16. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R., Lappin-Scott

H. M. (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology, 49,

pp. 711-745.

17. Cowan M. M., Warren T. M., Fletcher M. (1991), “Mixed species colonization

of solid surfaces in laboratory biofilms”, Biofouling, 3, pp. 23-34.

18. Czaczyk K., Myszka K. (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric

substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal

of Environmental Studies, 16(6), pp. 799-806.

19. Davey M. E., O'toole G. A. (2000), “Microbial biofilms: from ecology to

molecular genetics”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(B),

pp. 847-867.



20. Davies D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski B. H., Costerton J. W.,

Greenberg E. P. (1998), “The involvement of cell-to-cell signals in the

development of a bacterial biofilm”, Science, 280, pp. 295-298.

21. De Angelis M., Siragusa S., Berloco M., Caputo L., Settanni L., Alfonsi G.,

Amerio M., Grandi A., Gobbetti M. (2006), “Selection of potential probiotic

lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding”,

Research in Microbiology, 157, pp. 792-801.

22. De Weger L. A., Van Der Vlught C. I. M., Wijfjes A. H. M., Bakker P. A. H.

M., Schippers B., Lugtenberg B. (1987), “Flagella of a plant growth-

stimulating Pseudomonas fluorescens strain are required for colonization of

potato roots”, Journal of Bacteriology, 169, pp. 2769-2773.

23. Decho A. W. (1990), “Microbial exopolymer secretion in ocean environment:

Their role(s) in food web and marine process”, Oceanography and Marine

Biology: Annual Review, 28, pp. 73-153.

24. Deflaun M. F., Marshall B. M., Kulle E. P., Levy S. B. (1994), “Tn5 insertion

mutants of Pseudomonas fluorescens defective in adhesion to soil and

seeds”, Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 2637-2642.

25. Donlan R. M. (2000), “Role of biofilms in antimicrobial resistance”, American

Society for Artificial Internal Organs Journal, 46(6), pp. S47-S52.

26. Donlan R. M. (2002), “Biofilms: Microbial life on surfaces”, Emerging

Infectious Diseases, 8(9), pp. 881-890.

27. Donlan R. M., Pipes W. O., Yohe T. L. (1994), “Biofilm formation on cast iron

substrata in water distribution systems”, Water Research, 28, pp. 1497-1503.

28. Emerson D., Ghiorse W. C. (1992), “Isolation, cultural maintenance, and

taxonomy of a sheath-forming strain of Leptothrix discophora and

characterization of manganese-oxidizing activity associated with the sheath”,

Applied and Environmental Microbiology, 58, pp. 4001-4010.



29. Espinosa-Urgel M., Salido A., Ramos J. L. (2000), “Genetic analysis of

functions involved in adhesion of Pseudomonas putida to seeds”, Journal of

Bacteriology, 182, pp. 2363-2369.

30. Fall R., Kinsinger R. F., Wheeler K. A. (2004), “A simple method to isolate

biofilm-forming Bacillus subtilis and related species from plant roots”,

Systematic and Applied Microbiology, 27, pp. 372-379.

31. Flemming H. C. (1993), “Biofilm and environmental protection”, Water Science

and Technology, 27, pp. 1-10.

32. Fletcher M. (1988), “Attachment of Pseudomonas fluorescens to glass and

influence of electrolytes on bacterium-substratum separation distance”,

Journal of Bacteriology, 170, pp. 2027-2030.

33. Fujita M., Tanaka K., Takahashi H., Amemura A. (1994), “Transcription of the

principal sigma-factor genes, rpoD and rpoS, in Pseudomonas aeruginosa is

controlled according to the growth phase”, Molecular Microbiology, 13,

pp. 1071-1077.

34. Geesey G. G. (1990), Biofouling and biocorrosion in industrial water systems:

Proceedings of the international workshop on industrial biofouling and

biocorrosion, stuttg, Springer Verlag, Berlin, Germany.

35. Geesey G. G. (2001), “Bacterial behaviour at surfaces”, Current Opinion in

Biotechnology, 4, pp. 296-300.

36. Gilbert P., Das J., Foley I. (1997), “Biofilm susceptibility to antimicrobials”,

Advances in Dental Research, 11(1), pp. 160-167.

37. Haggag W. (2010), “The role of biofilm exopolysaccharides on biocontrol of

plant diseases”, Biopolymers, InTech, pp. 217-184.

38. Haggag W. M. (2007), “Colonization of exopolysaccharide-producing

Paenibacillus polymyxa on peanut roots for enhancing resistance against

crown rot disease”, African Journal of Biotechnology, 6(3), pp. 1568-1577.

39. Heukelekian H., Heller A. (1940), “Relation between food concentration and

surface for bacterial growth”, Journal of Bacteriology, 40(4), pp. 547-558.



40. Heydorn A., Nielsen A. T., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersboll B.

K., Molin S. (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel

computer program COMSTAT”, Microbiology, 146, pp. 2395-2407.

41. Hussain M., Wilcox M. H., White P. J. (1993), “The slime of coagulase -

negative staphylococci: biochemistry and relation to adherence”, FEMS

Microbiology Reviews, 104, pp. 191-208.

42. Jackson D. W., Simecka J. W., Romeo T. (2002), “Catabolite repression of

Escherichia coli biofilm formation”, Journal of Bacteriology, 184,

pp. 3406-3410.

43. Jones H. C., Roth I. L., Sanders W. M. (1969), “Electron microscopic study of a

slime layer”, Journal of Bacteriology, 99(1), pp. 316-325.

44. Kaplan J. B., Ragunath C., Ramasubbu N., Fine D. H. (2003), “Detachment of

Actinobacillus actinomycetemcomitans biofilm cells by an endogenous beta-

hexosaminidase activity”, Journal of Bacteriology, 185, pp. 4693-4698.

45. Kokare C. R., Chakraborty S., Khopade A. N., Mahadik K. R. (2009), “Biofilm:

Importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 8,

pp. 159-168.

46. Korber D. R., Lawrence J. R., Sutton B., Caldwell D. E. (1989), “Effects of

laminar flow velocity on the kinetics of surface colonization by mot+ and

mot- Pseudomonas fluorescens”, Microbial Ecology, 18, pp. 1-19.

47. Kubota H., Senda S., Nomura M., Tokuda H., Uchiyama H. (2008), “Biofilm

formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress”,

Journal of Bioscience and Bioengineering, 106(4), pp. 381-386.

48. Lamont R. J., Jenkinson H. F. (1998), “Life below the gum line: pathogenic

mechanisms of Porphyromonas gingivalis”, Microbiology and Molecular

Biology Reviews, 62, pp. 1244-1263.

49. Lazarova V., Manem J. (1995), “Biofilm characterization and activity analysis

in water and wastewater treatment”, Water Research, 29(10), pp. 2227-2245.



50. Lazarova V., Manem J. (2000), “Innovative biofilm treatment technologies for

water and wastewater treatment”, Biofilms II: process analysis and

applications, Wiley-Liss, New York, United States, pp. 159-206.

51. Lee J. W., Yeomans W. G., Allen A. L., Deng F., Gross R. A., Kaplan D. L.

(1999), “Biosynthesis of novel exopolymers by Aureobasidium pullulans”,

Applied and Environmental Microbiology, 65(12), pp. 5265-5271.

52. Lengeler J. W., Drews G., Schlegel H. G. (1999), Biology of the Prokaryotes,

Wiley-Blackwell, New Jersey, United States.

53. Leriche V., Sibille P., Carpentier B. (2000), “Use of an enzyme-linked

lectinsorbent assay to monitor the shift in polysaccharide composition in

bacterial biofilms”, Applied and Environmental Microbiology, 66,

pp. 1851-1856.

54. Matsukawa M., Greenberg E. P. (2004), “Putative exopolysaccharide synthesis

genes influence Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Journal of

Bacteriology, 186, pp. 4449-4456.

55. Mceldowney S., Fletcher M. (1986), “Variability of the influence of

physicochemical factors affecting bacterial adhesion to polystyrene

substrata”, Applied and Environmental Microbiology, 52(3), pp. 460–465.

56. Morikawa M. (2006), “Beneficial biofilm formation by industrial bacteria

Bacillus subtilis and related species”, Journal of Bioscience and

Bioengineering, 101(1), pp. 1-8.

57. Morikawa M., Kagihiro S., Haruki M., Takano K., Branda S., Kolter R., Kanaya

S. (2006), “Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces

γ - polyglutamate”, Microbiology, 152, pp. 2801-2807.

58. National Association of Corrosion Engineers (1976), “The role of bacteria in the

corrosion of oil field equipment”, Technical Practices Committee No 3,

National Association of Corrosion Engineers, Houston, Texas, pp. 23.



59. Nguyen Q. H., Nguyen T. P. L., Tran T. H. (2011), “Characterization of biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam”, VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 27(2S), pp. 187-193.

60. Notermans S., Doormans J. A., Mead G. C. (1991), “Contribution of surface attachment to the establishment of microorganisms in food processing plants: A review”, Biofouling, 5, pp. 21-36.

61. O'toole G. A., Gibbs K. A., Hager P. W., Phibbs P. V. J., Kolter R. (2000), “The global carbon metabolism regulator crc is a component of a signal transduction pathway required for biofilm development by Pseudomonas aeruginosa”, Journal of Bacteriology, 182(2), pp. 425-431.

62. O’toole G. A., Kolter R. (1998), “Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Molecular Microbiology, 30, pp. 295-304.

63. O’toole G. A., Kolter R. (1998), “Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: A genetic analysis”, Molecular Microbiology, 28, pp. 449-461.

64. Oliveira R., Melo L., Oliveira A., Salgueiro R. (1994), “Polysaccharide production and biofilm formation by Pseudomonas fluorescen: effects of pH and surface material”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2(1-3), pp. 41-46.

65. Otto K., Norbeck J., Larsson T., Karlsson K. A., Hermansson M. (2001), “Adhesion of type 1-fimbriated Escherichia coli to abiotic surfaces leads to altered composition of outer membrane proteins”, Journal of Bacteriology, 183, pp. 2445-2453.

66. Page S., Gaylarde C. (1990), “Biocide activity against Legionella and Pseudomonas”, International Biodeterioration, 26(2-4), pp. 139-148.

67. Pornsunthorntawee O., Maksung S., Huayyai O. (2009), “Biosurfactant production by Pseudonmonas aeruginosa SP4 using sequencing batch reactors: Effect of oil loading rate and cycle time”, Bioresource Technology 100, pp. 812-818.



68. Pratt L. A., Kolter R. (1998), “Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili”, Molecular Microbiology, 30(2), pp. 285-289.

69. Ramey B. E., Koutsoudis M., Von Bodman S. B., Fuqua C. (2004), “Biofilm formation in plant-microbe associations”, Current Opinion in Microbiology, 7(6), pp. 602-609.

70. Ron E. Z., Rosenberg E. (2001), “Natural roles for biosurfactants”, Environmental Microbiology, 3, pp. 229-236.

71. Sanger F., Nicklen E. F., Conlson A. R. (1997), “DNA Sequencing with chain terminating inhibitor”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(12), pp. 5403-5460.

72. Sauer K., Camper A. K., Ehrlich G. D., Costerton J. W., Davies D. G. (2002), “Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm”, Journal of Bacteriology, 184, pp. 1140-1154.

73. Schmoll T., Ott M., Oudega B., Hacker J. (1990), “Use of a wild-type gene fusion to determine the influence of environmental conditions on expression of the S fimbrial adhesin in Escherichia coli pathogen”, Journal of Bacteriology, 172(5), pp. 5103-5111.

74. Sleytr U. B. (1997), “Basic and applied S-layer research: an overview”, FEMS Microbiology Reviews, 20(1-2), pp. 5–12.

75. Stanley N. R., Lazazzera B. A. (2004), “Environmental signals and regulatory pathways that influence biofilm formation”, Molecular Microbiology, 52, pp. 917-924.

76. Steyn B. (2005), Proteomic analysis of the biofilm and biofilm – associated phenotypes of Pseudomonas aeruginosa cultured in batch, PhD dissertation, The Faculty of Natural and Agricultural Sciences, University of Pretoria, Pretoria.

77. Stoodley P., Sauer K., Davies D. G., Costerton J. W., Microbiol. A. R. (2002), “Biofilms as complex differentiated communities”, Annual review of microbiology, 56, pp. 187-209.



78. Sule P., Horne S. M., Logue C. M., Prüß B. M. (2011), “Regulation of cell division, biofilm formation, and virulence by FlhC in Escherichia coli O157:H7 grown on meat”, Applied and Environmental Microbiology, 77(11), pp. 3653–3662.

79. Sutherland I. W. (2001), “Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework”, Microbiology, 147, pp. 3-9.

80. Suwansukho P., Rukachisirikul V., Kawai F., H-Kittikun A. (2008), “Production and applications of biosurfactant from Bacillus subtilis MUV4”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 30, pp. 87-93.

81. Thys S. (2009), Effect of biosurfactants isolated from endophytes on biofilm formation by Candida albicans, Master dissertation, Universiteit gent, Novara, Italy.

82. Tolker-Nielsen T., Brinch U. C., Ragas P. C., Andersen J. B., Jacobsen C. S., Molin S. (2000), “Development and dynamics of Pseudomonas sp. biofilms”, Journal of Bacteriology, 182, pp. 6482-6489.

83. Watnick P., Kolter P. (2000), “Biofilm, city of microbes”, Journal of Bacteriology, 182(10), pp. 2675-2679.

84. Watnick P. I., Fulner K. J., Kolter R. (1999), “A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholera El Tor”, Journal of Bacteriology, 181, pp. 3606-3609.

85. Xie H., Cook G. S., Costerton J. W., Bruce G., Rose T. M., Lamont R. J. (2000), “Intergeneric communication in dental plaque biofilms”, Journal of Bacteriology, 182(24), pp. 7067-7069.

86. Zobell C. E. (1943), “The effect of solid surfaces upon bacteria activity”, Journal of Bacteriology, 46(1), pp. 39-56.

87. Zobell C. E., Anderson D. Q. (1936), “Observations on the multiplication of bacteria in different volumes of stored sea water and the influence of oxygen tension and solid surfaces”, The Biological bulletin, 71, pp. 324-342.



PHỤ LỤC

Bảng 1: Trình tự gen 16S rDNA của chủng M3.8 CTCAGGACGA ACGCTGGCGG CGTGCCTAAT ACATGCAAGT CGAGCGGACC

GACGGGAGCT TGCTCCGTTA GGTCAGCGGC GGACGGGTGA GTAACACGTG GGTAACCTGC CTGTAAGACT GGGATAACTC CGGGAAACCG GGGCTAATAC CGGATGCTTG ATTGAACCGC ATGGTTCAAT CATAAAAGGT GGCTTTTAGC

TACCACTTAC AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAACG

GCTCACCAAG GCGACGATGC GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA

CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT

CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC AACGCCGCGT GAGTGATGAA

GGTTTTCGGA TCGTAAAACT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA GTACCGTTCG

AATAGGGCGG TACCTTGACG GTACCTAACC AGAAAGCCAC GGCTAACTAC

GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT

TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG GCGGTTTCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCC

CGGCTCAACC GGGGAGGGTC ATTGGAAACT GGGGAACTTG AGTGCAGAAG

AGGAGAGTGG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG

AACACCAGTG GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGCGC

GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA

AACGATGAGT GCTAAGTGTT AGAGGGTTTC CGCCCTTTAG TGCTGCAGCA

AACGCATTAA GCACTCCGCC TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA

AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG

AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCTCTG ACAACCCTAG

AGATAGGGCT TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC

GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC

CTTGATCTTA GTTGCCAGCA TTCAGTTGGG CACTCTAAGG TGACTGCCGG

TGACAAACCG GAGGAAGGTG GGGATGACGT CAAATCATCA TGCCCCTTAT

GACCTGGGCT ACACACGTGC TACAATGGGC AGAACAAAGG GCAGCGAAGC

CGCGAGGCTA AGCCAATCCC ACAAATCTGT TCTCAGTTCG GATCGCAGTC

TGCAACTCGA CTGCGTGAAG CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT

GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAC

GAGAGTTTGT AACACCCGAA GTCGGTGAGG TAACCTTTTG GAGCCAGCCG

CC



Bảng 2: Trình tự gen 16S rDNA của chủng M4.9 CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC

GGACCGACGG GAGCTTGCTC CCTTAGGTCA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC

ACGTGGGTAA CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT

AATACCGGAT GCTTGATTGA ACCGCATGGT TCAATCATAA AAGGTGGCTT

TTAGCTACCA CTTACAGATG GACCCGCGGC GCATTAGCTA GTTGGTGAGG

TAACGGCTCA CCAAGGCGAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG

CCACACTGGG ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG

GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGAC GGAGCAACGC CGCGTGAGTG

ATGAAGGTTT TCGGATCGTA AAACTCTGTT GTTAGGGAAG AACAAGTACC

GTTCGAATAG GGCGGTACCT TGACGGTACC TAACCAGAAA GCCACGGCTA

ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA

ATTATTGGGC GTAAAGCGCG CGCAGGCGGT TTCTTAAGTC TGATGTGAAA

GCCCCCGGCT CAACCGGGGA GGGTCATTGG AAACTGGGGA ACTTGAGTGC

AGAAGAGGAG AGTGGAATTC CACGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATGT

GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTCTC TGGTCTGTAA CTGACGCTGA

GGCGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG

CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGAGG GTTTCCGCCC TTTAGTGCTG

CAGCAAACGC ATTAAGCACT CCGCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA

ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA

ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC CTCTGACAAC

CCTAGAGATA GGGCTTCCCC TTCGGGGGCA GAGTGACAGG TGGTGCATGG

TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG

CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG TTGGGCACTC TAAGGTGACT

GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC

CTTATGACCT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGGCAGAAC AAAGGGCAGC

GAAGCCGCGA GGCTAAGCCA ATCCCACAAA TCTGTTCTCA GTTCGGATCG

CAGTCTGCAA CTCGACTGCG TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGCGGATC

AGCATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC

ACCACGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGG TGAGGTAACC TTTTGGAGCC

AGCCGCC



Bảng 3: Trình tự gen 16S rDNA của chủng U1.3

AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCTGT AAGACTGGGA

TAACTCCGGG AAACCGGGGC TAATACCGGA TGGTTGTTTG AACCGCATGG

TTCAAACATA AAAGGTGGCT TCGGCTACCA CTTACAGATG GACCCGCGGC

GCATTAGCTA GTTGGTGAGG TAATGGCTCA CCAAGGCAAC GATGCGTAGC

CGACCTGAGA GGGTGATCGG CCACACTGGG ACTGAGACAC GGCCCAGACT

CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGAC

GGAGCAACGC CGCGTGAGTG ATGAAGGTTT TCGGATCGTA AAGCTCTGTT

GTTAGGGAAG AACAAGTACC GTTCGAATAG GGCGGTACCT TGACGGTACC

TAACCAGAAA GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA

GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGGGCT CGCAGGCGGT

TTCTTAAGTC TGATGTGAAA GCCCCCGGCT CAACCGGGGA GGGTCATTGG

AAACTGGGGA ACTTGAGTGC AGAAGAGGAG AGTGGAATTC CACGTGTAGC

GGTGAAATGC GTAGAGATGT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTCTC

TGGTCTGTAA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT

AGATACCCTG GTAGTCCACG CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGGGG

GTTTCCGCCC CTTAGTGCTG CAGCTAACGC ATTAAGCACT CCGCCTGGGG

AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA

GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG

TCTTGACATC CTCTGACAAT CCTAGAGATA GGACGTCCCC TTCGGGGGCA

GAGTGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG

GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG

TTGGGCACTC TAAGGTGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT

GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACACA CGTGCTACAA

TGGACAGAAC AAAGGGCAGC GAAACCGCGA GGTTAAGCCA ATCCCACAAA

TCTGTTCTCA GTTCGGATCG CAGTCTGCAA CTCGACTGCG TGAAGCTGGA

ATCGCTAGTA ATCGCGGATC AGCATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC

TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCACGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGT

TGAGGTAACC TTTTAGGAGC CAGCCGCCGA AGGTGGGACA GATGATTGGG

GTGAAGTCGT



Bảng 4: Trình tự gen 16S rDNA của chủng U3.7

GCTCAGGACG AACGCTGGCG GCGTGCCTAA TACATGCAAG TCGAGCGGAC

AGATGGGAGC TTGCTCCCTG ATGTTAGCGG CGGACGGGTG AGTAACACGT

GGGTAACCTG CCTGTAAGAC TGGGATAACT CCGGGAAACC GGGGCTAATA

CCGGATGGTT GTCTGAACCG CATGGTTCAG ACATAAAAGG TGGCTTCGGC

TACCACTTAC AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAACG

GCTCACCAAG GCGACGATGC GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA

CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT

CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC AACGCCGCGT GAGTGATGAA

GGTTTTCGGA TCGTAAAGCT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA GTGCCGTTCA

AATAGGGCGG CACCTTGACG GTACCTAACC AGAAAGCCAC GGCTAACTAC

GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT

TGGGCGTAAA GGGCTCGCAG GCGGTTTCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCC

CGGCTCAACC GGGGAGGGTC ATTGGAAACT GGGGAACTTG AGTGCAGAAG

AGGAGAGTGG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG

AACACCAGTG GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGAGC

GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA

AACGATGAGT GCTAAGTGTT AGGGGGTTTC CGCCCCTTAG TGCTGCAGCT

AACGCATTAA GCACTCCGCC TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA

AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG

AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCTCTG ACAATCCTAG

AGATAGGACG TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC

GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC

CTTGATCTTA GTTGCCAGCA TTCAGTTGGG CACTCTAAGG TGACTGCCGG

TGACAAACCG GAGGAAGGTG GGGATGACGT CAAATCATCA TGCCCCTTAT

GACCTGGGCT ACACACGTGC TACAATGGAC AGAACAAAGG GCAGCGAAAC

CGCGAGGTTA AGCCAATCCC ACAAATCTGT TCTCAGTTCG GATCGCAGTC

TGCAACTCGA CTGCGTGAAG CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT

GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAC

GAGAGTTTGT AACACCCGAA GTCGGTGAGG TAACCTTTAT GGAGCCAGCC

GCCGAAGGTG

Documents

MÀNG SINH VẬT (BIOFILM) Ở VIỆT NAM - hus.vnu.edu.vn · các sự cố tràn dầu, ứng dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như các nghiên cứu