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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA – CLAE (HPLC)
ELAINE LOPES JULHO/2012
INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA
Vem do grego “CHROMA”,
que significa “COR”
Vem do grego “GRAPHE”,
que significa “ESCREVER”
Métodos cromatográficos, de uma forma geral, permitem a separação, quantificação e
identificação de espécies químicas, ENTRETANTO a Cromatografia Líquida é uma
técnica de separação de grande resolução, mas não identifica com precisão o
composto.
INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Entre as vantagens desta técnica Diversidade de suas aplicações;
Desvantagens custo dos equipamentos, tempo para formação de um técnico ;
Uma expressão usada é que “os tempos de retenção são característicos, porém não
são exclusivos”.
Emprega-se outras técnicas espectrometria de massas, espectrometria de
infravermelho ou ressonância magnética;
INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Princípio da Técnica
Separação pela distribuição destes
componentes em duas fases que se
encontram em contato;
Durante a passagem da fase móvel pela
estacionária, os componentes da
mistura são seletivamente retido pela
fase estacionária;
A retenção seletiva pode operar por
mecanismos entrópicos e entálpicos.
Cromatografia Líquida Clássica colunas de vidro;
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High Perfomance Liquid
Chromatography (HPLC) auxílio de uma bomba de alta pressão;
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Tipos
Adsorção-Cromatografia Líquido-sólido Competição pelos sítios ativos da fase
estacionária;
Partição-Cromatografia líquido-líquido Baseada nas diferenças de solubilidade dos
componentes;
Troca iônica Diferentes tendências dos componentes iônicos da amostra a permutar
com os íons da fase estacionária;
Exclusão Os componentes são separados conforme o tamanho efetivo das
moléculas.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Classificação pelos mecanismos de separação
Cromatografia em Fase Normal
Fase Móvel APOLAR
Fase Estacionária POLAR
Exemplo uso de sílica gel com hexano ou diclorometano.
Cromatografia em Fase Reversa
Fase Móvel POLAR
Fase Estacionária APOLAR
Exemplo: uso de sílica gel modificada (C18) com metanol/água.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
Fase Móvel Fase Estacionária
K’a = Tra-to
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
Fator de Capacidade (K’) de “A” Velocidade
com que um dado composto migra ao longo da
coluna.
Tempo morto(to) Amostra não retida na coluna;
Tempo de retenção da fase móvel.
Resolução Medida quantitativa da separação
de dois picos consecutivos. OBS: Quando R = 1,5
separação é completa; Quando R = 1,0 os
picos estão somente 90% resolvidos.
Tempo de Retenção de “A” (Tra) Amostra introduzida no sistema até o ponto máximo do
pico da amostra.
Tra = tr-to
Figura: Resolução entre dois picos.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
Eficiência da coluna Número de pratos teóricos (N);
Quanto maior o valor de N MAIOR a eficiência da coluna;
Exemplos de Eficiências de Colunas:
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições
HPLC Fármacos
Cosméticos
Polímeros
Corantes
Aminoácidos, etc.
Alimentos
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Aplicabilidade
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Esquema Básico do Aparelho
O sistema cromatográfico é composto de:
Reservatório e sistema de Bombeamento da Fase Móvel (Solvente ou Solventes)
Sistema de Introdução da Amostra
Sistema Analítico (Coluna Cromatográfica – Fase Estacionária)
Sistema de Detecção
Sistema de Registro e Tratamento dos Dados
Pressão máxima de operação, fluxo, reprodutibilidade e constância do fluxo;
Todo solvente deve ser filtrado e desgaseificado;
Deve apresentar resistência a líquidos corrosivos, a facilidade de troca de fase
móvel e a limpeza do sistema;
É importante o estudo do manual da bomba;
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Bombas cromatográficas – Aspectos Importantes
Precisão das medidas Reprodutibilidade com a qual as amostras podem ser
introduzidas na coluna.
Injeção Manual pouca repetibilidade;
Injeção Automática maior repetibilidade;
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Introdução da Amostra (Injeção) – Aspectos Importantes
Podem ser universal ou seletivo;
Os detectores seletivos são compatíveis com eluição em gradiente e são usados
quando se quer minimizar interferentes;
Sensibilidade a razão entre o sinal gerado e a quantidade de amostra que
produziu o sinal;
Ruído é a variação do sinal que não é atribuído à amostra;
Linearidade deve-se guardar uma relação linear com a concentração da amostra;
Estabilidade o detector deve ser indiferente as variações de temperatura e fluxo.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Detectores – Aspectos Importantes
Ultra Violeta
Seletivo Detecta a quantidade de luz UV absorvida;
Proporcional a concentração da amostra;
É relativamente insensível as mudanças de fluxo e de temperatura
Índice de Refração
Universal Detecta a diferença de índice de refração entre a solução e o solvente empregado;
Menor sensibilidade do que detectores de UV;
Não há destruição da amostra;
Muito sensível a mudança de temperatura e pressão.
Fluorescência
Mais sensível Compostos que fluorescem;
Massas
Combina sensibilidade, versatilidade e universalidade – alto custo
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Detectores – Tipos
CROMATOGRAMA
17
Identificação dos picos
Em todo sistema cromatográfico a coluna é o “ coração” do sistema;
Segmento de tubo de aço inoxidável;
Diâmetro uniforme;
Capaz de resistir a altas pressões;
Paredes internas finamente polidas;
O aço inoxidável é o material mais usado.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
A capacidade da coluna Comprimento, diâmetro e material de empacotamento.
Diâmetro interno de cerca de 0,45 micra para separações analíticas e na faixa de 2,2 micra para
preparativas;
O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno
de 25-30 cm.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
O tamanho e a configuração das partículas
variam segundo a aplicação cromatográfica.
Estas partículas geralmente são de sílica ou
alumina e podem ser recobertas com outras
substâncias.
As partículas devem ter a menor variação de
diâmetro possível.
Quanto maior o tamanho da partícula porosa mais lento o processo de difusão;
Em consequência, mais lenta a transferência de massa entre a fase estacionária e a
fase móvel.
Conforme diminui o tamanho da partícula a profundidade dos poros diminui,
permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
Fase Normal
Fase estacionária polar Sílica, alumina, grupo amino(-NH2), grupo nitrilo (-CN);
Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter isopropílico);
O componente menos polar é eluído primeiro;
O componente mais polar é eluido depois;
Fase Reversa
Fase estacionária não polar–grupos octil (C8H17), octadecil (-C18H37);
Fase móvel relativamente polar (água, metanol,acetonitrila).
O componente mais polar é eluído primeiro;
O componente menos polar é eluido depois;
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Fase Normal x Fase Reversa
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
Sílica gel
Figura: Estrutura da sílica gel mostrando um possível poro da partícula
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes
Sílica gel
Figura: Diferentes formas de ligação entre moléculas de água e os grupos silanóis da superfície
Registrar ou manipular os dados obtidos
Registrador;
Computador
Vantagens do Computador
Aumentar a versatilidade, exatidão e precisão;
Processar os dados;
E também controlar parâmetros de análise.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Registro e Tratamento de Dados
SISTEMA CROMATOGRÁFICO Registro e Tratamento de Dados
Os solventes devem possuir:
Alto poder de solubilização das amostras;
Baixa reatividade;
Compatibilidade com o detector utilizado;
Baixa viscosidade;
Altíssimo grau de pureza (Grau HPLC);
Exemplos de solventes
FASE MÓVEL Características dos Solventes
Verdadeiro motor das separações cromatográficas;
Deve ser livre de impurezas;
Recomenda-se sua filtração e sua desgaseificação antes do uso;
Armazenamento em garrafas de vidro;
FASE MÓVEL Importância e recomendações para uma separação cromatográfica
A água é um solvente
comum na CLAE.
Entretanto, esta deve
ser purificada. Sua
armazenagem em
tambores plásticos não
é recomendada.
Isocrática quando se mantém a composição da fase móvel constante;
Programação de gradiente quando altera-se a composição da fase móvel
durante a execução da análise.
FASE MÓVEL Tipos de Eluição
Antes de desenvolver um método, é preciso definir alguns parâmetros:
Qual coluna?
Qual fase móvel?
Qual detector?
PARÂMETROS DE ANÁLISE O que usar??
A regra básica é:
Fase Estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma Fase Móvel de
polaridade diferente;
Se o analito apresentar na sua estrutura parte polar e apolar Usar coluna de fase
reversa;
Começar a eluição com uma fase móvel com alto poder de eluição:
Fase Normal – 100% diclorometano, metanol ou clorofórmio;
Fase Reversa – 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em água;
Obs: Nestas condições todos os componentes devem eluir no volume morto.
PARÂMETROS DE ANÁLISE Como definir??
PARÂMETROS DE ANÁLISE Como definir??
Início da eluição:
Fase Normal – 100% diclorometano, metanol ou clorofórmio;
Fase Reversa – 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em água;
Para aumentar a retenção, adicionar:
Fase Normal – Hexano ou Heptano;
Fase Reversa – Aumentar a porcentagem de solvente mais fraco (H2O)
Baixar o fluxo;
Trocar a coluna;
Reduzir a concentração da amostra e/ou volume da amostra.
Obs: A amostra deve ser filtrada e solúvel na FM.
PARÂMETROS DE ANÁLISE Como melhorar a eficiência da separação??
Fazer uma limpeza prévia na amostra usando um cartucho de extração de sílica ou
fase reversa;
O uso de uma pré-coluna também é recomendado;
Sempre correr um branco antes de começar a analisar a amostra;
A escolha do detector deve ser feita considerando se a amostra contém grupos
cromóforos;
PARÂMETROS DE ANÁLISE Ajustes necessários
Vantagens: Análises mais rápidas;
Melhora na separação;
Maior simetria dos picos.
PARÂMETROS DE ANÁLISE Análise com gradiente de eluição – Quando usar??
Mistura contendo 5 componentes;
FM: Hexano;
Eluição: Isocrática (tempo de análise longo);
Picos largos no final do cromatograma;
E o 5º componente não saiu.
DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 1
DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 2
Mesma mistura contendo os 5 componentes do exemplo anterior;
FM mais forte: Diclorometano;
Eluição: Isocrática;
O 5º componente foi eluído; Tempo de análise reduzido;
Perda de resolução entre os picos 1 e 2, 3 e 4
DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 3
Mesma mistura contendo os 5 componentes dos exemplos anteriores;
Empregou-se um gradiente de eluição resolução dos picos foi resolvida;
FM: 100% de Hexano até a eluição do 2º pico; A partir daí, adição de DCM a uma taxa
de 2%/min;
Composição final da FM é 100% DCM.
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Amostras:
Obter sempre o MÁXIMO de informações sobre a amostra;
Sempre filtrar!
Testar a solubilidade com a fase móvel;
Sempre que possível, usar a FM para dissolver a amostra
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Fase Móvel:
Usar SEMPRE solventes grau HPLC;
Filtrar a FM;
Usar filtro no reservatório da FM;
Evitar o uso de solventes alcalinos em colunas à
base de sílica;
FM com pH < 2 pode provocar o rompimento da
ligação Si-C
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Para desenvolvimento, usar solvente de um mesmo fabricante até o final da pesquisa;
Causa: altera o Tr, pode parecer uma “dobra” de pico, interferência no sinal, etc.
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Utilização de um solvente do fabricante B necessita de uma etapa de
purificação Remoção de contaminantes coluna de alumina
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Colunas:
Deixar a coluna equilibrar com a FM;
Nunca deixar a coluna exposta a fontes instáveis de radiação térmica;
Evitar queda da coluna;
Controlar a pressão do sistema.
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Não deixar que o leito da coluna seque;
Antes de usar uma coluna nova, avaliar sua eficiência;
Guardar a coluna no solvente adequado;
Nunca guardar uma coluna com soluções-tampão ou solventes halogenados;
Fechar as conexões da coluna.
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Mudanças em parâmetros T e P durante uma análise influenciam a resposta do
detector ;
Impurezas produzem a diminuição da resposta do detector e interferência;
Limpeza da célula do detector:
Passar solvente pelo sistema sem coluna;
Pode-se usar HNO3 6 N, MeOH, ACN, clorofórmio e hexano
Pisos achatados soluções concentradas resposta do detector não linear
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
Bombas:
Mudanças bruscas de pressão do sistema pode ser consequência de
vazamento, bolhas, etc.;
Verificar miscibilidade dos solventes; Exemplo: Uma FM com água mudando
para hexano;
Fase móvel deve ser filtrada.
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
O que causa perda de resolução?
Componentes fortemente retidos na coluna;
Coluna fisicamente danificada;
Perda de eficiência da coluna;
Coluna com sobrecarga de amostra.
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
O que causa diminuição do Tr?
Perda de sítios ativos da coluna;
A coluna pode ter sido má regenerada;
Contaminantes podem estar adsorvidos na coluna. na coluna
O que causa aumento do Tr?
Fluxo baixo;
Solvente com baixo poder de eluição. na coluna
CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO
DE PROBLEMAS
O que causa alargamento na forma do pico?
Força iônica da FM pode estar muito baixa;
Adsorção da amostra;
Perda de fase ligada – baixa eficiência;
Sobrecarga de amostra.
GRADIENTE ADEQUADO Resolução
Inadequado Solvente forte em todo cromatograma
Inadequado no início Solvente A é muito forte e
causa uma eluição rápida
Inadequado no final A troca do solvente A por B não
foi suficientemente forte e causa uma eluição rápida
GRADIENTE ADEQUADO Resolução
O que fazer para aumentar a resolução?
Diminuir a força do solvente;
Se for FN diminuir a polaridade;
Se for FR aumentar a polaridade;
Diminuir as condições iniciais;
Aumentar o tempo do gradiente;
Dobrar o fluxo.
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação
CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação