Distribución de la cefalexina y kanamicina, en el tejido mamario después de la administración intramamaria en vacas en lactación

La infusión intramamaria de medicamentos antimicrobianos (IMM) sigue siendo la forma más común para el tratamiento de la mastitis en el ganado lechero. Se espera altas concentraciones de fármaco en el sitio de la infección (Gruet et al, 2001.), Por lo tanto, la consecución de los medios es más eficaces para alcanzar y matar los agentes patógenos infecciosos. Esta razón debe ser impugnada porque la mayoría de los patógenos localizados en la ubre no se limitan a la glándula cisterna (donde las concentraciones de fármaco son más altas), también se puede encontrar profundamente en los tejidos mamarios. Además, el comportamiento farmacocinético de la mayoría de los tratamientos autorizados de mastitis IMM no están disponibles al público, es decir, el grado de distribución del fármaco desde la cisterna de la glándula en el tejido mamario con el tiempo es desconocido. Las concentraciones de la leche y de tejido rara vez son conocidos, ni si los niveles terapéuticos suficientes se mantienen durante un período de tiempo suficiente. Con IMM combinaciones de antibióticos, especialmente cuando se espera que la actividad sinérgica, la presencia y la concentración de cada compuesto en el sitio de la infección es de vital importancia.

La distribución de drogas en el tejido de la ubre puede variar sustancialmente, por ejemplo de acuerdo a sus propiedades lipofílicas (Gruet et al., 2001). La concentración de fármaco en la leche o la sangre después de la administración IMM no puede ser utilizado para estimar la concentración del fármaco en el tejido de la ubre (ehinger y Kietzmann, 2000b). Para evaluar si la actividad antibacteriana es adecuada (es decir, superior a las concentraciones mínimas inhibitorias) en el tejido glandular, las concentraciones de fármaco deben ser evaluados a partir de muestras de tejido de la ubre.

No se publicaron los detalles en las investigaciones in vivo de la distribución individual del medicament, en diferentes tiempos del trimestre. Para obtener esta información, se han propuesto distintos métodos insatisfactorios in vitro (Moore & Heider, 1984; ehinger y Kietzmann, 2000a, b). Recientemente, el aislado de la ubre bovina perfundido fue propuesto como un modelo apropiado para estudiar la farmacocinética de los fármacos después de la administración IMM. Aún no está claro si refleja con exactitud la situación in vivo (Zeitlin y Eshraghi, 2002;. Ehinger et al, 2006).

Una combinación de kanamicina y cefalexina fue autorizado recientemente en Europa para el tratamiento de la mastitis clínica (Ubrolexin, Boehringer Ingelheim Animal Health, Ingelheim, Alemania). La sinergia entre estos dos agentes contra los patógenos de mastitis fue demostrado por el tiempo de muerte mediante un análisis cinético en la leche y el medio de cultivo Mueller -Hinton (Ganiere y Denuault, 2009). Se desconoce si las interacciones sinérgicas también ocurren en el tejido de la ubre, lo que implica que ambas drogas están presentes en el mismo lugar al mismo tiempo. Este artículo se describe como un experimento original en vivo, que investigó las respectivas concentraciones de cefalexina y kanamicina en diferentes niveles de la ubre de las vacas lactantes tras la administración de la IMM.

El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética de la Escuela Nacional Veterinaria de Lyon (Vetagro, acuerdo de 1182). Se eligieron cuatro vacas lecheras Holstein saludables en

su segunda o tercera lactancia, entre 50 y 74 días en leche, con tamaño de la ubre comparable y conformación y cuatro pezones funcionales. El rendimiento medio de leche a la inclusión fue de 31.2 L/día. Los dos recuentos de células somáticas mensuales anteriores (compuesto lácteo de los cuatro trimestres) estaban por debajo de 250 células 000/mL. Se hizo un recuento de células somáticas de los cuatro pezones, también se realizó 2 días antes del tratamiento, y los valores eran todos por debajo de 119 000 células / ml. Justo antes del tratamiento, una prueba de Mastitis de California se realizó en leche de cada cuarto para detectar y retirar cualquier vaca con mastitis. Los animales fueron aislados 12-24-h durante el experimento. Las vacas fueron ordeñadas dos veces al día con un intervalo de 12 h y tuvieron libre acceso a heno y una ración de alimento regular para vacas lactantes.

Cada cuarto de ubre de la vaca fue inyectado con una suspensión IMM de 200 mg de monohidrato de cefalexina y 100 000 UI (= 133 mg) de monosulfato de kanamicina. Una sola inyección contenido con 10 ml (12 g) de la especialidad farmacéutica (Ubrolexin, Boehringer Ingelheim Animal Health) se administró a través del canal del pezón en la primera mañana después del ordeño completo de la ubre. Antes de cada toma de muestras de tejido, los animales recibieron una anestesia epidural caudal utilizando lidocaína tras una sedación de acción corta con romifidina (Sedivet®, Boehringer Ingelheim Animal Health, 0,3-0,4 mL IV). El muestreo se llevo a cabo en los animales anestesiados en posición vertical utilizando arneses para mantener la posición más fisiológica de la ubre. Cada cuarto de la ubre se divide esquemáticamente en cuatro capas horizontales superpuestas de igual tamaño, que define cuatro niveles de muestreo sucesivos, desde la base de la tetina en el abdomen a aproximadamente 6 intervalos cm (Fig. 1).

FIG. 1 Descripción de las capas de la ubre.

Las muestras de tejido fueron tomadas con una pistola de biopsia de un solo uso de 20 cm, con aguja de calibre 16 (Bard Monopty, BARD Biopsia Systems, Tempe, AZ, EE.UU.) después de una corta incisión con bisturí de la piel (5 mm). Las muestras se obtuvieron a partir de los diferentes cuartos de ubre (pezón) en cada momento. Dos vacas fueron muestreados a 1, 4, 8 y 12 h después de la administración de la suspensión IMM, respectivamente, mientras que los otros dos vacas fueron muestreados a 2, 6, 10 y 24 h después del tratamiento. Las 12 y 24h de muestreos se realizaron justo antes del ordeño. En cada punto de tiempo, se tomaron biopsias

contemporáneamente entre cuatro niveles diferentes de una mismo pezón. Dos biopsias se tomaron de cada capa, en dos direcciones diferentes dentro del mismo plano horizontal (uno por compuesto de fármaco). El método de biopsia utilizado en la capa más cercana a la tetina garantizó que las muestras no crucen la cisterna de la glándula, que contiene esencialmente la leche. De cada cuarto se tomaron muestras en un solo punto de tiempo. El peso de cada muestra fue de 17,05 ± 2,56 mg (media ± DE). Las muestras de tejido se acondicionaron inmediatamente e individualmente en tubos Eppendorf y se congelaron a 20°C hasta que se produjo la determinación analítica. Las concentraciones de Cefalexina y kanamicina se determinaron en muestras de tejido mamario mediante una cromatografía líquida interna método de acoplamiento a espectrometría de masas (LC-MS). Las referencias de las normas analíticas para la cefalexina (Ref. 33989) y sulfato de kanamicina de Streptomyces kanamyceticus (Ref. K4000) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Todos los reactivos analíticos eran de LC-MS de grado. Las muestras de tejido se mezclaron con 0,5 ml de agua ultrapura que contienen ácido tricloroacético a pH 1,9 en un tubo Eppendorf de 1 ml. A continuación, la mezcla se tritura y se colocó en un baño de ultrasonidos durante 30 min. Luego, la preparación resultante se filtró con un filtro de jeringa (fluoruro de polivinilideno, 0,45µm). Una muestra de 10-µl se inyectó directamente en el sistema de LC-MS. paralelamente, se prepararon muestras fortificadas para la calibración: tejido mamario libre de tratamiento en blanco se mezcló con soluciones estándar de las dos antimicrobianos preparados con agua ultrapura con contenido de ácido tricloroacético (pH 1,9). Las mezclas se procesaron a continuación como se describe previamente. El sistema LC-MS se compone de un sistema de cromatografía de líquidos (Agilent HP1100, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.) con un diodo UV detector de matriz fijado a 210 nm y un simple espectrómetro de masas cuádruple (Agilent MSD 1946b, Agilent Technologies Inc.) operado en el modo de ionización positivo. La El software de procesamiento fue adquirido de ChemStation B03.01 (Agilent Technologies Inc.). La separación cromatográfica se realizó en una columna estable de Bond C8 (2,1 X 50 mm, DP: 1,8µm Agilent) Operado a 60 °C, usando una elución en gradiente binario. La fase móvil A consistía en agua ultra-pura que contiene ácido tricloroacético ATPH 1,9 y la fase móvil B consistía en metanol que contiene 0,1% (v / v) de ácido fórmico. El gradiente de elución comenzó con un caudal de 0,4 mL/min con 20% de fase móvil B para lograr el 100% de fase móvil B en 4 min. Estas condiciones se mantuvieron durante 4 min. La velocidad de flujo se incrementó desde 0,4 hasta 0,6 mL/min a 1 minuto y a 13,9 min, la mezcla volvió a 20% de fase móvil B, el mantenimiento de estas condiciones hasta 16 min para devolver el sistema a las condiciones analíticas iniciales. Los parámetros del detector de masas eran 12 L/min para el secado de flujo de gas, 55 psig de presión para nebulizador, 350 °C para el secado de temperatura del gas y 4.000V para la tensión capilar. En el seguimiento de ion solo, la kanamicina apareció a m/z 485 [correspondiente a la de iones (M + H) +] con un fragmentador de 70 V y cefalexina aparecido a m/z 348 [correspondiente a la de iones (M + H) +] con un fragmentador de 40V. Los detalles analíticos se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. detalles analíticos

Antibiótico Cefalexina kanamicina

Concentración de calibración 0,50-50 1,0-80 (µg/g)LOD (µg/g) 0,30 0,7LOQ (µg/g) 0,50 1,0Precisión media en QC 13,5 (-15 a +18) 9,9 (-14 a +24) muestras% (rango)Precisión Inter-corrido % 3,0 a 27,3 (11,9) 11,6 a 24,2 (14,4) (media)

LOD, límite de detección; LOQ, límite de cuantificación; QC, control de calidad.

Las concentraciones de fármaco medidos en tiempos de muestreo sucesivos en los diferentes niveles de la ubre se presentan en las figuras 2 y 3. En cada punto de tiempo, se calcularon los valores medios a partir de mediciones realizadas en dos animales diferentes. 2 horas después del tratamiento, la concentración de cefalexina en el tejido glandular media (un promedio de cuatro capas) aumentó y alcanzó un pico a 25,9 ± 9,0 µg/g, disminuyendo linealmente a partir de entonces hasta el último tiempo de muestreo. Más de la mitad de la concentración inicial todavía se encontró en los tejidos a las 6 horas (13,2 ± 5,0 µg/g). Se redujo a alrededor del 17% a las 10 h (3,6 ± 1,6 µg/g). En 24 h, aproximadamente el 5% de la concentración inicial de cefalexina fue todavía medible en muestras de tejido. Aunque el número de muestras por capa está limitada, la disminución en las concentraciones tisulares de cefalexina desde el pezón a los niveles superiores sigue una tendencia exponencial. A 1 h, casi la mitad de la cantidad total de cefalexina medido fue en la capa más cercana a la teta, el 25% en la segunda capa y el resto se dividió entre las dos capas superiores. Alrededor de 2 h, un estado de equilibrio se alcanzó, en donde se encontraron concentraciones comparables en cada nivel individual. De 4 h en adelante, las concentraciones más altas se encontraron en los dos niveles más bajos, con concentraciones acumuladas representan el 50-65% de la concentración total de la ubre. La concentración máxima de kanamicina en el tejido glandular también se midió en 2 h (44.3 ± 10.7 µg/g). La concentración se redujo posteriormente de forma periódica, pero a un ritmo más lento que la cefalexina, con concentraciones relativamente altas se observaron hasta 12 h (12.8 ± 7.8 µg/g). La mitad de la concentración inicial aún estaba presente en la ubre a las 24 h (12.9 ± 5.6 LG / g). La kanamicina se distribuyo uniformemente entre las diferentes capas de la ubre, con concentraciones ligeramente más altas observadas en los niveles inferiores. La concentración disminuyó linealmente en todas las capas en el tiempo.

Figura. 2. Concentraciones de Cefalexina en los diferentes niveles de la ubre.

Figura. 3. Concentraciones de kanamicina en los diferentes niveles de la ubre.

Este experimento tuvo como objetivo describir y cuantificar la difusión de los dos compuestos por el barrio después de la aplicación IMM de una combinación de antibióticos. Biopsias de la ubre se tomaron de múltiples sitios de cuartos de cuatro vacas lactantes saludables a intervalos sucesivos. Para nuestro conocimiento, esta es la primera vez que el comportamiento farmacocinético de un fármaco en la glándula mamaria se ha investigado de tal manera. Franklin et al. (1986) estudio las concentraciones de la penicilina, la estreptomicina y la espiramicina en líquidos de tejido de la ubre de la especie bovina a través de la canulación de vasos linfáticos del parénquima superficiales. Concentraciones de ceftiofur en el tejido mamario se analizaron en biopsias tanto de lados no infectadas e infectados preliminarmente con Staphylococcus aureus (Owens et al., 1990). En este último estudio, las muestras de tejido fueron tomadas de sólo dos zonas de cada lado; profunda y parénquima cisternal en diversos

momentos después de la administración de antibióticos. Una metodología similar se utilizó para determinar la concentración de penicilina y novobiocina en el tejido mamario (Owens & Nickerson, 1990). Sin embargo, sólo una biopsia fue tomada en cada punto de tiempo y no se informó de su ubicación. En los estudios realizados con el aislado ubre bovina perfundido, múltiples muestras glandulares se tomaron dorsalmente al pezón (Ehinger y Kietzmann, 2000a, b; Ehinger et al, 2006;. Kietzmann et al, 2008, 2010.). En el caso de la cloxacilina, la penicilina, oxacilina y ampicilina, se consideró sólo un único tiempo de muestreo (3 o 6 h después de la administración de IMM), mientras que se utilizaron 3-4 tiempos de muestreo para evaluar la distribución de la cefquinoma en la ubre de (2, 4 y 6 h) y marbofloxacina (3, 6, 12 y 24 h), respectivamente. Esto puede ser insuficiente para evaluar la distribución de drogas con precisión a lo largo del trimestre con el tiempo, especialmente cuando se investigó una combinación de fármacos.

Por razones de bienestar, es decir, a causa de la invasividad del procedimiento, el número de vacas experimentales y la frecuencia de los puntos de muestreo se limita voluntariamente, permitiendo de este modo ninguna interpretación estadística de los datos. Sólo dos lados fueron considerados por punto de tiempo, que no puede compensar la variabilidad interindividual. Para reducir la variabilidad interindividual, las vacas libre de mastitis fueron seleccionados de acuerdo al tamaño y conformación de la ubre, el número de lactaciones y los niveles de producción de leche. Anteriormente, algunos autores han informado sobre el impacto probable de la inflamación y el estado de salud en la distribución de drogas en todo el tejido de la ubre (Owens & Nickerson, 1990;. Ehinger et al, 2004; Gehring & Smith, 2006;. Cagnardi et al, 2010; Zonca et al. , 2011). Las respectivas capacidades glandulares y el nivel de secreción de la leche de las vacas también pueden explicar las variaciones en la distribución de drogas (Ehinger y Kietzmann, 2000b;. Zonca et al, 2011). Se observó una eliminación comparativamente más lento de fármaco IMM en vacas que producen un menor volumen de leche, pero este efecto aún no está claro (Gehring & Smith, 2006). Tanto la cefalexina y kanamicina se detectaron en cada nivel de la ubre en todos los puntos de tiempo. Los dos fármacos tienen diferentes perfiles farmacocinéticos: cefalexina expresó una excelente capacidad de pasar de grandes conductos de la leche de los alvéolos, la secreción de los tejidos y, a continuación aún más en el torrente sanguíneo. La concentración máxima se alcanzó con relativa rapidez en cada capa y el limpiado de la cefalexina fue casi por completo del tejido de la ubre dentro de 24 h. La difusión de la cefalexina fue uniformemente a través de la ubre con concentraciones tisulares, disminuyendo ligeramente al aumentar la distancia vertical desde la base del pezón, como se describe anteriormente para otras beta-lactamasas (Ehinger y Kietzmann, 2000a, b). Cefalexina es un ácido débil, con un alto grado de lípo-solubilidad y una baja tasa de unión a proteínas. Treinta y seis por ciento de la cefalexina está presente en forma no ionizada en la leche a pH 6,8 (Ziv y Sulman, 1975). Esto es consistente con una distribución amplia de drogas a lo largo de la ubre y en el plasma después de la administración IMM (Ziv, 1980; Gruet et al, 2001.). Por el contrario, la kanamicina mostró una tasa de absorción más lenta, con grandes concentraciones de fármaco todavía medibles 24 h después de la administración. Esta persistencia prolongada combinado con una distribución uniforme a través de las capas de la ubre indica la captación de la droga dentro de la glándula mamaria. Este efecto se puede explicar por las características farmacológicas de la kanamicina. La kanamicina tiene un pKa alta (7,2), por lo tanto, la mayoría del fármaco se ioniza en la leche.

Además, la kanamicina se une ampliamente a las proteínas del tejido, lo que afecta la velocidad de eliminación, prolongando de este modo la persistencia de la droga en la ubre (Gehring & Smith, 2006). Esto hace que las concentraciones altas de kanamicina, sea observable a lo largo de la ubre durante un largo período de tiempo.

En este experimento, las concentraciones de la cefalexina y kanamicina en los tejidos glandulares fueron consistentes y dentro de la concentración en la leche, que también se informó anteriormente (Ganiere y Denuault, 2009;. Pilar et al, 2009). Las concentraciones de fármaco detectado en biopsias mamarias superaron las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM90) de los principales patógenos causantes de mastitis (Pilar et al., 2009). Aunque hay que reconocer que los tejidos están hechos de distintos compartimentos, por ejemplo, la leche, los líquidos intersticiales, linfa, células en las que los medicamentos no están distribuidos homogéneamente necesariamente (Mouton et al., 2008), Se puede suponer que tanto la cefalexina y kanamicina están presentes al mismo tiempo en cada nivel de la glándula mamaria después de la administración IMM. Además, las concentraciones adecuadas tanto de la cefalexina y kanamicina para permitir que se produzca sinergismo, se logra en el tejido glandular. Se informó de interacciones sinérgicas entre cefalexina y kanamicina en medio de caldo Mueller-Hinton y la leche, lo que resulta en una actividad bactericida más rápida y mejorada contra los principales patógenos de mastitis (Ganiere y Denuault, 2009). Bradley y Green (2009) reportaron que la administración de la combinación IMM kanamicina cefalexina es una cura efectiva contra; estreptococos y estafilococos, y por infecciones inducidas por coliformes. El presente experimento demostró que grandes concentraciones de ambos fármacos puede actuar en el tejido glandular durante un período suficientemente largo de tiempo para hacer de la combinación kanamicina cefalexina, una opción adecuada para el tratamiento de infecciones intramamarias, incluso en el tejido mamario más profundo. Este es el primero estudio de investigación de las variaciones en las concentraciones de fármaco respectivas en el tejido de la ubre después de la infusión IMM de una combinación de kanamicina cefalexina en vacas lactantes en vivo. La dinámica de difusión de ambos compuestos reflejan una amplia distribución a lo largo de la ubre y la persistencia de la concentración adecuada para permitir que la actividad sinérgica entre los dos antibióticos que deben alcanzarse en el tejido mamario.

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