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Biologia In Silico - Centro de Informática - UFPE
Ivan G. Costa [email protected]
Centro de InformáticaUniversidade Federal de Pernambuco
Medição de Expressão GênicaMicroarrays
Biologia In Silico - Centro de Informática - UFPE
Tópicos
• Medição de Expressão Gênica– metodos mais usados
• Microarrays– Funcionamento básico– Pipeline experimental– plataformas
• cDNA e Affymetrix
http://www.cin.ufpe.br/~igcf/aeg.html
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Métodos de Medição
• SAGE/RNA Seq– Pros: precisão– Contras: custo (tempo)
• RT-PCR, Northen Blot– Pros: alta precisão– Contras: baixa escala, custo
• Microarrays (cDNA e Oligoarrays)– Pros: larga escala, baixo-custo– Contras: ruído
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SAGE – Serial Analysis of Gene Expression
• separar celulas
• mRNA → cDNA
• cortar cDNA com enzima
• tagging
• ligar tags
• sequenciar e quantificar
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SAGE – Serial Analysis of Gene Expression
• Características:– não é preciso conhecer genes– exato – quantas copias de RNA em
uma celular– requer poucas celulas– custo (financeiro,tempo e pessoal)– Novas tecnologias -
pirosequenciamento
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Northern Blotting
• Baseado no uso de enzima de restricições e gels de agarose
• Características:– exato, baixa escala,
custo (tempo)
• Usado na validação de experimentos– RT-PCR, ...
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Microarrays Funcionamento Básico
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Microarrays
• Características:– alta escala (genomas
completos)– custo baixo (tempo,
financeiro)– presenca de ruído
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Microarray
Animação
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Microarrays - Etapas Desenho
ExperimentalDesenho
ExperimentalDesenho
ExperimentalDesenho
ExperimentalDesenho
ExperimentalDesenho
Experimental
1 Qual a hipotese biológica a ser explorada?
2 Que sondas devem estar no array? Qual plataforma?
3 Escanear array; Medir expressão de cada gene;
4 Análise dos dados; Classificação e Agrupamento
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Desenho Experimental
Design do microarray
Aquisição e processamento dos dados
Aquisição e processamento dos dados
Aquisição e processamento dos dados
Aquisição e processamento dos dados
Aquisição e processamento dos dados
Aquisição e processamento dos dados
Aquisição e processamento dos dados
Aquisição e processamento dos dados
Análise (alto nivel) dos dados
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Design Experimental (1)
• Qual o objetivo do experimento biológico?– enteder processos celulares
• expressão em relação ao tempo
– diagnóstico de cancer• expressão de diversos pacientes e tipos de
câncer
– desenvolvimento de drogas• expressão de uma celula de acordo com
varias dosagens/tipos de medicamento
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Design Experimental (2)
• Medir replicações de condições medidas– replica técnica
•usa mesmo material biológico•reduzir efeitos de ruído
– Replica biologica•usa diversos materiais biológicos
(em mesmas condições)•capturar variabilidade biologica
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Design do Microarray (1)
• Definir sondas no microarray– devem ser especifica de um gene <70%
de similaridde (cross-hidridization) – tamanho de 50-70 bases– não devem ter extrutura secundaria– baixo conteudo de CG– deve vir de sequencias do fim do genes
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Design do Microarray (2)
• Uso de multiplas sondas por gene– evitar ruidos
• São especificos do organismo e estudo• i.e. incluir apenas genes de interesse de
cancer, imunologia
• Plataformas Comerciais– design já definidos: Affymetrix, Agilent, ...
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Aquisição e Processamento de Dados
• Extração dos valores de expressão– identificação do spot– calcular intesidade do
sinal– normalizar valores
entre arrays– detecção de ruidos
Cond A Cond B Cond CGene 1 1,1 0,1 1,5Gene 2 3,1 3,4 2,1Gene 3 2,2 1,9 3... ... ...
BC
BC
A
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Analise Dados (alto nivel)• Extração de
informação – expressão
diferencial– classificação – agrupamento– ...
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Microarrays Plataformas
cDNA array Affymetrix ChipAffymetrix Chip Agilent
• Cada plataforma tem suas caracteristicas– costumização, preço, padronização,
tratamento de ruídos ...
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cDNA Microarray
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cDNA Microarray
• Confecção: uso de um robô para depositar sondas em um vidro
• Requer design do array e equipamentos in house
• Características: barato, requer trabalho inicial, customização
• Proposto por Brow Lab (Stanford)
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cDNA Microarray Confecção
• Bancos de clones com as sequencias das sondas
• Sondas tem sequencias de 400-1000 bases
• Uma sonda por gene
• ~12.000 por chip
• Processo de amplificacao pode gerar contaminação
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cDNA Microarray Experimento
• Requer sempre 2 amostras (referencia e controle)
• Cada amostra é marcada com verde (Cy3) ou vermelho (Cy5)
• Retorna apenas expressao relativa (Cy5/Cy3)
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verde (cy5)
vermelho(cy3)
cDNA Leitura - Exemplo
• Imagen é dividida em 2 canais (verde e vermelho)
• Grid é usado para identificar sondas
• Mediana da intesidade de cada circulo
• Expresão final é dada por– log(cy3/cy5)
20050
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AffymetrixMicroarray
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• Confecção: uso de um processo de litografia
• Tecnologia Comercial• Plataformas de arrays já definidas:
– Human U133, Mouse 430, ...• Características: barato, não requer
design, padronização
Affymetrix Microarray
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Affymetrix Confecção (1)
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Affymetrix Confecção (2)
• Confecção das mascaras é caro
• Escolha das sondas é feita de forma a minimizar o numero de mascaras
• Sondas vizinhas podem se contaminar
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Affymetrix Confecção (3)
• Sondas tem de 20 a 25 bases
• 20 sondas por genes (PF perfect match)
• Para cada uma sonda mismatch (MM)– uma base distinta– vizinho a sonda PM
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Affymetrix Experimento
• Marcador radiotivo
• Mede uma amostra por vez
• Razao pode ser obtida a partir do desenho experimental
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Affymetrix Leitura
• Grid quadrado é usado para marcar sondas
• Expressao absoluta do gene
PMPM
MM
PMPMPM
PM1 = 300PM1 = 0
PM2 = 2000PM2 = 100
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Affymetrix X cDNA
• Padronização X Customização• Custo Inicial:
– Baixo X Caro
• Custo de Larga Escala:– Medio X Baixo
• Qualidade– ???
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Qualidade Affy X cDNA
• Multiple Lab Comparison of Microarray Platforms, Rafael A. Irizarry et al., Department of Biostatistics, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health
•
•
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Outras Plataformas
• Agilent– Fabricação por tecnologia Inkjet– Sondas com 60 bases– Permite customização– Expressão controle e referência (2
color)– Qualidade ???
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Referencias
•
• Capitulo 1 e 2 do Causton.• Diógenes Ferreira Filho, INTRODUÇÃO À
TECNOLOGIA DE MICROARRAY
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Slides ...
• Parte dos slides foi retirado de aulas de Terry Speed, Christine Steinhof, Mateo Pardo, Tim Beissbarth