1

1

~ 7. UVOD U METABOLIZAM ~

• metabolizam = skup svih biohemijskih reakcija u organizmu• omogućava iskorišćavanje energije hrane i sunčeve energije• rezultat – konstantna razmena materije i energije između ćelije i spoljašnje

sredine• funkcije:

1.dobijanje hemijske energije iz hrane i/ili sunčeve svetlosti2.sinteza i razgradnja biomolekula

• prevođenje hranljivih materija u prekursore i gradivne blokove makromolekula

• povezivanje gradivnih blokova u proteine, NK, polisaharide, lipide

Metabolizam predstavlja celokupnu mrežu hemijskih reakcija i fizičkih procesa uključenih u održavanje i reprodukciju ćelije i organizma. Ima dve funkcije. Prvo, omogućava dobijanje korisne, hemijski vezane energije iz energetskih goriva (hrane) i/ili sunčeve svetlosti. Drugo, obezbeđuje sintezu i razgradnju biomolekula. Unete hranljive materije (i suvišni molekuli iz samog organizma) prevode se u prekursore i gradivne blokove, koji se zatim povezuju u biomolekule –aminokiseline i proteine, nukleinske kiseline, ugljene hidrate i lipide. Ovi procesi omogućavaju živom organizmu rast, reprodukciju, održavanje strukture, i odgovor na promene u životnoj sredini. Uprkos velikoj raznovrsnosti živih bića na Zemlji, i raznovrsnosti ćelija u jednom organizmu, mnogi metabolički putevi u njima veoma su slični (odn. univerzalni su).

2

2

7.1. IZVORI HRANLJIVE MATERIJE I ENERGIJE

Azotofiksirajućebakterije

Atmosferski N2

Nitrat (NO3-)

Amonijak (NH3),Urea (NH2CONH2)

Biljke

Životinje

Aminokiseline

Nitrifikujućebakterije

Nitrifikujućebakterije

Nitrit (NO2-)

Autotrofi Heterotrofi

CO2

hν

O2

Organskajedinjenja

• prema obliku ugljenika koji organizam koristi:

• autotrofni – neorganska → organska jedinjenja, koristeći:

• energiju svetlosti – fotoautotrofi

• energiju neorg. reakcija – hemoautotrofi

• heterotrofni – organsku materija uneta hranom

• ciklus azota:

Svi živi organizmi zahtevaju unos materije i energije iz životne sredine.

Prema poreklu ugljenika od koga izgrađuju svoje biomolekule, organizmi se mogu podeliti na autotrofe i heterotrofe. Autotrofni organizmi proizvode kompleksna organska jedinjenja iz neorganskih molekula (CO2). Energiju potrebnu za odvijanje biosinteza fotoautotrofi (zelene biljke, alge, fotosintetičke bakterije) dobijaju iz sunčeve svetlosti (fotosinteza), dok hemoautotrofi (neke bakterije) koriste energiju neorganskih hemijskih reakcija (oksidacija NH4

+, H2, H2S...). Heterotrofni organizmi (životinje, parazitske biljke, gljive, mnoge bakterije) nisu sposobni da sintetišu organska jedinjenja iz neorganskih, nego koriste organsku materiju iz hrane kao izvor gradivnih jedinica i energije.

Drugi esencijalni element koji je komponenta žive materije je azot. Životinje nisu sposobne da koriste neorganski azot u biosintezi, te ga moraju unositi (prvenstveno u vidu proteina) putem hrane. S druge strane, one u životnu sredinu izlučuju različite oblike azota, uključujući NH3 i ureu (koju mikroorganizmi u zemljištu dalje prevode u NH3). Biljke, s druge strane, mogu da koriste neorganske oblike azota – nitrat, amonijak – za sintezu aminokiselina i drugih biomolekula, ali ni one ne mogu da koriste najbogatiji izvor – atmosferski N2. Jedini organizmi koji mogu da prevode atmosferski, molekulski azot u formu koju drugi organizmi mogu da koriste su azotofiksirajuće bakterije, koje naseljavaju zemljište ili formiraju simbiotske kolonije na korenu nekih biljaka (uglavnom leguminoza).

3

3

OAA Cyt

acetilCoA CoA

CH3COSCoA

7.2. METABOLIČKI PUTEVI• metabolički put: serija hemijskih reakcija kojima se biomolekul konvertuje u neki drugi

prekursor → intermedijeri → proizvod

• niz diskretnih faza → precizna kontrola ulaza i izlaza materije i energije

• mogu biti linearni, ciklični ili spiralni:

Glc → Glc6P → Fru6P → Fru1,6BP → GAld3P+DHAP → ... → pyr

izoCyt

αKG

succCoAsucc

fumar

mal

CO2

CO2

C7H15COSCoA

C3H7COSCoA

C5H11COSCoA

Enz1

Enz2Enz3

Enz4

Metabolizam predstavlja kompleksan sistem (mrežu) međusobno zavisnih, povezanih metaboličkih puteva. Svaki metabolički put predstavlja seriju sukcesivnih hemijskih reakcija kojima se jedan biomolekul (prekursor) preko niza međuproizvoda (intermedijera) konvertuje u drugi (produkt). Produkt jedne enzimske reakcije postaje tako supstrat sledeće. Zahvaljujući ovoj postepenoj konverziji (preko niza diskretnih faza) ćelija može da, kontrolom određenih faza, precizno kontroliše ulaz i izlaz materije i energije, preusmerava intermedijere samo u produkciju metabolita koji su ćeliji trenutno potrebni. Kod endergonih reakcija, povezivanje sa egzergonim fazama omogućava energetsku povoljnost celog procesa. Kod veoma egzergonih reakcija, razdvajanje na faze obezbeđuje postepeno, kontrolisano otpuštanje energije.

Metabolički putevi mogu biti linearni, ciklični i spiralni. Linearni putevi (npr. glikoliza) predstavljaju jednostavnu konverziju prekursora preko niza intermedijerâ u produkt (uz eventualna grananja).Kod cikličnih puteva, prekursor se vezuje za jednog od učesnika ciklusa koji se na kraju procesa regeneriše. Na primer, kod ciklusa trikarboksilnih kiselina (Krebsovog ciklusa), prekursor – acetil-CoA – vezuje se za oksaloacetat i preko niza intermedijera razlaže na 2 CO2. Nizom reakcija nastali sukcinil-CoA prevodi se ponovo u oksaloacetat, koji je spreman da reaguje sa sledećim molekulom acetil-CoA. Na kraju, kod spiralnih puteva, produkt nekog niza reakcija ponovo se podvrgava tom nizu reakcija. Na primer, kod sinteze masnih kiselina, acil-CoA reaguje sa molekulom acetil-CoA, nakon čega slede redukcija, dehidratacija i ponovna redukcija; nastaje nova acil-CoA sa lancem dužim za 2 C-atoma. Ovaj produkt dalje reaguje sa sledećim molekulom acetil-CoA, redukuje se, dehidratiše i redukuje, pri čemu se lanac produžava za još 2 C. Proces se ponavlja dok ne nastane dovoljno dug lanac. Na ovaj način, ćelija izbegava potrebu za sintezom niza sličnih enzima – za navedeni proces sinteze masnih kiselina, dovoljna su samo 4 enzima koji ispoljavaju grupnu, ne apsolutnu specifičnost.

Kod svakog od ovih tipova mogu se javiti grananja, koja omogućavaju ulazak i/ili izlazak metabolita, odn. njihovo povezivanje sa drugim metaboličkim putevima.

4

4

5

5

Jedrosinteza NK

Jedrova membrana

Ćelijska membrana

ER- sinteza membranskih lipida- modifikacija proteina

Golgijev aparat- sortiranje i izlučivanje proteina

Citosol- sinteza MK- glikoliza- glukoneogeneza (veći deo)- pentoza-fosfatni put

Mitohondrija- ciklus limunske kiseline- oksidativna fosforilacija- razgradnja mk

• lokalizovani u određenim ćelijskim odeljcima – kompartmentalizacija • f-ja kompartmentalizacije:

• odvojeni rezervoari metabolita u ćeliji• simultano izvođenje reakcija u suprotnim smerovima• visoka lokalna koncentracija metabolita• koordinisana regulacija enzima

Neki metabolički putevi odvijaju se samo u određenim ćelijskim odeljcima, omeđenim biološkim membranama. Ovaj fenomen naziva se kompartmentalizacijom metaboličkih puteva, i ima višestruku ulogu. Prvo, obezbeđuje da su metaboliti razdvojeni međusobno i od većine enzima, čime se sprečavaju neželjene reakcije. Istovremeno, ovim se postiže i visoka lokalna koncentracija metabolitâ i enzimâ, što ubrzava reakciju a istovremeno utiče i na položaj ravnoteže. U različitim odeljcima, ista povratna reakcija čak može teći u suprotnim smerovima, u zavisnosti od lokalne koncentracije prekursora i produkata. Na kraju, smeštanje svih enzima jednog puta u isti odeljak olakšava i koordinaciju njihove aktivnosti.

Zahvaljujući smeštanju različitih metaboličkih puteva u različite organele, svaka organela ima definisanu funkciju u metabolizmu. Na primer, mitohondrije imaju ulogu u energetskom metabolizmu, jer se u njima odvijaju reakcije ciklusa trikarboksilnih kiselina (ciklus limunske kiseline, Krebsov ciklus), oksidativna fosforilacija i razgradnja masnih kiselina. Ribozomi, endoplazmatski retikulum i Goldžijev aparat zajedno učestvuju u sintezi, modifikaciji i izlučivanju proteina.

6

6

7.2.1. Regulacija metaboličkih puteva• metabolizam – visokokoordinisana i regulisana aktivnost → prilagođavanje tekućim potrebama• uticajem na brzinu enzimske r-je promenom:

• pH• koncentracije intermedijera i proizvoda r-je• koncentracije koenzima ili metalnih jona• aktivnosti enzima: kovalentna modifikacija, alosterna inhibicija/aktivacija• kontrolom brzine sinteze i degradacije enzima (sporo!)

A + B CEnz, koenz [A][B]v k→ →=

[C]v k← ←=

• uticaj koncentracije učesnikâ

[koenz][Enz]biosinteza

degradacija

[A], [B] [C]

Metabolizam je visokokoordinisana i regulisana aktivnost. Kontrolom brzine i smera reakcija ćelija i organizam se prilagođavaju promenama spoljašnjih uslova, a naročito trenutnoj raspoloživosti energije i hranljive materije. Na primer, ukoliko su energetske rezerve ćelije smanjene, aktiviraju se procesi u kojima se energija stvara (glikogenoliza, glikoliza, Krebsov ciklus, razgradnja masnih kiselina) a inhibiraju procesi koji služe deponovanju energije (sinteza glikogena), ili koji troše energiju na neesencijalne procese. Dodatno, metabolizam se značajno menja u određenim, genetski programiranim situacijama kao što su reprodukcija i embriogeneza. Promene mogu biti blage (finopodešavanje brzine nekog puta) ili dramatične (aktivacija/gašenje određenih puteva, preusmeravanje metabolita).

Regulacija pojedinih metaboličkih puteva može se postići na više načina. Prvo, na brzinu i smer reakcije neposredno utiče koncentracija svih učesnika reakcije; regulacijom koncentracije prekursora, intermedijera, produkata i kofaktora može se regulisati i odgovarajuća enzimska reakcija.

Promenom koncentracije enzima menja se i brzina reakcije koju on katalizuje. U slučaju nekih (tzv. konstitutivnih) enzima, aktivnost enzima (odn. njegova koncentracija) je uvek prisutna i konstantna, dok se u slučaju drugih (inducibilnih) reguliše uticajem na brzinu biosinteze, a putem uticaja (indukcije/represije) na ekspresiju gena. Dalje, ćelija takođe može regulisati i brzinu degradacije enzima.

7

7

• pomoću regulatornih (alosternih) enzima• inhibicija proizvodom (retroinhibicija, feedback inhibicija) • aktivacija (feed-forward)

• kovalentna modifikacija enzima

+

A B C D E FE1 E2 E3 E4 E5

G

E6

HE7

–

Enz-OH

Enz-OP

ATP

ADP

Pi

H2O

protein kinazafosfoprotein fosfataza

signal

– +

Aktivnost enzima može se modulirati i kovalentnom modifikacijom (fosforilacijom, koja predstavlja mehanizam delovanja mnogih hormona) ili vezivanjem alosternih aktivatora i inhibitora. Prvi tip kontrole prvenstveno je povezan sa hormonalnom regulacijom. Kao odgovor na stimulus (interni ili eksterni), endokrine žlezde luče hormone koji u ciljnim tkivima često dovode do fosforilacije/defosforilacije određenih ciljnih enzima, čime se njihova aktivnost uključuje ili isključuje.

Drugi mehanizam, vezivanje alosternih efektora, esencijalan je za regulaciju mnogih puteva i automatsko prilagođavanje procesa aktuelnim potrebama, i predstavlja najčešći vid kontrole. Naime, dok je u svakom metaboličkom putu većina reakcija pri fiziološkim uslovima reverzibilna i brzina im se ne kontroliše direktno, ključne tačke u putu (koje su najčešće ireverzibilne) katalizuju tzv. regulatorni enzimi. Aktivnost ovih enzima reguliše se vezivanjem alosternih aktivatora i/ili inhibitora. Veoma često, aktivatori su upravo prekursori datog puta (feed-forward inhibicija); visoka koncentracija ukazuje na višak prekursora, koga je zato potrebno preraditi. S druge strane, proizvodi puta često se ponašaju kao alosterni inhibitori (retroinhibicija, feedback inhibicija); njihova visoka koncentracija znači da su produkti u višku i nema više potrebe za njihovom sintezom. Do inhibicije tipično dolazi rano, u prvoj fazi puta koja je jedinstvena za dati produkt. Na ovaj način, inhibira se cela jedna grana metaboličke mreže, i sprečava nepotrebno nagomilavanje intermedijera (u putu prikazanom na slajdu, inhibicija E5 dovela bi do nagomilavanja beskorisnog intermedijera E).

U okviru jednog puta, nekoliko enzima mogu biti regulatorni. Ovim se postiže da se intermedijeri preusmeravaju u proizvodnju najpotrebnijih produkata. Na primer, u putu prikazanom na slajdu, inhibicija enzima E2 dovešće do smanjene produkcije svih proizvoda (F, H), dok će inhibicija E4 dovesti do smanjenja koncentracije F i preusmeravanja A u biosintezu proizvoda H.

8

8

7.3. KATABOLIZAM I ANABOLIZAM• katabolizam – biohemijski putevi u kojima se biomolekuli razlažu na manje jedinice uz oslobađanje energije• konvergentni: veliki broj razl. molekula → nekoliko jednostavnih proizvoda

• anabolizam – biohemijski putevi u kojima se sintetišu složeni biomolekuli od jednostavnijih prekursora, uz utrošak energije• divergentni: nekoliko jednostavnih prekursora → veliki broj razl. makromolekula

• amfibolički putevi – zajednički za katabolizam i anabolizam

rad

Ćelijski makromolekuli(UH, masti, proteini, NK) anabolizam

Prekursori(AK, monosaharidi, mk,

azotne baze)

Hranljive mat.bogate energijom

(UH, masti, proteini)

Otpadni produkti siromašni energijom

(CO2, H2O, NH3)katabolizam

ATPNAD(P)HFADH2

ADP+PiNAD(P)+

FAD

svetlosnaenergija

Metabolički putevi generalno se mogu podeliti u dve grupe – kataboličke i anaboličke.

Katabolizam predstavlja skup biohemijskih puteva u kojima se biomolekuli razlažu na manje jedinice, često uz oslobađanje energije. Funkcija mu je pretvaranje organske materije iz hrane (proteina, masti, ugljenih hidrata...) u jednostavnije molekule (aminokiseline, masne kiseline, monosaharidi, manji organski molekuli) koji će služiti kao prekursori u anabolizmu, ili koji će se dalje oksidovati do neorganskih otpadnih produkata (CO2, H2O, NH3) uz generisanje iskoristive energije. Sem organske materije iz hrane, u katabolizam ulaze i oštećeni ili otpadni biomolekuli iz samog organizma, koji se ovim recikliraju ili prevode u formu koja se može izbaciti iz organizma. Katabolički putevi su konvergentni – veliki broj različitih jedinjenja koja mogu biti uneta u organizam konvertuju se u mali broj osnovnih jedinica, i dalje u samo nekoliko jednostavnih produkata (npr. hiljade različitih proteina → 20 aminokiselina → <10 proizvoda).

Anabolizam predstavlja skup biohemijskih puteva u kojima se sintetišu složeni biomolekuli od jednostavnijih prekursora, uz utrošak energije. U ovom procesu, od jednostavnih prekursora (acetil-CoA itd.) sintetišu se monomeri (mnosaharidi, aminokiseline, masne kiseline...), koji se dalje povezuju u makromolekule (polisaharide, proteine, nukleinske kiseline, lipide...). Pošto od nekoliko prekursora nastaje veliki broj različitih produkata, za anabolizam se kaže da je divergentan.

Izvesan broj intermedijera, reakcija i metaboličkih puteva zajednički je za katabolizam i anabolizam. Na primer, većina reakcija glikolize (katabolički put: glukoza → piruvat) i glukoneogeneze (anabolički put: piruvat → glukoza) su identične, i katalizovane istim enzimom. Ovakvi putevi nazivaju se amfiboličkim.

9

9

glikoliza

Ciklus TCA

CO2

NADH, FADH2

1. faza katabolizmarazgradnja makromolekula na osnovne jedinice

2. faza katabolizmakonvergencija u jedan osnovni intermedijer

3. faza katabolizmakonverzija u CO2 i H2O

ATP

Oksidativna fosforilacija

katabolizamanabolizam

urea

Piruvat

Acetil-CoA

CO2

NH3

polisaharidi TAGproteini polinukleotidi

glukoneo-geneza

glukoza mk

hidroliza lipoliza

AK

hidroliza

nukleobaze drugiUH

nukleotiditranslacija

Na slajdu su šematski prikazani osnovni univerzalni metabolički putevi. U prvoj fazi katabolizma, makromolekuli uneti hranom (ili otpadni makromolekuli iz organizma) razgrađuju (depolimerizuju) se pod dejstvom hidrolaza na osnovne jedinice – proteini na aminokiseline, polinukleotidi na nukleotide i dalje na nukleobaze i monosaharide, polisaharidi na monosaharide, osapunjivi lipidi na masne kiseline. U sledećoj fazi, ove osnovne jedinice dalje se razgrađuju na jednostavne organske molekule. Iz širokog spektra osnovnih jedinica nastaje samo mali broj intermedijera, kao što su piruvat i acetil-CoA, odn. katabolički putevi konvergiraju. U trećoj fazi dolazi do finalne oksidativne degradacije ovih intermedijera u Krebsovom ciklusu (ciklusu trikarboksilnih kiselina, TCA), pri čemu nastaju otpadni produkti – CO2, H2O, NH3... a oslobođena energija koristi se za sintezu ATP.

Osnovne jedinice i drugi jednostavni molekuli nastali u katabolizmu se, sem za proizvodnju energije, koriste i za biosintezu (anabolizam). Treba napomenuti da anabolički putevi najčešće ne predstavljaju prosto kataboličke reakcije koje se odvijaju u drugom smeru.

10

10

7.4. BIOENERGETIKA

• promena Gibsove slobodne energije (ΔG):

gde je:T – temperatura,ΔH – promena entalpije (merilo toplotnih efekata r-je), ΔS – promena entropije (promena uređenosti sistema)

• ΔG > 0 – endergone reakcije – ne odvijaju se spontano• ΔG < 0 – egzergone reakcije – spontane• što je |ΔG| veća, veća je težnja da se postigne ravnoteža (odn. da r-ja teče)• pri ΔG = 0 sistem je u ravnoteži

A B ΔG > 0

A B ΔG >> 0

A B ΔG < 0

A B ΔG << 0

ΔG = T ΔH - ΔS

0 ln'G RT KΔ = − 0 [C][D]ln[A][B]

G G ` RTΔ Δ= +

Da bi se razumeli brojni procesi u živom organizmu, uključujući produkciju energije, aktivaciju biomolekula za potrebe biosinteze, membranski transport itd. neophodno je poznavanje osnovnih principa bioenergetike (i uopšte termodinamike). Bioenergetika je oblast biohemije koja kvantitativno proučava kretanje i transformacije energije u biološkim sistemima. Svi živi sistemi predstavljaju otvorene termodinamičke sisteme, koji iz spoljašnje sredine primaju energiju (u vidu hranljivih materija ili sunčeve energije) i otpuštaju je (u vidu toplote i entropije). U živom sistemu postiže se dinamička ravnoteža kontrolisanog unosa i otpuštanja materije i energije. Porast entropije (neuređenosti) znatno je sporiji nego u neživom svetu, zahvaljujući kontrolisanim reakcijama. Na primer, oksidacija glukoze do CO2 i H2O u neorganskom sistemu teče uz burno oslobađanje energije (sagorevanje), dok u živom sistemu teče kontrolisano, nizom sukcesivnih reakcija (glikoliza) uz postepeni prenos elektrona i oslobađanje energije u malim “paketićima”. Maksimalan porast entropije znači smrt za ćeliju.

Svaki proces (pa i biohemijski) praćen je razmenom energije, koja se izražava kao standardna promena Gibsove slobodne energije (ΔG0`), a koja u sebe uključuje toplotne efekte procesa (promenu entalpije, ΔH0`) i promenu uređenosti sistema (ΔS0`). ΔG0` računa se pri t=25 °C, pH=7 i koncentraciji svih učesnika reakcije (sem H+) od 1,0 mol/L. Aktuelna ΔG pri realnim koncentracijama učesnika reakcije može se izračunati iz jednačine ΔG = ΔG0` + RT ln ([C][D] / [A][B]). Procesi kod kojih je ΔG pozitivno (bilo zbog visoke ΔH, bilo zbog visokonegativne ΔS) nazivaju se endergonim i ne odvijaju se spontano. Ukoliko je G<0, proces je egzergon, odvija se spontano, i utoliko će lakše teći ukoliko je |ΔG| veće. ΔG je povezana sa ravnotežnom konstantom:reakcije sa ΔG>0 biće pomerene ka reaktantima, a sa ΔG<0 – ka proizvodima. Treba napomenuti da ΔG ukazuje na smer reakcije, ali ne i na njenu brzinu – proces koji je termodinamički povoljan može i dalje biti veoma spor.

11

11

• ΔG je aditivna veličina:A + B → C ΔG1C + D → E ΔG2────────────────────────A + B + D → E ΔG = ΔG1 + ΔG2

• → kuplovanje reakcija – egzergone r-je “vuku” endergonu

7.4.1. Kuplovanje reakcija

Promena Gibsove slobodne energije za neki složen, višefazni proces jednaka je zbiru ΔG za pojedinačne faze ovog procesa. Ova činjenica se u biološkim sistemima veoma često koristi za pokretanje procesa koji su inače nespontani (ΔG > 0), a putem kuplovanja sa nekim veoma povoljnim procesom (ΔG « 0).

12

12

• primer: fosforilacija GlcGlc + Pi ⇔ Glc6P + H2O ΔG0` = +13,8 kJ/molATP + H2O ⇔ ADP + Pi ΔG0` = –30,5 kJ/mol

kuplovanjem:Glc + ATP ⇔ Glc6P + ADP ΔG0` = –16,7 kJ/mol

Na primer, fosforilacija glukoze (reakcija glukoze sa neorganskim fosfatom uz formiranje estarske veze) endergon je proces (ΔG0` = 13,8 kJ/mol), i u ćeliji se neće spontano odvijati sam po sebi. Međutim, na enzimu heksokinazi ova reakcija se, formalno gledano, kupluje sa reakcijom hidrolize ATP koja je veoma egzergona (ΔG0` = –30,5 kJ/mol). Ukupan energetski bilans reakcije iznosi –16,7 kJ/mol, odn. sumarna reakcija je egzergona i stoga spontana (ravnoteža je pomerena ka produktima). Treba napomenuti da kuplovanje reakcija predstavlja samo formalni prikaz – u stvarnosti, reakcija teče u jednoj fazi, bez oslobađanja vode, direktnim transferom fosfatnog ostatka sa ATP na glukozu (Glc + ATP →Glc6P + ADP + H+). Dalje, kao što je već pomenuto, negativno ΔG i dalje ne garantuje da će se reakcija u ćeliji odvijati prihvatljivom brzinom; naprotiv, bez prisustva enzima reakcija je veoma spora (ATP je termodinamički nestabilan, ali kinetički stabilan).

13

13

7.4.2. Energijom bogata jedinjenja

• glavni izvor energije - biološke oksidacije („tiho sagorevanje bez plamena”)• toplotna energija: neiskoristiva • iskoristiva forma: hemijska energija

hrana/depoi+ O2

H2O + CO2 energijom bogatajedinjenja

potrošači:anabolizammehanički radtransport

• tioestri: acetil-CoA

• fosfati• fosfoanhidridi: ADP, ATP, GTP, CTP, UTP• enol-fosfati: fosfoenolpiruvat (PEP)• acil-fosfati: 1,3-bisfosfoglicerat (1,3-BPG)• gvanidino-fosfati: fosfokreatin, fosfoarginin

• redukovani koenzimi: NADH, NADPH, FADH2

Energiju za pokretanje nepovoljnih procesa heterotrofni organizmi dobijaju biološkom oksidacijom jedinjenja – metaboličkih goriva – iz hrane: ugljenih hidrata, masti i proteina. Ovaj proces ponekad se opisuje kao “tiho sagorevanje bez plamena”. Međutim, energiju oslobođenu pri egzergonim procesima u vidu toplotne energije ćelija ne može direktno da koristi. Umesto toga, ona se deponuje, transportuje i koristi u vezanom, hemijskom obliku – u vidu energijom bogatih jedinjenja – i po potrebi oslobađa (zapravo, prenosi) u pažljivo kontrolisanim egzergonim reakcijama.

U energijom bogata jedinjenja spadaju tioestri (acetil-CoA), različita fosfatna jedinjenja (fosfoanhidridi, enol-fosfati, acil-fosfati, gvanidino-fosfati) i redukovani koenzimi. Ova jedinjenja tipično sadrže fosfatnu ili neku drugu lako odlazeću grupu, čijim se transferom prenosi a hidrolizom oslobađa znatna količina energije.

14

14

• najznačajnije energijom bogato jedinjenje (glavni transportni oblik energije u ćeliji)

NO

O

OH

O

O-

O

P N

NN

NH2

OH

O

O-

O

PO-

O-

O

P

Mg2+

fosfoanhidridne veze

fosfoestarska veza

Mg2+ stabilizuje strukturu

• hidrolizom oslobađa veliku količinu energije:

ATP + H2O → ADP + Pi ΔG0` = –30,5 kJ/mol

ATP + H2O → AMP + PPi ΔG0` = –45,6 kJ/mol

7.4.2.1. ATP

Najznačajnije energijom bogato jedinjenje, odn. glavni transportni oblik energije (“energetska valuta”) u ćeliji, je adenozin-trifosfat (ATP). U ovom jedinjenju, energija je uskladištena u dve fosfoanhidridne veze (veze između dva fosfatna ostatka). Prilikom hidrolize ovih veza (hidroliza ATP do ADP uz oslobađanje neorganskog fosfata, ili do AMP uz nastajanje difosfata), oslobađa se velika količina energije (reakcija je visokoegzergona).

Treba napomenuti da se u biohemiji često pominje da se za pokretanje nekog procesa koristi energija hidrolize ATP. Ovo je samo formalni, pojednostavljeni način opisivanja procesa. U stvarnosti, do hidrolize ne dolazi (jer bi se dobila beskorisna toplotna energija, umesto iskoristive – hemijske) –energija se prenosi putem raskidanja fosfoanhidridne veze u ATP i formiranja nove energijom bogate veze na molekulu-recipijentu. Međutim, sumarni termodinamički efekat je identičan, na koji god način da se proces opiše.

Napomena: iako se to u biohemijskim reakcijama često izostavlja, prilikom hidrolize jednog molekula ATP oslobađa se i jedan H+ jon:

AdoO(PO2–)O(PO2

–)O(PO32–) + H2O → AdoO(PO2

–)O(PO32–) + HPO4

2– + H+

15

15

• razlozi:• smanjuje se elektrostatičko odbijanje između fosfatnih ostataka• proizvod (Pi ili PPi) bolje solvatisan• proizvod (Pi ili PPi) rezonantno stabilizovan

OO

O-

O

PO-

O-

O

POO

O-

O

PO

O-

O

PO-

O-

O

P OHO-

O-

O

P

P

O-

O O-

OH

P

O

O-

O-

OH

P

O-

O-

OOH

Nekoliko faktora čini raskidanje fosfoanhidridnih veza toliko povoljnim. Prvo, između negativno naelektrisanih fosfatnih ostataka (ukupno 4 negativne šarže skoncentrisane na malom prostoru) postoji značajno elektrostatičko odbijanje. Molekul je donekle stabilizovan kompleksiranjem saMg2+ (koji delimično neutrališe naelektrisanje na kiseonicima), ali se tek hidrolizom značajno smanjuje broj energetski nepovoljnih odbojnih interakcija.

Dalje, produkti hidrolize – Pi ili PPi – bolje su solvatisani od ATP. Solvatacija je, s jedne strane, egzoterman proces. S druge strane, okruživanje jona polarnim molekulima vode delimično maskira njihovo naelektrisanje, što smanjuje elektrostatičko odbijanje. Solvatacioni efekti verovatno predstavljaju najvažniji faktor koji doprinosi visokoj energiji hidrolize ATP.

Na kraju, nastali Pi ili PPi je rezonantno stabilizovan – negativno naelektrisanje je bolje raspoređeno (delokalizovano).

16

16

• ATP se troši:• u ranim fazama katabolizma (npr. glikoliza) → niskoenergetski fosfati• za pokretanje visokoendergonih reakcija• u sintezi NK: za produkciju drugih NTP (GTP, UTP, CTP)• u aktivnom membranskom transportu• pri mišićnim kontrakcijama

• kako se energija ATP koristi za pokretanje nepovoljnih reakcija?• endergona reakcija kupluje se sa hidrolizom ATP:

Glu + NH3 → Gln + H2O ΔG > 0ATP + H2O → ADP + Pi ΔG <<0-----------------------------------------------------------sumarno: Glu + ATP+ NH3 → Gln + ADP + Pi ΔG < 0-----------------------------------------------------------zapravo:Glu + ATP → Glu-P + ADPGlu-P + NH3 → Gln + Pi

energija je preneta na akceptora, koji je sada reaktivniji

ATP se troši u mnogim metaboličkim putevima i drugim procesima. U ranim fazama katabolizma, kaošto su npr. početne reakcije glikolize, fosforilacija može imati ulogu aktivacije biomolekula koji će se dalje razgrađivati. Istovremeno, uvode se fosfoestarske veze relativno niske energije, čiji će se sadržaj energije povećati prilikom biološke oksidacije (efektivno, energija oslobođena oksidacijom biće uskladištena u fosfoestarskoj vezi). U anabolizmu, fosforilacija se koristi za aktiviranje prekursora, odn. za pokretanje visokoendergonih reakcija putem kuplovanja reakcija. Značajna količina troši se za aktivni membranski transport, naročito u nervnom sistemu (Na+,K+-ATPaza!). Proces mehaničkog rada (mišićne kontrakcije, kretanje organela, vezikula i makromolekula krozćeliju, promena oblika ćelije) takođe zahteva utrošak energije u vidu ATP. Na kraju, ATP se troši i za sintezu drugih nukleozid-trifosfata (GTP, CTP, UTP...) koji su prekursori u sintezi nukleinskih kiselina, signalnog molekula – cAMP, i određenih koenzima.

Kao što je pomenuto, energija uskladištena u ATP koristi se za pokretanje energetski nepovoljnih (endergonih) procesa. Ovo se postiže kuplovanjem nepovoljne endergone reakcije (ΔG > 0) sa hidrolizom ATP kao visokoegzergonom reakcijom (ΔG « 0), pri čemu je sumarna reakcija egzergona tj. povoljna. Ovo je, zapravo samo pojednostavljeni, termodinamički prikaz procesa. U stvarnosti, ne dolazi do hidrolize ATP, nego se fosfatni ostatak privremeno prenosi na supstrat (uz oslobađanje ADP). Formirana veza sa fosfatom je visokoreaktivna (fosfat je dobra odlazeća grupa), i olakšava dalju reakciju supstrata (uz oslobađanje Pi).

17

17

• čovek mase 70 kg dnevno troši 65,5 kg ATP• u organizmu je prisutno ~50 g ATP, koji se reciklira (ciklus ATP/ADP)

ATP se regeneriše:• fosforilacijom na nivou supstrata• oksidativnom fosforilacijom

Mehanički rad

Transport

Biosinteza

Katabolizam

ATPADPPi

GorivoO2

CO2H2O

ATP je glavna energetska “valuta” u ćeliji, koja se koristi za pokretanje skoro svih nespontanih, energetski nepovoljnih (ΔG > 0) procesa. Zbog toga, organizam troši velike količine ovog jedinjenja – čovek mase 70 kg dnevno utroši prosečno 65,5 kg ATP. Budući da je u organizmu prisutno samo oko 50 g ATP, svaki molekul seočigledno hiljadama puta reciklira, u procesu poznatom kao ciklus ATP/ADP.

Glavni izvor energije koja se skladišti u ATP su reakcije biološke oksidacije. Oksidacijom metaboličkog goriva (glukoze, masnih kiselina, aminokiselina) iz hrane ili depoa stvara se energija koja se koristi za pokretanje reakcije ADP + Pi→ ATP (tj. za formiranje fosfoanhidridne veze). Ovaj ATP ćelija dalje koristi za pokretanje nepovoljnih procesa – anaboličkih reakcija, mehaničkog rada i aktivnog membranskog transporta – pri čemu se ATP razlaže na ADP i Pi, koji se vraćaju u ciklus.

Postoje dve metode sinteze ATP, odn. prenosa energije oslobođene prilikom biološke oksidacije: fosforilacija na nivou supstrata i oksidativna fosforilacija.

18

18

1) fosforilacija na nivou supstrata:• niskoenergetski fosfati → visokoenergetski fosfati → transfer Pi na ADP

potencijal za transfer fosfata(sadržaj energije)

–49 kJ/mol

–30 kJ/mol

–14 kJ/mol

1,3BPG

ATP

Glc6P

Glc6P 2 GA3P

2 NAD+ 2 NADH

2 (1,3BPG)

2 ADP 2 ATP

2 (3PG)oksidacija

2) oksidativna fosforilacija:

• energija oksidacije koristi se za pumpanje H+ → elektrohemijski gradijent na membrani → pri povratku H+ niz ∇C sintetiše se ATP

H+matriks

H+međumembr.

energijaoksidacije

ATP

ADP + Pi

Kod fosforilacije na nivou supstrata, niskoenergetski fosfati se prilikom oksidacije konvertuju u visokoenergetske, koji su bogatiji energijom od ATP i mogu preneti fosfatni ostatak na ADP, gradeći ATP. Na primer, prilikom glikolize, gliceraldehid-3-fosfat (GA3P) prelazi u 1,3-bisfosfoglicerat (1,3BPG), koji zatim predaje fosfatni ostatak ADP-u pri čemu sam prelazi u 3-fosfoglicerat (3PG).

Kod oksidativne fosforilacije, energija biološke oksidacije (u vidu elektronâ) se na mitohondrijalnom elektron-transportnom nizu koristi za formiranje protonskog gradijenta (ispumpavanje H+ iz matriksa u međumembranski prostor). Energija oslobođena povratkom H+ kroz ATP sintazu koristi se dalje za sintezu ATP.

19

19

7.4.2.2. Druga visokoenergetska jedinjenja

• druga jedinjenja sa visokim potencijalom transfera fosfata i dr. grupa:• enol-fosfati: PEP• acil-fosfati: 1,3BPG• gvanidino-fosfati: fosfokreatin, fosfoarginin• tioestri

Metabolit ΔG0`hidroliza (kJ/mol)

PEP -621,3-BPG -49fosfokreatin -43PPi -33fosfoarginin -32ATP (do AMP) -32acetil-CoA -32ATP (do ADP) -30Glc1P -21Glc6P -14glicerol-3-fosfat -9

mogu primiti fosfat od ATP

mogu predati fosfat AMP/ADP-u

PEP pyr

ADP ATP

Glc6P Glc

ADP ATP

Pored ATP, i neki drugi biomolekuli imaju visok sadržaj iskoristive energije. Mnoga od ovih jedinjenja sadrže fosfatnu grupu, čijim se transferom prenosi (a hidrolizom oslobađa) znatna količina energije. Najznačajniji predstavnici energijom bogatih fosfata su fosfoenolpiruvat (PEP), 1,3-bisfosfoglicerat (1,3-BPG), fosfokreatin, fosfoarginin i pirofosfat. Sva ova jedinjenja imaju viši potencijal transfera fosfata od ATP, i mogu preneti energiju ADP-u uz formiranje ATP. Dok neka od ovih jedinjenja imaju funkciju privremenog depoa energije (fosfokreatin), druga su proizvodi katabolizma i u njima je sadržan deo energije proizvedene biološkom oksidacijom (PEP i 1,3-BPG, koji nastaju u glikolizi) a koja se dalje odmah prevodi u ATP.

Kao što se može videti, ATP zauzima centralnu poziciju u termodinamičkoj hijerarhiji. Zahvaljujući tome, on služi kao posrednik u prenosu energije sa visokoenergetskih jedinjenja (nastalih prilikom oksidacije hranljive materije) na niskoenergetska.

20

20

• acil-fosfati• mešoviti anhidridi• izvor energije: rezonantna stabilizacija -COO–

• jedan od najbitnijih: 1,3BPG (1,3-bisfosfoglicerat):

• bilans hidrolize: 1,3BPG4– + H2O → 3PG3– + Pi2– + H+ ΔG°` = –49,3 kJ/mol

O

OH

O

O PO

-

O-

O

PO

-

O-

O

O

OHOH

O

PO

-

O-

O

O

OHO

O

PO

-

O-

O

-

H2O

PiH+

1,3-bisfosfoglicerat 3-fosfoglicerat

GA3P

NAD+ NADH

1,3BPG

ADP ATP

3PGoksidacija• u glikolizi:

Acil-fosfati predstavljaju grupu energijom bogatih jedinjnja sa strukturom mešovitog anhidrida karboksilne i fosfatne kiseline. Prilikom hidrolize anhidridne veze oslobađa se velika količina energije jer su proizvodi – fosfatni i karboksilatni anjon – rezonantno stabilizovani. Jedan od najznačajnijih predstavnika je 1,3-bisfosfoglicerat (1,3-BPG). Ovo jedinjenje nastaje u glikolizi oksidacijom gliceraldehid-3-fosfata; energija oslobođena oksidacijom koristi se za vezivanje fosfatnog ostatka, odn. za formiranje energijom bogate veze. 1,3-BPG se dalje koristi za sintezu ATP, u reakciji tipa fosforilacije na nivou supstrata.

21

21

• enol-fosfati• nezasićeni fosfoestri, nakon hidrolize tautomerizuju u keto-oblik• izvor energije: tautomerija

P

O

O-

O

O-

O

O -

OH

O

O -

O

O

O -

H2O

Pi

fosfoenolpiruvat piruvat

• bilans hidrolize: PEP + H2O → pyr + Pi2– ΔG°` = –61,9 kJ/mol

fosfoenolpiruvat ADP

piruvat ATP

U glikolizi nastaje i drugi energijom bogati fosfat – fosfoenolpiruvat (PEP) – koji predstavlja fosfat enolizovane forme piruvata (anjona pirogrožđane kiseline). Enolna struktura je “zaključana”vezivanjem fosfata; prilikom hidrolize, ona prelazi u mnogo povoljniji keto-tautomer, pri čemu se oslobađa veoma velika količina energije. PEP može predati fosfatni ostatak ADP-u uz formiranje ATP; reakcija je energetski veoma povoljna i stoga praktično ireverzibilna.

22

22

• gvanidino-fosfati• izvor energije: rezonantna stabilizacija gvanidino-grupe

NH

NH2+

NHP

O

O-

O-

NH3+

O

O-

fosfoarginin

fosfokreatin + H2O → kreatin + Pi2–

ΔG°` = –43,0 kJ/mol

fosfoarginin + H2O → arginin + Pi2–

ΔG°` = –32,0 kJ/mol

ON

O-

NH2+

NHP

O

O-

O- O

N

O-

NH2+

NH2O

N

O-

NH2

NH2+

H2O

Pi

fosfokreatin kreatin

deponovanje regeneracija

ATP

ADP + Pi

kreatin

fosfokreatin

ATP

ADP + Pi

kreatin kinazakreatin kinaza

Navedeni enol-fosfati i acil-fosfati predstavljaju visokoenergetske produkte kataboličkih puteva, koji omogućavaju da se energija oslobođena oksidacijom iskoristi za sintezu ATP. S druge strane, neki visokoenergetski fosfati – tzv. fosfageni – služe kao rezervoari energije. Najvažniji predstavnik ove grupe je fosfokreatin – derivat kreatina kod koga je za N-atom guanidino-ostatka vezana fosforil-grupa. Zahvaljujući rezonantnoj stabilizaciji proizvoda hidrolize, ima veoma visok sadržaj energije.

Kreatin je naročito zastupljen u mišićima. Kada ćelije raspolažu velikim količinama energije, ona se delimično skladišti u vidu kreatin-fosfata (ATP, koji je u višku, deluje kao donor fosfatnog ostatka). U slučaju naglog iscrpljenja rezervi ATP*, npr. usled nagle fizičke aktivnosti, ravnoteža se pomera i kreatin-fosfat se privremeno (tokom nekoliko sekundi) koristi za regeneraciju ATP dok se ne aktiviraju sporiji procesi za proizvodnju (glikoliza).

Kod mnogih beskičmenjaka, istu ulogu ima fosfoarginin.

• Zalihe ATP u ćeliji su vrlo male, i mogu da je snabdevaju najviše 1–2 min

23

23

TAG(masno tkivo)

masnekiseline

glikogen(mišići, jetra)

Glc(krv, ćelije)

ATP(ćelije)

fosfokreatin(ćelije)

trenutnodostupnaenergija

veoma brzodostupne rezerve

brzodostupne rezerve

brzodostupne rezerve

dugotrajne rezerve

Sumarno, organizam koristi nekoliko sistema za deponovanje energije. ATP, koji je iskoristiva forma, ne može se deponovati u većim količinama iz više razloga (povećavao bi osmotski pritisak, uticao na pH, narušavao sisteme regulacije energetskog metabolizma). Količina prisutna u ćeliji dovoljna je za 1–2 min normalnog rada. Ćelije koje intenzivno troše energiju moraju brzo da regenerišu rezerve. Zbog toga, ovakve ćelije (mišićne, nervne) koriste fosfokreatin u kombinaciji sa kreatin kinazom. Fosfokreatin predstavlja dodatnu energetsku rezervu ćelije, koja se može veoma brzo mobilisati (brže od glukoze, koja zahteva niz reakcija: glikoliza→Krebsov ciklus→oksidativna fosforilacija) i iskoristiti za sintezu ATP.

Glavna sirovina za proizvodnju energije u organizmu je glukoza, koja je u izvesnoj količini prisutna u krvnoj plazmi, kao i u ćelijama (u vidu glukoza-6-fosfata). Pošto bi visoka koncentracija glukoze značajno povećavala osmotski pritisak u ćelijama, glavnina se deponuje u vidu glikogena, u mišićima (koji će direktno da ga koriste) i jetri (koja po potrebi snabdeva glukozom ostatak organizma, preko krvotoka). Zalihe glikogena dovoljne su za zadovoljavanje jednodnevnih potreba organizma.

Višak energije organizam skladišti u vidu triacilglicerola u masnom tkivu. Ove zalihe su stabilne, mobilizuju se veoma sporo, i tek kada su ostale rezerve iscrpljene. TAG predstavljaju najkompaktniji oblik skladištenja energije.

24

24

• tioestri• O zamenjen sa S• najvažniji: acetil-CoA• izvor energije: rezonantna stabilizacija –COO– (i odsustvo stabilizacije

tioestra), solvatacija

C

SCoA

CH3

O

C

O

CH3

O-C

OH

CH3

O

H2O

CoASHH+

AcSCoA + H2O → AcO– + CoASH + H+ ΔG°` = – 31,4 kJ/mol

Ne sadrže sva energijom bogata jedinjenja fosfatne ostatke. Visok sadržaj energije ima i tioestarska veza, koja se formalno izvodi od estarske zamenom jednog kiseonikovog atoma sumporom. Hidrolizom tioestarske veze oslobađa se velika količina energije zbog više faktora. Prvo, proizvod reakcije (karboksilatni jon) bolje je rezonantno stabilizovan od tioestra, kod koga zbog lošeg preklapanja p orbitala ugljenika i sumpora nema stabilizacije. Drugo, karboksilatni jon bolje je solvatisan od mnogo manje polarne tioestarske veze. Najznačajniji tioestri su S-acil-derivati koenzima A, od kojih acetil-CoA ima ključno mesto u metabolizmu.

Građenje tioestara ne koristi se za proizvodnju iskoristive energije (ATP). Umesto toga, ono omogućava aktivaciju acil-grupa, čime se olakšava njihovo učešće u reakcijama transfera, kondenzacije i sl. Tako, acetil-CoA predstavlja aktivni oblik acetil-grupe.

25

25

• hemijsku energiju prenose i redukovani koenzimi: NAD(P)H i FADH2

• nastaju u:• biološkim redoks-reakcijama, pod dejstvom oksidoreduktaza • kod autotrofa: u fotosintetičkim sistemima

7.4.2.3. Redukovani koenzimi

• prema Nernstovoj jednačini:

0 (akceptor)ln(donor)

R T CE Ez F C

⋅= + ⋅⋅

• promena slobodne energije – srazmerna težnji reaktanata da otpuste/prime e–

(standardnom redoks potencijalu)

0 0Δ ΔG ` z F E `= − ⋅ ⋅ • z – broj razmenjenih elektrona• F = 96 485 C/mol, Faradejeva konstanta

Pored energijom bogatih fosfata, hemijsku energiju u ćeliji prenose i redukovani koenzimi (redoks ekvivalenti): NAD(P)H i FADH2.

Izvor elektrona za redukciju NAD(P)+ i FAD su:• reakcije biološke oksidacije biomolekula iz hrane pod dejstvom oksidoreduktaza (kod autotrofnih

organizama), uključujući proces glikolize, Krebsov ciklus, β-oksidaciju masnih kiselina, i• svetlošću pobuđeni fotosintetički sistemi (kod autotrofa).

Promena Gibsove slobodne energije u toku oksidoredukcione reakcije srazmerna je težnji reaktanata da otpuštaju ili primaju elektrone, a koja se izražava standardnim redoks-potencijalom (E0). Redoks potencijal je u realnom sistemu srazmeran koncentraciji učesnika reakcije, i izražava se Nernstovom jednačinom.

26

26

NAD(P)+ NAD(P)H

Anabolizam

Redukovaniproizvodi

Oksidovaniprekursori

Katabolizam

Redukovanogorivo

Oksidovaniproizvodi

ciklus NAD+/NADH:

Oksidativna fosforilacija

H2OATP

O2ADP + Pi

Energija oslobođena oksidacijom metaboličkog goriva najvećim delom se u vidu elektrona ili atoma vodonika prenosi na molekule redoks-koenzima (prvenstveno NAD+), pri čemu dolazi do njihove redukcije (iz NAD+ nastaje NADH, iz FAD –FADH2). Elektroni deponovani u ovim redukovanim koenzimima mogu se direktno trošiti u anabolizmu (pri čemu konvertuju oksidovane prekursore u redukovane proizvode, npr. acetil-CoA u masne kiseline). Alternativno, oni se prenose na kiseonik u procesu poznatom kao oksidativna fosforilacija, pri čemu se oslobođena energija koristi za sintezu ATP (kod aerobnih organizama, ovaj način sinteze ATP značajniji je od fosforilacije na nivou supstrata).