Metabolizam Lipoproteina i Ateroskleroza - Predavanje 4

Metabolizam lipoproteina i ateroskleroza

Predavanja iz Laboratorijske dijagnostike poremeaja metabolizma

kolska 2014/2015. godina

Uloga oksidativnog stresa u nastanku

ateroskleroze

Hipoteze o nastanaku ateroskleroze

- Hipoteza odgovora na povredu (disfunkcija endotela)

-Lipidna hipoteza

-Hipoteza oksidativne modifikacije lipoproteinskih estica

- Hipoteza inflamacije

Hipoteza oksidativne modifikacije lipoproteinske

estice

Steinberg uloga oksidativno modifikovanih LDL estica u nastanku ateroskleoroze

Oksidativni status

Oksidativni status predstavlja odnos markera oksidativnog stresa i antioksidativne zatite.

Oksidativni stres predstavlja poremeaj ravnotee oksidoredukcionih procesa koji nastaje zbogpoveanog stvaranja slobodnih radikala koje elijski homeostatski mehanizmi nisu u stanju da neutraliu.

Slobodni radikali

Slobodni radikali atomi, atomske grupe

ili molekuli sa jednim ili vie nesparenih elektrona

Slobodni radikali mogu nastati:

- gubitkom elektrona iz ne-radikala ili dodatkom elektona ne-radikalu

- raskidanjem kovalentne veze homolitika fizija

Pored slobodnih radikala u oksidoredukcionim procesima uestvuju i neradikalska jedinjenjakoja nemaju nesparen elektron ali uestvuju u reakcijama stvaranja radikala:

- Hidrogen peroksid H2O2- Hipohlorna kiselina HOCl

- Ozon

Izvori slobodnih radikala

Izvori slobodnih radikala mogu biti egzogeni i endogeni.

Endogeni izvori slobodnih radikala

- metabolike transformacije- metabolizam ksenobiotika

Oksidativni metaboliki procesi u kojima nastaju slobodni radikali: - respiratorni lanac mitohondrija

- oslobaanje kiseonika u toku fagocitoze

- sinteza eikozanoida

- enzimske reakcije oksidaza i oksigenaza

Egzogeni izvori slobodnih radikala:

- jonizujue zraenje- ultravioletna radijacija

- ultrazvuk

- duvanski dim


1O2

O2e

O2

HO2

H+

H2O2 + O22H+O2

ClHOCl

HO + HO

Fe2+

Fe3+OONO

NO

superoksid anjon radikal

hipohlorna kiselina

Singlet kiseonik

hidroperoksil radikalperoksinitril

hidroksil radikal

1O21O2

O2e

O2e

O2

HO2

H+

H2O2 + O22H+O2

H2O2 + O22H+O2

ClHOCl

HO + HO

Fe2+

Fe3+OONO

NO

OONO

NO


hipohlorna kiselina

Singlet kiseonik


hidroksil radikal

OHeHO 22 244 +++ Kiseonik je snaan oksidans u procesu oksidativne

fosforilacije u unutranjim membranama mitohondrija

u procesu oksidativne fosforilacije.

+ .22 OeO Delimina redukcija kiseonika do superoksid anjon radikala (0.4-4%)molekulskog kiseonika.


22.

2 OHH2e2O +++ U mitohondrijama se O2.- prevodi u H2O2 dejstvom

enzima superoksid dizmutaze (SOD).

H2O2 se dalje u mitohondrijama prevodi do molekula vode (H2O) i O2 pomou enzima glutation peroksidaze (GPx), a ukoliko pree u citozol, ovu reakciju katalizuje

antioksidativni enzim katalaza (CAT) .

1O2

O2e

O2

HO2

H+

H2O2 + O22H+O2

ClHOCl

HO + HO

Fe2+

Fe3+OONO

NO


hipohlorna kiselina

Singlet kiseonik


hidroksil radikal

1O21O2

O2e

O2e

O2

HO2

H+

H2O2 + O22H+O2

H2O2 + O22H+O2

ClHOCl

HO + HO

Fe2+

Fe3+OONO

NO

OONO

NO


hipohlorna kiselina

Singlet kiseonik


hidroksil radikal

U prisustvu jona prelaznih metala (gvoe, hrom, mangan, plemeniti metali) H2O2 stvara vrlo reaktivne slobodne radikale

(HO., HO-) i ova reakcija je poznata kao "Fentonova reakcija.

Nastali vodonik- peroksid u prisustvu jona

gvoa i bakra daje i jako potentan slobodni radikal hipohloritni jon (OCl-) uz uee enzima mijeloperoksidaze.

++ OHkiselinahipohlornaHOClClOH )(22

+ + OClHHOCl

Fentonova

reakcija

Izvori slobodnih radikala u vaskularnom

sistemuEnzimski izvori

- NAD(P)H-oksidaze- membranski enzim

- Ksantin oksidaza

- Mijeloperoksidaza MPO i njeni produkti

- Lipooksigenaza

15,12-lipooksigenaza

5-lipooksigenaza 5-LO

fosfolipaza A2

- NOS (azot oksid sintaza) endotelna

- Inducibilna NOS iNOS

Ne-enzimski izvori

- Tranzicioni metali : Cu 2+ i Fe 3+

- Respiracija u mitohondrijama

Curenje elektrona

Oksidativna modifikacija lipoproteina

Oksidativna modifikacija lipoproteina je posledica lipidne peroksidacije koja se deava pod dejstvom

slobodnih radikala. Lipidnoj peroksidaciji su podlone pre svega nezasiene masne kiseline koje se nalaze vezane za holesterol ili u fosfolipidima LDL estice. Lipidna peroksidacija se odvija u tri faze:

Produkti lipidne peroksidacije su ciklini peroksidi, ciklini endoperoksidi, malondialdehid i nonenal.

Oksidativna modifikacija lipoproteina

Faze lipidne peroksidacije

1.Inicijacija

Prve reakcije u lancu

Oduzimanje H+ jona pomou ROS (OH)

Stvaranje lipidnog radikala (LH)

Stvaranje peroksi radikala (LOO, ROO

)

2. Propagacija

Oduzimanje H+ sa lipidnim

peroksil radikalom (LOO)

3. Terminacija

Interakcija radikala

ne-radikalski produkt

Faze procesa oksidativne modifikacije LDL

esticeOksidativna modifikacija LDL estica se odvija u 4 faza:

1) Faza inicijacijeU ovoj fazi je znaajna uloga metalnih jona u zapoinjanju procesa. Tokom ove faze setroe antioksidativne komponente LDL estica (vitamin E) lag faza

2) Faza propagacijeU ovoj fazi dolazi do oksidacije nezasienih masnih kiselina do LOOH i ovaj proces se odvija jako brzo

3) Faza dekompenzacijeU ovoj fazi se lipidni hidroperoksidi konvertuju do reaktivnih aldehida ( malondialdehid

i 4- hidroksinonenal)

4) Fragmentacija apo B-100 i gubitak funkcije vezivanja za LDL receptoreLizin iz apo B-100 proteina LDL estice biva zamenjen reaktivnim aldehidima usled ega dolazi do fragmentacije apo B-100 gubi mogunost vezivanja za LDL receptore.Modifikovana LDL estica se vezuje za scavenger receptore na makrofagama i dovodi do akumulacije holesterola u makrofagama i stvaranja penastih elija.

Aterogene karakteristike oksidovane LDL

estice

- Oksidovani LDL stimulie hemotaksu

monocita.

- Oksidovani LDL inhibira izlazak monocita

kroz vaskularni zid.

- Oksidovani LDL biva lake preuzet od strane makrofaga koje ga akumuliraju i prelaze u penasteelije.

- Oksidovani LDL dovodi i do disfunkcije i oteenja endotela.

- Oksidovani LDL dovodi do nekroze penastih elija, oslobaanja lizomalnih enzima i stvaranja

nekrotinog tkiva.

Antioksidativna zatita

Antioksidansi slue za neutralizaciju slobodnih radikala u organizmu. U zdravom organizmupostoji ravnotea izmeu prooksidanasa i antioksidanasa.

elija

Antioksidansi imaju sposobnost doniranja

elektrona slobodnom radikalu !!!

Podela antioksidanasa:

Po lokalizaciji

- elijski (citoplazmatski i membranski)- Ekstracelularni

Po funkciji

- Enzimski

- Neenzimski

Hidrosolubilni

Liposolubilni

Enzimska antioksidativna zatita

Najvaniji enzimski antioksidansi su: superoksid dizmutaza (SOD), glutation peroksidaza (GPX),katalaza, glutation reduktaza, glutation S-transferaza, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, hem

oksigenaza, paraoksonaza.

Superoksid dizmutazaIzoenzimi:

- intracelularna Cu, Zn SOD (SOD I)

- mitohondrijalna Mn-SOD (SOD II)

- ekstracelularna SOD (SOD III)

Katalaza (CAT)-uklanja H2O2 i spreava oksidativnu modifikaciju proteina i lipidnu peroksidaciju

Glutation peroksidaza (GPx)- uklanja perokside, ak i lipidne hidroperokside

Neenzimska antioksidativna zatita

Neenzimski hidrosolubilni antioksidansi su: albumin, glutation, bilirubin vezan za albumin,

mokrana kiselina i vitamin C.

Uloga glutationa

Glutation titi membranu

eritrocita od lipidne peroksidacije

i spreava hemolizu.

Neenzimski liposolubilni antioksidansi su: vitamin E, ubihinon Q10, - karoten, likopeni polifenoli (flavonoidi) iz crvenog vina (rezervatrol, katehin)

Francuski paradoks

Mehanizmi antioksidativne zatite

Mehanizmi antioksidativne zatite:

- Direktna zatita od ROS

Superoksid dismutaza, glutation peroksidaza, katalaza

- Nespecifini redukcioni sistemi

Glutation, vitamin C

- Zatita od lipidne peroksidacije

Glutation peroksidaza, vitamin E, karoten

- Vezivanje metala

Transferin, laktoferin, feritin, metalotionein

- Sistemi reparacije

Enzimi reparacije DNK, makrooksiproteinaze, glutation transferaza

Mehanizmi antioksidativne zatite LDL

estice

LDL estice se tite od oksidacije inkorporacijom antioksidanasa.Inkorporacija antioksidanasa u vaskularne elije dovodi do manje oksidacije LDL estica,manje adhezije monocita, manjeg stvaranja penastih elija, manje citotoksinosti i poboljanja endotelne funkcije.

Laboratorijska dijagnostika oksidativnog

statusa

Markeri oksidativnog stresa

Merenje slobodnih radikala

Superoksidni anjon, vodonik peroksid, NO, peroksinitrit

Markeri oksidacije biomolekula

Produkti lipidne peroksidacije (TBARs, lipidni hidroperoksidi, malondialdehid, PGF2-Izoprostani,konjugovani dieni, 4-hidroksinonenal

Produkti hidroksilacije DNK (8-OH gvanozin)

Produkti oksidativne modifikacije proteina (produkti nitrozilacije, karbonili, AOPP, itd)

TOS-totalni oksidantni status

OxLDL

Markeri antioksidativne zatite

- SOD

- GPX

- Katalaza

- Paraoksonaza

- Glutation

- SH grupe

- TAS-totalni antioksidativni status

- PAB- prooksidativno-antioksidativni

balans

Antiaterogena uloga HDL estica

Rezultati Framingam studije : niske koncentracije HDL holesterola- nezavisni

prediktor koronarne srane bolestiFramingamska studije je poela 1948. godine, obuhvatala 5209 odraslih ispitanika, cilj jeprocena rizika za razvoj kardiovaskularnih bolesti. Studija je longitudinalna, traje jo uvek

(trea generacija). Framingam risk score procena rizika (%) za razvoj kardiovaskularnih bolesti u narednih

godina


0

1

2

3

2,6 4,1 5,7

0,65

1,68

2,2

1,16

Re

lati

vn

i ri

zik

od

KS

B p

osl

e 4

go

din

e

LDL holesterol (mmol/l) HDL h

oleste

rol

(mmo

l/L)

Framingamska studija

Porast nivoa HDL-H za 1% smanjuje rizik od KVB za 2-3 %


Antiaterogene uloge HDL setica:

- Reversni trasnport holesterola

- Inhibicija oksidacije LDL estica (enzim paraoksonaza 1)- Inhibicija ekspresije adhezionih molekula

- Inhibicija agregacije trombocita

- Spreava inhibiciju azot oksid sintaze


Struktura HDL estica

HDL je lipoprotein velike gustine koji

sadri 50% apolipoproteina, apo AI iapo AII.

50% lipidi

fosfolipidi 27%

holesterol 20%

trigliceridi 3%

HDL estice se sintetiu u jetri i intestinumu, u nascentnoj, diskoidnoj pre- formikoja se ugavnom sastoji od apolipoproteina i fosfolipida.

pre -HDL

Diskoidni HDL

Reversni transport holesterola

HDL estica ostvaruje svoju ateriprotektivnu ulogu tako to preuzima holesterol iz perifernih elija, makrofaga i taj holesterol vraa u jetru gde se on metabolie u une kiseline i izluujeputem ui.

- mesto sinteze nascentnog, diskoidnog HDL-a (hepatociti i intestinum)

- metabolizam u cirkulaciji

- metabolizam u jetri

- put izluivanja: jetra i bubrezi

Reversni transport holesterola se odvija u 4 faza:

- Preuzimanje holestrola iz perifernih elija vezivanjem HDL estica pomou apo AIEfluks holesterola se odvija pomou ABC A1 transportera(ATP vezujui kasetni transporter klase A1)

- Esterifikacija holesterola u holesterol estre (LCAT)- Indirektan transport holesterol estara u jetru putem transfera na lipoproteine koji su bogati

trigliceridima (CETP)- Direktan transport holesterol estara u jetru vezivanjem za SR BI receptore

Reversni transport holesterola

Lp A-I Lp A-I:A-IIpre-

HDL 2b

HDL 2a

HDL 3a

HDL 3b

HDL 3c

7,2 7,8 8,2 8,8 9,7 12Dijametar (nm)

Gu

stin

a(k

g/L

)

1,125

1,210

1,063

Dijametar (nm)

Gu

stin

a (k

g/L

)

HDL SUBFRAKCIJE

HDL 2 fenotip

HDL 3 fenotip

male, guste HDL male, guste HDL esticeestice

Mehanizmi regulacije metabolizma lipoproteina

U regulaciji metabolizma lipoproteina vanu ulogu imaju transkripcioni faktori (SREBP) i transkripcioni faktori koji se aktiviraju vezivanjem odgovarajuih liganada (LXR, PPAR, RXR).

PPAR Peroxisome Proliferator Activated Receptor

(receptori koji se aktiviraju proliferacijom peroksizoma)

PPAR su nuklearni transkripcioni faktori koji utiu na modulaciju genske ekspresije proteina i enzima koji uestvuju u homeostazi lipida.

Aktiviraju se vezivanjem liganada.

Endogeni ligandi: masne kiseline, eikozanoidi, oksisteroli

Egzogeni ligandi: lekovi (fibrati)

Postoje tri osnovna subtipa PPAR receptora:

PPAR- alfa (jetra)

PPAR gama (adipozno tkivo)

PPAR delta (miino tkivo)

Mehanizmi regulacije metabolizma lipoproteina

Struktura PPAR alfa transkripcionog faktora

PPAR-alfa transkripcioni faktor se sastoji iz tri domena:

- Ligand vezujui domen- Domen dimerizacije

- DNK vezujui domen (Cinkovi prsti)

Aktivacija PPAR alfa receptora

Aktivacija PPAR- alfa receptora se odvija u dve faze:

- Prva faza

Vezivanje endogenih i egzogenih liganada

Heterodimerizacija sa drugim transkripcionim faktorom RXR (retinoid X receptor)

Aktivacija PPAR alfa receptora

Aktivacija PPAR- alfa receptora se odvija u dve faze:

- Druga faza

Prepoznavanje gena u hepatocitima od strane heterodimera PPAR-RXR

PPRE- PPAR responsive element sekvenca nukleotida na molekuli DNK koju prepoznaje

DNK vezujui domen strukture PPAR-alfa AGGTCA-AGGTCA

Uticaj PPAR-alfa transkripcionih faktora na

metabolizam lipoproteina

Metabolizam HDL estica je regulisan pomou PPAR-alfa transkripcionih faktora koji utiu naekspresiju gena za sintezu apo AI, apo AII, ABC A1, LPL i SRB I u hepatocitima.

Na matabolizam VLDL estica utiu tako to u hepatocitima stimuliu beta-oksidaciju masnihkiselina, smanjuje se koncentracija slobodnih masnih kiselina a time i sinteza VLDL estica.PPAR-alfa inhibiraju sintezu apo CIII, inhibitora lipoproteinske lipaze, poveava se uklanjanjeVLDL estica , to posledino smanjuje i broj malih, gustih LDL estica.

Mehanizam dejstva fibrataFibrati su lekovi koji se koriste u terapiji hiperholesterolemije. Mehanizam dejstva je poveanasinteza enzima LPL, inhibicija sinteze apo CIII i poveana sinteza apo AII, preko PPAR alfa transkripcionih faktora.

Dislipidemije - Dislipoproteinemije

Hiperlipoproteinemije

Ciljevi ispitivanja lipidnog statusa

- Postavljanje dijagnoze dislipidemije

- Procena rizika za nastanak kardiovaskularne bolesti

- Primena terapije za leenje dislipidemija

Klasifikacija dislipidemija

- Klasifikacija po Fredericksonu

- beta klasifikacija

- WHO klasifikacija

-Hiperlipoproteinemije i Hipolipoproteinemije

-Disbetalipoproteinemije i Disalfalipoproteinemija

- Poremeaji u egzogenom, endogenom metabolizmu ili reversnomtransportu holesterola

Etioloka podela hiperlipoproteinemija

- Primarne (genetski uslovljene)

- Sekundarne ( nastale kao posledica neke druge bolesti)

- Kombinovane

Nedostaci: ne obuhvata sve dislipoproteinemije (samo hiperbetalipoproteinemije)

ne ukazuje na etiologiju bolesti

ne obuhvata hipolipoproteinemije

Dislipidemije Dislipidemije DislipoproteinemijeDislipoproteinemije

Primarne

Hiperhilomikronemija

Hiperholesterolemija *

Disbetalipoproteinemija *

Hipertrigliceridemija *

Genetski defekti na nivou:

Apolipoproteina

Receptora

Enzima

Transportera

Sekundarne1.Metabolike bolesti: DM tip I i DM Tip II

2.Poremeaji funkcije organa:jetre, bubrega, tireoideje

3.Dejstvo lekova

4.Gojaznost

5. Socijalne navike: fizika neaktivnost, puenje, aterogena ishrana, itd

Kombinovane hiperlipidemije *

* rana i vrlo izraena ateroskleroza, naroito koronarnih krvnih sudova

Primarne dislipidemije

Poremeaji vezani za LDL estice

Hiperbetalipoproteinemije

poveana koncenbtracija LDL-holesterolaPorodina hiperholesterolemija

- defekt LDL receptora (poremeaj sinteze LDL receptora). LDL estice ne mogu da se metaboliu, koncentracija LDL- holesterola je jako visoka

- defekt u primarnoj strukturi apo B-100 (na poziciji 3500 glutamin zamenjen argininom)

Familijarna apo B-3500 hiperholesterolemija

Poremeaji vezani za HDL esticeHipoalfalipoproteinemije

niske koncentracije HDL-holesterola, poveani aterogeni rizikuzroci: genski defekti na nivou apo AI, enzimima (LCAT) i transporteru ABC A1.

Familijarna hiperholesterolemija

Laboratorijska dijagnostika dislipidemija

Lipidni staus podrazumeva odreivanje sledeih parametara:- koncentracija ukupnog holesterola

- koncentracja triglicerida

- koncentracija LDL-holesterola

- koncentracija HDL-holesterola

Odreivanje apolipoproteina obuhvata:

- koncentracija apo AI ( antiaterogeni apolipoprotein)

- koncentracija apo B-100 (aterogeni apolipoprotein)

Aterogeni indeksi:

-ukupan holesterol/HDL-holesterol

- LDL-holesterol/HDL-holesterol

- Apo B/Apo A

- Trigliceridi/HDL-holesterol

- Non HDL-holesterol: ukupan holesterol - HDL-holesterol

LDL i HDL subfrakcije u proceni rizika od KVB

Aterogenost LDL estica se moe proceniti sledeim laboratorijskim odreivanjima:

- Koncentracija LDL-holesterola

- Koncentracija apolipoproteina B-100

- Veliina LDL estica

- Koncentracija holesterola i apo B-100 u LDL subfrakcijama

LDL SUBFRAKCIJE

LDL I

LDL II

LDL III

LDL IV

22,0 24,2 25,5 27,2 28,5Dijametar (nm)

Gu

stin

a(k

g/L

)

1,038

1,063

1,019

Dijametar (nm)

Gu

stin

a (k

g/L

)

LDL fenotip A

LDL fenotip B

male, guste LDL male, guste LDL esticeestice

Visok rizik

Nizak rizik

LDL subfrakcije

Razdvajanje LDL subfrakcija i HDL subfrakcija

- ultracentrifugiranje (razdvajanje na osnovu gustine)

- elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (gradijent gel elektroforeza)

- nuklearna magnetna rezonanca

Nain obeleavanja:

mali gusti LDL

LDL1, LDL2, LDL3, LDL4

fenotip A i fenotip B

LDL I, LDL II, LDL III i LDL IV

Fenotip A dominiraju velike LDL estice

Fenotip B - dominiraju male LDL estice

Diferencijacija fenotipova - dijametar estica

> 25,5 nm fenotip A

< 25,5 nm fenotip B

Gu

stin

a (k

g/L

)Dijametar (nm)

LDL subfrakcije

Na ekspresiju LDL B fenotpia utiu sledei faktori: - genetski faktor (autozomalno-dominantno nasleivanje) 35-45%

- pol (ene pre menopauze pod manjim rizikom, 5-10%)- abdominalna gojaznost

- hipertrigliceridemija

- rezistencija na insulin

Aterogenost malih, gustih LDL estica

LDL SUBFRAKCIJE KAO POTENCIJALNI

BIOMARKERI ATEROSKLEROZE

Kliniki znaaj

Male, guste LDL i HDL estice doprinose razvoju ateroskleroze nezavisno od drugih faktora rizika

Nema zvaninih preporuka za rutinsko odreivanje LDL i HDL subfrakcija

Ispitivanje LDL i HDL subfrakcija za procenu Ispitivanje LDL i HDL subfrakcija za procenu

rezidualnog rizika i prarezidualnog rizika i praenje progresije enje progresije

ateroskleroze.ateroskleroze.

Principi razdvajanja LDL subfrakcija

1.gustina

ultracentrifugiranje

2. naelektrisanje

hemijska precipitacija

elektroforeza na agarozi

3. veliina i naelektrisanje

gradijent gel elektroforeza

hromatografske tehnike

4. sastav apolipoproteina

imunohemijske metode

5. lipidni sastav

NMR spektroskopija

Lipoprotein a - Lp (a)

Lp (a) je lipoprotein izuzetno bogat holesterolom. Sastoji se iz dve strukturne komponente

apolipoproteina (a) koji je preko disulfidnog mosta vezan za apo B iz LDL estice.

Apolipoprotein (a) ima specifinu strukturukringl.

LDL estice i Lp (a) razliit metabolizam

- obrnuta korelacija Lp (a) koncentracije i veliineapo (a)

Lp (a) se sintetie u jetri a na povrini hepatocita se

udruuje sa apo B. Elektroforetski se izdvaja kao pre beta lipoproteinska frakcija.

Lipoprotein a kao faktor rizika za razvoj

kardiovaskularnih bolesti

Strukturna analogija sa plazminogenom

Lp(a) vezuje metabolizam lipida sa vaskularnom trombozom i fibrinolizom

Lp(a) inhibira lizu ugruka i smanjuje aktivaciju plazminogena

pomou aktivatora tkivnog plazminogena

Kliniki znaaj odreivanja Lp(a)

Proaterogena i protrombogena aktivnost Lp(a)

Funkcionalni znaaj jo uvek nije jasan. Nezavisni prediktor koronarne bolesti

Rizine vrednosti > 300 mg/L

Genetski polimorfizam apo (a)

Lp(a) je polimorfan u veliini i ima vie izomera. Koncentracija Lp(a) je genetski uslovljena, postoji veza genotipa i koncentracije Lp(a)

Documents

Metabolizam Lipoproteina i Ateroskleroza - Predavanje 4