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Instituto de Ganadería de Montaña (IGM) Departamento de Nutrición y Producción de Herbívoros
Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos Mediterráneos (CIHEAM) Instituto Agronómico Mediterráneo de Zaragoza (IAMZ)
Nuevas estrategias de alimentación del ovino para mejorar la
calidad de la grasa láctea: estudio in vitro de la utilización de
taninos para modificar la biohidrogenación ruminal de los
ácidos grasos de la dieta.
Hanen Benhissi 2011
Nuevas estrategias de alimentación del ovino para mejorar la
calidad de la grasa láctea: estudio in vitro de la utilización de
taninos para modificar la biohidrogenación ruminal de los
ácidos grasos de la dieta.
Memoria de la Tesis de Máster presentada por Hanen Benhissi
dirigida por
Dra. Pilar de Frutos Fernández y Dr. Gonzalo Hervás Angulo
para la obtención del título de
Master of Science del CIHEAM en Nutrición Animal, otorgado por el IAMZ.
Zaragoza, septiembre de 2011
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos
III
Me gustaría aprovechar este espacio para mostrar mis más sinceros
agradecimientos, aunque sé que las palabras se quedarán cortas para expresar, a todas
aquellas personas e instituciones que de alguna manera, forman parte importante de este
logro tan significativo para mí.
En primer lugar, quiero agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Pilar de frutos
y el Dr. Gonzalo Hervás por haberme dado la oportunidad de trabajar en su grupo de
investigación y por trabajar intensamente en esta tesis a pesar de todos sus
compromisos. Gracias para hacer lo posible para conseguir todo a tiempo, por vuestras
correcciones, por sus compromisos y especialmente por su apoyo personal. Sin vuestro
apoyo constante, este trabajo no hubiese sido fácil…mil gracias!
De igual manera mi más sincero agradecimiento al Dr. Álvaro Belenguer por
mostrarse siempre dispuesto a cooperar en este trabajo.
Deseo manifestar también mi gratitud al CIHEAM y al Instituto Agronómico
Mediterraneo de Zaragoza (IAMZ) por su apoyo económico, académico y técnico.
Mención especial merece el Dr. Armando Occon Plazahola, coordinador Area of
Animal Production del IAMZ, por su siempre atenta y seguimiento de la marcha de este
trabajo.
También agradezco al Instituto de Ganadería de Montaña de León (IGM), por
poner a mi disposición los medios necesarios para la realización de este trabajo.
Me gustaría agradecer también al Dr. Pablo Toral, por enseñarme con mucho
ánimo a trabajar con la técnica de cromatografía de gas a pesar de todos sus
compromisos.
Así también a todo el personal del IGM, dirección, recepción, administración y
técnicos, ya que dentro de los ámbitos que a cada uno le competen me han colaborado
sin ponerme ningún impedimento, al contrario, me han brindado siempre una sonrisa.
Igualmente agradecer a mis compañeros de la sala de becarios, por todo el ánimo y
sobre todo por su valiosa amistad, Mohammed, Tamara, Ana, Elena, Lara, Carolina,
Edgar, Nancy, José y David.
Para terminar, los agradecimientos más importantes a mi familia porque a pesar
de no estar presentes físicamente, se que procuran mi bienestar desde mi país,
Agradecimientos
IV
y está claro que si no fuese por el esfuerzo realizado por ellos, mis estudios de tercer
ciclo no hubiesen sido posible.
A mis padres Zina y Labidi, mis hermanos, sobrinos, y a mis amigos Adel,
Aymen Tlahig, Fatima, Giovana, Nahla y Najet, porque a pesar de la distancia, el
ánimo, apoyo y alegría que me brindan me dan la fortaleza necesaria para seguir
adelante.
ÍNDICE GENERAL
Índice general
VII
Página
AGRADECIMENTOS .................................................................................................... I
ÍNDICE GENERAL .......................................................................................................V
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................. IX
ÍNDICE DE FIGURAS ..............................................................................................XIII
ABREVIATURAS .................................................................................................... XVII
RESUMEN ..................................................................................................................XXI
SUMMARY ................................................................................................................XXV
RÉSUMÉ ..................................................................................................................XXIX
I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................1
II. OBJETIVO .................................................................................................................5
III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...............................................................................9
III. 1. TANINOS: DENOMINACIÓN, CLASIFICACIÓN Y PROPIEDADES ...........11 III. 1. 1. Definición de los taninos ...............................................................................11 III. 1. 2. Clasificación de los taninos ...........................................................................11
III. 1. 2. 1. Taninos hidrolizables.............................................................................11 III. 1. 2. 2. Taninos condensados.............................................................................11
III. 1. 3. Propiedades de los taninos.............................................................................12 III. 1. 3. 1. Interacción con las proteínas .................................................................13
III. 2. EFECTO DE LOS TANINOS SOBRE LA FERMENTACIÓN RUMINAL ......14 III. 2. 1. Efectos sobre la microbiota del rumen ..........................................................17
III. 3. COMPUESTOS BIOACTIVOS DE LA LECHE.................................................18 III. 3. 1. Ácido linoleico conjugado (CLA) .................................................................20 III. 3. 2. Origen del CLA de la leche ...........................................................................21
III. 3. 2. 1. Metabolismo lipídico en el rumen .........................................................22 III. 3. 2. 2. Síntesis en la glándula mamaria ............................................................22
III. 4. ESTRATEGIAS NUTRICIONALES PARA AUMENTAR EL CONTENIDO DE CLA EN LA LECHE .......................................................................24
III. 4. 1. Suplementación de la dieta con aceites vegetales u otros compuestos..........24 III. 4. 1. 1. Empleo de aceites vegetales ..................................................................25 III. 4. 1. 2. Utilización de semillas oleaginosas.......................................................25 III. 4. 1. 3. Suplementos de origen marino ..............................................................26 III. 4. 1. 4. Uso de taninos .......................................................................................26
IV. PLANTEAMIENTO Y DISEÑO EXPERIMENTAL .........................................29
V. MATERIAL Y MÉTODOS .....................................................................................33
V. 1. TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES.............................................................35 V. 2. CULTIVOS DISCONTINUOS DE MICROORGANISMOS RUMINALES
Y TECNICA DE PRODUCCIÓN DE GAS. ..............................................................36
Índice general
VIII
V. 2. 1. Animales donantes del inóculo ruminal .........................................................36 V. 2. 2. Procedimientos ...............................................................................................36
V. 2. 2. 1. Cinética de fermentación ruminal...........................................................37 V. 2. 2. 2. Degradación ruminal in vitro..................................................................39 V. 2. 2. 3. Parámetros indicativos de fermentación ruminal y perfil lipidico..........40
V. 2. 3. Análisis químicos ...........................................................................................40 V. 2. 3. 1. Alimentos y residuos de la incubación ...................................................40 V. 2. 3. 2. Amoniaco y ácidos grasos volátiles........................................................41 V. 2. 3. 3. Ácidos grasos de cadena larga................................................................42
V. 2. 4. Cálculos y análisis estadísticos.......................................................................43
VI. RESULTADOS........................................................................................................45
VI. 1. FERMENTATIÓN RUMINAL IN VITRO..........................................................47 VI. 2. BIOHIDROGENACIÓN RUMINAL DE LOS ÁCIDOS GRASOS ...................50
VII. DISCUSIÓN ...........................................................................................................55
VII. 1. FERMENTACIÓN RUMINAL IN VITRO ........................................................57 VII. 1. 1. Efecto de la suplementación lipídica ...........................................................57 VII. 1. 2. Efecto del aporte de taninos .........................................................................58
VII. 2. BIOHIDROGENACIÓN RUMINAL DE LOS ÁCIDOS GRASOS ..................62
VII. 2. 1. Efecto de la suplementación lipídica ...........................................................62 VII. 2. 2. Efecto del aporte de taninos .........................................................................67
VIII. CONCLUSIONES................................................................................................71
IX. BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................75
ÍNDICE DE TABLAS
Índice de tablas
XI
Página
Tabla 1. Composición química de la TMR utilizada como sustrato en los cultivos in vitro .............................................................................................................................36
Tabla 2. Ingredientes y composición química de la dieta administrada a los animales donantes............................................................................................................37
Tabla 3. Composición química del medio de incubación................................................39
Tabla 4. Parámetros cinéticos de producción de gas: A (ml/g MO; producción acumulada de gas), c (/h; ritmo fraccional de fermentación), AFR (ml gas/h; ritmo medio de fermentación), DE24 (g/g; degradabilidad efectiva), DMS72 (%; degradación de materia seca tras 72 horas de incubación in vitro) y DMO72 (%; degradación de materia orgánica tras 72 horas de incubación in vitro). Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo .................................................................................48
Tabla 5. Valores de pH, concentración de amoniaco (mg/l), producción de ácidos grasos volátiles totales (AGV total; mmol/l) y relación acético/propiónico (A/P). Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo ..........................................................................49
Tabla 6. Proporciones molares (%) de ácido acético, propiónico, butírico y otros (valérico, isobutírico, isovalérico y caproico). Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo ............................................................................................................................50
Tabla 7. Concentraciones (mg/g de digesta) de diversos ácidos grasos de cadena larga de la digesta ruminal. Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo ..........................52
Tabla 8. Concentraciones (mg/g de digesta) de ácidos grasos cis de la digesta ruminal. Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo .......................................................53
Tabla 9. Concentraciones (mg/g de digesta) de ácidos grasos trans de la digesta ruminal. Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo .......................................................54
ÍNDICE DE FIGURAS
Índice de figuras
XV
Página
Figura 1. Estructura molecular de los galotaninos y elagitaninos (Khanbabaee y van Ree, 2001).................................................................................................................12
Figura 2. Molécula de tanino condensado (Khanbabaee y van Ree, 2001).....................12
Figura 3. Estructura molecular de los ácidos ruménico (cis-9 trans-11 18:2; A) y linoleico (cis-9 cis-12 18:2; B) (Palmquist et al., 2005)..................................................21
Figura 4. Rutas principales de formación de cis-9 trans-11 18:2 en el rumen y en la glándula mamaria de rumiantes (Palmquist et al., 2005).............................................23
Figura 5. Cinéticas de producción de gas en los diferentes tratamientos ........................59
Figura 6. Concentraciones (mg/g de digesta) de los 18:2 no conjugados totales, del cis-9 cis-12 18:2, de CLA total y del cis-9 trans-11 CLA en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) ...........................................63
Figura 7. Concentraciones (mg/g de digesta) de los 18:1 totales y del 18:0 en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) ......................63
ABREVIATURAS
Abreviaturas
XIX
A.........................Producción asintótica de gas
AFR ...................Ritmo medio de fermentación
AG .....................Ácidos grasos
AGS ...................Ácidos grasos saturados
AGV ..................Ácidos grasos volátiles
A/P.....................Relación acético/propiónico
BH......................Biohidrogenación
c .........................Ritmo fraccional de producción de gas
CLA ...................Ácido linoleico conjugado
DE24 ...................Degradabilidad efectiva
DHA ..................Ácido docosahexaenoico
DMS72................Desaparición de MS tras 72 horas de incubación
DMO72 ...............Desaparición de MS tras 72 horas de incubación
EPA....................Ácido eicosapentaenoico
FAD ...................Fibra ácido detergente
FAME ................Ésteres metílicos de ácidos grasos
FND ...................Fibra neutro detergente
G ........................Tasa de producción de gas
kp .......................Ritmo de paso
LA......................Ácido linoleico
MO.....................Materia orgánica
MS .....................Materia seca
MUFA................Ácidos grasos monoinsaturados
N ........................Nitrógeno
OMS ..................Organización Mundial de la Salud
P.........................Probabilidad (nivel de significación)
PUFA.................Ácidos grasos poliinsaturados
PB ......................Proteína bruta
PEG....................Polietilenglicol
RA......................Ácido ruménico
SA......................Ácido estéarico
t ..........................Tiempo
TC ......................Taninos condensados
TH......................Taninos hidrolizables
TMR ..................Ración completa mezclada (total mixed ration)
VA .....................Ácido vaccénico
RESUMEN
Resumen
XXIII
Estudios recientes han propuesto que la suplementación de la dieta de rumiantes
con taninos podría ser una buena estrategia para alterar el proceso de biohidrogenación
ruminal (BH) de los ácidos grasos poliinsaturados de la dieta y favorecer la
acumulación de ácido vaccénico gracias a una inhibición del último paso de la BH. El
objetivo final de esta estrategia sería aumentar el contenido de algunos ácidos grasos
saludables (e. g., vaccénico y linoleico conjugado, CLA) en los productos finales de los
rumiantes. Sin embargo, los resultados al respecto son sumamente escasos e
inconsistentes.
Por lo tanto, este trabajo se planteó con el objetivo de estudiar, en ovejas, el efecto
de la adición de taninos a una dieta completa mezclada (TMR; relación
forraje:concentrado 40:60) enriquecida con un 2% de aceite de girasol (como fuente de
ácido linoleico para la síntesis de vaccénico en el rumen), sobre la fermentación ruminal
y la BH de los ácidos grasos, con especial atención a la acumulación de los principales
metabolitos del proceso.
El estudio se llevó a cabo in vitro mediante cultivos discontinuos de
microorganismos ruminales y la técnica de producción de gas, siguiendo un diseño
experimental (4 × 2) + 2, es decir, 4 tipos de taninos [2 hidrolizables (TH: castaño y
roble) y 2 condensados (TC: quebracho y uva)] × 2 dosis de cada uno (2 y 5% MS) + 2
controles (uno negativo -la dieta sin el suplemento lipídico- y otro positivo -la dieta
suplementada con aceite de girasol-). Como donantes del inóculo ruminal se utilizaron 4
ovejas canuladas en el rumen que fueron alimentadas con una dieta similar a la TMR
utilizada como sustrato en los cultivos.
De acuerdo con la cinética de producción de gas, solo algunos tratamientos con
taninos consiguieron reducir significativamente el ritmo de producción de gas, en tanto
que la mayoría redujo la degradabilidad efectiva en el rumen (DE24).
Con respecto a otros parámetros indicativos de la fermentación ruminal, la
suplementación de la dieta con taninos tuvo efectos limitados sobre los valores de pH y
la producción de AGV pero provocó una disminución notable de la concentración de
amoniaco, seguramente debido a una inhibición de la proteólisis ruminal. Dicha
reducción fue más pronunciada con los TH y con la dosis más alta (5%), lo cual
confirma que el efecto de estos compuestos polifenólicos depende del tipo y de la
concentración utilizados.
Resumen
XXIV
En relación al perfil lipídico de la digesta ruminal, los resultados de este
experimento mostraron que ninguno de los cuatro taninos, a ninguna de las dos dosis
empleadas, consiguió modificar el contenido ruminal de los ácidos grasos trans-11 18:1,
cis-9 trans-11 18:2 y CLA total. Tampoco alteraron los contenidos de 18:0 y trans-10
18:1.
Por el contrario, sí se detectaron incrementos significativos, debidos a la acción de
los taninos, en los niveles de determinados ácidos grasos como el linolénico, linoleico y
oleico, que apuntarían a una inhibición general del proceso de BH ruminal y no a una
inhibición específica del último paso (es decir, de la reducción de los 18:1 a 18:0).
La mayor parte de los resultados significativos se observaron en los tratamientos
con TH (castaño al 2 y al 5% y roble al 5%), lo que se explicaría probablemente por las
diferencias químicas y estructurales entre diferentes tipos de taninos. Esto demostraría
de nuevo la importancia tanto del tipo de tanino como de la dosis empleada.
En conjunto, los resultados de este estudio no permiten recomendar el tratamiento
con taninos de una dieta rica en ácido linoleico (i. e., suplementada con un 2% de aceite
de girasol) cuando el objetivo final es modular la BH ruminal para mejorar la calidad
nutricional de la grasa láctea de ovejas.
SUMMARY
Summary
XXVII
Recent studies have suggested that supplementing the diet of ruminants with
tannins may be a good strategy to modulate the process of ruminal biohydrogenation
(BH) of dietary polyunsaturated fatty acids and enhance the accumulation of vaccenic
acid due to an inhibition of the last step of BH. The ultimate goal of this strategy would
be to increase the content of some healthy fatty acids (such as conjugated linoleic acid –
CLA- and vaccenic acid) in the ruminant products. However, reports on this issue are
scarce and inconsistent.
Therefore, this experiment was conducted to study, in sheep, the effect of the
addition of tannins to a total mixed ration (TMR; relationship forage:concentrate 40:60)
supplemented with 2% of sunflower oil (as a source of linoleic acid for the synthesis of
vaccenic acid in the rumen), on ruminal fermentation and BH of fatty acids, with special
attention to the accumulation of the most important metabolites.
The experiment was conducted in vitro using batch cultures of rumen
microorganisms and the gas production technique, following an experimental design (4
× 2) + 2: 4 types of tannins [2 hydrolysable (HT: chestnut and oak) and 2 condensed
(CT: quebracho and grape) tannins] × 2 doses of each one (2 and 5% DM) + 2 controls
(one negative -the diet without lipid supplementation- and one positive -the diet
supplemented with sunflower oil-). Four ewes cannulated in the rumen fed a diet similar
to the TMR used as substrate in the cultures were used as donors of ruminal inoculum.
According to the kinetics of gas production, only some treatments with tannin
were able to reduce significantly the rate of gas production, while most of them
decreased the effective degradability in the rumen (DE24).
With respect to other indicators of rumen fermentation, dietary supplementation
with tannins had limited effects on the values of pH and VFA production but resulted in
a noticeable decrease in ammonia concentration, probably due to the inhibition of
ruminal proteolysis. This reduction was stronger with HT and with the highest dose
(5%), confirming that the effect of these polyphenolic compounds depends on the type
and concentration used.
Regarding the lipid profile of the ruminal digesta, the results of this experiment
showed that none of the four tannins and none of the two doses used, were able to
modify the rumen contents of trans-11 18:1, cis-9 trans-11 18:2 and total CLA. The
levels of 18:0 and trans-10 18:1 were not changed either.
Summary
XXVIII
However, significant increases, due to the action of tannins, were detected in the
concentration of specific fatty acids, such as linoleic, linolenic and oleic acids, which
would suggest a general inhibition of the ruminal BH process rather than a specific
inhibition of the last step (reduction of 18:1 to 18:0).
Most of the significant results were observed in treatments with HT (chesnut at 2
and 5% and oak at 5%), which would be probably explained by the chemical and
structural differences among different types of tannins. This would demonstrate again
the importance of the type and the dose of tannins.
Overall, the results of this study do not allow to recommend the treatment with
tannins of a diet enriched in linoleic acid (i. e., supplemented with 2% of sunflower oil)
when the ultimate goal is to modulate ruminal BH to improve the nutritional quality of
ewe milk fat.
RÉSUMÉ
Résumé
XXXI
Des études récentes ont suggéré que la supplémentation de la diéte des ruminants
avec des tanins pourrait être une bonne stratégie pour modifier le processus de
biohydrogenation ruminale (BH) des acides gras polyinsaturés de la diéte et promouvoir
l'accumulation de l'acide vaccénique, grâce à une inhibition de la dernière étape de BH.
L’objectif final de cette stratégie serait l’augmentation des contenus de quelques acides
gras sanitaires (tels que les acides vaccénique et linoléique conjugué CLA) au niveau
des produits finaux de ruminants. Cependant, les résultats à cet égard sont peu
nombreux et incohérents.
Par conséquent, cette étude a été menée dans l’objectif d’étudier chez les ovins,
l'effet de l'ajout de tanins à une ration mixte complète (TMR; relation
fourrage:concentré 40:60) enrichie avec 2% d'huile de tournesol (servant comme source
d'acide linoléique pour la synthèse d’acide vaccénique au niveau du rumen), sur la
fermentation ruminale et la BH des acides gras, avec une attention particulière à
l'accumulation des métabolites majeurs du processus de BH.
L’étude a été réalisée in vitro moyennant des cultures discontinues de
microorganismes ruminaux et la technique de production de gaz, suivant un modèle
expérimental (4×2) + 2: 4 types de tanins [2 tanins hydrolysables (TH: châtaignier et
chêne ) et 2 condensés (TC: quebracho et raisin)] × 2 doses pour chacun d’eux (2 et 5%
MS) + 2 contrôles (l’un est négatif -la diéte sans supplémentation lipidique- et l’autre
est positif -la diéte supplémentée avec l’huile de tournesol-). Quatre brebis équipées
d’une canule ruminale, qui ont été nourries avec une ration similaire à la TMR
employée comme substrat dans les cultures, ont été utilisées en tant que donatrices
d'inoculum ruminal pour les incubations.
Selon la cinétique de production de gaz, seulement quelques traitements ont été
capables de réduire significativement le taux de production de gaz, tandis que la
majorité d’eux a pu réduire la dégradabilité effective (DE24) au niveau du rumen.
Concernant les autres paramètres indicatifs de la fermentation ruminale, la
supplémentation de la diéte avec des tanins a engendré des effets limités sur les valeurs
de pH et la production des acides gras volatiles (AGV), mais elle a entrainé une chute
notable de la concentration d’ammoniac due à l'inhibition de la protéolyse ruminale.
Résumé
XXXII
Cette réduction a été plus prononcée avec les TH et la dose la plus élevée (5%),
confirmant que l'effet de ces composés polyphénoliques dépend du type et de la
concentration utilisés.
En ce qui concerne le profil lipidique de la digesta ruminal, les résultats de cet
essai ont montré qu'aucun des quatre tanins testés (quebracho, raisin, châtaignier et
chêne) à aucune des deux doses (2 et 5%) a réussi à modifier le contenu ruminal des
acides gras trans-11 18:1, cis-9 trans-11 18:2 et CLA total ni altérer les niveaux de 18:0
et trans-10 18:1.
Au contraire, des augmentations significatives, dues à l’action des tanins, ont été
observées au niveau des concentrations d’autres acides gras bien déterminés tels que les
acides linoléique, linolénique et oléique, ce qui indiquerait une inhibition générale du
processus de BH ruminale plutôt qu'une inhibition spécifique de la dernière étape
(réduction des 18:1 à 18:0).
La majorité des résultats significatifs a été observée avec les traitements de TH
(châtaignier à 2 et 5% et chêne à 5%), ce qui s’explique probablement par les
différences chimiques et structurelles entre les différents types de tanins. Ceci
démontrerait de nouveau l'importance du type de tanin ainsi que de la dose utilisée.
Globalement, les résultats de cette étude ne permettent pas de recommander le
traitement d’une diéte enrichie en acide linoléique (supplémentée avec 2% d'huile de
tournesol) avec des tanins lorsque le but final est la modulation de la BH ruminal afin
d’améliorer la qualité nutritionnelle de la grasse laitière de brebis.
I. INTRODUCCIÓN
Introducción
3
Según estimaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS), tres cuartas
partes de las muertes prematuras que se produzcan en el mundo en el año 2020 estarán
causadas por enfermedades crónicas de tipo cardiovascular, metabólico y degenerativo,
resultantes de los cambios en la alimentación de la población (OMS, 2003)
La dieta, que tiene un papel fundamental como factor de riesgo para dichas
enfermedades, también puede tenerlo en su prevención. Así, en las sociedades
industrializadas existe una demanda creciente de alimentos funcionales que, además de
mantener el carácter natural y los atributos sensoriales de los productos tradicionales,
proporcionen beneficios para la salud del consumidor (Shingfield et al., 2008; Siró et
al., 2008).
La leche es uno de esos alimentos que pueden considerarse funcionales o que
gozan de una funcionalidad natural. Lo atestigua en particular su alto contenido en
algunos ácidos grasos (AG) que poseen actividad biológica reconocida. Entre ellas
destaca, por sus potenciales efectos beneficiosos para la salud humana, el ácido
linoleico conjugado (conocido internacionalmente como CLA por sus siglas en inglés),
que describe un conjunto de isómeros posicionales y geométricos del ácido linoleico
con los dobles enlaces conjugados en distintas posiciones de la molécula (Palmquist et
al., 2005).
Si bien la presencia del CLA en la leche ya fue descrita hace décadas, fue a partir
de los años 80 cuando atrajo la atención del mundo científico, a raíz del descubrimiento
de su potencial acción anticancerígena. Con el tiempo, se le han ido atribuyendo otras
propiedades beneficiosas para la salud humana, como son, por ejemplo, su actividad
antiarteriosclerótica, antidiabética y de potenciación del sistema inmune (Pariza et al.,
2001).
Actualmente, se supone que el ácido graso cis-9 trans-11 18:2 (ácido ruménico,
RA), isómero más abundante del CLA, es el principal responsable de los efectos
potenciales beneficiosos para la salud de los humanos que se le atribuyen al CLA.
Algunos trabajos han señalado que el aporte de ácidos linoleico o linolénico con
la dieta de los rumiantes (por ejemplo, mediante la incorporación de aceite de girasol,
pasto o semillas de lino) permite aumentar la producción del ácido vaccénico en el
rumen para dar lugar después a una mayor concentración de CLA en la leche (Chilliard
et al., 2007, Gómez-Cortés et al., 2008; Hervás et al., 2008). Sin embargo, una parte
Introducción
4
importante de dicho VA será reducida a 18:0 (ácido esteárico), como paso último de la
biohidrogenación ruminal (Palmquist et al., 2005). No obstante, el RA que aparece en la
leche deriva no solo del producido en el rumen, sino también de su síntesis endógena en
la glándula mamaria a partir del trans-11 18:1 (ácido vaccénico, VA), gracias a la
acción de la enzima delta-9 desaturasa (Palmquist et al., 2005).
Trabajos recientes han señalado que el empleo de taninos, que han sido durante
mucho tiempo considerados como compuestos secundarios con efectos negativos en la
alimentación de los rumiantes (McSweeney et al., 2001b), podría ser un método
prometedor para inhibir el paso del vaccénico a esteárico en el rumen y favorecer un
flujo post-ruminal rico en VA capaz de aumentar la síntesis endógena de CLA e
incrementar su contenido en la leche (Khiaosa-Ard et al., 2009; Vasta et al., 2009a).
Sin embargo, los datos al respecto son sumamente escasos e inconsistentes. Así,
aunque algunos trabajos in vitro han puesto de manifiesto un incremento de los niveles
de VA y RA en el rumen (Khiaosa-Ard et al., 2009; Vasta et al., 2009a,b), estudios in
vivo han demostrado efectos opuestos o una ausencia de efecto de estos metabolitos
sobre el perfil lipídico de la grasa de leche (Benchaar y Chouinard, 2009; Cabiddu et al.,
2009, Toral et al., 2011).
Por ello, sigue siendo necesaria más investigación para aclarar los efectos de la
suplementación de la dieta de los rumiantes con taninos sobre el proceso de
biohidrogenación ruminal de los ácidos grasos insaturados y consecuentemente sobre el
perfil lipídico de la leche.
II. OBJETIVO
Objetivo
7
Este estudio se planteó con el objetivo concreto de estudiar, en ovejas, el efecto de
la adición de taninos a una dieta enriquecida con ácido linoleico (gracias a la adición de
aceite de girasol), sobre la fermentación ruminal y la biohidrogenación de los ácidos
grasos en el rumen, con especial atención a la acumulación de determinados
metabolitos.
III. REVISÓN BIBLIOGRÁFICA
Revisión bibliográfica
11
III. 1. TANINOS: DENOMINACIÓN, CLASIFICACIÓN Y PROPIEDADES
III. 1. 1. Definición de los taninos
Los taninos son un grupo muy complejo de compuestos fenólicos que se
encuentran en numerosas especies vegetales que pueden ser consumidas por los
rumiantes. El término “tanino” es un término bastante antiguo que deriva del francés
“tanner” y que hace referencia al curtido de las pieles. Aunque los taninos son
sustancias que no están bien definidas químicamente, se consideran como tal aquellos
compuestos fenólicos, con un alto peso molecular, que poseen la capacidad de formar
complejos reversibles o irreversibles con las proteínas principalmente, y también con
otras moléculas, tales como polisacáridos (celulosa, hémicelulosa, pectina…),
alcaloides, ácidos nucleicos, minerales, etc. (McLeod, 1974; Doce, 2010; Schofield et
al., 2001).
III. 1. 2. Clasificación de los taninos
Convencionalmente, aunque de modo un poco simplista según diversos autores,
los taninos se dividen en dos grandes grupos: los taninos hidrolizables y los taninos
condensados o proantocianidinas (McLeod, 1974; McMahon et al., 2000):
III. 1. 2. 1. Taninos hidrolizables (TH)
Son polialcoholes constituidos por un carbohidrato en posición central,
generalmente D-glucosa, cuyos grupos hidroxilo se encuentran esterificados con grupos
fenólicos [básicamente ácidos gálico (galotaninos) o elágico (elagitaninos); figura 1].
Son compuestos fácilmente hidrolizables tanto por ácidos y bases como por vía
enzimática.
III. 1. 2. 2. Taninos condensados (TC)
Son oligómeros o polímeros no ramificados de flavonoides (flavan-3-ol, flavan-
3,4-diol), unidos mediante enlaces carbono-carbono y carecen del núcleo glucidico que
caracteriza a los taninos hidrolizables, tal y como muestra la figura 2 (Khanbabaee y
van Ree, 2001; Haslam, 2007). Este tipo de taninos no hidrolizables poseen, en general,
un peso molecular mayor que los TH (1000-20000 vs. 500-3000; Mueller-Harvey,
1999).
Revisión bibliográfica
12
Figura 1. Estructura molecular de los galotaninos y elagitaninos (Khanbabaee y van Ree, 2001).
Figura 2. Molécula de tanino condensado (Khanbabaee y van Ree, 2001).
III. 1. 3. Propiedades de los taninos
Entre las propiedades químicas más notables de los taninos, caben reportar: su
poder reductor derivado de su capacidad para absorber oxígeno, especialmente en
soluciones alcalinas (Chyau et al., 2002), su actividad antioxidante (Malencic et al.,
2008) y su excelente capacidad como agente quelante que les permite unirse con
diversos iones metálicos (e. g., Fe3+, Al3+, Cu2+) y formar complejos que pueden
precipitar en soluciones acuosas (Santos-Buelga y Scalbert, 2000).
Sin embargo, la característica más importante de los taninos radica en su
capacidad para formar complejos estables con las proteínas y con otros polímeros tales
(Catequina)n
(Catequina)n
Galotaninos Elagitaninos
Revisión bibliográfica
13
como los polisacáridos, dependiendo de su grado de polimerización y peso molecular
(Hofmann et al., 2006). Esta propiedad será descrita a continuación con mayor detalle,
debido a su particular repercusión en la nutrición de los rumiantes.
III. 1. 3. 1. Interacción con las proteínas
Los taninos son sustancias vegetales caracterizadas químicamente como
polifenoles, con una elevada afinidad por las proteínas con las que pueden formar
complejos estables (Xu y Diosady, 2000; Hofmann et al., 2006).
La elevada afinidad de estos metabolitos por las proteínas se basa en que la
molécula de tanino presenta múltiples grupos fenólicos y anillos que proveen
numerosos puntos para la formación de cuatro tipos de enlaces con las proteínas (Xu y
Diosady, 2000), de los cuales los más frecuentes son los dos últimos (Poncet-Legrand et
al., 2006):
Enlaces iónicos reversibles entre el grupo aniónico del tanino y el grupo
catiónico de la molécula proteica.
Enlaces covalentes irreversibles formados por la oxidación de los polifenoles
a quinonas y su posterior condensación con un grupo nucleofílico de la
proteína.
Interacciones hidrofóbicas entre el anillo aromático del compuesto fenólico y
los regiones hidrofóbicas de la proteína. Estos enlaces son de tipo reversibles
y se producen generalmente entre los taninos condensados y las proteínas.
Puentes de hidrógeno reversibles entre los radicales hidroxilo que presentan
los taninos y el oxígeno del grupo carbonilo de los péptidos de las cadenas
proteicas.
Históricamente, se creyó que los taninos ligaban y precipitaban todas las proteínas
de manera no específica, pero ahora se sabe que las interacciones tanino-proteína son
específicas y dependen de las características de la proteína y del tanino (Mueller-
Harvey, 1999; Hofmann et al., 2006) y de las condiciones del medio donde se lleva a
cabo la formación del complejo tanino-proteína (Hagerman y Butler, 1978). Así, es
posible observar que, en el caso de las moléculas proteicas, una conformación
tridimensional abierta, un elevado peso molecular y un alto contenido en aminoácidos
Revisión bibliográfica
14
tales como la prolina o aminoácidos hidrofóbicos, confiere una mayor afinidad por los
taninos (Asquith y Butler, 1986).
El tipo, la estructura, la concentración, la solubilidad y el peso molecular del
tanino son también determinantes del grado de afinidad que estos polifenolos muestran
por las proteínas (Poncet-Legrand et al., 2006).
Además de las características propias de los taninos y de las proteínas, existen
otros factores ligados al medio que pueden influir en la formación y la precipitación de
los complejos tanino-proteína. Entre estos factores, el más importante es el pH
(McNabb et al., 1998). En este sentido, se ha demostrado que tanto los TH como los TC
forman complejos tanino-proteína que resultan estables en rangos de pH comprendidos
entre aproximadamente 3,5 y 8. Estos complejos, estables por tanto a pH ruminal, se
disocian posteriormente debido al pH del abomaso (2,5-3) y del duodeno
(aproximadamente 8) (McLeod, 1974; Muller-Harvey y McAllan, 1992).
III. 2. EFECTO DE LOS TANINOS SOBRE LA FERMENTACIÓN RUMINAL
El efecto de los taninos sobre el proceso de fermentación ruminal puede variar
considerablemente en función de su tipo, su estructura y peso molecular, la cantidad
consumida y de la especie rumiante que los consuma (Barahona et al., 2003; Hervás et
al., 2003; Frutos et al., 2004a).
En relación con el tipo de tanino, ya que los TH pueden ser rápidamente
hidrolizados y degradados en el rumen a glucosa y compuestos fenólicos de menor
tamaño (McSweeney et al., 2001b), diversos autores han señalado que estos provocan
un efecto menos acentuado que los TC (e. g., Bento et al., 2005; Getachew et al., 2008).
Muchos otros, sin embargo, han confirmado un efecto más acusado de los TH (Frutos et
al., 2004a; Martínez et al., 2005; Mutarabuka et al., 2007). Así, por ejemplo, Frutos et
al. (2004a) observaron, en un experimento realizado con ganada ovino, caprino y
bovino, que el efecto del ácido tánico (modelo de TH) sobre la fermentación ruminal in
vitro, fue más pronunciado que el del quebracho (modelo de TC).
Las características químicas de los taninos pueden ser también determinantes de
su efecto. Así, varios autores (e. g., Aerts et al., 1999; Stürm et al., 2007) han
Revisión bibliográfica
15
evidenciado que especies botánicas con un contenido similar de taninos, muestran un
efecto nutricional diferente.
Aerts et al. (1999), por ejemplo, observaron que, a pesar de tener contenidos
similares, los TC presentes en Lotus pedunculatus fueron más efectivos que los de L.
corniculatus en la reducción de la degradación de la proteína ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa oxigenasa extraída de Trifolium repens. Según Foo et al. (1997), este
diferente efecto podría estar relacionado con los distintos pesos moleculares, estructuras
y diferente riqueza de prodelfinidina de ambos taninos.
Con respecto a la cantidad consumida, los resultados recogidos en la literatura
científica son muy dispares debido a múltiples motivos. Por una parte, las diferentes
técnicas utilizadas en los distintos ensayos de nutrición animal (e. g., pruebas in vitro, in
situ) pueden no reflejar los mismos resultados (Makkar, 2005).
En esta línea, mientras Mathieu y Jouany (1993) observaron que la degradación
proteica in vitro de la harina de soja se reducía de forma exponencial a medida que se
incrementaba la cantidad de extracto de taninos de castaño incluida en la incubación (i.
e., desde 0 hasta 53 g TH/kg MS), Decruyenaere et al. (1993), mediante la técnica in
situ, no registraron una modificación de la degradación de dicho sustrato con la adición
de hasta 25 g del mismo extracto de tanino.
Por otra parte, se ha indicado que la relación entre el contenido de taninos
cuantificados químicamente y su efecto biológico pueden no mostrar una buena
correlación, lo cual evidencia la conveniencia de utilizar métodos que cuantifican la
actividad biológica de los taninos como, por ejemplo, la técnica de producción de gas in
vitro, en presencia y ausencia de polietilenglicol (PEG; polímero sintético capaz de
unirse a los taninos e inhibir su acción; Álvarez del Pino et al., 2005).
Comenzando por el impacto de los taninos sobre la fermentación ruminal de la
proteína, tal y como se ha mencionado por numerosos autores, posiblemente el principal
efecto de estos polifenoles sea la reducción de la degradación proteica en el rumen
asociada con una menor producción de nitrógeno amoniacal (e. g., Tabacco et al., 2006;
Bhatta et al., 2007) a través de diversos mecanismos tales como la formación de
complejos tanino-proteína, la inhibición de enzimas microbianas como las proteasas
(McMahon et al., 1999) o del crecimiento microbiano (Min et al., 2002).
Revisión bibliográfica
16
En este sentido, Frutos et al. (2000) y Hervás et al. (2000), utilizando torta de soja
como alimento base y taninos de un extracto comercial de quebracho y ácido tánico
como modelos de TC y TH, respectivamente, observaron que ambos tipos provocaron
una reducción significativa de la degradación ruminal in situ de la proteína en ovino y
que este efecto fue dependiente de la dosis.
Estos resultados han sido posteriormente confirmados, mediante la técnica in situ
de las bolsas de nailon por Frutos et al. (2004b), cuando observaron que la inclusión de
20,8 g/kg de MS de un extracto de TH de castaño, aunque no afecto a la extensión de la
degradación de la MS, redujo considerablemente la degradación de la proteína en
ovejas.
Los taninos pueden también influir sobre la síntesis de proteína microbiana a
través de diversos mecanismos como un cambio en la distribución de los nutrientes
disponibles o el enlentecimiento del proceso fermentativo (Salem et al., 2007).
Con respecto al primer mecanismo, se ha observado que los taninos pueden
destinar una mayor proporción de los nutrientes disponibles a la síntesis de proteína
microbiana, en detrimento de la empleada para la producción de ácidos grasos de
cadena corta (Baba et al., 2002), aunque existen trabajos que han demostrado efectos
opuestos (Getachew et al., 2008) o una ausencia de efecto (Alexander et al., 2008).
En relación al segundo mecanismo mencionado, Salem et al. (2007) señalaron que
la adición de PEG provocaba un incremento de la concentración de nitrógeno amoniacal
atribuido a una mayor degradación de la proteína o a una mala sincronización entre el
nitrógeno y la energía liberada en el rumen, observando una reducción de la eficiencia
de síntesis de proteína microbiana, por lo que concluyeron que un retardo provocado por
los taninos sobre el ritmo de fermentación ruminal podría favorecer la sincronización de
los nutrientes disponibles incrementando así la eficiencia de síntesis de proteína
microbiana.
Aunque su acción en el rumen se ejerce principalmente sobre las proteínas,
también se han observado efectos de los taninos sobre los hidratos de carbono;
particularmente la celulosa, la hémicelulosa y el almidón (Schofield et al., 2001).
En este sentido, Makkar et al. (1995a) y Bento et al. (2005) señalaron que los
taninos, mediante la adhesión a las moléculas de celulosa, pueden provocar una menor
Revisión bibliográfica
17
disponibilidad de los puntos de anclaje para las bacterias ruminales, reduciendo la
degradación de la misma.
La repercusión negativa de los taninos sobre la degradación de los hidratos de
carbono en general y de la fibra en particular, se puede producir a través de diversos
efectos, tales como la formación de complejos con las macromoléculas glucídicas
(McSweeney et al., 2001b), la reducción del número de microorganismos celulolíticos
por medio de su capacidad bactericida (McSweeney et al., 2001b) o la inhibición
enzimática (Björck y Nyman, 1987).
Independiente del mecanismo, los taninos son capaces de reducir la degradación
de ambos componentes (fibra y proteína). Este efecto puede verse reflejado tanto en la
producción de ácidos grasos volátiles (AGV) como en sus proporciones molares. Así,
por ejemplo, Makkar et al. (1995b) registraron una mayor proporción de ácido
propiónico y Tiemann et al. (2008) observaron un incremento del acetato en detrimento
del butirato y propionato por el efecto perjudicial de los taninos sobre la susceptibilidad
de las bacterias fibrolíticas productoras de ácido acético.
Es importante señalar, por último, que aunque es cierto que muchos autores han
evidenciado un detrimento de la producción neta de AGV en presencia de taninos
(Frutos et al., 2004a; Martínez et al., 2006; Tiemann et al., 2008), otros investigadores
no han registrado ninguna variación significativa (Hervás et al., 2004; Osoro et al.,
2007).
III. 2. 1. Efectos sobre la microbiota del rumen
En general, los taninos son conocidos como inhibidores de la actividad
microbiana en el rumen (Min et al., 2002). Sin embargo, los mecanismos involucrados
en ello no están del todo claros (McSweeney et al., 2001a). Entre los más aceptados,
figuran los siguientes: privación del sustrato para los microorganismos por los
complejos formados entre los compuestos fenólicos y los nutrientes (McSweeney et al.,
2001b), inhibición enzimática y acción directa sobre los microorganismos ruminales
(Jones et al., 1994).
En relación a la privación del sustrato para los microorganismos, se ha observado
que los taninos podrían impedir o disminuir la capacidad de las bacterias ruminales para
Revisión bibliográfica
18
adherirse a las paredes vegetales, lo cual reduciría de forma considerable la actividad
microbiana en el rumen (Bento et al., 2005).
Otro mecanismo es la interacción de los taninos con las enzimas microbianas
(bacterianas y fúngicas) inhibiendo o disminuyendo su actividad, inhibiendo el
transporte de los nutrientes y retrasando el crecimiento microbiano (McSweeney et al.,
2001b).
Con respecto a la acción directa de los taninos sobre las bacterias, se ha podido
comprobar una reducción del ritmo de crecimiento de ciertos microorganismos
ruminales, entre los cuales se encuentran las bacterias Butyrivibrio fibrisolvens (Jones et
al., 1994), involucrados en la biohidrogenación ruminal de los ácidos grasos
poliinsaturados (PUFA) (Jenkins et al., 2008), mediante la unión de estos polifenoles a
las paredes celulares bacterianas, lo cual podría alterar la biohidrogenación ruminal de
los PUFA (Benchaar y Chouinard; 2009) y reducir además la actividad fermentativa en
el rumen (McSweeney et al., 2001b).
Por otro lado, se ha observado que determinadas bacterias ruminales (e. g.,
Ruminobacter amylophilis, Prevotella ruminicola) podrían llegar a tolerar algunos tipos
de taninos (Jones et al., 1994) mediante su degradación y el empleo de los metabolitos
para su propio crecimiento (Krumholz y Bryant, 1986), la formación de un glicocálix o
matriz extracelular de polisacáridos que les otorga una cierta protección frente a los
taninos (Krause et al., 2005) y incremento de la síntesis de enzimas resistentes a estos
compuestos (e. g., acil hidrolasas, estearasas; Singth et al., 2001).
Por último, algunos estudios han demostrado que los taninos pueden actuar
también sobre los protozoos, reduciendo el número de dichos microorganismos en el
medio ruminal (Makkar et al., 1995c).
III. 3. COMPUESTOS BIOACTIVOS DE LA LECHE
La leche es un alimento básico que tiene la función primordial de satisfacer los
requerimientos nutricionales en la primera etapa de la vida de los mamíferos, incluidos
los humanos. Además, en la dieta de adolescentes y adultos, la ingesta de leche resulta
muy beneficiosa por su alto aporte de energía, proteínas bioactivas, vitaminas y
minerales (Park et al., 2007).
Revisión bibliográfica
19
Sin embargo, durante estos últimos años, se ha creado una corriente de opinión
poco proclive al consumo de productos lácteos, particularmente de la grasa láctea, por la
presencia en la misma de contenidos altos de ácidos grasos saturados (60% de AGS en
la leche; Jensen, 2002), ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) con configuración
trans, y colesterol, compuestos cuyo consumo ha sido relacionado con el incremento del
nivel de colesterol sanguíneo y del riesgo de enfermedades cardiovasculares (Shingfield
et al., 2008; Parodi, 2009).
En contraposición con esta corriente de opinión, diversos estudios científicos no
sólo han puesto en duda los efectos perjudiciales de la ingesta de grasa láctea sobre la
salud, sino que han presentado evidencias de signo contrario ya que se ha demostrado
que muchos ácidos grasos de la leche, que han sido durante mucho tiempo considerados
como compuestos con efectos negativos para la salud humana, podrían tener efectos
prometedores sobre el organismo humano (Lock et al., 2008; Parodi, 2009).
Así, mientras que el láurico (12:0), mirístico (14:0), y palmítico (16:0), ácidos
grasos pertinentes al grupo de los ácidos grasos saturados, se han relacionado con un
potencial aumento de los niveles del colesterol de la sangre, se ha demostrado que el
ácido esteárico (18:0), los de cadena corta y algunos de cadena media (4:0, 6:0, 8:0 y
10:0) carecerían de este potencial y resultarían beneficiosos para la salud humana por
poseer propiedades antitumorales, antimicrobianas y antivirales (Lock et al., 2008;
Parodi, 2009).
De todas formas, resultaría más importante mantener un buen equilibrio entre los
distintos grupos de ácidos grasos de la ingesta que los potenciales efectos beneficiosos o
perjudiciales que algunos de ellos pudieran ejercer de forma individual (Parodi, 2009).
La grasa láctea contiene, además, ácidos grasos omega-3 que, si bien son
cuantitativamente muy minoritarios, pueden desempeñar un papel relevante en la
prevención de algunas enfermedades. El principal exponente de esta fracción es el ácido
docosahexaenoico (DHA; 22:6n-3), al que se le ha atribuido un efecto prometedor sobre
las funciones cerebral y nerviosa, lo que remarca su importancia en dos fases muy
concretas del ciclo vital de la especie humana, la fase prenatal-neonatal y la senectud
(Bourre, 2005). También se han documentado efectos antiinflamatorios y antidiabéticos
de los ácidos α-linolénico (18:3n-3) y eicosapentaenoico (EPA; 20:5n-3) (Lock y
Bauman, 2004; Bourre, 2005).
Revisión bibliográfica
20
Por todo ello, resulta sumamente importante promover el consumo de este tipo de
AG manteniendo en nuestros hábitos alimenticios un equilibrio entre ellos (los ácidos
grasos omega-3) y los ácidos grasos omega-6. En este sentido, se ha documentado que
la relación ideal entre los ácidos grasos ω-6 y ω-3 para poder prevenir enfermedades
cardiovasculares debería ser igual o menor a 4:1 (Simopoulos, 2008).
Por otro lado, hay que destacar también que los ácidos grasos de configuración
trans presentes en la grasa láctea podrían influir sobre la salud humana. Así, algunos
autores han indicado que los AG trans podrían inducir un leve incremento del colesterol
sanguíneo y del riesgo de las enfermedades cardiovasculares (Roy et al., 2007).
Sin embargo, otros estudios han apuntado que no todos los ácidos grasos trans
procedentes de la grasa láctea podrían perjudicar la salud humana y que los efectos son
dependientes del isómero trans que sea considerado (Roy et al., 2007) y de la
procedencia de los ácidos grasos trans, ya que sus perfiles y proporciones pueden ser
muy distintos según sean de origen industrial o natural (Chardigny et al., 2008).
Así, por ejemplo, mientras se ha asociado a los ácidos vaccénico (VA, trans-11
18:1) y ruménico (RA, cis-9 trans-11 18:2) efectos anticarcinogénicos, antiaterogénicos
e hipocolesterolémicos (Pariza et al., 2001), los trans-10 18:1, trans-9 trans-12 18:2 y
trans-9 cis-12 18:2 se han relacionado con un posible incremento de riesgos
cardiovasculares (Roy et al., 2007; Shingfield et al., 2008).
También se ha señalado en otros estudios que, contrariamente a la grasa láctea,
que tiene un bajo contenido de ácidos grasos trans y el VA es su isómero
cuantitativamente más abundante, las grasas de origen industrial obtenidas por
hidrogenación pueden presentar niveles mayores de ácidos grasos trans, y el trans-10
18:1 es el isómero cuantitativamente mayoritario (Roy et al., 2007).
III. 3. 1. Ácido linoleico conjugado (CLA)
Entre los lípidos bioactivos encontrados en la grasa láctea, está presente un grupo
de ácidos grasos que fue descubierto accidentalmente hace unas décadas y que está
siendo muy estudiado últimamente por su propiedades beneficiosas sobre la salud
humana: CLA.
El acrónimo CLA se refiere a un conjunto de varios isómeros posicionales y
geométricos del ácido linoleico (LA; cis-9 cis-12 18:2) cuya estructura química varía
Revisión bibliográfica
21
según la configuración de los dobles enlaces (cis y trans), predominando la estructura
cis-9 trans-11 18:2, identificada como ácido ruménico (figura 3; Palmquist et al., 2005),
al cual se atribuyen la mayor parte de los efectos inmunomoduladores, antidiabéticos,
reguladores del peso y composición corporal, anti-ateroescleróticos y anticarcerígenos
del CLA (Pariza et al., 2001).
La mayoría de los isómeros de CLA son relativamente abundantes en las grasas
animales, sobre todo en los productos lácteos de rumiantes y representan >70% del
consumo diario. El ácido ruménico es el isómero más abundante (y supone alrededor
del 70-85 % del contenido en CLA de la leche; Palmquist et al., 2005).
Figura 3. Estructura molecular de los ácidos ruménico (cis-9 trans-11 18:2; A) y linoleico (cis-9 cis-12 18:2; B) (Palmquist et al., 2005).
III. 3. 2. Origen del CLA de la leche
La biosíntesis del CLA de la leche se puede producir mediante dos procesos
distintos. El primero tiene lugar en el rumen y ocurre durante la biohidrogenación de los
ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de la dieta; el segundo tiene lugar en la glándula
mamaria y consiste en una desaturación del ácido vaccénico por medio de una
desaturasa (Palmquist et al., 2005).
En los siguientes apartados viene detallada cada una de estas vías de síntesis.
Revisión bibliográfica
22
III. 3. 2. 1. Metabolismo lipídico en el rumen
Los lípidos que los rumiantes ingieren con la dieta se encuentran
mayoritariamente en forma de triglicéridos, que en el rumen sufren un proceso de
lipólisis por la acción de enzimas microbianas, dando como resultado glicerol y AG
libres. Debido al efecto inhibitorio que los AG insaturados tienen sobre el metabolismo
microbiano, los microorganismos ruminales realizan un proceso de biohidrogenación
(BH), cuyo producto final son AG saturados de menor toxicidad para ellos. El proceso
de BH del ácido linoleico es el más estudiado, y por tanto, mejor conocido. El ácido
linoleico da lugar, mediante una reacción de isomerización, a la formación del isómero
mayoritario del CLA, el ácido ruménico. Dicho ácido graso es rápidamente hidrogenado
a ácido vaccénico, que se reduce finalmente a ácido esteárico (SA; 18:0), tal como
puede observarse en la figura 4 (Palmquist et al., 2005).
El proceso de la biosíntesis de CLA en el rumen se lleva a cabo por la microbiota
ruminal, particularmente por bacterias. Dichas bacterias han sido tradicionalmente,
clasificadas en dos grupos (A y B) según la etapa en la que actúan: al grupo A
corresponden las bacterias que hidrogenan los 18:2n-6 y 18:3n-3 para dar lugar al VA,
mientras al grupo B pertenecen las que convierten el VA en ácido esteárico (Harfoot y
Hazlewood, 1997).
Análisis filogenéticos recientes han demostrado que prácticamente todas las
bacterias involucrados en la biohidrogenación de los ácidos grasos poliinsaturados en el
rumen pertenecen al grupo de Butyrivibrio, que incluye los géneros de Butyrivibrio y
Pseudobutyrivibrio y que, aunque una gran parte de estas bacterias son capaces de
biohidrogenizar los PUFA y producir el RA y VA, sólo unas pocas cepas pertinentes al
grupo de Butyrivibrio proteoclasticus tienen la capacidad de producir el 18:0 (Jenkins et
al., 2008; Belenguer et al., 2010).
III. 3. 2. 2. Síntesis en la glándula mamaria
Aunque la síntesis de RA y VA en el rumen parecía fuera de toda discusión,
diversos autores señalaron que el RA generado durante el proceso de biohidrogenación
ruminal no era la única fuente de RA en la leche y sugirieron que una gran parte de este
producto podría originarse también endógenamente, en la glándula mamaria, a partir del
VA que escapa de la BH en el rumen, mediante la enzima delta-9 desaturasa (figura 4,
Palmquist et al., 2005).
Revisión bibliográfica
23
Figura 4. Rutas principales de formación de cis-9 trans-11 18:2 en el rumen y en la glándula mamaria de rumiantes (Palmquist et al., 2005).
La existencia de otras moléculas 18:1 y 18:2 en la leche de los rumiantes indujo
pensar en la existencia de vías alternativas de síntesis que contribuirían a producir otros
isómeros de CLA (e. g., trans-10 cis-12 18:2) que, aunque generalmente se encuentran
en pequeñas proporciones en la grasa láctea, su significado biológico podría ser de
relevancia (Harvatine et al., 2009). En este sentido, Griinari y Bauman (1999)
propusieron una vía metabólica alternativa que explica la síntesis del isómero trans-10
cis-12 18:2. En dicha ruta, la primera etapa del proceso de biohidrogenación del ácido
linoleico sería su conversión en trans-10 cis-12 18:2 a través de la enzima cis-9 trans-
10 isomerasa. Posteriormente, el isómero de CLA se hidrogenaría a trans-10 18:1 y
Rumen Glándula
cis-9 trans-11 cis-15 18:3
trans-11 cis-15 18:2
Ácido linoleico cis-9 cis-12 18:2
Ácido ruménico cis-9 trans-11 CLA
Ácido vaccénico trans-11 18:1
Ácido esteárico
18:0
Ácido α-linolénico cis-9 cis-12 cis-15 18:3
Ácido linoleico cis-9 cis-12 18:2
Ácido ruménico cis-9 trans-11 CLA
Ácido vaccénico trans-11 18:1
Ácido esteárico
18:0
-9 Desaturasa
Isomerasa
Isomerasa
Hidrogenasa
Hidrogenasa
Hidrogenasa
Ácido α-linolénico
cis-9 cis-12 cis-15 18:3
Revisión bibliográfica
24
finalmente a ácido esteárico. Sin embargo, estas vías de formación siguen siendo sin
estar bien esclarecidas.
III. 4. ESTRATEGIAS NUTRICIONALES PARA AUMENTAR EL
CONTENIDO DE CLA EN LA LECHE
El contenido de CLA en la grasa láctea se ve influido por diversos factores, como
pueden ser los genéticos o fisiológicos, pero el principal y más importante es la dieta
que reciben los animales (Shingfield et al., 2008). Por ello, a continuación se detallan
las principales estrategias nutricionales que han sido estudiadas con el objetivo de
aumentar el contenido de CLA lácteo.
Diversos estudios han confirmado que la alimentación de los rumiantes en
pastoreo incrementa el contenido de CLA y reduce los niveles de ácidos grasos
saturados 10:0-16:0 de la grasa de la leche, lo que puede atribuirse al efecto que tiene el
pasto sobre el proceso de BH ruminal, y a su alto contenido de ácido linolénico (cis-9
cis-12 cis-15 18:3), un AG omega-3 que sirve como precursor para la producción
ruminal de VA y la síntesis endógena de RA (Chilliard et al., 2007; Gómez -Cortés et
al., 2009).
La relación forraje:concentrado de la dieta de los animales puede también afectar
a la composición de AG de la leche al modificar el patrón de fermentación ruminal. El
uso de dietas con una baja relación forraje:concentrado (< 40:60) puede ir asociado a
variaciones en las rutas de BH, debido a la caída del pH ruminal (Fuentes et al., 2009).
Con la reducción del pH se produce, principalmente, un descenso en la tasa de lipólisis
y alteraciones en el perfil de los AG trans-MUFA 18:1 presentes en el rumen, al
disminuir la formación de VA y aumentar la de trans-10 18:1 (Piperova et al., 2002). La
acumulación de este último AG y de otros metabolitos intermediarios de la BH puede
disminuir notablemente el contenido de CLA en la leche (Roy et al., 2006).
III. 4. 1. Suplementación de la dieta con aceites vegetales u otros compuestos
La grasa es una materia prima esencial en los programas de alimentación para
rumiantes de alta productividad, especialmente para animales en lactación, debido a su
gran aporte energético (Gargouri et al., 2006). Sin embargo, la inclusión de grasas en la
dieta puede ser utilizada no sólo para aumentar el aporte de energía, sino también para
Revisión bibliográfica
25
modificar el metabolismo ruminal y mejorar el perfil nutricional de los ácidos grasos de
la grasa láctea (Chilliard et al., 2007).
En este sentido, con objeto de aumentar los contenidos de CLA, se han ensayado
distintos suplementos lipídicos en la dieta de rumiantes basados en aceites o semillas
vegetales, suplementos de origen marino.
III. 4. 1. 1. Empleo de aceites vegetales
El empleo de dietas suplementadas con aceites vegetales ricos en ácidos grasos
insaturados (linoleico y linolénico, principalmente) permite lograr un incremento del
contenido de CLA en la leche (Gómez-Cortés et al., 2008; Hervás et al., 2008; Toral et
al., 2010a). Los aceites más ricos en ácido linoleico (girasol o soja) son generalmente
los más efectivos, debido a que este ácido graso favorece la síntesis de CLA mediante
dos vías: biohidrogenación ruminal y desaturación del VA en la glándula mamaria,
mientras que el ácido linolénico (encontrado por ejemplo en el aceite de colza)
únicamente contribuye a mejorar los niveles de RA mediante su síntesis endógena a
partir de VA (Palmquist et al., 2005).
En este sentido, estudios con ganado ovino y caprino demostraron que el empleo
de dietas complementadas con aceite de girasol o de colza triplica el contenido de CLA
en la grasa láctea sin modificar la producción de leche. Los mayores incrementos en el
CLA lácteo se lograron con el aceite de girasol (Mir et al., 1999; Hervás et al., 2008).
III. 4. 1. 2. Utilización de semillas oleaginosas
La forma de incorporación de los sustratos lipídicos puede influir en los niveles de
VA y RA que aparecen en la grasa láctea. De manera general, el uso de semillas enteras
de oleaginosas suele tener menor efecto sobre el contenido de CLA en la grasa de la
leche que el observado con sus respectivos aceites, por la menor disponibilidad de los
ácidos grasos para la microbiota ruminal (Lock y Bauman, 2004).
Los procesos de molturación, extrusión o micronización y el tratamiento térmico
de las semillas pueden mejorar los resultados, probablemente porque consiguen que los
triglicéridos sean más accesibles para los microorganismos responsables de la
biohidrogenación (Chilliard et al., 2009).
Revisión bibliográfica
26
III. 4. 1. 3. Suplementos de origen marino
Otra alternativa nutricional para aumentar los niveles de CLA en la grasa láctea es
inhibir el último paso de la BH ruminal de los PUFA e impedir la conversión del VA a
ácido esteárico para favorecer un flujo post-ruminal rico en VA capaz de aumentar la
síntesis endógena de RA (Griinari y Bauman, 1999).
Distintos trabajos han documentado que los productos o subproductos de origen
marino (como aceites de pescado o algas, ambos ricos en AG omega-3 de cadena larga)
son los más idóneos para inducir estos cambios (AbuGhazaleh et al., 2003, Toral et al.,
2010a,b). Los AG ω-3 de cadena larga, particularmente el DHA, presentes en el aceite
de pescado y las algas inhiben la etapa final de la BH y favorecen la acumulación de
VA en el líquido ruminal (Shingfield et al., 2006; Toral et al., 2010a,b).
El uso de estos suplementos de origen marino en combinación con un aceite
vegetal rico en ácido linoleico (como el de girasol) que sirva como sustrato para
aumentar la formación ruminal de VA, produce los mayores incrementos del contenido
de CLA en la grasa de la leche (AbuGhazaleh et al., 2003, Toral et al., 2010a,b). Así,
por ejemplo, Toral et al. (2010a), suplementando la dieta de ovejas lecheras de alta
producción con aceite de girasol y aceite de pescado, tanto de forma individual como
conjunta, observaron que la combinación de ambos aceites provocó los mayores
incrementos de CLA en la leche.
Otro experimento realizado por Toral et al. (2010b) con el fin de estudiar el efecto
de la suplementación de la dieta de ovejas lecheras con aceite de girasol y microalgas
marinas sobre su rendimiento productivo y el perfil de AG de la leche, demostró que
esta estrategia nutricional multiplicó por siete el contenido de CLA de la grasa de la
leche y redujo el ratio ω-6/ω-3 y el contenido de ácidos grasos saturados.
III. 4. 1. 4. Uso de taninos
Otra estrategia nutricional que se ha sugerido recientemente para mejorar el perfil
de ácidos grasos de la leche, principalmente el contenido de CLA, es el uso de los
taninos. Algunos trabajos han propuesto que la suplementación de la dieta de ovejas
lecheras con taninos podría inhibir el último paso de la biohidrogenación ruminal e
impedir la reducción del VA a 18:0, aumentando los contenidos de ácidos vaccénico y
RA de la leche (Vasta et al., 2009a). Esto se lograría gracias a la modificación del
Revisión bibliográfica
27
ambiente ruminal y, con ello, del proceso de biohidrogenación de los ácidos grasos de la
dieta en el rumen (Khiaosa-Ard et al., 2009).
En este sentido, Vasta et al. (2009a), incubando in vitro heno y heno mezclado
con concentrado (utilizados como sustratos control) con taninos de quebracho,
observaron que estos compuestos fenólicos provocaron una reducción significativa del
contenido de ácido esteárico (-16%) y un incremento del VA y de otros trans-18:1, sin
afectar a la concentración total de CLA, y que este efecto fue dependiente de la dosis, ya
que los mayores cambios se lograron con la cantidad más alta (1 mg de taninos/ml de
fluido ruminal).
En otro experimento llevado a cabo por Vasta et al. (2009b) con corderos, se
demostró que la suplementación de su concentrado con un 4% de quebracho produjo un
descenso significativo de la concentración de los ácidos grasos saturados en general
(-26%) y del esteárico en particular (-49%), acompañado de un incremento de los
niveles de VA (+97%), trans-10 18:1, total trans 18:1 y RA del fluido ruminal.
Los resultados obtenidos en este ensayo sugirieron también que los cambios del
perfil lipídico de la digesta ruminal fueron debidos a la inhibición del último paso de la
BH ruminal en presencia de taninos, ya que el uso de quebracho no tuvo ningún efecto
sobre los ratios RA/LA y VA/RA, sin embargo redujo significativamente el ratio
SA/VA, lo cual podría reflejar el hecho de que la acción de taninos se ejerce
principalmente sobre las bacterias del grupo B, responsables de la conversión del VA a
ácido esteárico.
En el mismo sentido, Khiaosa-Ard et al. (2009) señalaron que la suplementación
de un heno de pradera con 3% de aceite de lino y 7,9% de TC extraídos de Acacia
mearnsii cuadruplicó el contenido de VA del fluido ruminal y redujo el del esteárico
(-47%) debido al efecto inhibitorio ejercido por los taninos sobre el proceso de BH.
En contraposición con estos resultados, diversos estudios in vivo han puesto en
duda dicho efecto inhibitorio de los taninos sobre el proceso de BH ruminal, así como
su acción prometedora sobre el nivel de CLA de la grasa láctea. En este sentido,
Benchaar y Chouinard (2009) señalaron que la adición de 0,67% de un extracto de TC
de quebracho a una dieta de vacas lecheras, no fue suficiente para alterar el proceso de
BH ruminal y modificar el perfil de la grasa de la leche.
Revisión bibliográfica
28
Toral et al. (2011) evidenciaron también que la adición de una combinación de
dos extractos de taninos condensados e hidrolizables (1% en total) a una dieta completa
mezclada (con una relación forraje:concentrado 40:60), formulada para ovejas en
lactación y suplementada con un 2% de aceite de girasol, no tuvo ningún efecto
significativo sobre la concentración de los principales grupos de ácidos grasos de la
leche (i. e., saturados, monoinsaturados y poliinsaturados) en general, ni sobre el
enriquecimiento en VA y RA en particular.
Dichos autores (Toral et al., 2011) atribuyeron los cambios temporales en el perfil
lipidico de la leche al aceite de girasol de la dieta (ver, por ejemplo, Hervás et al., 2008
o Toral et al., 2010a). Además, sugirieron que la ausencia de efectos de los taninos
sobre el perfil lipídico de la grasa láctea pudo ser debida a la ineficacia del tipo de
taninos utilizados (dos extractos de TC y TH, derivados del quebracho y del castaño,
respectivamente) o a la insuficiencia de la dosis (1%).
IV. PLANTEAMIENTO Y DISEÑO EXPERIMENTAL
Planteamiento y diseño experimental
31
Este estudio se planteó con el objetivo de estudiar, en ovejas, el efecto de la
adición de taninos a una dieta rica en ácido linoleico sobre la fermentación ruminal y la
biohidrogenación de los ácidos grasos en el rumen, con especial atención a la
acumulación de determinados metabolitos.
La dieta rica en ácido linoleico (el cual sirve de sustrato para la formación de
ácido vaccénico en el rumen; Hervás et al., 2008), se consiguió mediante su
suplementación con un 2% de aceite de girasol.
Para este estudio, que se llevó a cabo in vitro mediante cultivos discontinuos de
microorganismos ruminales y la técnica de producción de gas, se siguió un diseño
experimental (4 × 2) + 2, es decir, 4 tipos de taninos (2 hidrolizables y 2 condensados) ×
2 dosis de cada uno (2 y 5%) + 2 controles (uno positivo -la dieta suplementada- y otro
negativo -la dieta sin el suplemento lipídico-).
Como donantes del inóculo ruminal para las incubaciones se utilizaron ovejas
canuladas en el rumen que fueron alimentadas con una dieta cuya composición era muy
similar a la de la dieta utilizada como sustrato en los cultivos. Dicha dieta consistió en
una ración completa mezclada (TMR), con una relación forraje:concentrado 40:60,
formulada para ovejas en lactación y suplementada con un 2% de aceite de girasol.
V. MATERIAL Y MÉTODOS
Material y métodos
35
V .1. TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES
Tal y como se ha mencionado en el apartado previo, en este estudio se evaluó el
efecto de la adición de 4 taninos diferentes: dos taninos hidrolizables (TH; castaño y
roble) y dos taninos condensados (TC; quebracho y uva) que se administraron en 2
concentraciones: 2 y 5%. Tanto los hidrolizables como los condensados son extractos de
taninos comercializados por la empresa Agrovin, S.A. (Alcázar de San Juan, Ciudad
Real, España). Además se incluyeron un control positivo (TMR + 2% de aceite de
girasol) y uno negativo (TMR sin aceite). Los 10 tratamientos, por lo tanto, fueron los
siguientes:
Control negativo
Control positivo
Castaño 2%
Castaño 5%
Roble 2%
Roble 5%
Quebracho 2%
Quebracho 5%
Uva 2%
Uva 5%
Para preparar cada tratamiento, se partió de una TMR (relación
forraje:concentrado 40:60) cuya composición se detalla en la Tabla 1. Dicha TMR se
secó en la estufa de aire forzado (P-Selecta, Barcelona, España) a 60 °C durante 48
horas y después se molió en un molino centrífugo (ZM 1000; Retsch, Haan, Alemania)
con una malla de 1 mm de paso.
A continuación, se mezclaron 25 g de esta muestra con un 2 o un 5% del tanino
correspondiente (según el tratamiento) y se agitaron hasta comprobar que estaban bien
homogeneizados. La adición del 2% de aceite de girasol a la TMR se realizó un día
antes de comenzar la incubación in vitro, para evitar problemas de rancidez. Con el
objetivo de asegurar que se administraba exactamente un 2% de aceite (y dada la
complejidad de su mezcla) a cada botella, se le añadieron directamente 10 mg de aceite
de girasol.
Material y métodos
36
Tabla 1. Composición química de la TMR utilizada como sustrato en los cultivos in vitro.
Composición química1 (g/kg MS, excepto para la propia MS que es g/kg de materia fresca)
MS 949,0 MO 882,3 PB 169,5 FND 299,7 FAD 193,4 Grasa bruta 21,7
1MS= materia seca; MO= materia orgánica; PB= proteína bruta; FND= fibra neutro detergente; FAD= fibra ácido detergente.
V. 2. CULTIVOS DISCONTINUOS DE MICROORGANISMOS RUMINALES Y
TÉCNICA DE PRODUCCIÓN DE GAS
V. 2. 1. Animales donantes del inóculo ruminal
Como donantes del inóculo ruminal para las incubaciones in vitro se utilizaron 3
ovejas adultas, no gestantes ni en lactación, provistas de una cánula ruminal y con un
peso vivo medio de 71,5 ± 17,77 kg, que pertenecían al rebaño experimental del
Instituto de Ganadería de Montaña (IGM) de León.
Estas ovejas recibieron ad líbitum, durante 15 días, una TMR con una relación
forraje:concentrado 40:60, cuya composición fue muy similar a la del sustrato empleado
en las incubaciones in vitro (ver tabla 2). Además, todos los animales dispusieron,
durante todo el periodo experimental, de agua fresca y de un bloque corrector
vitamínico-mineral (Tegablock; Inatega, León, España).
V. 2. 2. Procedimientos
Tras 13 y 15 días de adaptación a la dieta, se realizaron dos incubaciones in vitro,
a dos tiempos diferentes (24 y 72 horas) utilizando la técnica de producción de gas
descrita por Mauricio et al. (1999). El objetivo de estas incubaciones fue estudiar
distintos indicadores de la fermentación ruminal (cinética de producción de gas,
degradación ruminal, pH, amoniaco y ácidos grasos volátiles) y el perfil lipídico de la
digesta.
Material y métodos
37
Se utilizaron un total de 136 botellas [(10 tratamientos × 3 botellas/tratamiento ×
2 tiempos (24 y 72 h) × 2 tandas (días 13 y 15, réplicas) + (3 blancos/tiempo × 2
tiempos × 2 tandas) + (2 botellas de “Tiempo 0”/tanda × 2 tandas)].
Tabla 2. Ingredientes y composición química de la dieta administrada a los animales donantes.
TMR Ingredientes (g/kg MF)
Heno de alfalfa deshidratada 400,0 Maíz en grano 188,0 Torta de soja 150,0 Cebada en grano 122,0 Pulpa de remolacha 67,0 Melazas 49,0 Suplemento vitamínico-mineral 1 24,0
Composición química2 (g/kg MS, excepto para la propia MS que es g/kg de materia fresca)
MS 950 ,9 MO 844,6 PB 173,3 FND 260,3 FAD 177,8 Grasa bruta 29,3
1INA OV1 (Evialis, Madrid, España) 2MS=materia seca; MO= materia orgánica; PB= proteína bruta; FND= fibra neutro detergente; FAD= fibra ácido detergente.
V. 2. 2. 1. Cinética de fermentación ruminal
Antes de iniciarse la incubación, se preparó el medio de cultivo (Goering y Van
Soest, 1970; tabla 3), el cual contenía una solución tampón, una solución reductora,
macrominerales, microminerales y una solución de resazurina.
La solución final se mantuvo en un baño de agua a 39 ºC gaseando con CO2
durante aproximadamente 60 minutos (para asegurar su reducción) y se ajustó su pH a
aproximadamente 6,5 con ácido ortofosfórico a fin de simular las condiciones de pH
propias del rumen en una dieta con elevada proporción de concentrado.
Posteriormente, se recolectó el líquido ruminal de las tres ovejas antes de la
administración de la comida de la mañana a través de la cánula ruminal. Cada uno de
los 3 inóculos se filtró a través de dos capas de gasa y se transportó inmediatamente al
Material y métodos
38
laboratorio, procurando conservar en lo posible sus condiciones de anaerobiosis y
temperatura.
Una vez en el laboratorio, los inóculos se volvieron a filtrar, a través de 4 capas de
gasa y en condiciones de anaerobiosis, 90 ml del líquido ruminal (30 ml de cada
inóculo) se introdujeron en un baño de agua a 39 ºC para evitar cambios de temperatura
y se mezclaron al final con el medio de cultivo en la proporción 1:4 (v/v; fluido
ruminal/medio de cultivo).
En cada botella de suero de 125 ml, en las que previamente se habían pesado 500
mg de cada sustrato más 10 mg de aceite de girasol (cuando correspondía), se
dosificaron 50 ml de la mezcla (10 ml de fluido ruminal y 40 ml de medio de cultivo) y
a continuación se cerraron herméticamente con tapones de caucho y anillas de aluminio
y se introdujeron en un incubador (UFP 500; Memmert, Schwabach, Alemania) a
39,5 ºC.
La producción de gas se registró a intervalos regulares a lo largo de todo el
periodo de incubación (2, 4, 6, 9, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48, 60 y 72 horas post-
incubación) mediante un transductor de presión (Gems Sensors 2200; Gems Sensors,
Hampshire, Reino Unido) conectado a una pantalla (Tracker 223; Data Track Process
Instruments, Birmingham, Reino Unido) para disponer de una cinética completa de
producción de gas.
La presión almacenada (psi) se midió pinchando cada botella con una aguja de 0,6
mm de diámetro (Sterican; B. Braun, Barcelona, España) conectada al transductor.
Posteriormente, el transductor se retiraba de la aguja y esta se mantenía insertada unos
segundos en cada botella para permitir la salida de todo el gas acumulado en la misma.
Tras cada lectura, las botellas se agitaban individualmente y se volvían a depositar en el
incubador hasta la próxima lectura.
A partir de los valores de presión obtenidos, corregidos tanto para la cantidad de
MO incubada como para la producción de gas de los blancos, se estimó el volumen de
gas producido mediante la utilización de una ecuación de regresión lineal entre el
volumen y la presión obtenida previamente a partir de numerosas medidas simultáneas
de ambos parámetros (Hervás et al., 2005).
Material y métodos
39
Tabla 3. Composición química del medio de incubación.
Soluciones (compuestos químicos)
Solución final (ml/l)
Concentración parcial (/l)
Solución de macrominerales 208,1 Na2HPO4·12 H2O (g) 9,45 KH2PO4 (g) 6,20 MgSO4·7H2O (g) 0,60
Solución tampón 208,1 NH4HCO3 (g) 4,00 NaHCO3 (g) 35,00
Solución reductora 0,1 Cisteína-NCl (g) 6,25 NaOH 1M (ml) 40,00 Na2S·9 H2O (g) 6,25
Solución de Microminerales 62,4 CaCl2·2 H2O (g) 1,32 MnCl2·4 H2O (g) 1,00 CoCl2·6 H2O (g) 0,10 FeCl3·6 H2O (g) 0,80
Solución de resazurina 1,04 Resazurina (g) 0,01
V. 2. 2. 2. Degradación ruminal in vitro
Finalizada la incubación in vitro (72 horas post-incubación), se estimó la
desaparición de materia seca y materia orgánica en las botellas para poder calcular la
extensión de la degradación en el rumen. Para ello, se interrumpió la incubación
sumergiendo las botellas en agua y hielo picado. Posteriormente, todo el contenido de
cada botella se filtró utilizando crisoles de porosidad 1 (100-160 µm; Pyrex, Londres,
Reino Unido), con la ayuda de una bomba de vacío (VDE 0530; KNF Neuberger,
Alemania) y un baño de ultrasonidos (P-Selecta, Barcelona, España) cuando fue
necesario.
La desaparición de materia seca (DMS) se estimó introduciendo los crisoles en
una estufa de aire forzado a 103 ºC durante 24 horas.
La desaparición de materia orgánica (DMO) se determinó mediante la
incineración del residuo seco en un horno mufla (12-PR/400; Forns Hobersal S.L.,
Caldes de Montbui, Barcelona, España) a 550 ºC durante 6 horas.
Material y métodos
40
V. 2. 2. 3. Parámetros indicativos de la fermentación ruminal y perfil lipídico
En cada tanda, la mitad de las botellas se sumergieron en agua y hielo picado para
detener la incubación a las 24 horas. A continuación, se mezclaron las 3 botellas de cada
tratamiento para componer una única muestra y se tomaron muestras para analizar una
serie de parámetros indicativos de la fermentación ruminal y del perfil lipídico.
En cada muestra, se midió el pH mediante un pH-metro provisto de una sonda de
vidrio (GLP-22; Crison Instruments S.A., Alella, Barcelona, España) y se tomaron 8 ml
en tubos de propileno de 10 ml de capacidad que posteriormente se centrifugaron (3000
rpm, 10 min, 4 ºC; 5415C; Eppendorf, Madrid, España) para eliminar cualquier sólido
en suspensión. Cuatro ml del sobrenadante de cada muestra se acidificaron con 4 ml de
HCl 0,2 N y se almacenaron a -30 ºC hasta la determinación de la concentración de
amoniaco.
Así mismo, y por duplicado, se recogieron 0,8 ml del sobrenadante de cada
muestra en tubos Eppendorf de 2 ml de capacidad, se mezclaron con 0,5 ml de una
solución desproteinizante (20 g/l de ácido metafosfórico disueltos en 0,5 ml de ácido
clorhídrico 0,5 N) junto con 4 g/l de ácido crotónico (utilizado como patrón interno;
Merck, Alemania) y se congelaron a -30 ºC hasta el análisis de acidos grasos volátiles
(AGV).
Una vez recogidas las muestras para amoniaco y AGV, el resto del contenido de
cada muestra se liofilizó (FTS LyoStar, Warminster, Estados Unidos), se molió a 0,5
mm de tamaño en un molino centrifugo y se conservo a -80 °C hasta la determinación
de su perfil lipídico.
V. 2. 3. Análisis químicos
V. 2. 3. 1. Alimentos y residuos de la incubación
El análisis químico convencional de los alimentos y de los residuos de la
incubación se realizó siguiendo la metodología definida por la Organización
Internacional para la Estandarización correspondiente a la determinación del contenido
de materia seca (ISO 6496:1999), cenizas (ISO 5984:2002) y nitrógeno (ISO 5983-
2:2005).
Material y métodos
41
El contenido de materia seca (MS) de las muestras de incubación se determinó por
desecación en una estufa de ventilación forzada (P Selecta; España) a 103 ºC hasta peso
constante.
Posteriormente, la muestra seca se quemó en un horno-mufla (12-PR/400; Fornos
Hobersal; España) a 550 ºC durante 6 horas para determinar el contenido de cenizas.
El análisis de nitrógeno se efectuó adaptando la técnica Kjeldahl (AOAC; 1999) y
empleando un autoanalizador Kjeltec (KjeltezTM 2400; Suecia) y sulfato potásico y
sulfato cúprico como catalizadores. El contenido de proteína bruta (PB) se obtuvo
multiplicando la valor de nitrógeno de cada muestra por el factor de conversión 6,25
(PB = 6,25 × N).
El contenido de fibra neutro detergente (FND) y fibra ácido detergente (FAD) se
determinaron utilizando la metodología aportada por Van Soest et al. (1991) y Goering
y Van Soest (1970) con la adición de sulfito sódico y se expresaron incluyendo la ceniza
residual. Para llevar a cabo estos análisis se utilizó un analizador de fibra Ankom 2000
(Ankom, Macedon, Estados Unidos).
V. 2. 3. 2. Amoniaco y ácidos grasos volátiles
Amoniaco
La concentración de amoniaco de las muestras se estimó a partir de una recta de
calibración con cloruro de amonio como estándar de referencia, utilizando la
metodología descrita por Weatherburn (1967). Según este método, se descongelaron las
muestras a 4 ºC, se centrifugaron (3000 rpm, 10 min, 4 ºC) y se filtraron con embudo
cónico y papel de filtro (Albert 145). Posteriormente, se trataron con hipoclorito sódico
y con fenol, en un medio alcalino y, por último, se leyeron las absorbancias a 650 m en
un espectrofotómetro de doble haz (Shimadzu UV-1603; Tokio, Japón).
Ácidos grasos volátiles
La determinación de la producción de ácidos grasos volátiles se llevo a cabo
mediante la técnica de cromatografía de gases descrita por Carro et al. (1999) utilizando
el ácido crotónico (Merck, Madrid, Alemania) como patrón interno. Para ello, se
descongelaron las muestras en cámara frigorífica a 4 ºC, se centrifugaron (10000 rpm,
10 min, 4 ºC) y se recogió el sobrenadante en viales de cromatografía. A continuación,
se cuantificó la concentración de los AGV (acético, propiónico, butírico, valérico,
Material y métodos
42
isobutírico, isovalérico y caproico) utilizando un cromatografo de gases (Autosystem
XL; Perkin Elmer, Massachussets, Estados Unidos).
V. 2. 3. 3. Ácidos grasos de cadena larga
El perfil de ácidos grasos de cadena larga de la digesta se analizó mediante
cromatografía de gases (GC), siguiendo las recomendaciones de Shingfield et al. (2003),
tal y como se detalla a continuación.
a. Extracción y metilación
La preparación de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) fue realizada
siguiendo un procedimiento de extracción-transesterificación con cloroformo y ácido
sulfúrico mezclado con metanol (Shingfield et al., 2003).
Para poder cuantificar el contenido de ácidos grasos, se utilizó el ácido
tridecanoico (Sigma, Madrid, España) como estándar interno. Los lípidos de 200 mg de
muestra liofilizada se extrajeron por duplicado con 4 ml de una mezcla de hexano:2-
propanol (3:2, v/v), tras el ajuste del pH de la digesta a 2 con ácido clorhídrico 2 M.
Posteriormente, se combinaron los extractos orgánicos obtenidos de cada muestra
y se secaron bajo corriente de nitrógeno a 50 °C. A continuación, los lípidos disueltos
en 2 ml de hexano se metilaron (i. e., se transformaron en FAME) mediante una
transesterificación ácido-básica con una preparación fresca de metóxido sódico 0,5 M
en metanol, de 5 minutos a 20 °C, seguida de una reacción con una solución al 1% de
ácido sulfúrico en metanol, a 50 ºC durante 30 minutos.
b. Análisis de los FAME mediante cromatografía de gases
El análisis de los ésteres metílicos de los ácidos grasos se realizó mediante un
cromatografo de gas (Agilent 6890 N Network System; Palo Alto, Estados Unidos)
equipado con un inyector automático, un detector de ionización de llama (FID) y una
columna capilar CP-Sil 88 (100 m × 0,25 mm; 0,20 μm; Varian, Middelburg, Holanda),
utilizando helio como gas portador y aire sintético e hidrógeno como combustible.
El perfil de los ácidos grasos metilados (FAME) de 2 μl de muestra líquida,
inyectada con un split de 1:50, se determinó usando el gradiente de temperatura descrito
en Shingfield et al. (2003). Para conseguir un mejor análisis de los isómeros 18:1 se
realizó otro análisis en condiciones isotermas a 170 °C (Shingfield et al., 2003).
Material y métodos
43
Los picos cromatográficos de los distintos FAME fueron identificados basándose
en una mezcla de auténticos estándares (GLC-463, U-45-M, Nu-Chek Prep Inc.,
Elysian, Estados Unidos; 18919, O-5632, L-6031, L-8404; Sigma, Madrid, España) y
por comparación con muestras verificadas previamente mediante cromatografía de
gases y espectrometría de masas (GC-MS) de los derivados 4,4-dimetiloxazolínicos
(DMOX; e. g., Toral et al., 2010c).
V. 2. 4. Cálculos y análisis estadísticos
En función de los valores de presión obtenidos, y tras corregirlos para la cantidad
de MO incubada y el gas producido por los blancos, se estimó el volumen de gas
mediante la siguiente ecuación de regresión (Hervás et al., 2005):
Gas (ml) = 5,3407 × presión (psi)
R2 > 0,99; P<0,001 (n = 17790)
Los datos de producción de gas (G; ml/g MO) se ajustaron al modelo exponencial
descrito por France et al. (2000):
G = A (1 – exp – c × t)
siendo:
G, la producción de gas (ml/g MO) en el tiempo t,
A, la producción asintótica de gas (ml/g MO),
c, el ritmo fraccional de producción de gas (/h), y
t, el tiempo de lectura del gas (h).
Los parámetros A y c se estimaron mediante el método DUD iterativo utilizando
el procedimiento NLIN del paquete estadístico SAS (SAS, 2003).
A partir de los parámetros anteriores y mediante la ecuación propuesta por France
et al. (2000), se estimó la degradabilidad efectiva (DE24; %) de la MS considerando un
valor de ritmo de paso (kp) de 0,042 /h:
DE24 = [c × DMS72 / (c + kp)]
siendo DMS72 la desaparición de materia seca a las 72 horas post-incubación.
El ritmo medio de fermentación (AFR; ml gas/h), definido como el ritmo medio
de producción de gas en el intervalo de tiempo transcurrido entre el inicio de la
incubación y el punto donde se alcanza la mitad de la asíntota, se calculó como
AFR = A × c / (2 × ln 2)
Los parámetros cinéticos de producción de gas (A y c), la DE24, el AFR, los datos
de DMS y DMO a las 72 horas post-incubación, el pH final de incubación, la
Material y métodos
44
concentración de amoniaco, la producción de AGV y la concentración de FAMEs
obtenidos en la prueba in vitro se estudiaron mediante un análisis de varianza de una vía
utilizando el procedimiento MIXED del programa estadístico SAS (SAS, 2003),
conforme al siguiente modelo:
Yi = μ + Ti + ξi
siendo:
Yi, la variable dependiente,
μ, la media,
Ti, el efecto debido al tratamiento experimental, y
ξi, el error residual.
Los valores medios de cada parámetro para cada tratamiento se compararon con
los del tratamiento control positivo (TMR + 2% de aceite de girasol) mediante una t de
Student, utilizando los errores específicos para cada comparación de acuerdo con el
modelo estadístico utilizado.
Se admitieron como diferencias estadísticamente significativas aquellas con un
nivel de significación (P) inferior a P<0,05, considerándose P<0,10 una tendencia a la
significación.
VI. RESULTADOS
Resultados
47
Todos los resultados se presentan de la siguiente manera: primero se muestran los
valores medios y los errores estándar observados en los tratamientos control negativo
(TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y, a continuación, los porcentajes de
variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo.
VI. 1. FERMENTACIÓN RUMINAL IN VITRO
En ningún caso la suplementación con aceite de girasol de la dieta base (i. e.,
TMR vs. TMR+Girasol) dio lugar a diferencias significativas en los parámetros de
fermentación ruminal presentados en las tablas 4, 5 y 6 (P>0,10).
Los resultados de los indicadores de la fermentación ruminal in vitro A, c, AFR,
DE24, DMS72 y DMO72 figuran en la tabla 4. Como puede comprobarse, aunque todos
los tipos y dosis de taninos redujeron la producción asintótica de gas (A), dicha
reducción solo mostró una tendencia a la significación (P<0,10) con la dosis alta (5%)
de quebracho.
Con respecto al ritmo fraccional de fermentación (c), se registró una tendencia
(P<0,10) a valores menores en los tratamientos uva 5% y roble 2%. En cambio, el ritmo
medio de fermentación (AFR) se redujo de forma más acusada y significativamente
(P<0,05) con la dosis alta de los dos TC (quebracho y uva; -20,5% de media) y mostró
una tendencia a la disminución con uva 2% y con castaño 5%.
Por lo que respecta a los parámetros de desaparición in vitro de MS y MO, apenas
se observaron variaciones, con la excepción del quebracho 2%, que tendió a reducir el
valor de DMS72 (-2,5%; P<0,10).
En relación a la degradabilidad efectiva (DE24), aunque se observó una
disminución de su valor (de aproximadamente -1,8% de media) con todos los tipos y
dosis de taninos, solo con los tratamientos con quebracho, castaño 5% y roble 2% fue
estadísticamente significativa (P<0,05) o tendió a la significación (P<0,10) en el caso de
la uva 5%.
48
Tabla 4. Parámetros cinéticos de producción de gas: A (ml/g MO; producción asintótica de gas), c (/h; ritmo fraccional de fermentación), AFR (ml gas/h; ritmo medio de fermentación), DE24 (g/g; degradabilidad efectiva), DMS72 (%; degradación de materia seca tras 72 horas de incubación in vitro) y DMO72 (%; degradación de materia orgánica tras 72 horas de incubación in vitro). Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo.
A c AFR DE24 DMS72 DMO72
TMR 336,9±18,90 0,078±0,0004 18,95±0,970 53,10±0,070 84,93±0,260 85,41±0,195 TMR+Girasol 345,2±33,40 0,076±0,0002 19,01±1,800 53,10±0,380 85,58±0,555 85,75±0,670
+ Quebracho 2% -3,35 NS 0,85 NS -2,50 NS -2,15 * -2,45 † -2,45 NS
+ Quebracho 5% -20,10 † 1,85 NS -21,70 * -2,70 * -2,05 NS -2,25 NS + Uva 2% -13,60 NS -1,50 NS -15,00 † -0,45 NS 0,10 NS 0,00 NS
+ Uva 5% -15,05 NS -4,85 † -19,20 * -2,05 † -0,30 NS -0,85 NS + Castaño 2% -1,55 NS -2,15 NS -4,00 NS -1,35 NS -0,55 NS -0,85 NS + Castaño 5% -12,45 NS -4,05 NS -16,25 † -3,20 * -1,75 NS -2,75 NS + Roble 2% -5,65 NS -4,65 † -10,40 NS -2,45 * -0,80 NS -0,95 NS + Roble 5% -6,85 NS -3,75 NS -10,90 NS -0,35 NS 1,05 NS 1,80 NS
A la derecha de cada porcentaje de variación aparece su nivel de significación estadística (i. e., tratamiento vs. control positivo): NS = no significativo, P>0,10; † = P<0,10 y * = P<0,05.
Resultados
49
En la tabla 5, se presentan los datos correspondientes al pH, concentración de
amoniaco, producción de ácidos grasos volátiles totales y la relación acético/propiónico
tras 24 horas de incubación in vitro.
Tabla 5. Valores de pH, concentración de amoniaco (mg/l), producción de ácidos grasos volátiles totales (AGV total; mmol/l) y relación acético/propiónico (A/P). Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo.
pH Amoniaco AGV total A/P
TMR 6,23 ±0,060 606,3 ±27,75 65,2 ± 4,20 3,14±0,225TMR+Girasol 6,24 ±0,001 633,7 ±10,55 48,5 ±14,19 3,16±0,195
+ Quebracho 2% 0,70 NS -6,60 NS -7,05 NS 0,35 NS
+ Quebracho 5% 1,30 NS -18,05 * 26,00 NS -3,50 NS
+ Uva 2% 1,35 NS -9,55 NS 8,60 NS -4,00 NS + Uva 5% 2,85 * -13,20 * 7,90 NS 2,25 NS + Castaño 2% 2,70 * -9,35 NS 18,35 NS 2,60 NS
+ Castaño 5% 2,25 * -18,95 * 13,35 NS -1,75 NS
+ Roble 2% 1,30 NS -13,35 * 53,80 NS 1,80 NS + Roble 5% 1,35 NS -16,70 * 45,65 NS 3,10 NS
A la derecha de cada porcentaje de variación aparece su nivel de significación estadística (i. e., tratamiento vs. control positivo): NS = no significativo, P>0,10 y * = P<0,05.
Los valores de pH se vieron ligeramente aumentados (2,6% de media; P<0,05) al
tratar la TMR rica en girasol con uva 5% y con las dos dosis de TH de castaño.
Tal como figura en la tabla, todos los tipos y dosis de taninos redujeron la
concentración de amoniaco, aunque no todos los tratamientos llegaron a alcanzar los
niveles exigidos de significación. Así, cuando se trató la TMR enriquecida con girasol
con la dosis baja (2%) de quebracho, uva o castaño, no se observó ninguna
diferencia estadísticamente significativa (P>0,10). Cuando la variación de la
concentración de amoniaco resultó significativa, la caída media fue del -16,1%.
Como se puede observar en los resultados de los ácidos grasos volátiles, los
tratamientos con taninos no tuvieron ningún efecto significativo (P>0,10) ni sobre la
producción total ni sobre la relación acético/propiónico. Sin embargo, y tal como figura
en la tabla 6, sí se registraron variaciones significativas (P<0,05) sobre sus proporciones
molares, concretamente sobre aquellas del ácido acético y de los ácidos minoritarios
denominados “otros”.
Resultados
50
Tabla 6. Proporciones molares (%) de ácido acético, propiónico, butírico y otros (valérico, isobutírico, isovalérico y caproico). Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo.
Acético Propiónico Butírico Otros
TMR 59,1 ±0,11 18,6 ±1,39 17,0 ±1,40 5,0 ±0,11 TMR+Girasol 58,6 ±0,46 18,6 ±1,30 17,6 ±1,66 5,2 ±0,11
+ Quebracho 2% 0,45 NS 0,20 NS -0,50 NS -5,75 NS + Quebracho 5% 1,60 * 5,35 NS -6,45 NS -16,10 * + Uva 2% 1,20 † 5,50 NS -5,90 NS -12,65 † + Uva 5% 2,80 * 0,55 NS -5,05 NS -16,70 * + Castaño 2% 1,70 * -0,90 NS -1,35 NS -10,45 NS + Castaño 5% 2,25 * 4,25 NS -4,60 NS -12,95 * + Roble 2% 1,95 * 0,30 NS -3,65 NS -12,55 † + Roble 5% 3,05 * 0,20 NS -4,90 NS -20,80 *
A la derecha de cada porcentaje de variación aparece su nivel de significación estadística (i. e., tratamiento vs. control positivo): NS = no significativo, P>0,10; † = P<0,10 y * = P<0,05.
En cuanto a las proporciones del acético, los resultados muestran que casi todos
los tipos y dosis de taninos, con la única excepción del quebracho 2%, aumentaron su
proporción molar (de media un 2,1%). Por el contrario, las proporciones molares de los
“otros” se redujeron con la adición de taninos a las incubaciones. Así, tal como muestra
la tabla 6, las caídas más notables se observaron con la dosis alta (5%) de los 4 tipos de
extractos fenólicos. Por lo que respecta al efecto de las dosis bajas de taninos (i. e., 2%),
cabe destacar una tendencia (P<0,10) del roble y de la uva a disminuir la proporción
molar de los denominados “otros”.
VI. 2. BIOHIDROGENACIÓN RUMINAL DE LOS ÁCIDOS GRASOS
En la tabla 7 se muestra un perfil lipídico parcial de la digesta ruminal de las
incubaciones in vitro. Tal como puede observarse, la suplementación de la TMR con
girasol supuso un incremento (P<0,05) de las concentraciones de los 18:1 totales, de
ácido linoleico (cis-9 cis-12 18:2 o 18:2n-6), de CLA total y del total de 18:2 no
conjugados, pero no modificó significativamente (P>0,10) los contenidos de esteárico
(18:0), ruménico (cis-9 trans-11 18:2) o α-linolénico (cis-9 cis-12 cis-15 18:3.
La adición de los distintos tipos y dosis de taninos no produjo ningún cambio
significativo de las concentraciones del 18:0 y del total de los 18:1 (P>0,10). Tampoco
se encontraron diferencias significativas en la concentración total de CLA en general, ni
del isómero cis-9 trans-11 18:2 (RA) en particular.
Resultados
51
Sin embargo, sí se detectaron incrementos significativos (P<0,05) de ácido
linoleico (cis-9 cis-12 18:2), del total de los 18:2 no conjugados y del 18:3n-3 debidos
al tratamiento con el 5% de los dos TH (i. e., roble y castaño). De forma similar, se
registró una tendencia (P<0,10) hacia una mayor concentración de linoleico y de los
18:2 no conjugados con el castaño 2% y también del 18:3n-3 con el quebracho 5%.
En la tabla 8 se especifican los ácidos grasos cis 18:1. Habría que destacar, en
primer lugar, que la suplementación con aceite de girasol supuso un incremento del cis-
9, cis-10 + trans-15, cis-11 y cis-12.
En general, los tratamientos con taninos no dieron lugar apenas a cambios en la
acumulación de ácidos grasos cis 18:1. Sin embargo, sí que se observó un incremento
significativo (P<0,05) de la concentración del cis-9 y del cis-11 18:1 en respuesta a la
suplementación con castaño 5% y una reducción (P<0,05) del cis-12 18:1 en los
tratamientos con quebracho 5% y uva 5% y castaño (ambos, 2 y 5%) y del cis-16 18:1
con los tratamientos roble 5% y castaño 2 y 5%.
En cuanto a los ácidos grasos trans 18:1, que se presentan en la tabla 9, se observó
que ninguno de los tratamientos con taninos afectó a las concentraciones de los trans-5,
-10, -11 y -12 18:1 y que los cambios del resto de los MUFA trans 18:1 fueron debidos
únicamente a los TH. Dichos cambios consistieron en un descenso significativo
(P<0,05) de las concentraciones de los trans-6+7+8 18:1 con el tratamiento castaño 2%,
de las del trans-9 con roble 5% y castaño 5%, y una tendencia a la reducción (P<0,10)
del trans-9 con castaño 2% y de los trans-13 y trans-16 con el roble 5%. Conviene
señalar, eso sí, que el enriquecimiento de la dieta con aceite de girasol ya había supuesto
un aumento significativo de los trans-6+7+8, -9, -10, -11, -12, -13 18:1, y una tendencia
(P<0,10) también del trans-16.
52
Tabla 7. Concentraciones (mg/g de digesta) de diversos ácidos grasos de cadena larga de la digesta ruminal. Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo.
18:0 total 18:1 cis-9 cis-12 18:2 cis-9 trans-11 CLA Total CLA Total 18:2 no conj. 18:3n-3 TMR 12,36±0,984 4,83±0,809 0,75±0,051 0,03±0,001 0,19±0,005 1,07±0,115 0,19±0,008TMR+Girasol 14,22±0,098 7,75±0,481* 2,31±0,128* 0,08±0,030 0,64±0,022* 2,59±0,150* 0,17±0,009
+ Quebracho 2% 1,55 NS -1,45 NS -1,20 NS 25,30 NS -3,55 NS -0,40 NS 5,50 NS + Quebracho 5% -5,75 NS -0,20 NS 18,20 NS -4,65 NS -9,60 NS 17,45 NS 27,50 † + Uva 2% -11,50 NS 0,50 NS 8,95 NS -16,00 NS -3,85 NS 8,10 NS 16,80 NS + Uva 5% -2,70 NS 0,35 NS 18,65 NS 2,65 NS -7,00 NS 17,85 NS 15,85 NS + Castaño 2% 3,60 NS -6,00 NS 22,50 † 6,15 NS -10,05 NS 18,90 † 40,00 * + Castaño 5% -7,10 NS 1,70 NS 54,10 * -8,90 NS -7,85 NS 47,70 * 40,70 * + Roble 2% -8,55 NS -4,60 NS 20,70 NS 0,35 NS -6,35 NS 17,90 NS 18,95 NS + Roble 5% -8,90 NS -0,35 NS 41,25 * -3,60 NS -0,75 NS 35,10 * 32,65 *
A la derecha de cada porcentaje de variación aparece su nivel de significación estadística (i. e., tratamiento vs. control positivo): NS= no significativo, P >0,10; †= P<0,10 y * = P <0,05.
53
Tabla 8. Concentraciones (mg/g de digesta) de ácidos grasos cis 18:1 de la digesta ruminal. Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo.
cis-9 18:1 cis-10+trans-15 18:1 cis-11 18:1 cis-12 18:1 cis-13 18:1 cis-15 18:1 cis-16 18:1 TMR 1,13±0,260 0,29±0,051 0,21±0,022 0,10±0,016 0,04±0,010 0,04±0,004 0,04±0,002 TMR+Girasol 2,13±0,162* 0,50±0,038* 0,31±0,013* 0,22±0,007* 0,05±0,007 0,03±0,003 0,05±0,003* + Quebracho 2% -1,10 NS -6,80 NS 3,30 NS -10,65 NS -6,90 NS 0,15 NS 4,60 NS + Quebracho 5% 6,90 NS -4,60 NS 12,05 NS -20,35 * 1,55 NS 11,50 NS -0,45 NS + Uva 2% 6,60 NS -10,50 NS 7,70 NS -2,60 NS 13,00 NS 9,10 NS -11,40 NS + Uva 5% 9,55 NS -6,35 NS 12,50 NS -16,25 * 12,20 NS 22,70 NS -8,30 NS + Castaño 2% 6,55 NS -10,10 NS 4,80 NS -30,25 * -11,85 NS 11,20 NS -23,10 * + Castaño 5% 26,00 * -11,40 NS 21,45 * -24,05 * -0,85 NS 20,05 NS -21,85 * + Roble 2% 6,30 NS -9,35 NS 1,40 NS -7,45 NS -10,90 NS 4,75 NS -15,70 NS + Roble 5% 18,00 NS -7,90 NS 11,40 NS -11,10 NS -3,60 NS 2,65 NS -23,35 *
A la derecha de cada porcentaje de variación aparece su nivel de significación estadística (i. e., tratamiento vs. control positivo): NS= no significativo, P >0,10 y * = P <0,05.
54
Tabla 9. Concentraciones (mg/g de digesta) de ácidos grasos trans 18:1 de la digesta ruminal. Valor medio y error estándar en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol) y porcentaje de variación de cada tratamiento con taninos respecto al control positivo. trans-5 18:1 trans-6+7+8 18:1 trans-9 18:1 trans-10 18:1 trans-11 18:1 trans-12 18:1 trans-13 18:1 trans-16 18:1
TMR 0,04±0,010 0,14±0,018 0,12±0,012 0,16±0,015 1,80±0,298 0,30±0,055 0,27±0,028 0,18±0,014 TMR+Girasol 0,04±0,002 0,20±0,010* 0,21±0,008* 0,34±0,021* 2,63±0,223* 0,46±0,012* 0,36±0,008* 0,21±0,001†
+ Quebracho 2% 3,95 NS -3,35 NS -1,95 NS 0,35 NS 0,40 NS 5,15 NS -2,00 NS -2,90 NS
+ Quebracho 5% 25,15 NS -6,70 NS -5,60 NS -2,45 NS -2,85 NS -4,30 NS -0,90 NS -1,95 NS
+ Uva 2% -17,10 NS 6,40 NS -11,45 NS 10,25 NS -1,50 NS -5,15 NS -7,30 NS 0,80 NS
+ Uva 5% -2,05 NS -5,15 NS -5,55 NS -2,55 NS -6,15 NS 2,55 NS 9,00 NS 3,80 NS
+ Castaño 2% -3,40 NS -16,70 * -12,55 † -16,25 NS -9,60 NS -15,70 NS -9,75 NS -3,80 NS
+ Castaño 5% -7,85 NS -7,15 NS -19,95 * -9,95 NS -6,05 NS -13,35 NS -11,85 NS -5,80 NS + Roble 2% -5,10 NS -8,95 NS -5,60 NS -12,90 NS -9,10 NS -9,25 NS -10,25 NS -9,65 NS
+ Roble 5% -14,60 NS -1,50 NS -16,85 * -7,40 NS -5,70 NS -11,35 NS -17,25 † -14,40 †
A la derecha de cada porcentaje de variación aparece su nivel de significación estadística (i. e., tratamiento vs. control positivo): NS = no significativo, P>0,10; † = P<0,10 y * = P<0,05.
VII. DISCUSIÓN
Discusión
57
Aunque el objetivo principal de esta tesis fue estudiar el efecto de los taninos
sobre la fermentación ruminal y la biohidrogenación de los ácidos grasos en el rumen,
en cada apartado se discutirá inicialmente el impacto del aporte de aceite de girasol en
la dieta para centrarse a continuación en los efectos específicos de los taninos.
VII. 1. FERMENTACIÓN RUMINAL IN VITRO
VII.1.1. Efecto de la suplementación lipídica
De acuerdo con estudios realizados en décadas anteriores, la suplementación de la
dieta de los rumiantes con fuentes lipídicas (principalmente con PUFA) provocaría un
deterioro de la fermentación ruminal, al inhibir el crecimiento y la actividad de los
microorganismos del rumen (Harfoot y Hazelwood, 1997). No obstante, esta afirmación
no es siempre cierta y depende de numerosos factores entre los que cabría destacar, en
primer lugar, la cantidad de lípidos incluida en la dieta.
En nuestro estudio, no se observaron diferencias significativas ni en los
parámetros de la cinética de producción de gas ni en la desaparición de sustrato (DMS72,
DMO72), lo que sugiere que la inclusión de aceite de girasol no afectó negativamente ni
a la actividad de los microorganismos ruminales ni, consecuentemente, al proceso de
fermentación ruminal. Esto coincide incluso con los resultados obtenidos por Hervás et
al. (2008) con una TMR alta en concentrado, formulada para ovejas en lactación, y
suplementada con una cantidad bastante más elevada de aceite de girasol (6%).
Los valores de pH tampoco se vieron afectados por la suplementación lipídica, lo
cual posiblemente sea debido a la disponibilidad de un nivel adecuado de fibra efectiva
(Mertens, 1997) conseguido gracias al tamaño de partícula del heno de alfalfa (> 4cm) y
al aporte del cereal en grano. Esto apoyaría lo observado por otros autores con dietas
suplementadas con aceite de girasol tanto en ovino (al 6%, Hervás et al., 2008 y al 2%,
Toral et al., 2010a) como en bovino (>3,4%, Shingfield et al., 2008).
Tampoco se observó ningún efecto de la complementación de la dieta con aceite
de girasol sobre la concentración del amoniaco ruminal, al igual que observaron
previamente por Hervás et al. (2008). No obstante, conviene mencionar que en algunos
estudios con ganado ovino y bovino se ha encontrado que la adición de los aceites
vegetales puede reducir (Gómez-cortés et al., 2008; Shingfield et al, 2008) o
incrementar la concentración de NH3 ruminal (Zhang et al., 2008).
Discusión
58
Con respecto a los AGV, y tal como muestran los resultados de este ensayo, la
suplementación lipídica no produjo modificaciones destacables sobre la concentración
de AGV totales ni sobre la relación acético/propiónico o las proporciones molares de los
distintos AGV, lo cual ha sido previamente constatado en otros trabajos (Gómez-Cortés
et al., 2008; Hervás et al., 2008; Shingfield et al., 2008). No obstante, Zhang et al.
(2008) señalaron que la incubación in vitro de ácido linoleico con líquido ruminal de
ovejas produjo un incremento de la proporción molar de propiónico en detrimento de la
de acético, lo que, probablemente, sea el resultado de una mayor sensibilidad de las
bacterias productoras de acético, tales como Fibrobacter succinogenes y Ruminococcus
flavefaciens, conocidas como las bacterias celulíticas predominantes en el rumen.
Cabe destacar también que el efecto de la suplementación lipídica sobre la
proporción del butírico es muy variable, oscilando entre la ausencia de efectos
(Shingfield et al., 2008), incrementos (Palmquist y Griinari, 2006) o descensos del
mismo (Toral et al., 2010a). Al igual que en el caso del ácido acético, dichos cambios
podrían ser debidos a una elevada sensibilidad a los PUFA de las bacterias productoras
de butírico, entre las cuales se encuentran Butyrivibrio fibrisolvens y Eubacterium
ruminantium (Jenkins et al., 2008).
VII.1.2. Efecto del aporte de taninos
Numerosos estudios han puesto de manifiesto una reducción tanto del ritmo como
de la extensión de la producción de gas debida a la presencia de estos compuestos
polifenólicos (e. g., Getachew et al., 2000; Frutos et al., 2004a; Vasta et al., 2009a) lo
que, posiblemente, sea consecuencia de un detrimento en la adhesión de los
microorganismos a las partículas de alimento y una inhibición del crecimiento y de la
actividad enzimática de la microbiota ruminal (McSweeney et al., 2003; Smith et al.,
2005). Esto serviría para explicar, tal y como puede comprobarse en los resultados de
nuestro ensayo, la tendencia a la reducción de la producción asintótica de gas (A, figura
5) con la dosis alta (5%) de quebracho y del ritmo fraccional de fermentación (c) con
uva 5% y roble 2%, junto con el descenso significativo y más acusado del ritmo medio
de fermentación (AFR) con la dosis alta de los dos taninos condensados (quebracho y
uva).
Estos resultados reflejarían también el hecho de que la actividad de los taninos
está condicionada por el tipo (Frutos et al., 2004a) y la dosis de estos polifenoles (Aerts
et al., 1999, Hervás et al., 2003), ya que se ha comprobado que diferentes tipos de
Discusión
59
taninos pueden ejercer efectos muy diversos. En cuanto a la dosis, parece claro que la
actividad degradativa de los microorganismos ruminales se reduce más cuando la
concentración de estos compuestos es elevada. Sin embargo, cuando la concentración es
baja o moderada, algunos microorganismos pueden compensar los efectos negativos
mediante, por ejemplo, una mayor producción de enzimas ligadas a la membrana o la
formación de un glicocálix, con lo que pueden llegar a adaptarse a los taninos sin que la
actividad fermentativa se vea afectada de modo muy acusado (Degeest y De Vuyst,
1999).
Figura 5. Cinéticas de producción asintótica de gas (ml/g MO) en los diferentes tratamientos.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 12 24 36 48 60 72
ml /
g M
O
horas
TMR
TMR+Girasol
+ Quebracho 2%
+ Quebracho 5%
+Uva 2%
+ Uva 5%
+ Castaño 2%
+ Castaño 5%
+ Roble 2%
+ Roble 5%
En relación a la desaparición de MS, solo se observó una tendencia a una menor
DMS72 con el quebracho 2%. Como dato individual, podría apoyar la teoría de que la
presencia de TC en las dietas reduce la degradación ruminal de los alimentos (Mueller-
Harvey y McAllan, 1992; Aerts et al., 1999; Frutos et al., 2000). Sin embargo, lo más
sorprendente es precisamente lo contrario, es decir, que los demás tratamientos no
tuvieran ningún efecto significativo, lo cual es muy probable que fuera debido a la
enorme variación individual observada entre réplicas, tal y como se discutirá en detalle
más adelante.
Con respecto a la degradabilidad efectiva (DE24), y contrariamente a los
parámetros de la cinética de fermentación ruminal, que se vieron más afectados con los
TC, se observó un efecto inhibidor más acusado de los TH, especialmente con una dosis
Discusión
60
alta de castaño. Estas diferencias contrarrestarían la teoría de que los TH provocan un
efecto menos acentuado que los TC (Foley et al., 1999), al ser rápidamente hidrolizados
y degradados en el rumen a glucosa y compuestos fenólicos de menor tamaño
(McSweeney et al., 2001b; Getachew et al., 2008), y confirman el efecto más
pronunciado de algunos TH encontrado por ciertos autores (Frutos et al., 2004a;
Martínez et al., 2005; Mutarabuka et al., 2007).
El pH ruminal, el amoniaco (producido a partir de la degradación de la proteína),
y los AGV (productos de la fermentación principalmente de los hidratos de carbono)
pueden resultar buenos indicadores de las alteraciones observadas en las características
de la degradación ruminal (Giráldez et al., 1994).
En relación al pH, los valores obtenidos en este ensayo se vieron ligeramente
aumentados al tratar la TMR rica en girasol con uva 5% y con las dos dosis de TH de
castaño, lo que probablemente refleje la estimulación de ciertos grupos microbianos
productores de ácidos grasos específicos (el acético en este caso) en detrimento de otros
o un cambio de las vías de degradación microbianas (Russel y Wallace, 1997).
En cuanto a la concentración de amoniaco en el rumen, habría que puntualizar en
primer lugar que su reducción es uno de los efectos más conocidos de los taninos y de
los más señalados en la literatura científica. La disminución de este parámetro ruminal,
derivada de una menor degradación de la proteína (Frutos et al., 2004b; Bhatta et al.,
2007; Getachew et al., 2008), puede ser debida a la formación de complejos entre los
taninos y la proteína del alimento (Hagerman y Butler, 1981), la inhibición de enzimas
microbianas como la ureasa (Griffiths y Jones, 1977) o la reducción de la actividad de
bacterias proteolíticas ruminales (Jones et al., 1994). En este experimento, se comprobó
que todos los tipos y dosis de taninos disminuyeron la concentración de amoniaco,
aunque no todos los tratamientos llegaron alcanzar los niveles exigidos de significación.
La menor concentración de amoniaco se obtuvo con los TH, particularmente con
el castaño 5%, confirmando el efecto más pronunciado de estos taninos encontrado por
ciertos autores sobre la degradación de proteína (Frutos et al., 2004a; Martínez et al.,
2005; Mutarabuka et al., 2007).
Cabe destacar también que las caídas de amoniaco más notables se observaron
con la dosis alta (5%) de los 4 tipos de extractos polifenólicos, lo cual confirmaría que
el efecto de los taninos sobre la degradación de la proteína depende significativamente
Discusión
61
de la dosis (Jones et al., 1994, Molan et al., 2001). En este sentido, Jones et al. (1994)
trabajando con TC extraídos de Onobrychis vicifolia, observaron que la actividad de
diversas cepas de bacterias proteolíticas solo se inhibía cuando la elevada concentración
de taninos excedía la capacidad de las poblaciones microbianas para resistir sus efectos
o para destoxificarlos.
Es oportuno señalar también, incidiendo nuevamente en que la concentración
ruminal de amoniaco parece ser el parámetro más sensible al efecto de los taninos, que
el resto de los indicadores estudiados (DMS o, como se verá a continuación, AGV) se
vieron mínimamente afectados en esta prueba, lo cual ha sido previamente constatado
en otros trabajos (e. g., McMahon et al., 1999; Hervás et al., 2004). En este sentido,
Frutos et al. (2004b) observaron que el tratamiento de la torta de soja con un extracto
comercial de TH de castaño no afectaba a la extensión de la degradación de la MS en el
rumen de ovejas, pero reducía considerablemente la de la proteína. Esto responde a la
mayor capacidad de los taninos para formar puentes de hidrógeno con las proteínas,
gracias a la elevada afinidad entre los grupos hidroxilo de los taninos y los grupos
carbonilo de los péptidos (McLeod, 1974; Xu y Diosady, 2000; Hofmann et al., 2006).
En relación a los AGV, tal y como ya se ha indicado, la presencia de taninos no
produjo notables modificaciones ni de la concentración total ni de la relación
acético/propiónico. El efecto de los taninos sobre el contenido total de AGV es muy
inconstante y en la literatura se pueden encontrar numerosos ejemplos de estudios en los
que no se observó ninguna variación (Hervás et al., 2004, Khiaosa-Ard et al., 2009;
Toral et al., 2011), o en los que se encontraron claras reducciones (Frutos et al., 2004a;
Martínez et al., 2006; Tiemann et al., 2008). De acuerdo con los autores, estas últimas
fueron debidas a la capacidad de los taninos para unirse a la porciones fibrosas del
alimento (McSweeney et al., 2001b) o a su efecto inhibitorio sobre el crecimiento o la
actividad de las poblaciones bacterianas del rumen (Jones et al., 1994; McSweeney et
al., 2001a). En este sentido, es destacable la reducción del número de microorganismos
celulolíticos (McSweeney et al., 2001a) o la inhibición de las celulasas (Björck y
Nyman, 1987; Bento et al., 2005) señaladas en diversos trabajos.
En cuanto a las proporciones molares de los AGV, los resultados mostraron un
incremento de la proporción molar del acético con todos los tipos y dosis de taninos,
con la única excepción del quebracho 2%, y un descenso de la de los ácidos grasos
Discusión
62
minoritarios (valérico, isobutírico, isovalérico y caproico), especialmente con la dosis
alta (5%) de los 4 tipos de extractos polifenólicos.
Al igual que sucedía con el contenido de AGV totales, el efecto de los taninos
sobre las proporciones molares es también muy variable, sin variación (Toral et al.,
2011), con incrementos del ácido propiónico (Makkar et al., 1995b; Khiaosa-Ard et al.,
2009), descensos del mismo (Bento et al., 2005) o aumentos del acético en detrimento
del propiónico (Tiemann et al., 2008). Estas divergencias podrían evidenciar la
estimulación de ciertos grupos microbianos productores de ácidos grasos volátiles
específicos en detrimento de otros o un cambio de las vías de degradación microbianas
(Russel y Wallace, 1997).
Con respecto a los AGV minoritarios, puesto que estos se producen en el rumen a
partir de la descarboxilación y desaminación de ciertos aminoácidos (Andries et al.,
1987), son un buen indicador indirecto de la proteólisis ruminal, además de resultar
esenciales como factores de crecimiento para la microbiota del rumen (Moharrery,
2004). Por ello, el descenso observado en nuestro ensayo podría indicar una reducción
de la actividad proteolítica que concuerda con los resultados observados en la
concentración de amoniaco.
VII. 2. BIOHIDROGENACIÓN RUMINAL DE LOS ÁCIDOS GRASOS
VII. 2. 1. Efecto de la suplementación lipídica
Estudios recientes han mostrado que la incorporación de un aceite vegetal rico en
ácido linoleico en la dieta de rumiantes es una de las estrategias más efectivas para
aumentar el contenido de CLA de la leche (Palmquist et al., 2005; Chilliard et al., 2007;
Hervás et al., 2008). Sin embargo, existe aún muy poca información sobre el efecto
concreto de la suplementación de la dieta con 18:2n-6 sobre la composición de AG de la
digesta ruminal.
El perfil de ácidos grasos analizados en este estudio es un perfil parcial, ajustado a
los intereses más importantes de la investigación. Así, se han determinado los
principales ácidos grasos procedentes de la dieta suplementada (i. e., ácidos linoleico y
oleico), así como el representante mayoritario de los PUFA omega-3 (ácido linolénico),
aunque su aporte con la dieta (incluida la suplementada) fue muy limitado. A
continuación, se han buscado los principales metabolitos del proceso de BH ruminal:
Discusión
63
tanto 18:2 no conjugados como CLA, con especial atención al ruménico, así como 18:1
y finalmente 18:0. Dentro de los 18:1, se ha buscado un perfil lo más completo posible,
tanto de los cis como de los trans, ya que los estudios previos sobre la acción de los
taninos apuntan precisamente a una inhibición del último paso de la BH ruminal y a una
consiguiente acumulación de estos metabolitos (Khiaosa-Ard et al., 2009; Vasta el al.,
2009a).
Algunos de los cambios inducidos por la suplementación lipídica se muestran en
las figuras 6 y 7.
Figura 6. Concentraciones (mg/g de digesta) de los 18:2 no conjugados totales, del cis-9 cis-12 18:2, del CLA total y del cis-9 trans-11 CLA en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol).
0
1
2
3
total 18:2 no conjugados
cis-9 cis-12 18:2 total CLA cis-9 trans-11 CLA
m g / g d i g es ta
mg
/ g d
iges
ta TMR
TMR+Girasol
Figura 7. Concentraciones (mg/g de digesta) de los 18:1 totales y del 18:0 en los tratamientos control negativo (TMR) y control positivo (TMR+Girasol).
0
4
8
12
16
total 18:1 18:0
mg
/ g d
iges
ta
TMR
TMR+Girasol
Discusión
64
Por otra parte, es conveniente señalar que las unidades en las que se expresan los
ácidos grasos analizados son mg/g de digesta. En este sentido, es importante evitar la
confusión con otras unidades (e. g., porcentaje del total de ácidos grasos) que son más
comunes cuando se trata de un perfil más completo, pero que no tendrían sentido en este
caso.
En nuestro experimento con cultivos seriados de microorganismos ruminales, la
primera fuente de variación en la cantidad de ácidos grasos de la digesta ruminal fue la
propia suplementación con un 2% de girasol. Este aceite ha sido utilizado en estudios
previos del grupo de investigación (Toral et al., 2010c) y su composición lipídica, en
g/kg, es la siguiente: 12:0 (0,04), 14:0 (0,59), 16:0 (52,7), cis-9 16:1 (0,83), 18:0 (42,1),
cis-9 18:1 (347), cis-11 18:1 (7,72), 18:2n-6 (479), 18:3n-3 (0,61), 20:0 (2,73), cis-11
20:1 (1,55), 22:0 (7,08), 24:0 (2,16), y ácidos grasos totales (953). Por lo tanto, el mayor
aporte fue de ácido linoleico (aproximadamente 48%), seguido de ácido oleico (34,7%),
palmítico (5,3%) y esteárico (4,2%).
Por comenzar con los 18:3, concretamente con el 18:3n-3, la suplementación
lipídica de la TMR no produjo cambios en la concentración de este AG, debido
probablemente a su bajo contenido en el aceite añadido. Sin embargo, sí provocó
modificaciones sustanciales en el perfil de otros ácidos grasos, dentro de los cuales
destacaría, en primer lugar, el incremento significativo del 18:2n-6 y,
consecuentemente, del total de 18:2 no conjugados.
Aunque a priori pueda resultar sorprendente, diversos estudios han mostrado que
la suplementación lipídica de la dieta con 18:2n-6 da lugar a concentraciones menores
de este AG en la digesta ruminal (Kitessa et al., 2001; Toral et al., 2010c y en prensa).
Sin embargo, esto suele ser debido a un simple efecto de dilución (por expresarse las
concentraciones en porcentaje del total de AG, como ya se ha señalado) o a una BH
ruminal más extensa de los AG de 18 carbonos como respuesta a determinados PUFA
de cadena larga presentes en lípidos de origen marinos (Sinclair et al., 2005; Shingfield
et al., 2010). Sin embargo, esto no es aplicable al presente estudio y, lógicamente, la
concentración de ácido linolénico aumentó al aumentar su aporte con el aceite de
girasol, lo cual coincide con el incremento observado por otros autores (Kucuk et al.,
2004; Atkinson et al., 2006) en el contenido post-ruminal de este AG cuando se aporta
en la dieta.
Discusión
65
Otro resultado de la suplementación lipídica fue el aumento notable de la
concentración de CLA total, debido seguramente al aporte de 18:2n-6, precursor de la
síntesis de CLA en el rumen (Shingfield et al., 2010). Sin embargo, no se detectaron
diferencias significativas en el contenido de cis-9 trans-11 18:2 (RA), isómero
mayoritario de CLA, lo que coincidiría con los resultados obtenidos en trabajos
recientes con ovejas, en los que la incorporación de aceites vegetales ricos en ácido
linoleico en la dieta no provocó cambios en los contenidos ruminal (Toral et al., en
prensa) ni post-ruminal (Kucuk et al., 2004) de este ácido graso.
Esta ausencia de incrementos significativos en el contenido de RA cuando la dieta
se suplementa con 18:2n-6, a pesar de su mayor concentración en la leche (Hervás et al.
2008, 2011), confirma que su incremento en la grasa láctea es debido principalmente al
mayor aporte de VA que, en la glándula mamaria, servirá de sustrato para la síntesis
endógena de RA gracias a la acción de la enzima delta-9 desaturasa (Palmquist et al.,
2005).
Otra consecuencia del enriquecimiento lipídico de la TMR fue el aumento de los
ácidos grasos 18:1, tanto los cis como los trans. El incremento del cis-9 18:1 sería
atribuible directamente a su aporte con el aceite de girasol, mientras que el de los cis-10,
-11 y -12 18:1 se deberían principalmente a la hidrogenación de algunos CLA (cis-10
cis-12 18:2, cis-9 cis-11 18:2, trans-10 cis-12 18:2) generados a partir del cis-9 cis-12
18:2 de la dieta (Shingfield et al., 2010).
Con respecto al aumento de los AG trans 18:1 observado en este estudio,
numerosos trabajos previos han demostrado que la incorporación de aceites vegetales
ricos en ácido linoleico en la dieta de ovinos y bovinos, se traduce en un considerable
incremento del contenido ruminal (Atkinson et al., 2006; Toral et al., 2010c y en
prensa) y post-ruminal (AbuGhazaleh et al., 2002; Kucuk et al., 2004; Shingfield et al.,
2008) de los trans 18:1, ya que el ácido linoleico es un precursor de su síntesis en el
proceso de BH ruminal (Kucuk et al., 2004; Shingfield et al., 2008).
Así, el incremento de estos AG derivaría posiblemente del aumento de los CLA
originados en la BH del cis-9 cis-12 18:2 (trans-8 trans-10 18:2, trans-9 trans-11 18:2,
cis-9 trans-11 18:2, trans-10 cis-12 18:2, trans-10 trans-12 18:2, precursores de síntesis
de los trans-8, -9, -10, -11 y -12 18:1), así como del cis-9 18:1 (precursor de los trans-6,
Discusión
66
-7, -8, -9, -10, -11, -12 y -13 18:1; Shingfield et al., 2010) aportados con el aceite de
girasol.
Como cabía esperar, el trans-11 18:1 fue el isómero mayoritario de los 18:1 (Or-
Rashid et al., 2011; Toral et al., en prensa). No obstante, es importante señalar que, a
pesar de que el trans-10 18:1 ha sido ignorado en numerosos estudios (posiblemente por
no existir un estándar comercial para cromatografía de gases), su determinación es
fundamental porque, de lo contrario, es muy probable que se incluya como parte del
trans-11 18:1, lo cual representaría un error importante. Aunque el VA es un ácido
graso “deseable”, por ser un precursor del RA en la glándula mamaria y en otros tejidos
(Palmquist et al., 2005; Mosley et al., 2006; Bernard et al., 2010), no sucede lo mismo
con el trans-10 18:1. Además de su posible implicación negativa en la salud de los
consumidores (Roy et al., 2007), estudios recientes en vacuno han mostrado que, en
grandes cantidades, puede inhibir la lipogénesis mamaria y dar lugar al síndrome de
baja grasa en la leche (Shingfield et al., 2010).
En ciertas dietas, especialmente en aquellas con una elevada proporción de
alimentos concentrados, la adición de lípidos de origen marino produce cambios
acusados del ambiente ruminal que se traducen en alteraciones de las rutas de BH y,
consecuentemente, en un incremento del trans-10 18:1 a expensas del trans-11 18:1
(Loor et al., 2005; Boeckaert et al., 2008; Toral et al., 2010c), tal y como aparece
después en la grasa de la leche. Estas modificaciones, no obstante, no se han observado
en la grasa láctea de ovejas suplementadas con cantidades similares de aceite de girasol
(Gómez-Cortés et al., 2011). En el presente estudio in vitro, el ratio trans-10 18:1/trans-
11 18:1 en el rumen apenas varió con el suplemento lipídico de la dieta, lo cual coincide
plenamente con lo observado por Toral et al. (en prensa) in vivo, con valores numéricos
también muy similares.
En cuanto a la respuesta del 18:0, último producto de la BH ruminal, la
suplementación lipídica de la TMR no ejerció ningún efecto significativo sobre el nivel
de dicho AG. No obstante, el incremento marginal (15%) encontrado en este estudio in
vitro concuerda totalmente con el señalado por Toral et al. (en prensa) en un estudio in
vivo con ovejas en lactación suplementadas con un 2,5% de girasol (16%).
Discusión
67
VII. 2. 2. Efecto del aporte de taninos
El empleo de los taninos es otra alternativa nutricional que se ha sugerido
recientemente para modificar el metabolismo ruminal y mejorar el perfil lipídico de la
grasa láctea (Khiaosa et al. 2009, Vasta el al., 2009a,b).
No obstante, los resultados de este experimento no mostraron un efecto
beneficioso de estos polifenoles para lograr un aumento del contenido ruminal de VA y,
gracias a su posterior aporte a la glándula mamaria y a la acción de la enzima delta-9
desaturasa, un consiguiente incremento de su concentración y de la de RA en la grasa de
la leche. De hecho, ninguno de los taninos probados (quebracho, uva, castaño y roble), a
ninguna de las dos dosis (2 y 5%) consiguió modificar los contenidos ruminales de
trans-11 18:1, cis-9 trans-11 18:2 y CLA total. Tampoco alteraron los contenidos de
18:0 y trans-10 18:1.
Por el contrario, sí se detectaron aumentos significativos en los contenidos de
determinados AG como el linolénico, linoleico y oleico, que coinciden con lo señalado
por Khiaosa-Ard et al. (2009) y apuntarían a una inhibición general del proceso de BH
ruminal por parte de los taninos y no a una inhibición específica del último paso de la
biohidrogenación, como han señalado algunos autores (e. g., Kronberg et al., 2007).
Esta inhibición sería posiblemente un reflejo de los cambios en la comunidad bacteriana
del rumen en respuesta al consumo de taninos (Smith et al., 2005).
El aumento del 18:2n-6 llevó parejo un aumento de los 18:2 no conjugados y el
efecto negativo de los taninos sobre su hidrogenación ruminal hizo que disminuyera la
concentración de determinados metabolitos intermedios (e. g., trans-9 18:1, cis-12 18:1
y cis-16 18:1) (Shingfield et al., 2010). Algo muy similar sucedió con otros 18:1 (e. g.,
trans-6+7+8 18:1) procedentes principalmente de la isomerización del ácido oleico
(Shingfield et al., 2010).
Un aspecto llamativo sobre el que convendría hacer un pequeño comentario es la
ausencia de diferencias significativas (i. e., con una P<0,10) en casos en los que los
porcentajes de variación debidos al tratamiento con taninos rondaron o incluso
superaron el 20% y que probablemente fueran debidos a la enorme variación individual
observada entre réplicas. En este sentido, son destacables las grandes diferencias
encontradas entre las dos tandas de incubación (réplicas) llevadas a cabo en días
diferentes pero con inóculo ruminal de los mismos animales donantes, tal y como se
Discusión
68
explica en el apartado IV.2.2.2. del Material y Métodos. Aunque se supone que esta
metodología es la más correcta para disponer de réplicas (López et al., 2010) porque se
asume que existe una cierta estabilidad en la estructura de la microbiota ruminal a lo
largo de periodos de tiempo cortos (Yáñez-Ruiz et al., 2009), estudios previos han
mostrado variaciones significativas en la comunidad bacteriana del fluido ruminal
utilizado como inóculo (Belenguer et al., 2011). Dichas diferencias son especialmente
acusadas cuando los donantes del inóculo son ovejas alimentadas con una dieta
completa (TMR), como es el caso de este estudio, lo cual podría haber contribuido a que
no se detectaran como significativos determinados efectos que, sin esta elevadísima
variación, posiblemente sí lo hubieran sido.
Otro aspecto sobre el que es preciso tratar en la discusión es que los efectos
observados no fueron comunes para todos los tipos de taninos ni para las dos
concentraciones, lo cual demuestra la importancia tanto del tipo de tanino como de la
dosis empleada. En nuestro experimento, la mayor parte de los resultados significativos
se encontraron en los dos tratamientos con castaño (2 y 5%, aunque principalmente con
el 5%) y con roble al 5%.
Los taninos se han clasificado tradicionalmente en dos grandes grupos:
condensados e hidrolizables, aunque esta clasificación no ha resultado demasiado útil
para predecir la respuesta de los animales a su consumo (Mueller-Harvey, 2006). En
este estudio se utilizaron 2 taninos condensados (quebracho y uva) y dos hidrolizables
(castaño y roble). Las diferencias químicas y estructurales entre ambos tipos permiten
explicar muchas diferencias en su capacidad para unirse a otras moléculas y,
consecuentemente, ejercer sus efectos. Por ello, es importante tener en cuenta que los
resultados obtenidos con un determinado tipo de tanino no pueden ser directamente
extrapolados a otros (Mueller-Harvey y McAllan, 1992).
Otro tema fundamental en el uso de extractos de plantas como aditivos
zootécnicos es la cantidad empleada. En este estudio se utilizaron dos concentraciones
(2 y 5% MS) con el objetivo de modular la BH ruminal del 18:2n-6 sin afectar
negativamente al proceso de fermentación de la dieta. Incluso la dosis más alta se
encuentra dentro de las más usadas con esta finalidad en los trabajos recogidos en la
literatura (e. g., Benchaar y Chouinard, 2009; Khiaosa-Ard et al., 2009; Vasta et al.,
2009a). Con la excepción del castaño 2%, el resto de los efectos significativos se
observaron únicamente con la dosis 5% lo cual podría sugerir que con dosis más bajas,
Discusión
69
las poblaciones microbianas involucrados en el proceso de BH ruminal podrían llegar a
adaptarse a los taninos sin que su actividad se viera afectada de modo muy acusado
(Smith et al., 2005).
También podría producirse una especie de interacción tipo × dosis, ya que
diferentes tipos de taninos pueden tener distinta reactividad y, por lo tanto, efectos muy
variables sobre la BH ruminal. Así, por ejemplo, un estudio in vitro demostró que la
inclusión de un 7,9% de taninos condensados de Acacia mearnsii inhibía el último paso
de la BH de los 18:1, mientras que la misma dosis, aportada en forma de esparceta
(Onobrychis viciifolia) no ejercía este efecto pero reducía la desaparición de los ácidos
linoleico y linolénico (Khiaosa-Ard et al., 2009; Vasta et al., 2009a). Para finalizar, los
resultados de este experimento coinciden con los publicados por Toral et al. (2011)
acerca de un estudio con ovejas en lactación cuya dieta se suplementó con un 2% de
aceite de girasol y una combinación de dos extractos comerciales de taninos
condensados e hidrolizables derivados del quebracho y del castaño (1%). En dicho
estudio, el tratamiento con taninos no consiguió modificar las concentración de los
principales ácidos grasos de la leche relacionados con la salud de los consumidores (e.
g., no aumentó ni el CLA ni el VA) más allá de las mejoras conseguidas con el
suplemento lipídico.
En cualquier caso, sería recomendable continuar con esta línea de investigación
antes de atreverse a concluir definitivamente si el uso de taninos puede o no alterar la
biohidrogenación ruminal de los ácidos grasos insaturados de la dieta y lograr así una
mejora de la calidad nutricional de la leche.
VIII. CONCLUSIONES
Conclusiones
73
1. En general, la adición de taninos (extraídos de quebracho, uva, castaño o roble,
y añadidos al 2 o 5% de la materia seca) a una dieta rica en ácido linoleico (gracias a la
incorporación de un 2% de aceite de girasol) tuvo efectos limitados sobre los valores de
pH y de producción de ácidos grasos volátiles pero provocó una disminución notable de
la concentración de amoniaco en incubaciones in vitro con inóculo ruminal de ovejas.
Este efecto fue más acusado con los taninos hidrolizables (castaño y roble) y con la
dosis más alta (5%), lo cual confirma que este depende del tipo de taninos y de la
cantidad utilizada.
2. La mayor parte de los tratamientos con taninos redujo ligeramente la
degradabilidad efectiva de la dieta, estimada in vitro mediante cultivos discontinuos de
microorganismos ruminales y la técnica de producción de gas. Dicha reducción fue de
aproximadamente un 1,84% de media.
3. Ninguno de los cuatro tipos de extractos comerciales de taninos (quebracho,
uva, castaño y roble), a ninguna de las dosis empleadas (2 y 5%), consiguió modificar in
vitro el contenido ruminal de los ácidos grasos bioactivos trans-11 18:1, cis-9 trans-11
18:2 y CLA total. Tampoco ninguno logró alterar significativamente los contenidos de
18:0 y trans-10 18:1.
4. Algunos tratamientos con taninos aumentaron las concentraciones in vitro de
los ácidos grasos linolénico, linoleico y oleico en el rumen, lo cual apuntaría a una
inhibición general de la biohidrogenación ruminal de los ácidos grasos insaturados. La
mayor parte de los resultados significativos se observaron en los tratamientos con
taninos hidrolizables (castaño al 2 o 5% y roble al 5%), confirmando nuevamente la
importancia del tipo de taninos y de la dosis empleada.
5. En conjunto, los resultados de este estudio no permiten recomendar el
tratamiento con taninos de una dieta rica en ácido linoleico (i. e., suplementada con un
2% de aceite de girasol) cuando el objetivo final es modular la biohidrogenación
ruminal de los ácidos grasos insaturados para mejorar la calidad nutricional de la grasa
de la leche de ovejas.
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